Abstract
במהלך פיתוח, תאי hematopoietic נובעים ממשנה מיוחד של תאי האנדותל, האנדותל hemogenic (HE). פיתוח מודלים הוא במבחנה הוא חיוני למחקרים מכניסטית של מעבר אנדותל-hematopoietic ומפרט hematopoietic. כאן, אנו מתארים שיטה לזירוז יעיל של HE מתאי אנושיים pluripotent גזע (hPSCs) בדרך של ביטוי יתר של קבוצות שונות של גורמי שעתוק. השילוב של ETV2 וGATA1 או GATA2 TFS משמש כדי לגרום לו עם פוטנציאל פאן-מיאלואידית, תוך שילוב של GATA2 וגורמי שעתוק TAL1 מאפשר לייצורו עם erythroid ופוטנציאל megakaryocytic. התוספת של LMO2 לGATA2 ושילוב TAL1 משמעותית מאיצה בידול ומגבירה את ייצור תאי erythroid וmegakaryocytic. שיטה זו מספקת אמצעי יעיל ומהיר של האינדוקציה HE מhPSCs ומאפשרת לתצפית של האנדותל-hematopoietiמעבר ג בצלחת תרבות. הפרוטוקול כולל נהלי התמרה hPSCs וניתוח שלאחר התמרה-שלו ואבות דם.
Introduction
היכולת הייחודית של תאי גזע pluripotent האנושיים (hPSCs) לעצמית לחדש ולהתמיין לתאים של שלוש השכבות נבט, כוללים דם, לגרום להם כלי רב ערך עבור המחקרים מכניסטית של פיתוח hematopoietic, מודלים של מחלות דם, הקרנת סמים, מחקרים רעילים, והפיתוח של טיפולים סלולריים. בגלל היווצרות דם בתמורת העובר מהאנדותל hemogenic (HE) דרך מעבר hematopoietic אנדותל 1,2, הדור של HE בתרבויות תהיה חיוני כדי ללמוד את המנגנונים המולקולריים המסדירים את המעבר לאנדותל hematopoietic ומפרט hematopoietic. שיטות נוכחי ללימודים של HE מבוססות על האינדוקציה של בידול hematoendothelial באגרגטים (EBS) עם התוספת של ציטוקינים hematopoietic 3-5, וcoculture של hPSCs עם תאי סטרומה hematopoiesis-תומך 6,7 או בתרבויות דו ממדים עם תאי מטריצות וגytokines 8,9. שיטות הבחנה הקלאסיות אלה מבוססות על ההיכרות של אותות חיצוניים הפועלים על פני השטח של התאים וייזום מפלי מסלולים מולקולריים שסופו של דבר יובילו להפעלה של תכנית תעתיק המנחה פיתוח hematoendothelial. לפיכך, את היעילות של בידול hPSCs במערכות אלה מסתמך על אינדוקציה יעילה של אותות אלה, הולכים אותות לגרעין, והפעלה של רגולטורי תעתיק ספציפיים וכתוצאה מכך. בנוסף, המחקר של HE בתרבויות בידול קונבנציונליים דורש צעד נוסף של בידוד HE תאים באמצעות מיון תא. כאן, אנו מתארים פרוטוקול פשוט לזירוז הישיר שלו ודם על ידי ביטוי יתר של גורמי שעתוק hematopoietic. שיטה זו מאפשרת לאינדוקציה היעילה של HE בצלחת ותצפית ישירה של האנדותל למעבר hematopoietic ללא הצורך בבידוד של HE באמצעות הליך מיון תא מסורבל.
היווצרות הוא והדם מתאי גזע pluripotent אנושיים יכולים להיגרם ביעילות על ידי overexpressing רק כמה גורמי שעתוק (TFS). שילוב האופטימלי של TFS מסוגל גרימת hematopoiesis פאן-מיאלואידית החזקה מhPSCs כולל וGATA1 או GATA2 ETV2. לעומת זאת, שילוב של GATA2 וTAL1 גורם erythromegakaryocytopoiesis 10. תכנות hPSCs דרך ביטוי יתר של גורמים אלה מבדיל hPSCs ישירות לVE-CAD + CD43 - CD73 - הוא תאים שירכשו את הפנוטיפ hematopoietic שהוגדר על ידי הביטוי של CD43 סמן hematopoietic מוקדם 7 בהדרגה. שיטה זו מבוססת על lentiviral לתכנות הישיר של שיטת תאי גזע pluripotent האנושית היא ישימה עבור הדור שלו ותאי דם למחקרים מכניסטית, מחקרים של האנדותל למעבר דם, ורגולצית תעתיק של פיתוח ומפרט hematopoietic. למרות גפרוטוקול urrent מתאר ייצור דם באמצעות ביטוי מכונן של transgenes, ניתן להשיג תוצאות דומות באמצעות mRNA שונה 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנות וירוס וצירופי גורם שעתוק
- הכן את הפתרונות עם פלסמיד ביטוי lentiviral pSIN-EF1α מכיל DNA המקודדים חלבונים לETV2, GATA1, GATA2, TAL1 וLMO2 (טבלת 1).
- למדוד את הריכוז וטוהר הכנות פלסמיד המשמשות לייצור lentiviral על ידי הקלטת קליטת UV עם ספקטרופוטומטר ב 230 ננומטר, 260 ננומטר, ו -280 ננומטר. הערה: הכנות DNA A260 / 280 וA260 / 230 ערכי הוכחה גדולים יותר מאשר 1.8 נחשבים בדרך כלל באיכות טובה. A260 / 280 ערכים נמוכים עלולים להצביע על זיהום חלבון, בעוד A260 / 230 ערכים נמוכים מצביעים על זיהומים עם מלחים או כמה כגון פנול הממס. ריכוז פלסמיד מומלץ הוא 1-3 מיקרוגרם / μl.
- לייצר lentiviruses לtransductions כפי שתואר בפרוטוקולים שפורסמו בעבר 11. אינדוקציה שלו עם פוטנציאל פאן-מיאלואידית דורשת שיתוף ביטוי של ETV2 וGATA1, או ETV2 וGATA2.אינדוקציה שלו עם פוטנציאל erythro- וmegakaryocytic דורשת GATA2 וTAL1. התוספת של LMO2 משפרת באופן משמעותי את התשואה של תאי erythro-megakaryocytic מhPSCs בנוכחות GATA2 וTAL1 10.
2. hPSCs תרבות פרוטוקול
- לגדל תאי גזע pluripotent במושבות הדוקות עם קצוות חדים לconfluency 70-80% לפני subculturing. מארק ולהסיר הבדיל מושבות באופן ספונטני לפני passaging תאים.
- לדלל ג'ל המסחרי תאי מטריצה (ראה טבלה 2) על פי הוראות היצרן וצלחות מעיל 6-גם הלילה ב 4 ° C, או לפחות שעה אחת על 37 מעלות צלזיוס לפני השימוש. לפני passaging תאים, לשאוב את המטריצה, להוסיף 2 מיליליטר של culturemedium המלא המסחרי הטרי (ראה טבלה 2) ולשמור על צלחות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עד התאים מוכנים לזריעה.
- hPSCs מעבר
- ASPIRAבינוני te מטוב אחד ומחוברות של 6-גם צלחת עם hPSCs ולהוסיף 1.5 מיליליטר של תמיסת Dispase השני מראש חימם (2 מ"ג / מיליליטר בDMEM / F12, מעוקר על ידי סינון דרך 0.22 מיקרומטר מסננים). דגירה 5-7 דקות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עד הקצוות של מושבות להתחיל להרים מהמשטח.
- פתרון לשאוב Dispase השני ובזהירות לשטוף את המושבות פעמיים על ידי הוספה ולאחר מכן aspirating 2 מיליליטר של מדיום DMEM / F12 הטרי. לאחר מכן, באמצעות פיפטה זכוכית סרולוגיות 5 מיליליטר, לנתק hPSCs עם 3 מיליליטר של מדיום תרבות השלמה מסחרי טרי (ראה טבלה 2) על ידי pipetting השעיה תא למעלה ולמטה מספר פעמים.
- הוסף 0.5 מיליליטר של השעיה תא היטב בכל צלחת 6-היטב המכילה 1.5 מיליליטר של מדיום תרבות השלמה המסחרי (ראה טבלה 2). להתסיס את צלחת קדימה ואחורה וזכות מספר פעמים שמאלי כדי להבטיח חלוקת תא אחידה כאשר למקם את הצלחת לתוך החממה. שמור את התאים על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ל18-24 שעות.
- שינוי היום הבינוני הבאה למדיום תרבות השלמה מסחרי טרי (ראה טבלה 2) ולבחון את מורפולוגיה hPSCs. תוצאות passaging מוצלחות במושבות קטנות, מצורפים היטב שמירת מורפולוגיה hPSC. hPSCs חייב להיות מוזן עם 2.5-3 מיליליטר freshmedium לכל גם על בסיס יומי וpassaged כל 4-5 ימים בלא יותר ממפגש 70-80%.
הערה: אם hiPSCs נשמרו על fibroblasts העכבר העוברי (MEFs), הם צריכים להיות מועברים לתנאים ללא מזין וpassaged 2-3 פעמים לפני שהתמרה כדי להבטיח בידול יעיל.
3. אינדוקציה של Hematoendothelial Pprecursors מhPSCs (יום 0, התמרה של hPSCs)
- להכין מדיום תגובה לשלב 1.3 מיליליטר של מדיום סרום ללא שלם מסחרי (ראה טבלה 2), וירוס, polybrene, ומעכב Y27632 ROCK (טבלת 1): להוסיף 1.3 μl של מעכבי ROCK 10 מ"מ 1.3 מיליליטר בינוני עד Concentra סופיtion של 10 מיקרומטר, וpolybrene למיקרוגרם / מיליליטר ריכוז 6 סופי.
- להוסיף כמות מתאימה של תרכיז נגיפי (ים) בריכוז סופי של 0.5-1.0 משרד הפנים (ריבוי של זיהום) של כל וירוס לכל תא. שמור בינוני תגובה על קרח או על 4 מעלות צלזיוס עד ההשעיה התא הבודד מוכנה.
הערה: אותו הסכום של משרד הפנים לכל וירוס בGATA1 / ETV2, GATA2 / TAL1, ותערובות GATA2 / TAL1 / תגובת LMO2 הוא אופטימלית לאינדוקציה של בידול. תרבויות עם זאת, בETV2 / GATA2 transduced הכפלת משרד הפנים לGATA2, ביחס לETV2, משפרת בידול. לכן, לתרבויות אלה, יחס 1: 2 למשרד פנים של ETV2 ומשרד הפנים של 1 GATA2 מומלץ (למשל, אם להתרכז ויראלי מוערך בכ 6.8 x 10 7 מיליליטר / חלקיקים, להוסיף 10 μl של ETV2 ו -20 μl של תרכיזים נגיפיים GATA2 ל 0.68 x 10 6 תאים לכל תגובת ETV2 / GATA2 אחד בבאר 35 מ"מ של צלחת 6-היטב).
- להוסיף כמות מתאימה של תרכיז נגיפי (ים) בריכוז סופי של 0.5-1.0 משרד הפנים (ריבוי של זיהום) של כל וירוס לכל תא. שמור בינוני תגובה על קרח או על 4 מעלות צלזיוס עד ההשעיה התא הבודד מוכנה.
- הכן hPSCs בתליוני תא בודדיםension.
- לגדול hPSCs בתנאים ללא מזין כפי שתואר בסעיף 2. ביום 4 בעקבות המעבר האחרון, להתבונן צפיפות תאים ומורפולוגיה תחת מיקרוסקופ הפוכה. hPSCs צריך לגדול במושבות הדוקות עם קצוות חדים ללא התמיינות ספונטנית ולהגיע ~ confluency 60-70% ביום של התמרה.
- בינוני לשאוב, להוסיף 1.5-2 מיליליטר של מגיב תא דיסוציאציה המסחרי (טבלה 1) לכל היטב ולדגור על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 5-7 דקות.
- איסוף תאים לכמויות שווה של מדיום שלם מסחרי (ראה טבלה 2) עם 10 מיקרומטר של מעכבי ROCK, לספור את התאים ולקבוע את הכדאיות. תאים גלולה על ידי צנטריפוגה XG 200 במשך 5 דקות ולאחר מכן resuspend תאים בינוניים שלם מסחרי עם 10 מיקרומטר של מעכבי ROCK לריכוז של 3.4-5 x 10 6 תאים לכל מיליליטר.
הערה: כדאיות תא היא קריטיות עבור התמרה ויראלי מוצלחת ובידול שלאחר מכן.בדרך כלל, כדאיות תא לפני התמרה יעלה על 90%.
- הוסף 200 μl של ההשעיה התא, המכיל תאי .68-1 x10 6, ל1.3 מיליליטר של מדיום התגובה שהוכן ב3.1.
- לשאוב את פתרון המטריצה מצלחת 6-היטב מצופה הלילה הערוך 2.2., להעביר את תערובת התגובה לטובה אחד של צלחת 6-היטב ולהפיץ תאים באופן שווה. לדגור על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 למשך 24 שעות. לאחר 24 שעות לפחות 80% מהתאים צריכים להיות מחוברים למטריצה.
4. אינדוקציה של Hematoendothelial מבשרי מhPSCs (יום 1-7)
- 24 שעות לאחר התמרה-, להסיר בינוני המכיל וירוס ולשטוף תאים מצורפים עם מדיום תרבות תא שלם מסחרי (ראה טבלה 1) ולאחר מכן להוסיף 3 מ"ל לכל טוב של מדיום תרבות תא שלם מסחרי המכילים ציטוקינים hematopoietic: SCF 100 ng / ml, TPO 50 מיליליטר ng /, bFGF 20 ng / ml (להלן כ3F-בינוני).
- החלף בינוני מוחלט עם 3F-בינוני טרי בימים 2, 3 ויום 4 להסרת תאים מתים ופסולת. לאחר יום 4, כאשר תאי hematopoietic צפים הם מתעוררים, להחליף מחצית מ3F-הבינוני בכל יום אחר, תוך השמירה על הנפח הכולל ב 4 מיליליטר.
הערה: פלסמידים ביטוי lentiviral pSIN-EF1α לשלב גן התנגדות puromycin ובכך לאפשר לסלקציה חיובית של תאי transduced. 1 מיקרוגרם / מיליליטר של puromycin ניתן להוסיף עד בינוני במהלך 1-2 הימים הראשונים של בידול לחסל את כל hPSCs מובחן שייר. - שים לב מורפולוגיה תא ביום 4 תחת מיקרוסקופ הפוכה: אשכולות צפופים של תאים עם מורפולוגיה האנדותל טיפוסית מתחילים להופיע (2A דמויות, 3A). תאי דם עגולים מופיעים מיום 5 ליום 7 של בידול, ואילו באזורים מסוימים עשויים לשמור מורפולוגיה hPSCs. לנתח הוא ובידול hematopoietic כמתואר להלן.
הערה: שונה hematoendothelial מוצלחiation תוצאות בייצור של תאי דם המופיעים תאים עגולים refractile כפי שצורף לתאי האנדותל שטוחים בסיס רופף. תאים אלה באופן פעיל להתרבות יוצרים אגרגטים קטנים, וסופו של דבר לנתק ולצוף (2A דמויות ו3A). תאי דם בשידור חי יכולים להיות מכובדים מבחינה ויזואלית מהתאים המתים וגוססים מבוססים על היכולת שלהם כדי לשקף את האור ולהרחיב בתנאי תרבות.
5. ניתוח של שלב האנדותל (HE) Hemogenic של בידול.
- זיהוי היווצרות HE בין ימים 3 ו -4 של בידול על ידי תצפית מיקרוסקופית של תאים עם מורפולוגיה האנדותל. אין תאי דם צפים בתרבות, בשלב זה של בידול. נוכחות שהוא יכול להיות מאושר על ידי צביעת immunofluorescent וזרימת ניתוח cytometric באמצעות נוגדני VE-cadherin, CD73, CD226 וCD43.
- כדי להעריך היווצרותו על ידי תאי שימוש ניתוח התזרים cytometric ביום 3ויום 4 מניסוי אחד. איסוף תאים על ידי דוגרים של תרבויות עם מגיב תא דיסוציאציה מסחרי (ראה טבלה 1) למשך 5-10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ולאחר מכן להשתמש עד 1 x 10 5 תאים לכל תגובה מכתימה (cytometry זרימת ההליך מכתים המתוארים ב 12).
הערה: VE-cadherin + HE תאים לרכוש ביטוי של CD226 סמן hematopoietic מוקדם, אבל חוסר הביטוי של CD73 וCD43 6. לעומת זאת, תאים שאינם HE להביע (2B דמויות, 3B) CD73.
- כדי להעריך היווצרותו על ידי תאי שימוש ניתוח התזרים cytometric ביום 3ויום 4 מניסוי אחד. איסוף תאים על ידי דוגרים של תרבויות עם מגיב תא דיסוציאציה מסחרי (ראה טבלה 1) למשך 5-10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ולאחר מכן להשתמש עד 1 x 10 5 תאים לכל תגובה מכתימה (cytometry זרימת ההליך מכתים המתוארים ב 12).
- מכתים immunofluorescence כי הוא נגזר hPSC.
- שטוף את monolayer המצורף של תאים עם מי מלח פוספט (PBS) ולאחר מכן לתקן תאים בparaformaldehyde 4% 30-60 דקות בטמפרטורת חדר.
- לשטוף את תאים שוב עם PBS ולאחר מכן Permeabilize באמצעות 0.1% Triton X-100 ב PBS במשך 20 דקות בטמפרטורת חדר.
- לשטוף את התאים בPBS שני שלוש פעמים ולאחר מכן דגירה בחסימת מאגר בהיקף של PBS עם 10% בסרום שור עוברי (FBS), למשך 30 עד 120 דקות.
- הכן פתרון מכתים, המכיל את שני נוגדנים ראשוניים (1: 1,000 דילול) CD43 אנטי אנושי בעכבר וארנב אנטי אנושי VE-cadherin בPBS עם FBS 5%, (טבלה 1).
- לשאוב את מאגר החסימה מהתאים ולהוסיף 1 מיליליטר לכל טוב של חיץ מכתים עם הנוגדנים העיקריים הוסיפו; דגירה 3 שעות בטמפרטורת חדר, או הלילה ב 4 מעלות צלזיוס.
- שוטפים את התאים שלוש פעמים על ידי הוספת 2 מיליליטר של PBS עם 5% FBS.
- הכן חיץ מכתים שני, המכיל נוגדנים משני בשעת 1: 500 דילול ב PBS עם 5% FBS: חמור נגד ארנב מצומדות עם צבע ירוק ניאון, ואנטי עכבר מצומדות עם צבע אדום ניאון (טבלת 1). הוסף 1 מיליליטר לכל טוב של חיץ מכתים המשני ודגירה בטמפרטורת חדר למשך שעה 1.
- לשטוף שלוש פעמים עם PBS ללא סרום. תאי כתם עם 300 ננומטר DAPI עובד פתרון ב DH2 O במשך 10-15 דקות.
- לשטוף את התאים עם PBS פעמיים ולהוסיף 2-3 מיליליטר של PBS לתוך היטב עם תאים מוכתמים. שים לב הקרינה עם מסנני מיקרוסקופ ירוקים, אדום וכחול.
6. ניתוח של מבשרי Hematopoietic המושרה
- לשמור על תרבויות בידול עד תאים צפים להרחיב באופן משמעותי, עד 10-14 ימים, שינוי מחצית 3F-הבינוני, כפי שתוארו בסעיף 3.1, בכל יומיים.
- לנתק ולאסוף ההבחנה monolayers של תאים על ידי טיפול בתאים עם מגיב תא דיסוציאציה המסחרית (ראה טבלה 1) למשך 5-10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- לבצע cytometry זרימה באמצעות אנטי VE-cadherin-, נוגדני CD43 וCD45 להעריך hematopoiesis בתרבויות 12. שים לב שחלק גדול של תאים, עד 40% מתאי ETV2 וGATA2 transduced, שיתוף מבטא VE-CAD וCD43. הנוגדנים הבאים יכולים לשמש כדי לזהות שושלות תאים ספציפיות הבאים דוארxpansion או בידול של אבות דם מושרה: CD235a (תאי erythroid), CD41a (megakaryocytic), CD32 (כל סוגי תאי מיאלואידית), CD66b (נויטרופילים) וCD163 (מקרופאגים).
- בצע CFC-assay באמצעות מדיום מסחרי clonogenic (טבלת 1) על פי הוראות היצרן.
- העבר 1-2 x 10 4 תאים לתוך 3 מיליליטר של מדיום clonogenic המסחרי (ראה טבלה 3) כדי להעריך את מספר תאי מושבה יוצרים וסוגים של מושבות hematopoietic. צפיפות זריעה אופטימלית מאפשרת זיהוי והבידוד של מושבות אחת שגדלות בנפרד זה מזה ואינו חופף. צפיפות זריעה עשויה להשתנות בין ניסויים בהתאם ליעילות בידול, אבל לא תעלה על 1 x 10 4 תאים לכל 1 מיליליטר של מדיום clonogenic המסחרי.
- מערבבים תאים בינוניים clonogenic המסחרי על ידי vortexing העדין, ולהעביר 3 מיליליטר של השעיה לשני מנות של 35 מ"מ מצורף נמוכות במיוחדעבור assay CFC, 1.5 מיליליטר של השעיה לכל מנה. להפיץ בינוני באופן שווה ולדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 14 יום. להימנע מלהפריע המנות; להתבונן הקמת מושבה ביום 7 ויום 10 של assay.
- לזהות ולספור מושבות hematopoietic לפי המורפולוגיות ביום 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
התרשים סכמטי של הוא ואינדוקצית דם מhPSCs ידי ביטוי יתר של גורמי שעתוק מוצג באיור 1. ETV2 עם שילוב GATA1 או GATA2 גורם hematopoiesis פאן-מיאלואידית, בעוד GATA2, TAL1 +/- שילוב LMO2 גורם hematopoiesis בעיקר erythro-megakaryocytic. שני שילובי TF ישירות מושרה תאיו שהפכו בהמשך לאבות דם עם ספקטרום שונה של בידול hematopoietic. בידול של hPSCs ממדינת pluripotent לדם הפקה הוא לוקח על 4 ימים בממוצע. תאי דם עגולים יוצאים ראשון ביום 5 של בידול. בהמשך לכך, תאי דם צפים רבים מופיעים ולהרחיב בתרבויות. כדי למקסם את מספר תאי דם צף, יכולה להיות ממושכות תרבויות הודעה התמרה-ל10-14 ימים. השושלת הרצויה של תאים ניתן להרחיב בתנאים נמוכים חסיד עם השילוב המתאים של ציטוקינים hematopoietic. איור 2 demonstrates האינדוקציה של דם מhPSCs באמצעות ETV2 וTFS GATA1 או GATA2. בעקבות התמרה עם ETV2 וGATA2, תאים לרכוש מורפולוגיה האנדותל טיפוסית ביום 4 של בידול, וסופו של דבר להפוך לתאים עגולים דם (יום 6-8 של בידול (איור 2 א). תאים שנאספו בימים 3-4 בידול להראות טיפוסי VE-cadherin + CD226 + CD73 -. HE פנוטיפ (איור 2, 3 ב) ביום 7 של בידול יותר מ -50% מVE-cadherin + תאים לרכוש CD43 hematopoietic + פנוטיפ (איור 2 ג) CFC-מבחני של GATA2 / ETV2. תאי -induced עולים כי מושבות מורכבות של פוטנציאל (HPP) CFCs שגשוג הגבוה, erythroid (E) CFCs, מקרופאגים (M) CFCs, וגרנולוציטים (G) CFCs (איור 2E). בידול hematoendothelial בhPSCs הבא ביטוי יתר של GATA2 ו TAL1 לבד או עםLMO2 מוצג באיור 3. שלב הוא מזוהה ביותר בתרבויות עם GATA2 וTAL1. התוספת של LMO2 מאיצה בידול ובולט חוזים שעל במה. שילוב GATA2 וTAL1 לבד או עם LMO2 מדגים בידול והתבגרות של אבות דם לתאים בעיקר erythroid וmegakaryocytic איור 3D ו3E. איור 4 אופטימיזציה מופעים של יעילות התמרה בH1 hESCs באמצעות GFP lentivirus () ומוות של תאים והתמיינות ביעילות תרבויות transduced עם GATA2 / TAL1 / LMO2 במשרד פנים גבוהים ונמוכים.
איור 1:. תרשים סכמטי של פרוטוקול לאינדוקציה של תאי האנדותל ודם hemogenic דרך הביטוי הכפוי של TFS קריקטורה מתאר את צעדים ניסיוניים גדולים ולוחות זמנים. בעקבות הכנת ההשעיה תא בודדת, hPSCs הם transduced עם TFים וזורע על מטריצה במדיום סרום ללא מסחרי מלא. למחרת, בינוני מוחלף במדיום מסחרי בחינם גורם גדילה בתוספת bFGF, TPO וSCF (3F בינוני). בעקבות 3-4 ימים של תרבות, הוא יצר. בהמשך לכך, הוא עובר לאנדותל מעבר hematopoietic עם היווצרותם של תאי דם מרובים.
איור 2:. ETV2 בידול מושרה GATA2 / של hPSCs () בניגוד שלב תמונות של ETV2 / בידול מושרה GATA2 בH1 hESCs בימים 2, 4, 6 ו -8 לאחר התמרה; בר סולם, 100 מיקרומטר. ניתוח תזרים cytometric של תאי ETV2 / מושרה GATA2 עוברים אנדותל למעבר hematopoietic ביום 3 של בידול (B): VE-cadherin + HE תאים להביע CD226 וחסר הבעה של CD73. אחוז קטן של תאי האנדותל להביע CD73 (לא HE). (ג) תזרים cytometricnalysis של ETV2 / GATA1- וETV2 / מושרה GATA2 H1 hPSCs ביום שלאחר 7 התמרה. ניתוח תזרים cytometric של תאים / hematopoietic ETV2 המושרה GATA2 הרחיבו במדיום בתוספת FBS וSCF, IL3, IL6, GM-CSF, G-CSF וEPO למשך 14 יום (ד '). (ה) סוגים של מושבות hematopoietic נוצרו מתאי ETV2 / GATA2 transduced בCFC-assay וCytospins מוכתם-רייט המקביל מייצגים erythroid (E), המקרופאגים (M), גרנולוציטים (GR) ומושבות פוטנציאל גבוה שגשוג (HPPs). ברים סולם לCFC-assay, 250 מיקרומטר, לCytospins, 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3:. GATA2 / TAL1 וGATA2 / TAL1 / בידול מושרה LMO2 של hPSCs () בניגוד שלב תמונות של GATA2 / TAL1 / LMO2בידול -induced בhESCs H1 בימים 2, 4, 6 ו -8; בר סולם, 100 מיקרומטר. ניתוח תזרים cytometric של GATA2 תאים / מושרה TAL1 עוברים אנדותל למעבר hematopoietic ביום 3 של בידול (B): VE-cadherin תאים + לרכוש ביטוי של HE סמן CD226. אחוז קטן של תאי האנדותל להביע CD73 (לא HE). מכתים Immunofluorescent של GATA2 בידול מושרה TAL1 / בH1 hESC, יום 5 (ג); VE-cadherin + תאים (ירוק) לרכוש ביטוי של CD43 hematopoietic סמן (אדום). ניתוח תזרים cytometric של GATA2 / TAL1 / (ד) LMO2 מושרה תרבויות hematopoietic בהשעיה ביום 14 לאחר התמרה-הבאים התרחבות במדיום סרום ללא תוספת SCF, TPO, EPO וbFGF; (ה) סוגים של מושבות hematopoietic נוצרו בCFC-ידי assay cellsand המובחן GATA2 / TAL1 / LMO2 המקביל Cytospins מוכתם-רייט מייצג erythroid (E), המקרופאגים (M), וMegakaryocytes (ח"כ). ברים סולם לCFC-assay, 250 מיקרומטר, לCytospins, 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: אופטימיזציה של הליך התמרה lentiviral התמרה () של H1 hESCs עם משרד הפנים של lentivirus GFP שונה.. (ב) כדאיות תא ויעילות הבידול בתרבויות transduced עם GATA2 / TAL1 / LMO2 בנמוך (1 לכל וירוס) וגבוה (2 לכל וירוס) משרד הפנים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיטה מתוארת לעיל לבידול hematopoietic של hPSCs ידי ביטוי יתר של TFS, מייצגת גישה מהירה ויעילה לייצור הוא ואבות מיאלואידית וerytho-magakaryocytic מhESCs וiPSCs, ובכך לאפשר את ייצור תאי דם עד 30 מיליון מ תאי גזע pluripotent מיליון 10. שיטה זו הציגה בידול עקבי בקווי hESC וiPSCs מרובים 10. במהלך בידול על ידי ETV2 וGATA2, גורמי GATA1 כמו גם גורמי GATA2 וTAL1, תאי האנדותל דם יוצרים הפקה, הוא ולעבור האנדותל למעבר hematopoietic. היווצרות הוא בדרך כלל נצפתה בין ימים 3 ו -4 של בידול. תוספת של LMO2, גורם שיתוף תעתיק של TAL1, לGATA2 ושילוב TAL1, גדלה באופן משמעותי על חוסנו של בידול, ואילו הפכה את הבמה הוא נדבק במידה ניכרת.
ההצלחה של דיפרנציאלי מכווניםtion של hPSCs ידי גורמי שעתוק בעיקר תלוי ב( i) משלוח יעיל של חומצות גרעין לתאים, (ii) כדאיות תא הבאים מניפולציות גנטיות, וכן (iii) תרגום יעיל של תמלילים אקסוגניים בתוך התא.
אחד הצעדים המרכזיים של השיטה המתוארת הוא הייצור של יחידות lentiviral יעילות, אשר תלוי בחיץ pH מדויק לtransfection תא HEK 293T, והעדר מזהמי רעלן פנימי בכל השלבים של ניסויי ייצור והתמרה ויראלית. השלמות של כל המבנים, כוללים פלסמידים אריזה ומעטפה, יש לוודא אם אין סימנים של ייצור נגיפי בתאי 293T HEK הוא ציין 13.
עיצוב פרוטוקול הבידול באמצעות שילובים של גורמי שעתוק צריך לשקול מספר משתנה. יעילות גבוהה של התמרה ויראלית היא חשובה לבידול מוצלח. מאז יעילות התמרה תלויה בשיטה המשמש לוירוסייצור וטיהור, לייעל התמרה hPSC באמצעות וקטור GFP-lentiviral מומלץ (איור 4 א). התמרה שילוב ויראלי הבאה צריכה להיות מאומת באמצעות PCR עם פריימרים הגנומי transgene הספציפי (לוח 3). בידול אופטימיזציה צריכה לכלול גם התאמה של ריכוז lentiviral בתערובת התגובה. כמות נמוכה יחסית של וירוס, משרד הפנים של 0.5-1, הוא מסוגלת גרימת בידול hPSC. בעוד משרד הפנים גבוהים יותר מגביר את היעילות של בידול, זה גם מגביר תא מוות (איור 4). צעד אופטימיזציה נוסף יכול לכלול התאמת יחס משרד הפנים עבור כל וירוס בתערובת התגובה. בGATA2 / ETV2 transduced תרבויות, הכפלת משרד הפנים לGATA2, ביחס לETV2, מגדיל את היעילות של בידול. לGATA1 / ETV2, GATA2 / TAL1 וGATA2 / TAL1 / LMO2 משרד הפנים שווים לכל וירוס הוא אופטימלי.
בעקבות התמרה עם TFS, רוב מכריע של תאי underwאף אוזן גרון בידול angiohematopoietic בעוד רק מעטים תאים נשמרים מורפולוגיה מובחנת. מאז וקטורי lentiviral pSIN-EF1α לשלב עמידות לאנטיביוטיקה, טיפול בתרבויות עם puromycin יכול לשמש כדי לחסל את תאים שלא עברו התמיינות שייר.
ההיווצרות של תאים עם מורפולוגיות אופייניות אנדותל, תאי דם וסיבוב שלאחר מכן, מצביעה על בידול מוצלח. בממוצע, שילוב GATA2 / ETV2 מייצר 40-50% של CD43 + VE-cadherin תאי +/- דם ביום 9-10 בידול עם עד 30 תאי% הנותרים VE-cadherin + CD43 -. GATA1 / שילוב ETV2 גורם ביטוי CD43 במהירות רב יותר ומייצר מספר גדול יותר של CD43 + תאים בהשוואה לשילוב GATA2 / ETV2. בתרבויות אלה, רוב CD43 + תאי coexpress VE-cadherin. בתרבויות transduced עם GATA2 / TAL1, מספר CD43 + התאים בדרך כלל מגיע 4050%. התוספת של LMO2 לGATA2 / TAL1 משמעותית מאיצה ומשפרת את ייצור הדם, וניכרת חוזי שלב האנדותל של פיתוח.
יש להשתמש במבחני מושבה יוצרים כדי לקבוע את התדירות וסוג של אבות hematopoietic מושרה. הטבע של תאי מושבה יוצרים יכול להיות מאושר על ידי הכנת Cytospins מוכתם-רייט ממושבות בודדות. hPSCs transduced עם ETV2 וGATA2 לייצר (יותר מ -0.5 מ"מ קוטר) בעיקר גדולים מושבות גבוהות שגשוג פוטנציאלית (HPP) מיאלואידית המורכבת מgranulocytic בוגר ותאי monocytic, עם כמה תאים בוגרים מיאלואידית ומדי פעם erythroid ותאי megakaryocytic. על יותר מ -80% מממוצע בCFCs GATA2 / תרבויות ETV2 transduced הן HPPs מיאלואידית. בנוסף, תרבויות אלה יוצרות מושבות erythroid ומקרופאג (איור 2E), אשר בדרך כלל מהווים פחות מ -20% מCFCs הכולל. התמרה hPSC עם ETV2 וGATA1 מגבירה באופן משמעותי את החלק דואר של CFC-E של עד 50%. תרבויות transduced TAL1 וGATA2 לייצר בעיקר erythroid (יותר מ -80% מCFCs סך הכל) ומושבות megakaryocytic (יותר מ -10% מCFCs סך הכל) עם מעט מאוד מושבות מקרופאג (פחות מ -5% מCFCs סך הכל). התוספת של LMO2 לTAL1 ושילוב GATA2 מגבירה באופן משמעותי את התדירות של תאי מושבה יוצרים עם erythro-megakaryocytic פוטנציאל 10. דפוס פעילות CFC הבא התמרה עם שילובים המתוארים של גורמי שעתוק הוא עקבי בין hESC שונה וקווי hiPSC 10.
לסיכום, ביטוי יתר בתיווך lentiviral בhPSCs הוא כלי יחסית מהיר ויעיל לגיוס שלו ולדם באמצעות TFS. גם מערכת זו יכולה לשמש להערכת יכולת הבידול של TFS האחר ולזהות את אלה שנדרשים לאנדותל ומפרט hematopoietic. עם זאת, יש לו את הפרוטוקול הנוכחי שירות מוגבל ללימודים לשעברtracellular איתות מעורב בגיוס של HE, כפי שהיא משתמשת TFS לעקוף את איתות קולטן בתיווך פני השטח. אף על פי הפרוטוקול הנוכחי מתאר ייצור דם באמצעות הביטוי המכונן של transgene, ניתן להשיג תוצאות דומות באמצעות mRNAs שונה 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
IS היא בעל מניות מייסדים ויועץ לCynata.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
Table 1. Induction of hPSCs differentiation with trancription factors and analysis of hemogenic endothelium and blood cells. |
|||
| pSIN4-EF1a-ETV2-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61061 | Lentiviral Vector |
| pSIN4-EF1a-GATA2-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61063 | Lentiviral Vector |
| pSIN4-EF1a-GATA1-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61062 | Lentiviral Vector |
| pSIN4-EF1a-TAL1-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61062 | Lentiviral Vector |
| pSIN4-EF1a-LMO2-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61064 | Lentiviral Vector |
| Hexadimethrine bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | 107689-10G | Cationic polymer used to increase the efficiency of infection |
| Y-27632 (Dihydrochloride) ROCK inhibitor | STEMCELL Technologies | 72302 | RHO/ROCK pathway inhibitor Inhibits ROCK |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies | A11105-01 | Cell Dissociation Reagent |
| Incomplete (growth factor- free) culture medium mTeSR1 Custom formulation | WiCell Research Institute (Madison, WI) | MCF | Serum-free mTeSR1 medium without bFGF and TGFb |
| human SCF | Peprotech | 300-07 | Premium grade |
| human TPO | Peprotech | 300-18 | Research grade |
| human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | Premium grade |
| CD144 (VE-cad) FITC | BD Biosciences | 560411 | Endothelial marker (FACS) |
| CD226 PE | BD Biosciences | 338305 | Hematopoietic (FACS) |
| CD43 PE | BD Biosciences | 560199 | Hematopoietic (FACS) |
| CD73 APC | R&D Systems | FAB5795A | Endothelial marker (FACS) |
| CD45 APC | BD Biosciences | 555485 | Hematopoietic (FACS) |
| 7AAD | Life Technologies | A1310 | Live/Dead assay (FACS) |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-500G | Cell fixation |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | Permeabilization |
| FBS | Fisher Scientific | SH3007003 | Fetal bovine serum |
| Mouse anti-human CD43 | BD Biosciences | 551457 | Pure, primary antibody for Immunofluorescence (IF) staining |
| Rabbit anti-human VE-cadherin | BenderMedSystem | BMS158 | Primary (IF) |
| Anti-rabbit Alexa Fluor 488-conjugated | JacksonResearch | 715-486-152 | Secondary (IF) |
| Anti-mouse Alexa Fluor 594-conjugated | JacksonResearch | 715-516-150 | Secondary (IF) |
| DAPI nucleic acid stain | Life Technologies | D1306 | Live/Dead assay (IF) |
| Clonogenic medium MethoCult H4435 Enriched | STEMCELL Technologies | 4435 | CFC-assay |
| Wright Stain solution | Sigma -Aldrich | 32857 | Staining cytospins |
Table 2. hPSCs culture. |
|||
| Human Pluripotent Stem Cells (hPSCs) | WiCell Research Institute (Madison, WI) | hESCs (WA01, WA09) human Embryonic Stem cells; iPSCs (DF-19-9-7T, DF-4-3-7T) transgene-free induced Pluripotent Stem Cells | hPSCs are able to self-renew and to differentiate into cells of three germ layers |
| Complete serum-free medium for culture of hPSCs mTeSR1 media | WiCell Research Institute (Madison, WI) | M500 | Serum-free medium with growth factors for feeder free culture of ESC/iPSCs |
| Matrigel | BD Biosciences/ Corning | 356234 | Matrix for maintenance of human ESC/iPSCs |
| DMEM/F-12, powder | Life Technologies | 12500-062 | Basal Medium |
| HyClone Dulbecco's PBS powder | Fisher Scientific | dSH30013.04 | PBS |
| Dispase II, powder | Life Technologies | 17105-041 | Neutral protease, Cell dissociation |
Table 3. Primers for detection of virus genomic integration. |
|||
| Primer's Name | Forward (Fwd) 5’ -->3’ | Reverse (Rev) 5’-->3’ | Discription |
| pSIN EF1a Fwd | TTC CAT TTC AGG TGT CGT GA | -- | EF1a promoter sequence |
| GATA1 Rev | -- | TCC CTG TAG TAG GCC AGT GC | Coding Region |
| GATA2 Rev | -- | GGT TGG CAT AGT AGG GGT TG | Coding Region |
| TAL1 Rev | -- | AGG CGG AGG ATC TCA TTC TT | Coding Region |
| LMO2 Rev | -- | GGC CCA GTT TGT AGT AGA GGC | Coding Region |
| ETV2 Rev | -- | GAA CTT CTG GGT GCA GTA AC | Coding Region |
References
- Zape, J. P., Zovein, A. C. Hemogenic endothelium: origins, regulation, and implications for vascular biology. Semin Cell Dev Biol. 22, 1036-1047 (2011).
- Swiers, G., Rode, C., Azzoni, E., de Bruijn, M. F. A short history of hemogenic endothelium. Blood Cells, Mol & Dis. 51, 206-212 (2013).
- Kennedy, M., et al. T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2, 1722-1735 (2012).
- Wang, L., et al. Endothelial and hematopoietic cell fate of human embryonic stem cells originates from primitive endothelium with hemangioblastic properties. Immunity. 21, 31-41 (2004).
- Rafii, S., et al. Human ESC-derived hemogenic endothelial cells undergo distinct waves of endothelial to hematopoietic transition. Blood. 121 (5), 770-780 (2012).
- Choi, K. D., et al. Identification of the hemogenic endothelial progenitor and its direct precursor in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2, 553-567 (2012).
- Vodyanik, M. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. Leukosialin (CD43) defines hematopoietic progenitors in human embryonic stem cell differentiation cultures. Blood. 108, 2095-2105 (2006).
- Wang, C., et al. TGFbeta inhibition enhances the generation of hematopoietic progenitors from human ES cell-derived hemogenic endothelial cells using a stepwise strategy. Cell Res. 22, 194-207 (2012).
- Uenishi, G., et al. Tenascin C promotes hematoendothelial development and T lymphoid commitment from human pluripotent stem cells in chemically defined conditions. Stem Cell Rep. 3, 1073-1084 (2014).
- Elcheva, I., et al. Direct induction of haematoendothelial programs in human pluripotent stem cells by transcriptional regulators. Nat Commun. 5, 4372 (2014).
- Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat Protoc. 1, 241-245 (2006).
- Vodyanik, M. A., Slukvin, I. I. Hematoendothelial differentiation of human embryonic stem cells. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 23, Unit 23.6 (2007).
- Cao, F., et al. Comparison of gene-transfer efficiency in human embryonic stem cells. Mol Imgn and Biol. 12, 15-24 (2010).
