Abstract
Au cours du développement, les cellules hématopoïétiques proviennent de un sous-ensemble spécialisé de cellules endothéliales, l'endothélium hemogenic (HE). Modélisation HE développement in vitro est essentiel pour des études mécanistiques de la transition de l'endothélium hématopoïétiques et la spécification hématopoïétique. Ici, nous décrivons un procédé efficace pour l'induction de IL partir de cellules humaines pluripotentes de troncs (hPSCs) au moyen de la surexpression de différents ensembles de facteurs de transcription. La combinaison de ETV2 et GATA1 ou GATA2 TF est utilisé pour induire un potentiel SE pan-myéloïde, tandis qu'une combinaison de GATA2 et des facteurs de transcription TAL1 permet la production de IL avec érythroïde et mégacaryocytaire potentiel. L'ajout de LMO2 à GATA2 et la combinaison TAL1 accélère sensiblement la différenciation érythroïde et augmente et les cellules mégacaryocytaires production. Cette méthode offre un moyen efficace et rapide de SE l'induction de hPSCs et permet l'observation de l'endothélium hematopoietic transition dans une boîte de culture. Le protocole comprend des procédures hPSCs de transduction et l'analyse post-transduction de SE et des progéniteurs sanguins.
Introduction
La capacité unique de cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) d'auto-renouvellement et de se différencier en cellules des trois feuillets embryonnaires, y compris le sang, faire un outil précieux pour les études mécanistiques de développement hématopoïétique, la modélisation des maladies du sang, le dépistage des drogues, Les études de toxicité et le développement de thérapies cellulaires. Parce que la formation du sang dans l'embryon produit à partir de l'endothélium hemogenic (HE) à travers une transition hématopoïétique endothéliale 1,2, la génération de SE dans les cultures serait essentiel d'étudier les mécanismes moléculaires régulant l'endothélium à la transition hématopoïétiques et la spécification hématopoïétique. Les méthodes actuelles pour les études de SE sont basés sur l'induction de la différenciation dans les agrégats hematoendothelial (EBS) avec l'ajout de cytokines hématopoïétiques 3-5, et de co-culture avec des cellules hPSCs stromales hématopoïèse-6,7 de soutien ou dans des cultures en deux dimensions avec extracellulaire et c matricesytokines 8,9. Ces méthodes classiques de différenciation sont basées sur l'introduction de signaux externes agissant à la surface de la cellule et d'initier des cascades de voies moléculaires qui conduisent finalement à l'activation du programme de transcription orienter le développement hematoendothelial. Ainsi, l'efficacité de hPSCs différenciations dans ces systèmes repose sur une induction efficace de ces signaux, la transduction du signal vers le noyau, et l'activation résultant de régulateurs transcriptionnels spécifiques. En outre, l'étude de SE dans les cultures de différenciation classiques nécessite l'étape supplémentaire consistant à isoler des cellules SE en utilisant le tri de cellules. Ici, nous décrivons un protocole simple pour l'induction directe de SE et de sang par la surexpression de facteurs de transcription hématopoïétiques. Cette méthode permet l'induction efficace de SE dans un plat et l'observation directe de l'endothélium à la transition hématopoïétique, sans la nécessité pour l'isolation des SE en utilisant une procédure de tri cellulaire encombrant.
Formation de SE et de sang à partir de cellules souches pluripotentes humaines peuvent être efficacement induites par la surexpression seulement quelques facteurs de transcription (FT). La combinaison optimale de TFS capables d'induire robuste hématopoïèse pan-myéloïde de hPSCs comprend ETV2 et GATA1 ou GATA2. En revanche, la combinaison de GATA2 et TAL1 induit erythromegakaryocytopoiesis 10. Programmation hPSCs par la surexpression de ces facteurs différencie hPSCs directement à la VE-cad + CD43 - CD73 - HE cellules qui acquièrent progressivement le phénotype hématopoïétique défini par l'expression du début hématopoïétiques CD43 marqueur 7. Cette méthode basée lentivirus pour la programmation directe de pluripotentes méthode des cellules souches humaines est applicable pour la génération de SE et de cellules sanguines pour des études mécanistes, des études de l'endothélium à la transition hématopoïétique, et la régulation transcriptionnelle du développement hématopoïétique et la spécification. Bien que le cprotocole de dusyst décrit la production de sang en utilisant une expression constitutive des transgènes, des résultats similaires pourraient être obtenus en utilisant l'ARNm modifié 10.
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Protocol
1. préparations de virus et facteur de transcription Combinaisons
- Préparer des solutions avec pSIN EF1-lentiviral plasmide d'expression contenant l'ADN codant pour la protéine de ETV2, GATA1, GATA2, LMO2 et TAL1 (tableau 1).
- Mesurer la concentration et la pureté des préparations de plasmides utilisés pour la production lentiviral enregistrement par absorption UV avec un spectrophotomètre à 230 nm, 260 nm et 280 nm. Note: préparations d'ADN démontrant A260 / 280 et A260 / 230 des valeurs supérieures à 1,8 sont généralement considérés comme de bonne qualité. A260 / 280 valeurs inférieures peuvent indiquer une contamination de la protéine, tandis que la baisse A260 / 230 valeurs indiquent les impuretés avec des sels ou un peu de solvant tel que le phénol. Concentration de plasmide recommandée est de 1-3 pg / pl.
- Produire lentivirus pour transductions comme décrit dans les protocoles précédemment publiés 11. Induction de SE avec un potentiel pan-myéloïde nécessite co-expression de ETV2 et GATA1 ou ETV2 et GATA2.Induction de SE avec un potentiel erythro- et mégacaryocytes nécessite GATA2 et TAL1. L'addition de LMO2 améliore de manière significative le rendement en cellules érythro-mégacaryocytaire de hPSCs en présence de 10 GATA2 et TAL1.
2. hPSCs Protocole Culture
- Cultiver des cellules souches pluripotentes en colonies serrées avec des arêtes vives à 70-80% de confluence avant repiquage. Mark et retirer spontanément différenciées colonies avant passage de cellules.
- Diluer gel commercial de la matrice extracellulaire (voir le tableau 2) selon les instructions du fabricant et des plaques à 6 puits couche pendant une nuit à 4 ° C ou pendant au moins 1 heure à 37 ° C avant utilisation. Avant de passage de cellules, aspirer la matrice, ajouter 2 ml de milieu de culture commerciale complète frais (voir le tableau 2) et de garder les plaques à 37 ° C, 5% de CO2 jusqu'à ce que les cellules sont prêtes pour l'ensemencement.
- HPSCs Passage
- Aspirate moyen d'un puits de confluence d'une plaque à 6 puits avec hPSCs et ajouter 1,5 ml de solution dispase II préchauffé (2 mg / ml dans du DMEM / F12, stérilisé par filtration à travers des filtres de 0,22 um). Incuber pendant 5-7 minutes à 37 ° C, 5% CO 2 jusqu'à ce que les bords des colonies commencent à se soulever de la surface.
- Aspirer solution Dispase II et se laver soigneusement les colonies à deux reprises par l'ajout puis aspirer 2 ml de milieu DMEM / F12 frais. Puis, en utilisant un 5 ml sérologique pipette en verre, dissocier hPSCs avec 3 ml de milieu frais de culture complet commerciale (voir le tableau 2) par pipetage suspension cellulaire monter et descendre plusieurs fois.
- Ajouter 0,5 ml de suspension cellulaire dans chaque puits d'une plaque à 6 puits contenant 1,5 ml de milieu de culture complet commerciale (voir le tableau 2). Agiter la plaque arrière et de droite à gauche à plusieurs reprises pour assurer une répartition uniforme des cellules où situer la plaque dans l'incubateur. Maintenir les cellules à 37 ° C, 5% CO 2 pour une8-24 h.
- La prochaine moyen de changement de jour dans un milieu frais de culture complet commerciale (voir le tableau 2) et d'examiner hPSCs morphologie. Résultats de passages réussis dans de petites colonies, bien attachés retenue HPSC morphologie. hPSCs doivent être nourris avec 2,5-3 ml par puits freshmedium sur une base quotidienne et un passage tous les 4-5 jours à pas plus de 70-80% de confluence.
REMARQUE: si hiPSCs ont été maintenues sur des fibroblastes embryonnaires de souris (MEF), ils doivent être transférés à des conditions exemptes d'alimentation et des passages 2-3 fois avant transduction pour assurer la différenciation efficace.
3. Induction de Hematoendothelial Pprecursors de hPSCs (jour 0, la transduction du hPSCs)
- Pour préparer le milieu de réaction combiner 1,3 ml de milieu sans sérum complète commerciale (voir le tableau 2), le virus, polybrène, et l'inhibiteur de ROCK Y27632 (tableau 1): ajouter 1,3 pi d'inhibiteur de ROCK 10 mM à 1,3 ml de milieu à une concentration finaletion de 10 uM, et de polybrène à une concentration finale de 6 ug / ml.
- Ajouter une quantité appropriée de concentré (s) virale à une concentration finale de 0,5 à 1,0 MOI (multiplicité d'infection) de chaque virus par cellule. Garder milieu réactionnel sur de la glace ou à 4 ° C jusqu'à ce que la suspension cellulaire unique est prêt.
REMARQUE: La même quantité de virus pour chaque MOI dans la GATA1 / ETV2, GATA2 / TAL1, et des mélanges de GATA2 / TAL1 / de réaction de LMO2 est optimale pour l'induction de la différenciation. Cultures Toutefois, dans ETV2 / GATA2 transduites doublement MOI pour GATA2, par rapport à ETV2, améliore la différenciation. Par conséquent, pour ces cultures, le ratio 1: 2 pour MOI de ETV2 et une MOI de GATA2 est recommandée (par exemple, si le concentré viral est estimé à environ 6,8 x 10 7 particules / ml, ajouter 10 ul de ETV2 et 20 ul de GATA2 concentrés viraux à 0,68 x 10 6 cellules par une seule réaction ETV2 / GATA2 dans un 35 mm et d'une plaque de 6 puits).
- Ajouter une quantité appropriée de concentré (s) virale à une concentration finale de 0,5 à 1,0 MOI (multiplicité d'infection) de chaque virus par cellule. Garder milieu réactionnel sur de la glace ou à 4 ° C jusqu'à ce que la suspension cellulaire unique est prêt.
- Préparer hPSCs en une seule susp cellulaireension.
- Cultivez hPSCs dans des conditions exemptes de cellules nourricières, comme décrit dans la section 2. Le jour 4 suivant le dernier passage, observer la densité cellulaire et de morphologie sous un microscope inversé. hPSCs doivent croître en colonies serrées avec des arêtes vives, sans différenciation spontanée et atteindre ~ 60-70% de confluence le jour de la transduction.
- Aspirer le milieu, ajouter 1,5-2 ml de réactif commerciale de dissociation cellulaire (tableau 1) par puits et incuber à 37 ° C avec 5% de CO 2 pendant 5-7 min.
- Recueillir des cellules dans des volumes égaux de milieu complet commerciale (voir le tableau 2) avec 10 uM de l'inhibiteur de ROCK, compter les cellules et de déterminer la viabilité. Pellet cellules par centrifugation à 200 g pendant 5 min, puis remettre en suspension les cellules dans un milieu complet commerciale avec 10 uM de l'inhibiteur de ROCK à une concentration de 3.4-5 x 10 6 cellules par ml.
NOTE: La viabilité des cellules est essentiel pour la transduction virale réussie et la différenciation ultérieure.Généralement, la viabilité des cellules avant la transduction doit être supérieure à 90%.
- Ajouter 200 ul de la suspension cellulaire, contenant 0.68-1 x10 6 cellules, dans 1,3 ml du milieu de réaction préparé en 3.1.
- Aspirer la solution de la matrice de la plaque de 6 puits revêtu nuit préparé en 2.2., Transférer le mélange de réaction à un puits d'une plaque à 6 puits et distribuer les cellules uniformément. Incuber à 37 ° C avec 5% de CO2 pendant 24 heures. Après 24 h au moins 80% des cellules doit être fixé à la matrice.
4. Induction de Hematoendothelial précurseurs de hPSCs (Jour 1-7)
- 24 heures après la transduction, éliminer le milieu contenant le virus et laver les cellules attachées avec un milieu de culture cellulaire incomplète commerciale (voir le tableau 1), puis ajoutez 3 ml par puits de milieu de culture cellulaire incomplète commerciale contenant des cytokines hématopoïétiques: EFC 100 ng / ml, TPO 50 ng / ml de bFGF, 20 ng / ml (ci-après dénommé 3F-moyen).
- Remplacer milieu total avec des produits frais 3F-moyen les jours 2, 3 et 4 jours pour éliminer les cellules mortes et les débris. Après le jour 4, lorsque les cellules hématopoïétiques flottantes apparaissent, remplacer la moitié de la 3F-support tous les jours tout en conservant le volume total à 4 ml.
NOTE: pSIN-EF1 plasmides d'expression lentiviral incorporent gène de résistance à la puromycine permettant ainsi une sélection positive des cellules transduites. Le 1 ug / ml de puromycine peut être ajouté au milieu au cours des 1-2 premiers jours de différenciation pour éliminer les résiduels des hPSCs indifférenciées. - Observez la morphologie des cellules le jour 4 sous un microscope inversé: grappes serrées de cellules ayant une morphologie typique endothéliale commencent à apparaître (Figures 2A, 3A). Globules ronde apparaît du jour 5 au jour 7 de la différenciation, tandis que certaines régions peuvent conserver hPSCs morphologie. Analyser HE et différenciation hématopoïétique tel que décrit ci-dessous.
REMARQUE: différente hematoendothelial réussieiation se traduit par la production de cellules sanguines qui apparaissent comme des cellules rondes réfractiles attaché de manière lâche aux cellules endotheliales planes sous-jacents. Ces cellules prolifèrent activement à former de petits agrégats, et finalement se détacher et flotteur (Figures 2A et 3A). Cellules sanguines vivantes peuvent être distingués visuellement des cellules mortes et mourantes en fonction de leur capacité à réfléchir la lumière et se développer dans des conditions de culture.
5. Analyse des Hemogenic endothélium (HE) stade de différenciation.
- Détecter la formation de SE entre les jours 3 et 4 de différenciation par l'observation microscopique des cellules ayant une morphologie endothéliale. Il n'y a pas de globules flottants dans la culture à ce stade de différenciation. La présence de SE peut être confirmée par coloration immunofluorescence et de débit analyse cytométrique en utilisant des anticorps VE-cadhérine, CD73, CD226 et CD43.
- Pour évaluer la formation HE par les cellules de l'utilisation de l'analyse de cytométrie en flux au jour 3et quatre jours d'une expérience. Recueillir les cellules par incubation de cultures avec commercial réactif de dissociation cellulaire (voir tableau 1) pendant 5-10 min à 37 ° C, 5% CO 2 et ensuite utiliser jusqu'à 1 x 10 5 cellules par réaction de coloration (cytométrie de flux procédure de coloration décrit dans 12).
REMARQUE: VE-cadhérine + HE cellules acquièrent expression de début hématopoïétique marqueur CD226, mais manque l'expression de CD73 et CD43 6. En revanche, les cellules ES non-expriment CD73 (figures 2B, 3B).
- Pour évaluer la formation HE par les cellules de l'utilisation de l'analyse de cytométrie en flux au jour 3et quatre jours d'une expérience. Recueillir les cellules par incubation de cultures avec commercial réactif de dissociation cellulaire (voir tableau 1) pendant 5-10 min à 37 ° C, 5% CO 2 et ensuite utiliser jusqu'à 1 x 10 5 cellules par réaction de coloration (cytométrie de flux procédure de coloration décrit dans 12).
- Immunofluorescence pour HE HPSC dérivés.
- Laver la monocouche attachée de cellules avec un tampon phosphate salin (PBS) et fixer ensuite les cellules dans du paraformaldéhyde 4% entre 30 et 60 min à température ambiante.
- Laver les cellules à nouveau avec du PBS puis perméabilisent utilisant 0,1% de Triton X-100 dans du PBS pendant 20 min à température ambiante.
- Laver les cellules dans du PBS à deux trois fois, puis incuber àun tampon de blocage consistant en PBS avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS), de 30 à 120 min.
- Préparer la solution de coloration, contenant à la fois des anticorps primaires (1: 1000 dilution) de souris CD43 anti-humain de lapin et anti-VE-cadhérine humaines dans du PBS avec 5% de FBS, (tableau 1).
- Aspirer le tampon de blocage à partir des cellules et ajouter 1 ml par puits de tampon de coloration avec les anticorps primaires a été ajoutée; incuber 3 heures à température ambiante, ou une nuit à 4 ° C.
- Laver les cellules trois fois en ajoutant 2 ml de PBS avec 5% de FBS.
- Préparer un deuxième tampon de coloration, contenant des anticorps secondaires à dilution 1: 500 dans du PBS avec 5% de FBS: âne anti-lapin conjugué à un colorant fluorescent vert, et anti-souris conjugué à un colorant fluorescent rouge (Tableau 1). Ajouter 1 ml par puits de tampon de coloration secondaire et incuber à température ambiante pendant 1 heure.
- Laver trois fois avec du PBS sans sérum. Cellules tache avec une solution 300 nM DAPI travail en DH2 O pendant 10-15 min.
- Laver les cellules avec du PBS deux fois et ajouter 2-3 ml de PBS dans le puits avec des cellules colorées. Observer la fluorescence avec des filtres de microscope vert, rouge et bleu.
6. Analyse des précurseurs hématopoïétiques induits
- Maintenir des cultures de cellules flottantes jusqu'à ce que la différenciation se dilatent de manière significative, jusqu'à 10-14 jours, en changeant la moitié de la 3F-moyen, tel que décrit au paragraphe 3.1, tous les deux jours.
- Dissociation de différenciation et de recueillir des monocouches de cellules par traitement de cellules avec un réactif de dissociation cellulaire du commerce (voir tableau 1) pendant 5-10 min à 37 ° C, 5% CO 2.
- Effectuer cytométrie de flux utilisant des anticorps anti-VE-cadhérine, anticorps CD43 et CD45 pour évaluer l'hématopoïèse dans les cultures 12. Notez qu'une fraction importante de cellules, jusqu'à 40% des cellules ETV2 et GATA2 transduites, co-exprime VE-CAD et CD43. Les anticorps suivants peuvent être utilisés pour détecter des lignées cellulaires spécifiques suivantes eXpansion ou la différenciation des progéniteurs sanguins induites: CD235a (cellules érythroïdes), CD41a (mégacaryocytes), CD32 (tous les types de cellules myéloïdes), CD66b (neutrophiles) et CD163 (macrophages).
- Effectuer CFC-dosage clonogénique en utilisant un milieu commercial (Tableau 1) selon les instructions du fabricant.
- Transfert 1-2 x 10 4 cellules dans 3 ml de milieu donogene commerciale (voir tableau 3) pour évaluer le nombre de cellules et de types de colonies hématopoïétiques formant colonie. Densité d'ensemencement optimale permet l'identification et l'isolement de colonies uniques qui se développent indépendamment les uns des autres et ne se chevauchent pas. La densité de semis peut varier entre les expériences en fonction de l'efficacité de différenciation, mais ne devrait pas dépasser 1 x 10 4 cellules par 1 ml de milieu donogene commerciale.
- Mélanger cellules dans un milieu donogene commerciale par tourbillonnement doux, et transférer 3 ml de suspension à deux 35 mm des plats ultra-faible attachementpour le dosage de CFC, 1,5 ml de suspension à chaque plat. Distribuer uniformément milieu et incuber à 37 ° C, 5% CO 2 pendant 14 jours. Éviter de perturber les plats; observer la formation de colonies sur les jours 7 et 10 de dosage.
- Identifier et compter les colonies hématopoïétiques selon leurs morphologies sur 14 jours.
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Representative Results
Le schéma de SE et l'induction de sang de hPSCs par la surexpression de facteurs de transcription est montré dans la figure 1. ETV2 avec GATA1 ou GATA2 combinaison induit hématopoïèse pan-myéloïde, tandis qu'un GATA2, TAL1 +/- combinaison LMO2 induit hématopoïèse principalement érythro-mégacaryocytaire. Les deux combinaisons de TF directement induites cellules ES qui ont transformé ensuite en progéniteurs sanguins avec un spectre distinct de la différenciation hématopoïétique. Différenciation des hPSCs de l'état pluripotent au sang produisant Il prend en moyenne 4 jours. Globules ronds émergent d'abord par jour 5 de différenciation. Par la suite, de nombreux globules flottants apparaissent et se développer dans les cultures. Afin de maximiser le nombre de globules flottante, cultures post-transduction peut être prolongée à 10-14 jours. La lignée de cellules désiré peut être étendue dans des conditions de faible adhérentes avec la combinaison appropriée de cytokines hématopoïétiques. Figure 2 demonstrates l'induction de sang de hPSCs utilisant ETV2 et GATA1 ou Gata2 TF. Suite à la transduction avec ETV2 et GATA2, les cellules endothéliales prennent une morphologie typique par jour 4 de la différenciation, et finalement se transforment en cellules sanguines rondes (8.6 jour de différenciation (figure 2A). Les cellules recueillies sur les jours 3 à 4 montrent une différenciation de typique VE-cadhérine + CD226 + CD73 -. HE phénotype (figure 2B, 3B) Au jour 7 de la différenciation de plus de 50% des CFC-dosages de GATA2 / ETV2 VE-cadhérine + des cellules acquérir le CD43 hématopoïétique + phénotype (figure 2C). cellules induites révèlent que les colonies sont composées de haute potentiel prolifératif (HPP) CFC, érythroïde (E) les CFC, les macrophages (M) CFC, et des granulocytes (G) CFC (figure 2E). La différenciation hematoendothelial dans hPSCs suivante surexpression de GATA2 et TAL1 seul ou avecLMO2 est montré dans l'étape Figure 3. Il est le plus identifié dans les cultures avec GATA2 et TAL1. L'ajout de LMO2 accélère la différenciation et il contracte nettement scène. La combinaison de GATA2 et TAL1 seul ou avec LMO2 démontre la différenciation et la maturation des progéniteurs sanguins pour la plupart des cellules érythroïdes et mégacaryocytaires la figure 3D et 3E. La figure 4 montre l'optimisation de l'efficacité de transduction dans H1 hESC en utilisant GFP lentivirus (A) et la mort cellulaire et de l'efficacité de la différenciation dans cultures transduites avec GATA2 / TAL1 / LMO2 à haute et basse MOI.
Figure 1:. Schéma de protocole pour l'induction de cellules endothéliales et de sang hemogenic via l'expression forcée de TFS Cartoon décrit les principales étapes et les échéances expérimentales. Après la préparation de la suspension de cellule unique, hPSCs sont transduites avec TFs et ensemencées sur la matrice dans un milieu complet dépourvu de sérum du commerce. Le lendemain, milieu est remplacé par le facteur de croissance moyen commerciale libre complété avec bFGF, TPO et SCF (3F moyenne). Après 3-4 jours de culture, Il est formé. Par la suite, SE subit endothéliales de transition hématopoïétiques avec formation de cellules sanguines multiples.
Figure 2:. ETV2 / différenciation induite de GATA2-de hPSCs (A) des images à contraste de phase de ETV2 / différenciation induite GATA2-H1 dans CSEh aux jours 2, 4, 6 et 8 après transduction; La barre d'échelle, 100 um. (B) Débit d'analyse cytométrique de ETV2 / cellules induite Gata2-subissant endothéliale à la transition hématopoïétique au jour 3 de la différenciation: VE-cadhérine + HE cellules expriment CD226 et manquent expression de CD73. Un petit pourcentage de cellules endothéliales expriment CD73 (non-HE). (C) une cytométrie en fluxnalyse des ETV2 / GATA1- et ETV2 / induite GATA2-H1 hPSCs au jour 7 post-transduction. (D) Débit d'analyse cytométrique de ETV2 / cellules hématopoïétiques induite Gata2 expansées dans un milieu supplémenté avec du FBS et SCF, IL3, IL6, GM-CSF, G-CSF et l'OEB pendant 14 jours. (E) Types de colonies hématopoïétiques formés à partir ETV2 / Gata2 cellules transduites dans CFC-test et correspondant cytospins Wright-colorées représentant érythroïde (E), les macrophages (M), de granulocytes (Gr) et High prolifératives colonies potentiels (centrales hydroélectriques). Les barres d'échelle pour le CFC-dosage, 250 um, pour cytospins, 20 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3:. GATA2 / TAL1 et / TAL1 / différenciation des hPSCs induite LMO2-GATA2 (A) des images à contraste de phase de GATA2 / TAL1 / LMO2différenciation induite dans CSEh H1 à jour 2, 4, 6 et 8; La barre d'échelle, 100 um. (B) Débit d'analyse cytométrique de cellules / TAL1 induites Gata2 subissant endothéliale à la transition hématopoïétique au jour 3 de la différenciation: VE-cadhérine cellules + acquièrent expression de HE marqueur CD226. Un petit pourcentage de cellules endothéliales expriment CD73 (non-HE). (C) de coloration immunofluorescente de GATA2 / TAL1 différenciation induite par H1 hESC, 5 jours; VE-cadhérine + cellules (vert) acquièrent expression de CD43 marqueur hématopoïétique (rouge). (D) Débit d'analyse cytométrique de GATA2 / TAL1 / LMO2-induite cultures hématopoïétiques en suspension sur 14 jours post-transduction suivantes expansion milieu sans sérum complété avec SCF, TPO, l'OEB et bFGF; (E) Les types de colonies hématopoïétiques formées dans CFC-essai par GATA2 / TAL1 / LMO2 cellsand différenciée lames de cytocentrifugation colorées représentant Wright-érythroïde (E), des macrophages (M), et M correspondantegakaryocytes (MK). Les barres d'échelle pour le CFC-dosage, 250 um, pour cytospins, 20 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: Optimisation de la procédure lentiviral de transduction (A) transduction de CSEh H1 avec différents MOI de GFP lentivirus.. (B) la viabilité cellulaire et l'efficacité de la différenciation dans les cultures transduites avec GATA2 / TAL1 / LMO2 à faible (1 pour chaque virus) et haute (2 pour chaque virus) MOI.
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Discussion
La méthode décrite ci-dessus pour la différenciation hématopoïétique de hPSCs par la surexpression de TFS, représente une approche rapide et efficace pour la génération de SE et myéloïdes et erytho-magakaryocytic progéniteurs de CSEh et CSPi, permettant ainsi la production de jusqu'à 30 millions de cellules de sang de un million de cellules souches pluripotentes 10. Cette méthode présentait différenciation cohérente dans de multiples lignées de CSEh et CISP 10. Au cours de la différenciation par ETV2 et GATA2, facteurs de GATA1 ainsi que les facteurs de Gata2 et TAL1, cellules forment le sang production endothélium, HE et subissent une endothélium à la transition hématopoïétique. Formation de SE est généralement observée entre les jours 3 et 4 de la différenciation. Ajout de LMO2, un co-facteur de transcription de TAL1, à l'GATA2 et la combinaison TAL1, augmenté de manière significative la robustesse de la différenciation, tandis que l'étage, il est devenu nettement contracté.
Le succès de différenciation dirigéetion de hPSCs par des facteurs de transcription dépend principalement de (i) une fourniture efficace d'acides nucléiques dans des cellules, (ii) la viabilité cellulaire suivant les manipulations génétiques, et (iii) une traduction efficace des produits de transcription exogènes à l'intérieur de la cellule.
L'une des étapes principales du procédé décrit est la production d'unités lentiviraux efficaces, qui dépend d'un tampon pH précis pour HEK 293T transfection cellulaire, et l'absence de contaminants d'endotoxine à toutes les étapes de production et d'expériences de transduction virale. L'intégrité de toutes les constructions, y compris l'emballage et enveloppe plasmides, doit être vérifiée si aucun signe de production virale dans les cellules 293T HEK est observé 13.
La conception du protocole de différenciation en utilisant des combinaisons de facteurs de transcription doit tenir compte de plusieurs variables. Grande efficacité de la transduction virale est important pour la différenciation réussie. Étant donné que l'efficacité de transduction dépend de la méthode utilisée pour les virusla production et la purification, HPSC optimiser la transduction en utilisant un vecteur lentiviral GFP est recommandé (figure 4A). L'intégration virale transduction suivante doit être vérifiée à l'aide de PCR génomique avec des amorces spécifiques de transgènes (Tableau 3). L'optimisation de la différenciation devrait également inclure l'ajustement de la concentration lentiviral dans le mélange réactionnel. Une quantité relativement faible de virus, de 0,5 à 1 MOI, est capable d'induire la différenciation HPSC. Bien qu'un MOI plus élevé augmente l'efficacité de la différenciation, il augmente aussi la mort cellulaire (figure 4B). Étape d'optimisation supplémentaire peut inclure MOI ajustement du rapport pour chaque virus dans le mélange réactionnel. Dans GATA2 / ETV2 cultures transduction, le doublement de la MOI pour GATA2, par rapport à ETV2, augmente l'efficacité de la différenciation. Pour GATA1 / ETV2, GATA2 / TAL1 et GATA2 / TAL1 / LMO2 égale MOI pour chaque virus est optimal.
Après transduction avec FO, une vaste majorité des cellules UnderwEnt différenciation angiohematopoietic tandis que seulement un très peu de cellules conservées une morphologie indifférenciée. Depuis pSIN-EF1 vecteurs lentiviraux intègrent la résistance aux antibiotiques, traitement des cultures avec la puromycine peut être utilisé pour éliminer les cellules non différenciées résiduels.
La formation de cellules endotheliales avec des morphologies caractéristiques, et les globules rondes subséquentes, indique une différenciation réussie. En moyenne, la combinaison GATA2 / ETV2 produit 40-50% de CD43 + VE-cadhérine cellules +/- de sang par jour 9-10 de la différenciation avec jusqu'à 30% de cellules restantes VE-cadhérine + CD43 -. GATA1 / combinaison de ETV2 induit l'expression de CD43 et génère plus rapidement un plus grand nombre de cellules CD43 + par rapport à la combinaison GATA2 / ETV2. Dans ces cultures, la majorité des cellules CD43 + coexpriment la VE-cadhérine. Dans les cultures transduites avec GATA2 / TAL1, le nombre de cellules CD43 + 40- atteint habituellement50%. L'addition de LMO2 à GATA2 / TAL1 accélère et accroît sensiblement la production de sang, et se contracte sensiblement l'étape de développement endothelial.
Des dosages de formation de colonies doivent être utilisés pour déterminer la fréquence et le type de progéniteurs hématopoïétiques induits. La nature des cellules formant des colonies peut être confirmée en préparant des lames de cytocentrifugation Wright-colorées provenant de colonies individuelles. hPSCs transduction avec ETV2 et GATA2 produisent la plupart de grandes (supérieure à 0,5 mm de diamètre) à haut potentiel (HPP) colonies myéloïdes prolifératives composées de granulocytes immatures et les cellules monocytes, avec quelques cellules myéloïdes et érythroïdes matures occasionnels et les cellules mégacaryocytaires. En moyenne, plus de 80% des CFC dans GATA2 / cultures ETV2 transduites sont centrales hydroélectriques myéloïdes. En outre, ces cultures génèrent des érythroïdes et des macrophages colonies (figure 2E), qui comprennent généralement moins de 20% des CFC totaux. HPSC transduction avec ETV2 et GATA1 augmente considérablement èmee proportion de CFC-E à un maximum de 50%. TAL1 et Gata2 cultures transduites produisent principalement érythroïde (plus de 80% du total des CFC) et les colonies mégacaryocytaires (plus de 10% du total CFC) avec très peu de colonies de macrophages (moins de 5% du total CFC). L'addition de LMO2 et TAL1 à la combinaison de GATA2 augmente de manière significative la fréquence des cellules formant des colonies de mégacaryocytes potentiel érythro-10. Le modèle d'activité de CFC suivante transduction avec les combinaisons décrites de facteurs de transcription est cohérente entre les CSEh différent et lignes hiPSC 10.
En résumé, la surexpression de lentivirus médiée dans hPSCs est un outil relativement rapide et efficace pour l'induction de la SE et de sang en utilisant TF. Ce système peut également être utilisé pour évaluer la capacité de différenciation et d'autres facteurs de transcription identifier ceux qui sont nécessaires pour endotheliales et hématopoïétiques spécification. Toutefois, le protocole actuel a une utilité limitée pour les études de l'exintracellulaire de signalisation impliquées dans l'induction de HE, car il utilise TF pour contourner la signalisation médiée par les récepteurs en surface. Bien que le protocole actuel décrit la production de sang en utilisant l'expression constitutive d'un transgène, des résultats similaires pourraient être obtenus en utilisant des ARNm modifiés 10.
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Disclosures
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
Table 1. Induction of hPSCs differentiation with trancription factors and analysis of hemogenic endothelium and blood cells. |
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| pSIN4-EF1a-ETV2-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61061 | Lentiviral Vector |
| pSIN4-EF1a-GATA2-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61063 | Lentiviral Vector |
| pSIN4-EF1a-GATA1-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61062 | Lentiviral Vector |
| pSIN4-EF1a-TAL1-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61062 | Lentiviral Vector |
| pSIN4-EF1a-LMO2-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61064 | Lentiviral Vector |
| Hexadimethrine bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | 107689-10G | Cationic polymer used to increase the efficiency of infection |
| Y-27632 (Dihydrochloride) ROCK inhibitor | STEMCELL Technologies | 72302 | RHO/ROCK pathway inhibitor Inhibits ROCK |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies | A11105-01 | Cell Dissociation Reagent |
| Incomplete (growth factor- free) culture medium mTeSR1 Custom formulation | WiCell Research Institute (Madison, WI) | MCF | Serum-free mTeSR1 medium without bFGF and TGFb |
| human SCF | Peprotech | 300-07 | Premium grade |
| human TPO | Peprotech | 300-18 | Research grade |
| human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | Premium grade |
| CD144 (VE-cad) FITC | BD Biosciences | 560411 | Endothelial marker (FACS) |
| CD226 PE | BD Biosciences | 338305 | Hematopoietic (FACS) |
| CD43 PE | BD Biosciences | 560199 | Hematopoietic (FACS) |
| CD73 APC | R&D Systems | FAB5795A | Endothelial marker (FACS) |
| CD45 APC | BD Biosciences | 555485 | Hematopoietic (FACS) |
| 7AAD | Life Technologies | A1310 | Live/Dead assay (FACS) |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-500G | Cell fixation |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | Permeabilization |
| FBS | Fisher Scientific | SH3007003 | Fetal bovine serum |
| Mouse anti-human CD43 | BD Biosciences | 551457 | Pure, primary antibody for Immunofluorescence (IF) staining |
| Rabbit anti-human VE-cadherin | BenderMedSystem | BMS158 | Primary (IF) |
| Anti-rabbit Alexa Fluor 488-conjugated | JacksonResearch | 715-486-152 | Secondary (IF) |
| Anti-mouse Alexa Fluor 594-conjugated | JacksonResearch | 715-516-150 | Secondary (IF) |
| DAPI nucleic acid stain | Life Technologies | D1306 | Live/Dead assay (IF) |
| Clonogenic medium MethoCult H4435 Enriched | STEMCELL Technologies | 4435 | CFC-assay |
| Wright Stain solution | Sigma -Aldrich | 32857 | Staining cytospins |
Table 2. hPSCs culture. |
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| Human Pluripotent Stem Cells (hPSCs) | WiCell Research Institute (Madison, WI) | hESCs (WA01, WA09) human Embryonic Stem cells; iPSCs (DF-19-9-7T, DF-4-3-7T) transgene-free induced Pluripotent Stem Cells | hPSCs are able to self-renew and to differentiate into cells of three germ layers |
| Complete serum-free medium for culture of hPSCs mTeSR1 media | WiCell Research Institute (Madison, WI) | M500 | Serum-free medium with growth factors for feeder free culture of ESC/iPSCs |
| Matrigel | BD Biosciences/ Corning | 356234 | Matrix for maintenance of human ESC/iPSCs |
| DMEM/F-12, powder | Life Technologies | 12500-062 | Basal Medium |
| HyClone Dulbecco's PBS powder | Fisher Scientific | dSH30013.04 | PBS |
| Dispase II, powder | Life Technologies | 17105-041 | Neutral protease, Cell dissociation |
Table 3. Primers for detection of virus genomic integration. |
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| Primer's Name | Forward (Fwd) 5’ -->3’ | Reverse (Rev) 5’-->3’ | Discription |
| pSIN EF1a Fwd | TTC CAT TTC AGG TGT CGT GA | -- | EF1a promoter sequence |
| GATA1 Rev | -- | TCC CTG TAG TAG GCC AGT GC | Coding Region |
| GATA2 Rev | -- | GGT TGG CAT AGT AGG GGT TG | Coding Region |
| TAL1 Rev | -- | AGG CGG AGG ATC TCA TTC TT | Coding Region |
| LMO2 Rev | -- | GGC CCA GTT TGT AGT AGA GGC | Coding Region |
| ETV2 Rev | -- | GAA CTT CTG GGT GCA GTA AC | Coding Region |
References
- Zape, J. P., Zovein, A. C. Hemogenic endothelium: origins, regulation, and implications for vascular biology. Semin Cell Dev Biol. 22, 1036-1047 (2011).
- Swiers, G., Rode, C., Azzoni, E., de Bruijn, M. F. A short history of hemogenic endothelium. Blood Cells, Mol & Dis. 51, 206-212 (2013).
- Kennedy, M., et al. T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2, 1722-1735 (2012).
- Wang, L., et al. Endothelial and hematopoietic cell fate of human embryonic stem cells originates from primitive endothelium with hemangioblastic properties. Immunity. 21, 31-41 (2004).
- Rafii, S., et al. Human ESC-derived hemogenic endothelial cells undergo distinct waves of endothelial to hematopoietic transition. Blood. 121 (5), 770-780 (2012).
- Choi, K. D., et al. Identification of the hemogenic endothelial progenitor and its direct precursor in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2, 553-567 (2012).
- Vodyanik, M. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. Leukosialin (CD43) defines hematopoietic progenitors in human embryonic stem cell differentiation cultures. Blood. 108, 2095-2105 (2006).
- Wang, C., et al. TGFbeta inhibition enhances the generation of hematopoietic progenitors from human ES cell-derived hemogenic endothelial cells using a stepwise strategy. Cell Res. 22, 194-207 (2012).
- Uenishi, G., et al. Tenascin C promotes hematoendothelial development and T lymphoid commitment from human pluripotent stem cells in chemically defined conditions. Stem Cell Rep. 3, 1073-1084 (2014).
- Elcheva, I., et al. Direct induction of haematoendothelial programs in human pluripotent stem cells by transcriptional regulators. Nat Commun. 5, 4372 (2014).
- Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat Protoc. 1, 241-245 (2006).
- Vodyanik, M. A., Slukvin, I. I. Hematoendothelial differentiation of human embryonic stem cells. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 23, Unit 23.6 (2007).
- Cao, F., et al. Comparison of gene-transfer efficiency in human embryonic stem cells. Mol Imgn and Biol. 12, 15-24 (2010).
