Abstract
Durante el desarrollo, las células hematopoyéticas se derivan de un subconjunto especializado de las células endoteliales, el endotelio hemogenic (HE). HE desarrollo Modeling in vitro es esencial para estudios mecanísticos de la transición-endotelial hematopoyético y especificación hematopoyético. Aquí se describe un método para la inducción eficiente de SE a partir de células humanas pluripotenciales (hPSCs) mediante la sobreexpresión de diferentes conjuntos de factores de transcripción. La combinación de ETV2 y GATA1 o GATA2 TFS se utiliza para inducir HE con potencial de pan-mieloide, mientras que una combinación de factores de transcripción y GATA2 TAL1 permite la producción de HE con eritroide y megacariocítica potencial. La adición de LMO2 a GATA2 y la combinación TAL1 acelera sustancialmente la diferenciación y aumenta células eritroides y megacariocíticos producción. Este método proporciona un medio eficiente y rápida de HE inducción de hPSCs y permite la observación del endotelio hematopoietic transición en una placa de cultivo. El protocolo incluye procedimientos hPSCs transducción y análisis post-transducción de SE y progenitores de sangre.
Introduction
La capacidad única de células madre pluripotentes humanas (hPSCs) para auto-renovarse y diferenciarse en células de las tres capas germinales, incluyendo sangre, que sean una herramienta valiosa para los estudios sobre el mecanismo de desarrollo hematopoyético, el modelado de enfermedades de la sangre, la detección de drogas, Los estudios de toxicidad y el desarrollo de terapias celulares. Debido a la formación de la sangre en los embriones producto de endotelio hemogenic (HE) a través de una transición hematopoyético endotelial 1,2, la generación de la ES en culturas sería esencial para estudiar los mecanismos moleculares que regulan la endotelial a la transición hematopoyético y especificación hematopoyético. Los métodos actuales para estudios de HE se basan en la inducción de la diferenciación hematoendothelial en los agregados (EBS) con la adición de citoquinas hematopoyéticas 3-5, y de cocultivo con células estromales hPSCs-hematopoyesis de apoyo 6,7 o en cultivos de dos dimensiones con extracelular matrices y moldes cytokines 8,9. Estos métodos de diferenciación clásicos se basan en la introducción de señales externas que actúan en la superficie celular y que inician cascadas de vías moleculares que eventualmente conducen a la activación de programa transcripcional guiar el desarrollo hematoendothelial. Por lo tanto, la eficiencia de hPSCs diferenciaciones en estos sistemas se basa en una inducción efectiva de esas señales, la transducción de señales al núcleo, y la activación resultante de reguladores transcripcionales específicos. Además, el estudio de HE en cultivos de diferenciación convencionales requiere la etapa adicional de aislamiento de células HE usando la clasificación de células. Aquí se describe un protocolo sencillo para la inducción directa de HE y sangre por la sobreexpresión de factores de transcripción hematopoyéticas. Este método permite la inducción eficiente de HE en un plato y la observación directa del endotelial a la transición hematopoyéticas sin la necesidad de aislamiento de HE utilizando un procedimiento de clasificación de células engorroso.
Formación de SE y la sangre a partir de células madre pluripotentes humanas pueden ser inducidas de manera eficiente mediante la sobreexpresión a pocos factores de transcripción (TFS). La combinación óptima de TFS capaces de inducir robusta hematopoyesis-pan mieloide de hPSCs incluye ETV2 y GATA1 o GATA2. En contraste, la combinación de GATA2 y TAL1 induce erythromegakaryocytopoiesis 10. Programación hPSCs través de la sobreexpresión de estos factores que diferencia hPSCs directamente a la VE-cad + CD43 - CD73 - células HE que adquieren gradualmente el fenotipo hematopoyético definirse por la expresión de principios del CD43 marcador hematopoyético 7. Este método basado en lentiviral para la programación directa del método de pluripotentes células madre humana es aplicable para la generación de HE y las células de sangre para estudios mecanísticos, estudios de endotelial a la transición hematopoyético, y la regulación transcripcional de desarrollo hematopoyético y especificación. Aunque la current protocolo describe la producción de sangre usando la expresión constitutiva de los transgenes, resultados similares podrían obtenerse utilizando ARNm modificado 10.
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Protocol
1. Virus Preparaciones y factor de transcripción Combinaciones
- Preparar soluciones con plásmido de expresión lentiviral pSIN-EF1α que contiene ADN que codifica la proteína para ETV2, GATA1, GATA2, TAL1 y LMO2 (Tabla 1).
- Medir la concentración y pureza de las preparaciones de plásmido utilizado para la producción de lentiviral mediante el registro de la absorción UV con un espectrofotómetro a 230 nm, 260 nm, y 280 nm. Nota: preparaciones de ADN demuestran A260 / 280 y A260 / 230 valores superiores a 1,8 se consideran en general de buena calidad. 280 Los valores más bajos A260 / pueden indicar contaminación de proteínas, mientras que los valores más bajos A260 / 230 indican impurezas con sales o algún disolvente tal como fenol. Concentración de plásmido recomendada es de 1 a 3 mg / l.
- Producir lentivirus para transducciones como se describe en los protocolos publicados previamente 11. La inducción de la SE con potencial de pan-mieloide requiere co-expresión de ETV2 y GATA1 o ETV2 y GATA2.La inducción de la SE con potencial de eritro- y megacariocítico requiere GATA2 y TAL1. La adición de LMO2 mejora significativamente el rendimiento de las células-eritro megacariocítica de hPSCs en presencia de GATA2 y TAL1 10.
2. Protocolo Cultura hPSCs
- Crecer células madre pluripotentes en colonias cerradas con bordes afilados para el 70-80% de confluencia antes de subcultivo. Mark y eliminar espontáneamente diferenciadas colonias antes de pases células.
- Diluir gel de matriz extracelular comercial (véase la Tabla 2) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y las placas de capa de 6 pocillos durante la noche a 4 ° C, o durante al menos una hora a 37 ° C antes de su uso. Antes de pases células, aspirar la matriz, añadir 2 ml de culturemedium completa comercial fresco (ver Tabla 2) y mantener las placas a 37 ° C, 5% de CO 2 hasta que las células están listas para la siembra.
- HPSCs Passage
- Aspirate medio de un pozo confluente de una placa de 6 pocillos con hPSCs y añadir 1,5 ml de la solución de pre-calentado dispasa II (2 mg / ml en DMEM / F12, se esteriliza por filtración a través de filtros de 0,22 micras). Incubar durante 5-7 min a 37 ° C, 5% de CO 2 hasta que los bordes de las colonias empiezan a levantar de la superficie.
- Aspirar solución de dispasa II y cuidadosamente se lavan las colonias dos veces mediante la adición de aspiración y luego 2 ml de medio DMEM / F12 fresco. Luego, utilizando una pipeta de vidrio de 5 ml serológica, se disocian hPSCs con 3 ml de medio de cultivo completo fresco comercial (véase la Tabla 2) pipeteando la suspensión celular arriba y abajo varias veces.
- Añadir 0,5 ml de suspensión celular a cada pocillo de una placa de 6 pocillos que contenía 1,5 ml de medio de cultivo completo comercial (véase la Tabla 2). Agite la placa de ida y vuelta y de derecha a izquierda varias veces para asegurar una distribución de células uniforme cuando situar la placa en la incubadora. Mantenga las células a 37 ° C, 5% de CO 2 por 108.24 h.
- El siguiente cambio medio día al medio de cultivo completo comercial fresco (ver Tabla 2) y examinar hPSCs morfología. Resultados pases acertados en pequeñas colonias, así conectados a retención HPSC morfología. hPSCs deben ser alimentados con 2.5-3 ml freshmedium por pocillo sobre una base diaria y se pasaron cada 4-5 días en no más de un 70-80% de confluencia.
NOTA: Si se mantuvieron hiPSCs en fibroblastos de embriones de ratón (MEFs), tienen que ser transferidos a condiciones de alimentación libre y pases 2-3 veces antes de transducción para asegurar la diferenciación eficiente.
3. Inducción de Hematoendothelial Pprecursors de hPSCs (día 0, la transducción de hPSCs)
- Para preparar medio de reacción se combinan 1,3 ml de medio libre de suero completa comercial (ver Tabla 2), virus, polibreno, y Y27632 inhibidor ROCA (Tabla 1): añadir 1,3 l de inhibidor ROCA 10 mM a 1,3 ml de medio a una concentración final deción de 10 m, y polibreno a una concentración final de 6 mg / ml.
- Añadir una cantidad apropiada de concentrado viral (s) a una concentración final de 0,5 a 1,0 MOI (multiplicidad de infección) de cada virus por célula. Mantener medio de reacción en hielo oa 4 ° C hasta que la suspensión de una sola célula está listo.
NOTA: La misma cantidad de MOI para cada virus en el GATA1 / ETV2, GATA2 / TAL1, y mezclas de GATA2 / TAL1 de reacción / LMO2 es óptimo para la inducción de la diferenciación. Culturas Sin embargo, en ETV2 / GATA2 transducidas duplicando MOI para GATA2, en relación con ETV2, aumenta la diferenciación. Se recomienda 2 para MOI de ETV2 y 1 MOI de GATA2 (por ejemplo, si concentrado viral se estima aproximadamente 6,8 x 10 7 partículas / ml, añadir 10 l de ETV2 y 20 l de GATA2 concentrados virales a: Por lo tanto, para estos cultivos, la relación de 1 0.68 x 10 6 células por una de las reacciones ETV2 / GATA2 en un pozo de 35 mm de una placa de 6 pocillos).
- Añadir una cantidad apropiada de concentrado viral (s) a una concentración final de 0,5 a 1,0 MOI (multiplicidad de infección) de cada virus por célula. Mantener medio de reacción en hielo oa 4 ° C hasta que la suspensión de una sola célula está listo.
- Preparar hPSCs en una sola susp celularensión.
- Crecer hPSCs en condiciones libres de alimentador como se describe en la sección 2. El día 4 a partir del último paso, observar la densidad celular y la morfología bajo un microscopio invertido. hPSCs deben crecer en colonias apretados con bordes afilados sin diferenciación espontánea y llegar a ~ 60-70% de confluencia en el día de la transducción.
- Aspirar medio, añadir 1.5-2 ml de reactivo comercial de disociación celular (Tabla 1) por pocillo e incubar a 37 ° C con 5% de CO 2 durante 5-7 min.
- Recoger las células en volúmenes iguales de medio completo comercial (ver Tabla 2) con 10 M de inhibidor de ROCK, contar las células y determinar la viabilidad. Precipitar las células por centrifugación a 200 xg durante 5 min y luego se resuspenden las células en medio completo comercial con 10 M de inhibidor de ROCK una concentración de 3.4-5 x 10 6 células por ml.
NOTA: La viabilidad celular es fundamental para la transducción viral exitosa y posterior diferenciación.Típicamente, la viabilidad celular antes de la transducción debe exceder de 90%.
- Añadir 200 l de la suspensión celular, que contiene 0.68-1 6 células x10, en 1,3 ml del medio de reacción preparada en 3.1.
- Aspirar la solución de la matriz de la placa de 6 pocillos recubiertos noche preparado en 2.2., La transferencia de la mezcla de reacción a un pocillo de una placa de 6 pocillos y distribuir uniformemente las células. Incubar a 37 ° C con 5% de CO 2 durante 24 horas. Después de 24 horas a menos 80% de las células debe estar unido a la matriz.
4. Inducción de Hematoendothelial Precursores de hPSCs (día 1-7)
- 24 horas después de la transducción, eliminar el medio que contiene virus y lavar las células unidas con medio de cultivo celular incompleta comercial (véase la Tabla 1) y luego añadir 3 ml por pocillo de medio de cultivo celular incompleta comercial que contiene citoquinas hematopoyéticas: SCF 100 ng / ml, TPO 50 ng / ml, bFGF 20 ng / ml (en adelante como 3F-medio).
- Reemplace medio total, con frescos 3F-medio en los días 2, 3 y 4 días para eliminar las células muertas y los desechos. Después del día 4, cuando están surgiendo células hematopoyéticas flotantes, reemplace la mitad del 3F-medio cada dos días, manteniendo el volumen total de 4 ml.
NOTA: pSIN-EF1α plásmidos de expresión lentiviral incorporan gen de resistencia a puromicina permitiendo de este modo para la selección positiva de las células transducidas. El 1 mg / ml de puromicina se puede añadir al medio durante los primeros 1-2 días de diferenciación para eliminar los cualquier hPSCs indiferenciadas residuales. - Observar la morfología celular en el día 4 bajo un microscopio invertido: racimos apretados de células con morfología típica endotelial comienzan a aparecer (Figuras 2A, 3A). Células de la sangre de la Ronda aparece desde el día 5 al día 7 de diferenciación, mientras que algunas zonas pueden retener hPSCs morfología. Analizar HE y la diferenciación hematopoyética tal como se describe a continuación.
NOTA: diferente hematoendothelial Exitosaiation resulta en la producción de células sanguíneas que aparecen células redondas como refráctiles débilmente unido a las células endoteliales planas subyacentes. Estas células proliferan activamente la formación de pequeños agregados, y, finalmente, separar y flotador (Figuras 2A y 3A). Glóbulos en directo se pueden distinguir visualmente de las células muertas y moribundas en función de su capacidad de reflejar la luz y ampliar en las condiciones de cultivo.
5. Análisis de Hemogenic endotelio (HE) etapa de diferenciación.
- Detectar la formación de HE entre los días 3 y 4 de la diferenciación por la observación microscópica de las células con morfología endotelial. No hay células de la sangre que flotan en el cultivo en esta etapa de diferenciación. La presencia de SE puede confirmarse mediante tinción de inmunofluorescencia y citometría de flujo análisis utilizando anticuerpos VE-cadherina, CD73, CD226 y CD43.
- Para evaluar la formación de HE by células utilizan el análisis de citometría de flujo en el día 3y 4 días de un experimento. Recoger las células por incubación de las culturas con el reactivo de disociación celular comercial (ver Tabla 1) durante 5-10 minutos a 37 ° C, 5% de CO 2 y luego usar hasta 1 x 10 5 células por reacción de tinción (citometría de flujo procedimiento de tinción se describe en 12).
NOTA: VE-cadherina + HE células adquieren expresión de principios CD226 marcador hematopoyético, pero carecen de la expresión de CD73 y CD43 6. En contraste, las células no expresan CD73 HE (Figuras 2B, 3B).
- Para evaluar la formación de HE by células utilizan el análisis de citometría de flujo en el día 3y 4 días de un experimento. Recoger las células por incubación de las culturas con el reactivo de disociación celular comercial (ver Tabla 1) durante 5-10 minutos a 37 ° C, 5% de CO 2 y luego usar hasta 1 x 10 5 células por reacción de tinción (citometría de flujo procedimiento de tinción se describe en 12).
- La tinción de inmunofluorescencia para derivados de HPSC HE.
- Lavar la monocapa adjunta de células con tampón fosfato salino (PBS) y luego fijar las células en paraformaldehído al 4% de 30 a 60 min a temperatura ambiente.
- Lavar las células de nuevo con PBS y después se permeabilizan utilizando 0,1% de Triton X-100 en PBS durante 20 min a temperatura ambiente.
- Lavar las células en PBS dos a tres veces y luego se incuban entampón de bloqueo que consiste en PBS con suero bovino fetal al 10% (FBS), por 30 a 120 min.
- Preparar solución de tinción, que contiene ambos anticuerpos primarios (1: 1000 dilución) de ratón anti-CD43 humana y de conejo anti-humanos VE-cadherina en PBS con 5% de FBS, (Tabla 1).
- Aspirar el tampón de bloqueo de las células y añadir 1 ml por pocillo de tampón de tinción con los anticuerpos primarios añadidos; incubar 3 horas a temperatura ambiente, o durante la noche a 4 ° C.
- Se lavan las células tres veces mediante la adición de 2 ml de PBS con 5% de FBS.
- Preparar un segundo tampón de tinción, que contiene anticuerpos secundarios en dilución 1: 500 en PBS con 5% de FBS: burro anti-conejo conjugado con colorante fluorescente verde, y anti-ratón conjugado con colorante fluorescente rojo (Tabla 1). Añadir 1 ml por pocillo de tampón de tinción secundaria y se incuba a temperatura ambiente durante 1 hr.
- Lavar tres veces con PBS sin suero. Las células se tiñen con 300 nM DAPI solución de trabajo en DH2 O durante 10-15 min.
- Lavar las células con PBS dos veces y añadir 2.3 ml de PBS en bien con células teñidas. Observar con filtros de fluorescencia de microscopio verde, rojo y azul.
6. Análisis de Inducidos hematopoyéticas Precursores
- Mantener culturas de diferenciación hasta que las células flotantes se expanden significativamente, hasta 10-14 días, cambiando el medio de 3F-medio, como se describe en 3.1, cada dos días.
- Se disocian y recoger la diferenciación de monocapas de células mediante el tratamiento de las células con un reactivo de disociación celular comercial (véase la Tabla 1) durante 5-10 min a 37 ° C, 5% de CO 2.
- Realizar citometría de flujo utilizando anti-VE-cadherina, anticuerpos CD43 y CD45 para evaluar la hematopoyesis en las culturas 12. Tenga en cuenta que una gran parte de las células, hasta el 40% de las células ETV2 y GATA2 transducidas, co-expresa VE-cad y CD43. Los siguientes anticuerpos pueden utilizarse para detectar linajes celulares específicos siguientes eXpansion o la diferenciación de células progenitoras de sangre inducidos: CD235a (células eritroides), CD41a (megacariocítica), CD32 (todos los tipos de células mieloides), CD66b (neutrófilos) y CD163 (macrófagos).
- Realizar CFC-ensayo utilizando un medio clonogénico comercial (Tabla 1) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Traslado 1-2 x 10 4 células en 3 ml de medio clonogénica comercial (ver Tabla 3) para evaluar el número de células y tipos de colonias hematopoyéticas formadoras de colonias. Densidad óptima de siembra permite la identificación y el aislamiento de colonias individuales que crecen por separado unos de otros y no se solapan. Densidad de siembra puede variar entre los experimentos en función de la eficiencia de la diferenciación, pero no debe exceder de 1 x 10 4 células por 1 ml de medio clonogénico comercial.
- Mezclar células en medio clonogénica comercial por agitación suave, y la transferencia de 3 ml de suspensión de dos 35 mm platos ultra-bajas de fijaciónpara el ensayo de CFC, 1,5 ml de la suspensión a cada plato. Distribuir uniformemente medio y se incuba a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 14 días. Evite molestar a los platos; observar la formación de colonias en el día 7 y el día 10 del ensayo.
- Identificar y contar colonias hematopoyéticas según sus morfologías en el día 14.
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Representative Results
El diagrama esquemático de HE y la inducción de sangre de hPSCs por la sobreexpresión de factores de transcripción se muestra en la Figura 1. ETV2 con la combinación GATA1 o GATA2 induce la hematopoyesis pan-mieloide, mientras que un GATA2, TAL1 +/- combinación LMO2 induce la hematopoyesis predominantemente eritro-megacariocítica. Ambas combinaciones TF directamente inducidos células el que posteriormente transforman en células progenitoras de sangre con un espectro diferente de diferenciación hematopoyética. La diferenciación de hPSCs del estado pluripotente a la sangre produciendo Toma un promedio de 4 días. Glóbulos Ronda primero emergen por día 5 de diferenciación. Posteriormente, numerosos glóbulos flotantes aparecen y se expanden en las culturas. Para maximizar el número de glóbulos flotante, culturas post-transducción pueden prolongarse hasta 10-14 días. El linaje deseado de células se puede ampliar en condiciones de baja adherentes con la combinación apropiada de citocinas hematopoyéticas. Figura 2 demuestra la inducción de la sangre de hPSCs utilizando ETV2 y GATA1 o GATA2 TFS. Después de la transducción con ETV2 y GATA2, las células adquieren una morfología endotelial típica por día 4 de diferenciación, y, finalmente, se transforman en células de la sangre redondos (día 6-8 de la diferenciación (Figura 2A). Las células recogidas en los días 3 a 4 de la diferenciación muestran una típica VE-cadherina + CD226 + CD73 -. HE fenotipo (Figura 2B, 3B) Por día 7 de diferenciación más de 50% de VE-cadherina + células adquirir el CD43 hematopoyéticas + fenotipo (Figura 2C) de CFC-ensayos de GATA2 / ETV2. Las células inducidas revelan que las colonias se componen de alto potencial proliferativo (HPP) CFC, eritroide (E) CFC, los macrófagos (M) CFC y granulocitos (G) CFC (Figura 2E). La diferenciación hematoendothelial en hPSCs siguiente sobreexpresión de GATA2 y solo o con TAL1LMO2 se muestra en la etapa de la Figura 3. Él es el más identificado en cultivos con GATA2 y TAL1. La adición de LMO2 acelera la diferenciación y marcadamente HE contrae etapa. La combinación GATA2 y TAL1 solo o con LMO2 demuestra la diferenciación y maduración de células progenitoras de sangre a las células eritroides y megacariocíticos Figura 3D y 3E. Mayormente La Figura 4 muestra la optimización de la eficiencia de transducción en H1 hESCs usando GFP lentivirus (A) y la muerte celular y la eficiencia de diferenciación en culturas transducidas con GATA2 / TAL1 / LMO2 a MOI alto y bajo.
Figura 1:. Esquema del protocolo para la inducción del endotelio y las células sanguíneas hemogenic a través de la expresión forzada de TFS Cartoon esboza las principales etapas experimentales y los plazos. Después de la preparación de la suspensión de células individuales, hPSCs son transducidas con TFs y se sembró en la matriz en un medio libre de suero comercial completa. Al día siguiente, se sustituyó el medio con factor de crecimiento medio comercial libre de suplementado con bFGF, TPO y SCF (3F Medium). Después de 3-4 días de cultivo, HE se forma. Posteriormente, se somete endoteliales a la transición hematopoyéticas con formación de múltiples células sanguíneas.
Figura 2:. ETV2 / diferenciación inducida GATA2 de hPSCs (A) imágenes de contraste de fase de ETV2 / diferenciación inducida GATA2-H1 en hESCs en los días 2, 4, 6 y 8 después de la transducción; Barra de escala, 100 micras. (B) Análisis de citometría de flujo de células inducida / GATA2-ETV2 endotelial sometidos a la transición hematopoyético en el día 3 de diferenciación: VE-cadherina + HE células expresan CD226 y carecen de expresión de CD73. Un pequeño porcentaje de las células endoteliales expresan CD73 (no HE). (C) por citometría de flujo de unnálisis de ETV2 / GATA1- y ETV2 / inducida GATA2-H1 hPSCs en el día 7 después de la transducción. (D) Flujo de análisis de citometría de / células hematopoyéticas inducida GATA2-ETV2 ampliadas en medio suplementado con FBS y SCF, IL3, IL6, GM-CSF, G-CSF y EPO durante 14 días. (E) Tipos de colonias hematopoyéticas formados a partir ETV2 / GATA2 células transducidas en CFC-ensayo y correspondientes cytospins teñidos con Wright representan eritroide (E), macrófagos (M), granulocitos (Gr) y High proliferativas colonias potenciales (PVM). Las barras de escala para el CFC-ensayo, 250 m, para cytospins, 20 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3:. GATA2 / TAL1 y GATA2 / TAL1 / diferenciación inducida LMO2 de hPSCs (A) imágenes de contraste de fase de GATA2 / TAL1 / LMO2la diferenciación inducida en hESCs H1 en los días 2, 4, 6 y 8; Barra de escala, 100 micras. (B) Análisis de citometría de flujo de las células inducidas por GATA2 / TAL1 endotelial sometidos a la transición hematopoyético en día 3 de diferenciación: VE-cadherina + células adquieren expresión de HE marcador CD226. Un pequeño porcentaje de las células endoteliales expresan CD73 (no HE). (C) tinción de inmunofluorescencia de GATA2 / diferenciación inducida TAL1 en H1 células madre, el día 5; VE-cadherina células (verde) + adquieren la expresión de CD43 marcador hematopoyético (rojo). (D) Análisis de citometría de flujo de GATA2 / TAL1 / LMO2 indujo- culturas hematopoyéticas en suspensión en el día 14 después de la transducción siguientes expansión en medio libre de suero suplementado con SCF, TPO, EPO y bFGF; (E) Tipos de colonias hematopoyéticas formadas en CFC-ensayo por GATA2 / TAL1 / LMO2 cellsand diferenciado correspondiente cytospins teñidos con Wright representan eritroide (E), macrófagos (M), y Megakaryocytes (Mc). Las barras de escala para el CFC-ensayo, 250 m, para cytospins, 20 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Optimización del procedimiento de transducción lentiviral (A) Transducción de H1 hESCs con diferentes MOI de GFP lentivirus.. (B) La viabilidad celular y la eficiencia de diferenciación en cultivos transducidos con GATA2 / TAL1 / LMO2 a baja (1 para cada virus) y alto (2 para cada virus) MOI.
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Discussion
El método anteriormente descrito para la diferenciación hematopoyética de hPSCs por la sobreexpresión de TFS, representa un enfoque rápido y eficiente para la generación de HE y mieloides y erytho magakaryocytic progenitores de hESCs y CMPI, permitiendo así la producción de hasta 30 millones de células de sangre de un millón de células madre pluripotentes 10. Este método exhibió diferenciación consistente en múltiples células madre y iPSCs líneas 10. Durante la diferenciación por ETV2 y GATA2, factores GATA1 así como factores GATA2 y TAL1, células forman producir sangre endotelio, HE y se someten a un endotelio de transición hematopoyético. Formación de HE se observa por lo general entre los días 3 y 4 de la diferenciación. La adición de LMO2, un co-factor transcripcional de TAL1, a la GATA2 y la combinación TAL1, aumentó significativamente la robustez de la diferenciación, mientras que la etapa se convirtió marcadamente contrajo.
El éxito de diferenciación dirigidación de hPSCs por factores de transcripción depende principalmente de (i) el suministro eficaz de los ácidos nucleicos en las células, (ii) la viabilidad celular después de manipulaciones genéticas, y (iii) una traducción eficaz de las transcripciones exógenos dentro de la célula.
Uno de los pasos clave del método descrito es la producción de unidades lentivirales eficaces, que depende de un tampón de pH precisa para la transfección de células HEK 293T, y la ausencia de contaminantes de endotoxina en todos los pasos de los experimentos de producción y transducción viral. La integridad de todas las construcciones, incluyendo plásmidos de embalaje y el sobre, se debe verificar si hay signos de la producción viral en células HEK 293T se observaron 13.
El diseño del protocolo de diferenciación utilizando combinaciones de factores de transcripción debe considerar varias variables. Alta eficiencia de la transducción viral es importante para la diferenciación exitosa. Dado que la eficacia de transducción depende del método utilizado para el virusproducción y purificación, optimizar HPSC transducción utilizando un vector lentiviral-GFP se recomienda (Figura 4A). Viral integración tras la transducción debe ser verificada mediante PCR genómico con cebadores transgén específico (Tabla 3). Diferenciación de optimización también debe incluir el ajuste de la concentración de lentiviral en la mezcla de reacción. Una cantidad relativamente baja de virus, MOI de 0,5 a 1, es capaz de inducir la diferenciación HPSC. Mientras que una MOI mayor aumenta la eficiencia de diferenciación, sino que también aumenta la muerte celular (Figura 4B). Paso de optimización adicional puede incluir MOI ajuste de la relación para cada virus en la mezcla de reacción. En GATA2 / ETV2 transdujo culturas, duplicando Ministerio del Interior de GATA2, en relación con ETV2, aumenta la eficacia de la diferenciación. Para GATA1 / ETV2, GATA2 / TAL1 y GATA2 / TAL1 / LMO2 igual MOI para cada virus es óptimo.
Después de la transducción con TFS, una gran mayoría de las células Underwent diferenciación angiohematopoietic mientras que sólo un muy pocas células conservan una morfología indiferenciada. Desde pSIN-EF1α vectores lentivirales incorporan resistencia a los antibióticos, el tratamiento de los cultivos con puromicina se puede utilizar para eliminar las células no diferenciadas residuales.
La formación de células con morfologías características endoteliales y células de sangre redondas posteriores, indican una diferenciación exitosa. En promedio, la combinación GATA2 / ETV2 produce el 40-50% de CD43 + VE-cadherina células +/- sangre por día 9-10 de diferenciación con hasta 30% las células restantes VE-cadherina + CD43 -. Combinación GATA1 / ETV2 induce la expresión de CD43 más rápidamente y genera un mayor número de células CD43 + en comparación con la combinación GATA2 / ETV2. En estos cultivos, la mayoría de las células CD43 + coexpresan VE-cadherina. En las culturas transducidas con GATA2 / TAL1, el número de células CD43 + 40- por lo general alcanza50%. La adición de LMO2 a GATA2 / TAL1 acelera considerablemente y aumenta la producción de la sangre, y se contrae notablemente la etapa del desarrollo endotelial.
Ensayos de formación de colonias se deben utilizar para determinar la frecuencia y el tipo de progenitores hematopoyéticos inducidos. La naturaleza de las células formadoras de colonias se puede confirmar mediante la preparación de cytospins teñidos con Wright de colonias individuales. hPSCs transducidas con ETV2 y GATA2 producen principalmente grandes (mayores de 0,5 mm de diámetro) potenciales (HPP) colonias mieloides proliferativas altas compuestas de granulocítica inmaduro y células monocíticas, con algunas células mieloides y eritroides maduras ocasional y células megacariocíticas. En promedio, más del 80% de los CFC en GATA2 / culturas ETV2 transducidas son PVM mieloides. Además, estos cultivos generan eritroides y macrófagos colonias (Figura 2e), que generalmente comprenden menos de 20% de los CFCs totales. transducción de HPSC con ETV2 y GATA1 aumenta significativamente THe proporción de CFC-E a un máximo de 50%. Cultivos transducidos TAL1 y GATA2 producen principalmente eritroide (más del 80% de los CFC total) y las colonias megacariocíticas (más de 10% del total de CFCs) con muy pocas colonias de macrófagos (menos de 5% del total de los CFC). La adición de LMO2 a la TAL1 y la combinación GATA2 aumenta significativamente la frecuencia de las células formadoras de colonias con-eritro megacariocítica potencial 10. El patrón de actividad de CFC después de la transducción con las combinaciones descritas de factores de transcripción es consistente entre diferentes células madre y las líneas hiPSC 10.
En resumen, la sobreexpresión lentiviral mediada por hPSCs es una herramienta relativamente rápido y eficiente para la inducción de HE y la sangre usando TFS. Este sistema también se puede utilizar para evaluar la capacidad de diferenciación de otros TFS y a identificar a aquellos que se requieren para endotelial y la especificación hematopoyético. Sin embargo, el protocolo actual tiene una utilidad limitada para los estudios de exintracelular de señalización implicadas en la inducción de la SE, ya que utiliza TFS para eludir la señalización mediada por receptores de superficie. Aunque el protocolo actual describe la producción de sangre usando la expresión constitutiva de un transgén, resultados similares se pueden obtener utilizando mRNAs modificados 10.
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Disclosures
IS es accionista fundador y consultor de Cynata.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
Table 1. Induction of hPSCs differentiation with trancription factors and analysis of hemogenic endothelium and blood cells. |
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| pSIN4-EF1a-ETV2-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61061 | Lentiviral Vector |
| pSIN4-EF1a-GATA2-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61063 | Lentiviral Vector |
| pSIN4-EF1a-GATA1-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61062 | Lentiviral Vector |
| pSIN4-EF1a-TAL1-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61062 | Lentiviral Vector |
| pSIN4-EF1a-LMO2-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61064 | Lentiviral Vector |
| Hexadimethrine bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | 107689-10G | Cationic polymer used to increase the efficiency of infection |
| Y-27632 (Dihydrochloride) ROCK inhibitor | STEMCELL Technologies | 72302 | RHO/ROCK pathway inhibitor Inhibits ROCK |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies | A11105-01 | Cell Dissociation Reagent |
| Incomplete (growth factor- free) culture medium mTeSR1 Custom formulation | WiCell Research Institute (Madison, WI) | MCF | Serum-free mTeSR1 medium without bFGF and TGFb |
| human SCF | Peprotech | 300-07 | Premium grade |
| human TPO | Peprotech | 300-18 | Research grade |
| human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | Premium grade |
| CD144 (VE-cad) FITC | BD Biosciences | 560411 | Endothelial marker (FACS) |
| CD226 PE | BD Biosciences | 338305 | Hematopoietic (FACS) |
| CD43 PE | BD Biosciences | 560199 | Hematopoietic (FACS) |
| CD73 APC | R&D Systems | FAB5795A | Endothelial marker (FACS) |
| CD45 APC | BD Biosciences | 555485 | Hematopoietic (FACS) |
| 7AAD | Life Technologies | A1310 | Live/Dead assay (FACS) |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-500G | Cell fixation |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | Permeabilization |
| FBS | Fisher Scientific | SH3007003 | Fetal bovine serum |
| Mouse anti-human CD43 | BD Biosciences | 551457 | Pure, primary antibody for Immunofluorescence (IF) staining |
| Rabbit anti-human VE-cadherin | BenderMedSystem | BMS158 | Primary (IF) |
| Anti-rabbit Alexa Fluor 488-conjugated | JacksonResearch | 715-486-152 | Secondary (IF) |
| Anti-mouse Alexa Fluor 594-conjugated | JacksonResearch | 715-516-150 | Secondary (IF) |
| DAPI nucleic acid stain | Life Technologies | D1306 | Live/Dead assay (IF) |
| Clonogenic medium MethoCult H4435 Enriched | STEMCELL Technologies | 4435 | CFC-assay |
| Wright Stain solution | Sigma -Aldrich | 32857 | Staining cytospins |
Table 2. hPSCs culture. |
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| Human Pluripotent Stem Cells (hPSCs) | WiCell Research Institute (Madison, WI) | hESCs (WA01, WA09) human Embryonic Stem cells; iPSCs (DF-19-9-7T, DF-4-3-7T) transgene-free induced Pluripotent Stem Cells | hPSCs are able to self-renew and to differentiate into cells of three germ layers |
| Complete serum-free medium for culture of hPSCs mTeSR1 media | WiCell Research Institute (Madison, WI) | M500 | Serum-free medium with growth factors for feeder free culture of ESC/iPSCs |
| Matrigel | BD Biosciences/ Corning | 356234 | Matrix for maintenance of human ESC/iPSCs |
| DMEM/F-12, powder | Life Technologies | 12500-062 | Basal Medium |
| HyClone Dulbecco's PBS powder | Fisher Scientific | dSH30013.04 | PBS |
| Dispase II, powder | Life Technologies | 17105-041 | Neutral protease, Cell dissociation |
Table 3. Primers for detection of virus genomic integration. |
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| Primer's Name | Forward (Fwd) 5’ -->3’ | Reverse (Rev) 5’-->3’ | Discription |
| pSIN EF1a Fwd | TTC CAT TTC AGG TGT CGT GA | -- | EF1a promoter sequence |
| GATA1 Rev | -- | TCC CTG TAG TAG GCC AGT GC | Coding Region |
| GATA2 Rev | -- | GGT TGG CAT AGT AGG GGT TG | Coding Region |
| TAL1 Rev | -- | AGG CGG AGG ATC TCA TTC TT | Coding Region |
| LMO2 Rev | -- | GGC CCA GTT TGT AGT AGA GGC | Coding Region |
| ETV2 Rev | -- | GAA CTT CTG GGT GCA GTA AC | Coding Region |
References
- Zape, J. P., Zovein, A. C. Hemogenic endothelium: origins, regulation, and implications for vascular biology. Semin Cell Dev Biol. 22, 1036-1047 (2011).
- Swiers, G., Rode, C., Azzoni, E., de Bruijn, M. F. A short history of hemogenic endothelium. Blood Cells, Mol & Dis. 51, 206-212 (2013).
- Kennedy, M., et al. T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2, 1722-1735 (2012).
- Wang, L., et al. Endothelial and hematopoietic cell fate of human embryonic stem cells originates from primitive endothelium with hemangioblastic properties. Immunity. 21, 31-41 (2004).
- Rafii, S., et al. Human ESC-derived hemogenic endothelial cells undergo distinct waves of endothelial to hematopoietic transition. Blood. 121 (5), 770-780 (2012).
- Choi, K. D., et al. Identification of the hemogenic endothelial progenitor and its direct precursor in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2, 553-567 (2012).
- Vodyanik, M. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. Leukosialin (CD43) defines hematopoietic progenitors in human embryonic stem cell differentiation cultures. Blood. 108, 2095-2105 (2006).
- Wang, C., et al. TGFbeta inhibition enhances the generation of hematopoietic progenitors from human ES cell-derived hemogenic endothelial cells using a stepwise strategy. Cell Res. 22, 194-207 (2012).
- Uenishi, G., et al. Tenascin C promotes hematoendothelial development and T lymphoid commitment from human pluripotent stem cells in chemically defined conditions. Stem Cell Rep. 3, 1073-1084 (2014).
- Elcheva, I., et al. Direct induction of haematoendothelial programs in human pluripotent stem cells by transcriptional regulators. Nat Commun. 5, 4372 (2014).
- Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat Protoc. 1, 241-245 (2006).
- Vodyanik, M. A., Slukvin, I. I. Hematoendothelial differentiation of human embryonic stem cells. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 23, Unit 23.6 (2007).
- Cao, F., et al. Comparison of gene-transfer efficiency in human embryonic stem cells. Mol Imgn and Biol. 12, 15-24 (2010).
