Abstract
Lage dosis straling blootstelling kan een verscheidenheid van biologische effecten die verschillen in hoeveelheid en kwaliteit van de door hoge stralingsdoses effecten veroorzaken. Het aanpakken van vraagstukken in verband met de veiligheid van het milieu, het werk en de volksgezondheid in een goede en wetenschappelijk verantwoorde manier sterk afhankelijk is van het vermogen om de biologische effecten van een lage dosis verontreinigende stoffen, zoals ioniserende straling en chemische stoffen nauwkeurig te meten. DNA-schade en herstel zijn de belangrijkste vroege indicatoren van de gezondheidsrisico's als gevolg van hun mogelijke gevolgen op lange termijn, zoals kanker. Hier beschrijven we een protocol om het effect van chronische in vivo blootstelling aan lage doseringen γ- en β-straling op DNA schade en herstel bij muizen miltcellen bestuderen. Met behulp van een algemeen bekend merker DNA double-strand breaks, gefosforyleerd histon H2AX genoemd γH2AX, laten we zien hoe het gebruikt kan worden om niet alleen de mate van DNA-schade te evalueren, maar ook veranderingenin de DNA-reparatie capaciteit potentieel geproduceerd door lage dosis in vivo blootstelling. Flowcytometrie maakt een snelle, nauwkeurige en betrouwbare meting van immunofluorescently gelabeld γH2AX in een groot aantal monsters. DNA double-strand break repair kan worden geëvalueerd door het blootstellen geëxtraheerd splenocyten een uitdagende dosering van 2 Gy tot voldoende produceren van DNA breuken te herstellen activeren en door het meten van de geïnduceerde (1 uur na bestraling) en resterend DNA schade (24 hrs post-bestraling). Residuele DNA schade indicatief onvolledige reparatie en het risico van langdurige genomische instabiliteit en kanker zijn. In combinatie met andere tests en eindpunten die gemakkelijk kan worden gemeten zoals in vivo studies (bijvoorbeeld chromosoomafwijkingen, micronuclei frequenties in beenmerg reticulocyten, genexpressie, enz.), Deze benadering maakt een nauwkeurige en contextuele evaluatie van de biologische effecten van laag niveau stressoren.
Introduction
Aanzienlijke controverse over de mogelijke schadelijke effecten van een lage of zeer lage doses ioniserende straling en angst publiek van de straling, gedreven door beelden van de Hiroshima en Nagasaki atomaire bombardementen en van zeldzame kerncentrale ongelukken (verergerd door de massamedia), heeft geleid tot een zeer strikte regelgeving en normen die potentieel wetenschappelijk verantwoord zijn niet stralingsbescherming. In de laatste drie decennia praktijk blijken zowel het ontbreken van schadelijke en de aanwezigheid van potentieel gunstige biologische effecten geïnduceerd door een lage dosis straling 1-4 gedocumenteerd. De belangrijkste gezondheidsproblemen straling risicofactor is de kans op kanker, geschat op basis van epidemiologische studies van atomaire bom overlevenden die hoge of gemiddelde stralingsdoses. Lineaire extrapolatie van deze gegevens (zogenaamde lineaire-no-drempel of LNT model) wordt gebruikt om het risico op kanker te schatten bij lage doses. Echter, deze aanpak niet heeft ontvangen wereldwijde wetenschappelijke acceptatieen is zwaar gedebatteerd 5.
Het is duidelijk dat er meer studies nodig zijn om deze kwestie te verduidelijken en eventueel te verbeteren stralingsbescherming normen. Dergelijke studies moeten chronische behandelingen (beste benadering van milieu- en beroepsmatige blootstelling), in vivo diermodellen te betrekken (het beste voor het extrapoleren van effecten op mens) en dergelijke eindpunten zoals DNA-schade tarieven, DNA-reparatie en mutagenese. Het is bekend dat DNA is het voornaamste doelwit voor beschadiging stralingseffecten en incomplete of verkeerd onderhoud mogen leiden tot mutagenese en kankerontwikkeling 6.
Dubbele DNA-breuken (DSB) is een van de meest schadelijke vormen van DNA-laesies en kan leiden tot celdood en het ontstaan van tumoren 7. Het is daarom belangrijk om in staat om betrouwbaar en nauwkeurig meten van het niveau van DSB na blootstelling aan lage dosis bestraling en / of andere stressoren, zoals chemische stoffen. Een van de meest gevoelige en specifieke markersDNA DSB is gefosforyleerd histon H2AX, genaamd γH2AX 8, maar andere merkers en werkwijzen zijn voorgesteld 9,10. Geschat wordt dat duizenden H2AX moleculen in de nabijheid van een geïnduceerde DSB, zijn betrokken bij de vorming van γH2AX die de detectie van afzonderlijke DSB door immunofluorescentie labeling met een anti-γH2AX antilichaam en fluorescentiemicroscopie 11. De reactie is zeer snel en bereikte zijn maximum tussen 30 en 60 min. Het bewijs bestaat dat γH2AX vergemakkelijkt de reparatie van DNA DSB door het aantrekken van andere reparatie factoren om de sites van de pauzes en door het wijzigen van chromatine structuur om gebroken DNA uiteinden verankeren en bieden toegang voor andere reparatie-eiwitten (beoordeeld in 12). Na voltooiing van de reparatie van DNA DSB, krijgt γH2AX de-gefosforyleerd en / of ondergaat afbraak en nieuw gesynthetiseerde H2AX moleculen vervangen γH2AX in de getroffen gebieden van chromatine 10. Monitoring vorming en verlies van γH2AX kan,Daarom nauwkeurige raming van DNA-DSB-reparatie kinetiek. Deze benadering is gebruikt om herstel van DSB bestuderen verschillende humane tumorcellijnen bestraald met hoge doses straling en de snelheid en overgebleven DSB niveaus bleken te correleren met stralingsgevoeligheid 13-15.
We pasten deze experimentele benadering toegepast op een in vivo muis studie waarbij het effect van lage doses van chronische γ- en β-bestraling op DNA-DSB-reparatie en niveaus (figuur 1) te onderzoeken. Ten eerste tonen we een methode om een langdurige chronische blootstelling van muizen uitgevoerd dat β-straling uitgezonden door hetzij tritium (waterstof-3) in de vorm van getritieerd water (HTO) of organisch gebonden tritium (OBT) opgelost in drinkwater . Beide vormen worden geacht te accumuleren en / of anders in het lichaam en daarom distribueren, geven verschillende biologische effecten. Beide vormen zijn potentiële gevaren in de nucleaire industrie. Deze behandelingwordt parallel met chronische blootstelling aan γ-straling bij een equivalente dosistempo een correcte vergelijking van de twee typen straling, wat cruciaal is voor de evaluatie van de relatieve biologische werkzaamheid toe. Beta-straling bestaat uit elektronen, waardoor het erg verschillend van de γ-straling, hoogenergetische fotonen. Als gevolg van dit verschil, Β-straling bestaat hoofdzakelijk interne gezondheidsrisico en kunnen verschillende biologische effecten in vergelijking met γ-straling. Deze complicatie resulteerde in aanzienlijke controverses over de regulering van de blootstelling aan β-straling van HTO. Zo regelgeving niveaus van HTO in drinkwater voor het publiek varieert van 100 Bq / l in Europa tot 75.000 Bq / l in Australië. Het is daarom belangrijk om biologische effecten van HTO gelijkwaardige doses van γ-straling vergelijken. Ten tweede wordt de snelheid van DNA DSB gemeten in geïsoleerde splenocyten na de voltooiing van een chronische blootstelling gebruik immunofluorescently gelabelde γH2AX detecterened door flow cytometrie. Hierdoor kan de evaluatie van de mate van DNA-schade veroorzaakt door de in vivo blootstelling. Echter, is het verstandig om te verwachten dat een dergelijke lage niveau blootstellingen geen detecteerbare tarieven van DNA DSB kunnen produceren; in plaats daarvan, een verborgen wijzigingen / reacties te verwachten dat de cellen in staat zijn om DNA-schade te herstellen zou beïnvloeden. Deze veranderingen, indien gevonden, kan zowel stimulerend (produceren van een gunstig effect) of remmende (produceren van een schadelijk effect). De voorgestelde protocol maakt onthullen dergelijke veranderingen door tegen de splenocyten geëxtraheerd met een hoge dosis straling die een aanzienlijke hoeveelheid schade veroorzaakt (bijvoorbeeld 2 Gy produceert ongeveer 50 DNA DSB per cel of 3 -. 5-voudige toename van de totale γH2AX level) . Vervolgens, de vorming en verlies van γH2AX, die de initiatie en voltooiing van DSB reparatie wordt gecontroleerd door flow cytometrie. Hierdoor kan niet alleen de basale en door behandeling geïnduceerde niveaus van DNA DSB te meten, maarOok de potentiële invloed op de cellen in staat zijn om te reageren en reparatie DNA-schade geïnduceerd door veel hogere niveaus stressor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle muis handling en behandeling procedures moeten zich houden aan de regels uiteengezet door de wetgever en / of dierlijke zorgprogramma's en goedgekeurd door een plaatselijke dier zorg commissie. Alle methoden beschreven in dit protocol werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Canadese Raad van Animal Care met toestemming van de plaatselijke dier zorg commissie.
LET OP: Alle werkzaamheden met radioactiviteit (waaronder, maar niet beperkt tot het behandelen van tritium, externe γ-straling, het hanteren van radioactief dierlijke weefsels, beddengoed afval) moeten zich houden aan de regels uiteengezet door de wetgever en / of stralingsbescherming autoriteiten en worden uitgevoerd door geautoriseerde personeel in een gecertificeerd laboratorium en / of faciliteit.
1. Dierlijke Work
- Animal Groepering
- Als muizen afkomstig uit een externe organisatie, acclimatiseren dieren gedurende ten minste 10 dagen in de dierfaciliteit. Als de studie omvat verschillende behandelingsgroepen, ervoor te zorgen dat het dier leverancier al kan sturenl dieren als één partij.
- Willekeurig muizen toewijzen aan behandelingsgroepen van 10 muizen per groep. Bij gebruik van mannelijke muizen van de C57BL / 6 stam, hebben het dier leverancier pre-regelen randomisatie van zeer jonge C57BL / 6 mannetjes in hun mogelijkheid om agressie problemen te beperken.
- Chronische blootstelling van muizen aan interne β-straling
- Bereid werkende concentraties tritium (10 kBq / l en 1 MBq / l) bij muizen drinkwater door verdunning van de oorspronkelijke stam van HTO en OBT (een mengsel van getritieerd proline, alanine en glycine aminozuren) oplossingen.
- Valideer de eindconcentraties van tritium in het drinkwater door het meten van radioactiviteit met een vloeistof scintillatieteller. Pas concentraties, indien nodig.
- Behandel dieren voor een maand door toegang ad libitum aan het tritium water. Als de behandeling water krijgt laag in de periode van twee weken, voeg meer water. Anders op twee weken veranderen flessen.
- Behandel sham-bestraalde controlemuizen identiek. Houd ze in een aparte "schone" kamer of op een aparte "schone" rack onder positieve luchtdruk tritium kruisbesmetting uit de lucht te voorkomen.
- Chronische blootstelling van muizen aan externe γ-straling
Opmerking: γ-straling voorziening / materiaal varieert afhankelijk van de locatie. - Met behulp van beschikbare wijzen van dosimetrie, bepalen de afstand tot een γ-stralingsbron die stralingsvelden produceren van de gewenste doses hebben. Zorg ervoor dat de homogeniteit van de straling gebieden binnen de gebieden die het dier kooien.
Opmerking: 1,7 μGy / h betekent een dosistempo door 1 MBq / l tritium in het lichaam. - Expose muizen door het plaatsen van de muis kooien op het bepaald in stap 1.3.1 voor een maand afstanden. Minimaliseren dagelijkse onderbreking van γ-bestraling 30 min. Gebruik thermoluminescentie dosimeters totale geabsorbeerde doses te meten.
2. Offers en Sampling
Opmerking: Extracted milten kan in 60 mm schalen worden gehouden met media (tot 2 uur) terwijl de rest van de muizen Sacrificed. Afhankelijk van het aantal mensen dat deelneemt, tussen 5 en 15 muizen worden verwerkt in één dag.
3. Bereiding van splenocyten Cultures
- Homogeniseren van de milt door hakken in een cel zeef met steriel pincet met een gebogen einde.
- De cel zeef en verzamel de gefiltreerde celsuspensie van 60 mm schaal in een 15 ml buis.
- Spoel de cel zeef met 5 ml medium aan de rest van de cellen te verzamelen.
- Centrifugebuizen bij 300 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Decanteer supernatant en resuspendeer pellet in 10 ml RPMI.
- Centrifugebuizen bij 300 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Decanteer supernatant en resuspendeer pellet in 5 ml RPMI.
- Overdracht 4 ml celsuspensie in een 25 ml weefselkweek kolf en naar een CO 2-incubator (37 ° C, 5% CO2, 80% vochtigheid)
4. Uitdagende Bestraling en Fixing
- Breng deresterende 1 ml celsuspensie uit stap 3,8 in een 1,5 ml buis op ijs en centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. DNA schade gemeten in dit voorbeeld zowel behandeling geïnduceerde schade en t = 0 datapunt voor de constructie van een DNA-herstel curve vertegenwoordigt.
- Zuig het supernatant met behulp van een vacuümpomp zorgvuldig. Voorzichtig resuspendeer pellet in 1 ml TBS-buffer (20 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 2,7 mM KCl).
- Centrifugebuizen bij 300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Zuig het supernatant met behulp van een vacuümpomp zorgvuldig. Voorzichtig resuspendeer pellet in 300 ul TBS.
- Onder mengen op een vortex bij lage snelheid, voeg 700 ul van -20 ° C 100% ethanol. Sluit het deksel en omkeren een paar keer om te mengen.
- Bewaar de monsters bij -20 ° C. In ethanol vaste splenocyten kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C gedurende ten minste 12 maanden zonder merkbaar verlies van de γH2AX signaal.
- Bestraal het kweken van splenocyten uit stap 3.8 een uitdagende γ-rad iation dosis van 2 Gy bij een dosis ≥ 200 mGy / min met behulp van beschikbare bestralingsinrichting.
Opmerking: Het doel van deze bestraling DNA DSB ertoe om de reparatie machine betwisten. Röntgenstralen kunnen ook worden gebruikt voor dit doel. - Onmiddellijk terug de culturen naar een CO 2 incubator.
- 1 uur na de uitdagende 2 Gy bestraling, verwijder de culturen uit de incubator naar een biologische veiligheid kabinet. Een representatieve hoeveelheid verzamelen, zacht resuspendeer cellen met behulp van een pipet en overdracht 1 ml van de celsuspensie op een 1,5 ml buis op ijs. Zet de celkweken een CO 2 incubator.
- Centrifugebuizen bij 300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Zuig het supernatant met behulp van een vacuümpomp zorgvuldig. Voorzichtig resuspendeer pellet in 1 ml TBS.
- Herhaal stap 4,3-4,5.
- 24 uur na de uitdagende 2 Gy γ-straling, de oogst en vast te stellen op = 24 uur monster zoals beschreven in stap 4,8-4,10.
Opmerking: Typisch, 15 - kan 30 monsters per dag immunofluorescently worden gelabeld en geanalyseerd door flowcytometrie in één run. Om een nauwkeurige vergelijking tussen de groepen te zorgen, onder meer monster (s) van elke groep. Zie ook Referentie 16 voor meer informatie.
- Bereid een label set van buizen voor het aantal monsters te verwerken en plaats op ijs. Gebruik 12 x 75 mm afgetopte glazen buizen. Steriliteit is niet vereist voor dit werk. Inclusief een extra historische controle monster voor het labelen met secundaire antilichaam alleen ("slechts 2 Ab"). Gebruik deze historische controle monster in elke flowcytometrie draaien binnen een studie.
- Voeg 0,5 ml ijskoude TBS aan elke buis.
- Verwijder vaste splenocyten van -20 ° C, vortex gedurende 5 seconden en breng een 0,5 ml aliquot voorbereide buizen met TBS. Plaats de resterende monsters terug in -20 ° C opslag enhouden als backup monster.
- Centrifugeer splenocyten bij 300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Giet supernatant en voorzichtig resuspendeer pellet in 1 ml ijskoude TBS bevattende 1% FBS
- Centrifugeer cellen bij 300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Giet het supernatant en voorzichtig resuspendeer pellet in 1 ml TST buffer (0,05% Triton X-100, 2% FBS in TBS). Incubeer gedurende 20 min op ijs.
- Centrifugeer cellen bij 300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Giet het supernatant en voorzichtig resuspendeer pellet in 200 ul van de primaire anti-γH2AX antilichaam verdund 1: 150 in TST buffer. Gebruik 200 ul van TST voor de "2e Ab alleen" control monster.
- Position buizen op een roterende schudinrichting bij een hoek van 45 - 60 ° en schud gedurende 1,5 uur bij 300 x g bij kamertemperatuur.
- Terwijl buizen incuberen, stelt een voldoende volume (200 ul / monster) van de geit anti-muis secundair antilichaam geconjugeerd met Alexa-488 bij een 1: 200 verdunning in TST buffer.
Opmerking: Alle werkzaamheden met Alexa-488geconjugeerd antilichaam (stappen 5,10-5,16 hieronder) moet onder schemerige lichtomstandigheden worden gedaan en gelabelde monsters moeten worden beschermd tegen het licht door het wikkelen van buizen in aluminiumfolie. - Nadat de 1,5 uur incubatie voltooid, voeg 1 ml ijskoude TBS bevattende 2% FBS aan elke buis en centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Giet het supernatant en voorzichtig resuspendeer pellet in 1 ml TBS dat 2% FBS.
- Centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Giet supernatant en voorzichtig resuspendeer pellet in 200 pl van het secundaire antilichaam oplossing uit stap 5.8.
- Incubeer de monsters op een schudplateau gedurende 1 uur zoals in stap 5.7.
- Voeg 1 ml ijskoude TBS bevattende 1% FBS.
- Centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Giet supernatant en voorzichtig resuspendeer pellet in 1 ml ijskoude TBS.
- Centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Giet het supernatant en voorzichtig resuspendeer pellet in 0,5 ml TBS dat 50 ug / mlpropidium jodide.
- Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur beschermd tegen licht.
- Analyseer monsters op een flowcytometer met behulp van instrument-specifieke protocollen 16. Lees minstens 10.000 cellen per monster.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 2 toont voorbeelden van flowcytometrie grafieken verwacht splenocyten bereid volgens de hieronder beschreven werkwijze. De cellen worden eerst gated gebaseerd op de <elektronische volume-side scatter> scatterplot (figuur 2A en 2D, elektronische volume is gelijk aan voorwaartse verstrooiing). FL3 / propidiumjodide histogrammen (figuur 2B en 2E) bevestigen normale celcyclus distributie. Gemiddelde γH2AX signaal berekend volgens de FL1 kanaal bevestigt> 2-voudige toename in DNA-DSB-2 Gy bestraalde cellen (figuur 2F) in vergelijking met de onbehandelde controle (Figuur 2C). Vervolgens onderzochten we de gevoeligheid van de beschreven meetmethode immunofluorescently gelabeld γH2AX door flow cytometrie in muizen splenocyten. Figuur 3A toont γH2AX niveaus, indicatief voor DNA DSB splenocyten van muizen 1 uur na de ex vivo blootstelling aan lage (0,1Gy) en hoge (2 Gy) doses van γ-straling ten opzichte van de onbehandelde controle. Te zien is dat 0,1 Gy induceerde een lichte stijging van de DSB niveau dat toename was statistisch significant. De sterke 3-voudige inductie werd verwacht en waargenomen na 2 Gy belichting. Om de specificiteit van γH2AX immunofluorescent etikettering valideren, zoals beschreven in het protocol, werden gelabelde cellen onderzocht met een fluorescentiemicroscoop. De sterke foci-achtig patroon waargenomen aangeeft dat het fluorescentiesignaal afkomstig van de afzonderlijke DNA-DSB binnen de chromatine (Figuur 3B).
Representatieve resultaten van de beoordeling van DNA DSB rate met reparatie in splenocyten van muizen die zijn blootgesteld werken om een zeer lage concentraties van getritieerd water (10 kBq / L) worden getoond in figuur 4. Men kan zien (Figuur 4A) dat hoewel de behandeling resulteerde in een toename van de basale γH2AX level 10%, was de verandering geent statistisch significant (N = 5, één sample Student's t test). Ook de gemeten vorming en verlies van γH2AX na de uitdaging 2 Gy bestraling, die de kinetiek van DNA-DSB-reparatie, was niet verschillend tussen de cellen van de controle- en HTO-behandelde muizen (figuur 4B).
Figuur 1. Experimentele diagram om het effect van chronische in vivo bestraling op DNA schade en DNA herstel te evalueren. Na in vivo behandeling van muizen met chronische bestraling gedurende een gewenste tijdsperiode worden muizen opgeofferd en splenocyten kweken worden opgesteld en blootgesteld aan een uitdagende bestraling. Splenocyt monsters worden verzameld en op verschillende tijdstippen vastgesteld nadat de uitdagende dosis. Niveaus van γH2AX worden vervolgens gemeten met behulp van immunofluorescentie labeling en met behulp van flow cytometrie. De grafiek aan de onderzijde van de figuur is een schema van verwachte data. Gamma-H2AX niveau drastisch verhoogt vroeg na de uitdagende bestraling gevolgd door een daling terug naar de controle waarde, indien DNA-reparatie is voltooid. DNA-schade Δ vertegenwoordigt de schade geproduceerd als gevolg van de experimentele behandeling van muizen en DNA-herstel Δ vertegenwoordigt het effect van de behandeling van de muizen op DNA-DSB-reparatie capaciteit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Vertegenwoordiger cytometrie ruwe data stromen. (A, D) Scatter plots en gating regio voor splenocyten en celresten en erytrocyten. (B, E) DNA histogrammen vertegenwoordigen celcyclus distributies.
Figuur 3. Detectie van γ H2AX met flow cytometrie is gevoelig en specifiek. (A) Splenocyten vers geïsoleerd uit mannelijke CBA-muizen werden bestraald met hetzij 0,1 of 2 Gy van γ-straling, of sham-behandeld en men liet γH2AX reactie gedurende 1 uur te ontwikkelen. Cellen werden vervolgens gefixeerd, immunofluorescentlygelabeld met anti-γH2AX antilichaam en geanalyseerd met flow cytometrie. Genormaliseerde gemiddelde waarden ± SD worden getoond (N = 12). * En *** betekenen statistisch verschil met p <0,05 en p <0,001, respect (one-sample Student's t-test). (B) Vertegenwoordiger microfoto van onbehandelde controle (UT) of 2 Gy bestraalde splenocyten immunofluorescently gelabeld met anti-γH2AX antilichaam. De brandpunten-achtig patroon van groene fluorescentie bevestigt de specificiteit van de immunofluorescentie etikettering voor γH2AX. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Representatieve resultaten tonen het ontbreken van gevolgen van blootstelling aan 1-maand muizen om getritieerd water (HTO) op DNA-DSB-niveau en reparatie. (A) De splenocyten werden geïsoleerd uit muizen behandeld met 10 kBq / l HTO in drinkwater en controledieren. Het niveau van γH2AX werd gemeten met immunofluorescentie labeling en flow cytometrie zoals beschreven in het protocol. Mean γH2AX fluorescentie niveaus ten opzichte van die van de controle ± SD zijn vertegenwoordigd (N = 5). Deze data werden gegenereerd uit de t = 0 tijdpunt, dat werd gebruikt in figuur 3B voor de evaluatie van DNA-DSB-reparatie. (B) geïsoleerd splenocyten werden blootgesteld aan een uitdagende 2 Gy dosis γ-straling en aliquots van de cellen werden gefixeerd op tijdstippen t = 0, 1 en 24 uur na de uitdaging bestraling. De gemiddelde fluorescentie van γH2AX ten opzichte van zijn eigen t = 0 controle wordt getoond ± SD (N = 5). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De in dit document protocol is nuttig voor het uitvoeren van grootschalige muizen in vivo studies die de genotoxische effecten van lage niveaus van verschillende chemische en fysische agentia, zoals ioniserende straling. Onze unieke specifieke pathogeenvrije dier faciliteit uitgerust met een GammaBeam 150 bestraler en een 30 meter lange bestraling hal laat uitvoeren levenslange studies met lage of zeer lage dosering bestralingen op honderden of zelfs duizenden muizen. Kleinere doorstralingsinstallaties voor chronische lage dosis bestraling kan worden opgezet in een universiteit of ziekenhuis omgeving waar radiobiologie studies routinematig worden uitgevoerd en richtlijnen stralingsbescherming / voorschriften worden uitgevoerd. Echter, strengere voorschriften normaliter op installaties voor intern dierlijke bestraling wanneer behandeling van radionucliden, zoals tritium, wordt uitgevoerd. Hoewel zeldzaam, laboratoria gecertificeerd voor een zodanige interne blootstelling aan straling studies bestaan in verschillende research instellingen wereldwijd en hun unieke mogelijkheden kunnen worden gebruikt voor onderzoek beschreven in dit protocol.
Binnen het protocol, gebruiken we de immunofluorescentie labeling van γH2AX DNA DSB tarieven door experimentele blootstelling nauwkeurig te evalueren. Belangrijker is dat de invoering van een uitdagende bestraling afgeleverd ex vivo geëxtraheerd splenocyten maakt het mogelijk de intactheid van de DNA DSB response (γH2AX niveau 1 uur na de challenge) evalueren en DNA-DSB-reparatie (γH2AX niveau 24 uur vergeleken 0 uur). Opgemerkt zij dat kwantificering van γH2AX foci per cel door fluorescentiemicroscopie hogere gevoeligheid dan flowcytometrie kunnen bepalen. Bijvoorbeeld doses zo laag als 0,001 Gy werd gemeld dat significante toenames in het aantal γH2AX foci per cel produceren. Het gebruik van flowcytometrie-gebaseerde detectie van γH2AX verschaft voordelen boven fluorescentiemicroscopie analyse becagebruik het minder tijd voor metingen vereist, is het niet zeer gespecialiseerd / opgeleid personeel nodig hebben en het voorkomt subjectief-besluitvorming inzake γH2AX foci herkenning en tellen. Deze voordelen zijn cruciaal voor grootschalige dierstudies. Een typisch experiment op proefdieren 10 behandelingsgroepen en 10 muizen per groep resulteert in 100 x 3 = 300 milt monsters, indien de voorgestelde methode (figuur 1) gevolgd. Gegevens uit het aantal monsters genereren, zal ongeveer 100 uur vereist behulp van flow cytometrie. Als alternatief, indien uitgevoerd door handmatige microscopische analyses, dezelfde taak zou tenminste 300 uur duren, met een conservatieve schatting van 40 min van veeleisende microscoop keer per monster. Getracht analyse en scoring van γH2AX foci automatiseren zijn gegeven 17-19, ze allemaal een aantal beperkingen. Vooral de ronde vorm en de geringe afmetingen van muizen splenocyten en lymfocyten maakt het onpraktisch om alle lossen individual γH2AX foci microscopisch. Terwijl hechtende cellen met succes gescoord door geautomatiseerde microscopiesystemen voor γH2AX foci is zonder succes aangetoond voor zowel muis splenocyten en lymfocyten.
De beste manier om de dag-tot-dag variabiliteit in de gemeten waarden van γH2AX signaal door middel van flowcytometrie te elimineren is om experimentele groep en controlemonsters in dezelfde run te nemen en de relatieve γH2AX veranderingen binnen elke run berekenen. Extra aanbevelingen zijn onder meer: a) een historische controlegroep bestaande uit onbehandeld en 2 Gy bestraald monster wordt gebruikt in elke run; b) één persoon voert alle procedures antilichaam labeling; c) een enkele voorraad van buffers en een enkele partij van antilichaam, zowel primair als secundair, wordt gebruikt voor de hele set van de monsters binnen één experiment. Het is ook van vitaal belang om een flowcytometer kwaliteitscontrole testen aanbevolen door de fabrikant van het instrument regelmatig en voorafgaand aan elke run van de monsters uit te voeren. Dit is required optische uitlijning en fluïdica systeem van het instrument te controleren en helpt het minimaliseren van dag tot dag verschillen in gemeten fluorescentie γH2AX tussen de te vergelijken monsters of samen in een groep.
Er zij op gewezen dat het gebruik van een groter aantal tijdstippen (bijvoorbeeld 1, 2, 4, 6 uur) na uitdaging bestraling kan helpen het analyseren en meten korte DNA-DSB-reparatie kinetiek nader 16. Echter zouden de totale mogelijke herstel en de waarschijnlijkheid van vertraagde gezondheidseffecten worden weergegeven met de resterende schade enkel gemeten bij 24 uur en vergeleken met het niveau bij de eerste tijdstip (t = 0) 13-15 (figuur 4).
Aangezien γH2AX basale niveaus is bekend dat verhoging van oudere dieren of verouderde cellen 20 om een nauwkeuriger interpretatie van de verkregen langdurige blootstelling muisstudies (> 6 maanden) resultaten met de beschreven werkwijze, the toepassing van een jong onbehandelde groep, naast een leeftijd overeenkomende controle, wenselijk zijn. Hoewel sommige rapporten geven aan dat γH2AX kan toenemen in prolifererende cellen, hetgeen niet worden gerelateerd aan DNA-DSB, kan eenvoudig worden gecontroleerd door het meten van S-fase en G2 / M-fase-celfracties middels DNA histogrammen (figuur 2A, D). Indien bepaalde experimentele omstandigheden nog steeds voorkomen dat onderzoekers gebruiken γH2AX als merker van DNA schade (vanwege de bovenstaande of een combinatie redenen), ander eiwit vormen DNA-beschadiging foci, zoals 53BP1, kan worden gebruikt 21.
Hoewel er is getracht deze methode voor niet-lymfoïde weefsels, zoals spieren, het hart, de hersenen en anderen, zou het lijken moeilijk te verwerken voor flowcytometrie. Weefselcoupes en microscopie voor γH2AX foci toe zou het methode zijn, indien de analyse van dergelijke weefsels vereist. Echter, andere lymfoïde cellen, zoals perifere bloed lymphocytes, beenmerg lymfocyten of thymocyten, kan worden gebruikt voor het meten γH2AX niveaus volgens de beschreven werkwijze. Het voordeel van milt lymfocyten is de relatieve eenvoud van de celsuspensie preparaat en het grote aantal cellen die worden geïsoleerd uit de milt. Dit wordt nog extra voordelig wanneer eindpunten zijn opgenomen in de studie. In onze ervaring, een typische opbrengst van splenocyten per muis maakt het verzamelen van ten minste 10 monsters, elk voor een van de volgende assays: flowcytometrie, RT-qPCR voor gen- of miRNA expressie, western blot, genomisch DNA voor CpG methylering assay. Aldus kunnen additionele splenocyten aliquots parallel met die betreffende γH2AX eindpunt verzameld worden gebruikt om de expressie van genen betrokken bij DNA-schade signalering en herstel responsen meet. Dergelijke genen als GADD45A en CDKN1A, die normaal transcriptioneel opgereguleerd in reactie op cytotoxische behandeling 22 kan een aanwijzing verschaffen te wettenhaar cellen goed reageren op de uitdaging van stress invloed. Evenzo kunnen eiwitniveaus en post-translationele modificaties die deze stressresponsen worden beoordeeld. Ten slotte wordt niet verwacht dat een van de stappen van de extractieprocedure, indien uitgevoerd zoals hier beschreven, kan γH2AX induceren in splenocyten.
Het zou nuttig en zeer aan te bevelen om extra organen en weefsels te proeven tijdens de offers aan DNA-schade en herstel van gegevens verkregen voor splenocyten als per gepresenteerde protocol met andere eindpunten te vullen zijn. Bijvoorbeeld, we routinematig verzamelen beenmergcellen voor de in vivo beenmerg micronucleustest, verschillende weefsels voor-veroudering geassocieerde β-galactosidase en DNA-herstel genexpressie metingen. De mogelijkheid om andere weefsels zal afhangen van de beschikbare technische ondersteuning tijdens offers verzamelen; echter, kan het aanzienlijk helpen in de juiste interpretatie van de resultaten en de aanleg van een much biologisch systemisch beeld van de reactie op de geringe behandeling onderzocht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HTO: tritiated water, [3H] | locally obtained from a nuclear reactor | stock activity 3.7 GBq/mL; can be substituted with HTO from Perkin Elmer | |
| OBT: Alanine, L-[3-3H]: organically bound tritium (OBT) | Perkin Elmer | NET348005MC | 1 mCi/ml (185 MBq) |
| OBT: Glycine, [2-3H]: organically bound tritium | Perkin Elmer | NET004005MC | 1 mCi/ml (185 MBq) |
| OBT: Proline, L-[2,3-3H]: organically bound tritium (OBT) | Perkin Elmer | NET323005MC | 1 mCi/ml (185 MBq) |
| tritiated water, [3H] (HTO) | Perkin Elmer | NET001B005MC | substitute for HTO of local origin |
| GammaBeam 150 irradiator | Atomic Energy of Canada Limited | locally manufactured | can be substituted with another g-radiation source of sufficiently low activity |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379-500ML | |
| RPMI | Fisher Scientific | SH3025501 | Hyclone RPMI 1640 with L-Glutamine and HEPES 500mL |
| fetal bovine serum | Sigma Aldrich | F1051-100ML | |
| anti-gH2AX antibody, clone JBW301 | Millipore | 05-636 | |
| Alexa fluor-488 goat anti-mouse antibody | Life Technologies (formerly Invitrogen) | A21121 | |
| propidium iodine | Sigma Aldrich | P4864-10ML | 1 mg/ml |
| ethanol | Commercial Alcohols | P006-EAAN | 500 ml bottles Absolute Ethanol |
| 1.5 ml tubes | Fisher Scientific | 2682550 | microcentrifuge tubes |
| 15 ml tubes | Fisher Scientific | 05-539-5 | sterile polypropylene centrifuge tubes |
| liquid nitrogen | Linde | P110403 | |
| 12 x 75 mm uncapped glass tubes | Fisher Scientific | K60B1496126 | disposable borosilicate glass tubes with plain end |
| T25 flasks | VWR | CA15708-120 | nunc tisue culture 25ml flask (supplier no. 156340) |
| scissors | Fine Science Tools | 14068-12 | Wagner scissors 12 cm sharp/sharp |
| forceps, straight | Fine Science Tools | 11008-13 | Semken forceps 13 cm, straight |
| forceps, curved | Fine Science Tools | 11003-12 | Narrow Pattern forceps 12 cm, curved |
| 60 mm petri dishes | VWR | CA25382-100 | BD Falcon tissue culture dish 60 x 15 mm |
| cell strainers, 70 mm | Fisher Scientific | 08-771-2 | Falcon cell strainers 50/case |
| PBS recipe: 1 tablet dissolved in 200 ml of deionized water, adjust pH to 7.4 if needed. | Sigma Aldrich | P4417-100TAB | Phosphate Buffered Saline Tablets |
| TBS recipe: to make 10x stock | |||
| 30 g TRIS HCl | Sigma Aldrich | T3253-1KG | Trizma hydrochloride |
| 88 g NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | Sodium Chloride |
| 2 g KCl | Fisher Scientific | P217-500 | Potassium Chloride |
| Dissolve in 1 L of deionized water, adjust pH to 7.4 |
References
- Mitchel, R. E., Jackson, J. S., McCann, R. A., Boreham, D. R. The adaptive response modifies latency for radiation-induced myeloid leukemia in CBA/H mice. Radiat Res. 152 (3), 273-279 (1999).
- Shadley, J. D. Chromosomal adaptive response in human lymphocytes. Radiat Res. 138 (Suppl 1), S9-12 (1994).
- Wiencke, J. K., Afzal, V., Olivieri, G., Wolff, S. Evidence that the [3H]thymidine-induced adaptive response of human lymphocytes to subsequent doses of X-rays involves the induction of a chromosomal repair mechanism). Mutagenesis. 1 (5), 375-380 (1986).
- Mitchel, R. E. The dose window for radiation-induced protective adaptive responses. Dose-Response. 8 (2), 192-208 (2010).
- Tubiana, M., Feinendegen, L. E., Yang, C., Kaminski, J. M. The linear no-threshold relationship is inconsistent with radiation biologic and experimental data. Radiology. 251 (1), 13-22 (2009).
- Gent, D. C., Hoeijmakers, J. H., Kanaar, R. Chromosomal stability and the DNA double-stranded break connection. Nat Rev Genet. 2 (3), 196-206 (2001).
- Jackson, S. P. Sensing and repairing DNA double-strand breaks. Carcinogenesis. 23 (5), 687-696 (2002).
- Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).
- Schultz, L. B., Chehab, N. H., Malikzay, A., Halazonetis, T. D. p53 binding protein 1 (53BP1) is an early participant in the cellular response to DNA double-strand breaks. J Cell Biol. 151 (7), 1381-1390 (2000).
- Kinner, A., Wu, W., Staudt, C., Iliakis, G. Gamma-H2AX in recognition and signaling of DNA double-strand breaks in the context of chromatin. Nucleic Acids Res. 36 (17), 5678-5694 (2008).
- Sedelnikova, O. A., Rogakou, E. P., Panyutin, I. G., Bonner, W. M. Quantitative detection of (125)IdU-induced DNA double-strand breaks with gamma-H2AX antibody. Radiat Res. 158 (4), 486-492 (2002).
- Yuan, J., Adamski, R., Chen, J. Focus on histone variant H2AX: to be or not to be. FEBS Lett. 584 (17), 3717-3724 (2010).
- Taneja, N., et al. Histone H2AX phosphorylation as a predictor of radiosensitivity and target for radiotherapy. J Biol Chem. 279 (3), 2273-2280 (2004).
- Olive, P. L., Banath, J. P., Sinnott, L. T. Phosphorylated histone H2AX in spheroids, tumors, and tissues of mice exposed to etoposide and 3-amino-1,2,4-benzotriazine-1,3-dioxide. Cancer Res. 64 (15), 5363-5369 (2004).
- Banath, J. P., Klokov, D., MacPhail, S. H., Banuelos, C. A., Olive, P. L. Residual gammaH2AX foci as an indication of lethal DNA lesions. BMC Cancer. 10, 4 (2010).
- Blimkie, M. S., Fung, L. C., Petoukhov, E. S., Girard, C., Klokov, D. Repair of DNA double-strand breaks is not modulated by low-dose gamma radiation in C57BL/6J mice. Radiat Res. 1815 (5), 548-559 (2014).
- Runge, R., et al. Fully automated interpretation of ionizing radiation-induced gammaH2AX foci by the novel pattern recognition system AKLIDES(R). Int J Radiat Biol. 88 (5), 439-447 (2012).
- Jucha, A., et al. FociCounter: A freely available PC programme for quantitative and qualitative analysis of gamma-H2AX foci. Mutat Res. 696 (1), 16-20 (2010).
- Garty, G., et al. The RABIT: a rapid automated biodosimetry tool for radiological triage. Health Phys. 98 (2), 209-217 (2010).
- Kovalchuk, I. P., et al. Age-dependent changes in DNA repair in radiation-exposed mice. Radiat Res. 182 (6), 683-694 (2014).
- Rube, C. E., et al. DNA repair in the context of chromatin: new molecular insights by the nanoscale detection of DNA repair complexes using transmission electron microscopy. DNA Repair. 10 (4), 427-437 (2011).
- Amundson, S. A., Do, K. T., Fornace, A. J. Induction of stress genes by low doses of gamma rays. Radiat Res. 152 (3), 225-231 (1999).
