Abstract
Düşük doz radyasyon yüksek radyasyon dozları tarafından üretilen etkilerden nicelik ve nitelik olarak farklı biyolojik etkileri çeşitli üretebilir. Doğru ve bilimsel haklı bir şekilde, çevre, mesleki ve halk sağlığı güvenliği ile ilgili sorulara yanıt ağır doğru radyasyon ve kimyasal madde iyonize olarak düşük doz kirleticilerin, biyolojik etkilerini ölçmek için yeteneği dayanır. DNA hasarı ve onarımı nedeniyle kanser gibi potansiyel uzun vadeli sonuçları, sağlık riskleri en önemli erken göstergeleridir. Burada fare dalak hücrelerinde DNA hasarı ve onarımı üzerine γ- ve β-radyasyon düşük dozlarda in vivo maruz kalma kronik etkisini incelemek için bir protokol açıklar. DNA çift iplikli kırılmalara bir genel kabul görmüş kalem kullanarak, γH2AX denilen fosforile histon H2AX, biz DNA hasarı sadece düzeylerini değerlendirmek için nasıl kullanılabileceğini göstermek değil, aynı zamanda değişirDNA onarım kapasitesi potansiyel in vivo pozlarda düşük dozda tarafından üretilen. Örneklerin çok sayıda immunofluorescently etiketli γH2AX hızlı, doğru ve güvenilir bir ölçüm sağlar akım sitometrisi. DNA çift sarmallı mola onarımı (DNA onarımını tetiklemek için tatili yeterli sayıda üretmek için 2 Gy zorlu doz ayıklanır splenositlerin teşhir ederek ve isteyerek (1 saat sonrası radyoterapi) ve kalan DNA hasarını ölçerek 24 saat değerlendirilebilir post-ışınlama). Kalıntı DNA hasarı eksik onarımı ve uzun vadeli genomik instabilite ve kanser riski göstergesi olabilir. Kolayca in vivo çalışmalar (örneğin, kromozom anormallikleri, kemik iliği retikülositlerde Mikronukleus frekansları, gen ekspresyonu, vs.) gibi ölçülebilir diğer deneylerden ve son-nokta ile birlikte, bu yaklaşım, biyolojik etkileri arasında doğru ve bağlamsal değerlendirme sağlar düşük düzeyde stres.
Introduction
(Kitle iletişim araçlarının şiddetlenir) radyasyon ve Hiroşima ve Nagasaki atom bombalama ve nadir nükleer santral kazalarının görüntüleri ile tahrik radyasyon halkın korku iyonize düşük ya da çok düşük dozlarda ya potansiyel zararlı etkileri üzerinde önemli tartışma, yol açmıştır çok sıkı radyasyondan korunma yönetmeliği ve potansiyel bilimsel haklı değildir standartları. Son üç yıl içinde, çok sayıda raporlar zararlı olmaması ve düşük doz radyasyon 1-4 tarafından uyarılan potansiyel olarak yararlı biyolojik etkiler varlığını hem de belgelenmiştir. büyük radyasyon sağlık risk faktörü radyasyon yüksek veya orta doz alan atom bombası kurtulanların epidemiyolojik çalışmalara dayanarak tahmin edilen kanser olasılığı vardır. (Yani doğrusal-no-eşik veya LNT modeli olarak adlandırılır) Bu verilerin lineer ekstrapolasyonu düşük dozlarda kanser riskini tahmin etmek için kullanılır. Ancak, bu yaklaşım, dünya çapında bilimsel kabul almadıve ağır 5 tartışmalıdır.
Daha çalışmalar bu konuyu açıklığa kavuşturmak ve muhtemelen radyasyondan korunma standartlarını iyileştirmek için gerekli olduğu açıktır. Bu tür çalışmalar, DNA hasarı oranları, DNA tamiri ve mutasyon olarak ve son puan (insan etkileri tahminde için en iyi) in vivo hayvan modellerinde kronik tedaviler (çevresel ve mesleksel maruziyet en iyi yaklaşım), içermelidir. DNA mutagenez ve kanser gelişimi 6 yol açabilir radyasyon etkileri ve eksik ya da yanlış onarım zarar için öncelikli hedef olduğu bilinmektedir.
DNA çift iplikli sonları (DSB), DNA lezyonlarının en zararlı türlerinden biri olan ve hücre ölümü ve tümörogenez 7 yol açabilir. Dolayısıyla, önemli bir güvenilir ve doğru bir düşük doz radyasyon ve / veya kimyasal kirleticilerin gibi diğer stres, maruz kaldıktan sonraki DSB düzeyini ölçmek mümkün edilir. En duyarlı ve spesifik belirteçler biriDNA DSB γH2AX 8 olarak adlandırılan, fosforile edilmiş histon H2AX, henüz diğer belirteçler ve yöntemler 9,10 önerilmiştir. Bu H2AX moleküllerinin binlerce indüklenen bir DSB yakınında, bir anti-γH2AX antikoru ve floresan mikroskobu 11 immünofloresan etiketleme tek tek DSB saptanmasını sağlayan γH2AX oluşumunda yer olduğu tahmin edilmektedir. cevap 30 dakika ila 60 maksimuma ulaşan, çok hızlıdır. Kanıt γH2AX sonları sitelere diğer onarım faktörleri çekerek ve kırık DNA uçlarını çapa ve (12 gözden) diğer onarım proteinleri için erişim sağlamak için kromatin yapısını değiştirerek DNA DSB tamirini kolaylaştırır var. DNA DSB onarım tamamlanması üzerine, γH2AX fosforile de ve / veya bozulmaya uğrar ve yeni sentezlenen H2AX molekülleri kromatin 10 etkilenen bölgelerde γH2AX yerini alır. ΓH2AX oluşumunu ve kaybı olabilir İzleme,Bu nedenle, DNA DSB onarım kinetik kesin bir tahmininin sağlanması. Bu yaklaşım, Radyosensitivitenin 13-15 ile ilişkili olduğu gösterilmiş olan radyasyon ve hızı ve kalıntı DSB seviyelerinin yüksek dozlarda ışınlandı, çeşitli insan tümör hücre çizgilerinde DSB onarım incelemek için kullanılmıştır.
Biz bu deneysel bir yaklaşım modifiye ve DNA DSB düzeyleri ve tamiri (Şekil 1) Kronik γ- ve β-radyasyon düşük dozlarda etkilerini incelemek için canlı bir fare çalışmasında bunu uyguladık. İlk olarak, içme suyu içinde çözülmüş β-radyasyon için toz haline getirilmiş, su (HTO) şeklinde ya da trityum tarafından yayılan (hidrojen-3) ya da organik olarak bağlanmış trityum (OBT) farelerin bir uzun vadeli kronik maruz kalma gerçekleştirmek için bir yöntem ortaya koymaktadır . İki form birikir ve / ya da farklı vücut ve dolayısıyla dağıtma, farklı biyolojik etkilere beklenmektedir. Her iki form nükleer endüstride potansiyel tehlikeler vardır. Bu tedavibunların nispi biyolojik etkinliğinin değerlendirilmesi için çok önemlidir, iki radyasyon türlerinin doğru bir karşılaştırmasını izin vermek için, bir eşdeğer bir doz oranında γ-radyasyonuna kronik maruz kalınması ile paraleldir. Beta-radyasyon γ-radyasyon, yüksek enerjili fotonların den çok farklı kılan, elektron oluşmaktadır. Bu nedenle farkı, Β-radyasyon çoğunlukla iç sağlık tehlikesi temsil eder ve γ-radyasyon ile karşılaştırıldığında farklı biyolojik etkilere neden olabilir. Bu komplikasyon β-radyasyon için YTO yaydığı maruz düzenlenmesi üzerinde önemli tartışmalar sonuçlandı. Böylece, halk için içme suyu YTO düzenleyici düzeyleri Avrupa'da 100 Bq / L Avustralya'da 75,000 Bq / L arasında değişmektedir. Bu γ-radyasyon eşdeğer dozlara tibial osteotomi biyolojik etkilerini karşılaştırmak için, bu nedenle çok önemlidir. İkincisi, DNA DSB oranı immunofluorescently tespit γH2AX etiketli kullanarak kronik maruziyetin tamamlanmasıyla izole splenositlerde ölçülürflow sitometri tarafından ed. Bu in vivo maruz kalma açtığı DNA hasarının ölçüde değerlendirilmesini sağlamaktadır. Ancak, bu gibi düşük düzeyde maruz DNA DSB tespit edilebilir herhangi bir fiyat vermeyebilir beklemek mantıklıdır; Bunun yerine, bazı gizli değişiklikleri / yanıtları DNA hasarı onarmak için hücrelerin yeteneğini etkileyebilir ki beklenebilir. Bu değişiklikler bulursa, olabilir, ya uyarıcı (zararlı bir etki üreten) (faydalı bir etki oluşturarak) ya da inhibitör. önerilen protokol hasarı önemli miktarda üretir radyasyon yüksek bir doz ile ekstre splenositlerin zorlayarak bu tür değişiklikleri ortaya sağlar (örneğin, 2 Gy yaklaşık 50 hücre başına DNA DSB veya 3 üretilmesi -. Toplam γH2AX seviyesinde 5 kat artış) . Daha sonra, DSB onarım başlangıç ve bitiş yansıtan oluşumu ve γH2AX kaybı, akış sitometrisi tarafından izlenir. Bu şekilde, taban ve DNA DSB tedavisi kaynaklı seviyeleri sadece ölçülen edilebilir, ancakAyrıca hücrelerin yeteneği üzerindeki potansiyel etkisi yanıt ve onarım DNA hasarı çok daha yüksek stres seviyeleri tarafından uyarılan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm fare kullanımı ve tedavi prosedürleri, yerel hayvan bakım komitesi tarafından yasama ve / veya hayvan bakım programları tarafından belirlenen ve onaylanan kurallara uymalıdır. Bu protokol açıklanan tüm yöntemler, yerel hayvan bakım komitesi onayı ile Hayvan Bakımı Kanada Konseyi kurallarına uygun olarak yapıldı.
DİKKAT: radyoaktivite ile tüm çalışma (dahil, ancak radyoaktif hayvan dokuları, yatak atık taşıma, Trityum taşınması, dış γ-radyasyon sınırlı olmayan) Yasama ve / veya radyasyon koruma yetkilileri tarafından belirlenen kurallara uymak gerekir ve yetkili tarafından gerçekleştirilmelidir sertifikalı laboratuvar ve / veya tesis personel.
1. Hayvan Çalışması
- Hayvan gruplandırma
- Fareler, bir dış kuruluş gelen yapıyorsanız, hayvan barınağında en az 10 gün süreyle hayvan iklime alıştırmak. Çalışma birden fazla tedavi grupları içeriyorsa, hayvan tedarikçisi al gönderebilirsiniz sağlamaktek bir toplu iş olarak l hayvanlar.
- Rastgele grup başına 10 farelerden oluşan gelişigüzel tedavi gruplarına tahsis fareler. C57BL / 6 suşu erkek fareler kullanıyorsanız, saldırganlık sorunları azaltmak için kendi tesislerinde çok genç C57BL / 6 erkek rasgele ön düzenlemek hayvan tedarikçisi var.
- İç β-Radyasyon Fareler Kronik Maruz
- YTO ve OBT çözeltiler (toz haline getirilmiş olan prolin, alanin ve glisin amino asitler karışımı) orjinal stok seyreltilmesi ile bir fare, içme suyu içinde çalışan trityum konsantrasyonları (10 kBq / L ve 1 MBq / L) hazırlayın.
- Bir sıvı sintilasyon sayacı kullanılarak radyoaktivite ölçülerek, içme suyu içinde trityum nihai konsantrasyonlar doğrula. Gerekirse, konsantrasyonları ayarlayın.
- Trityum suya erişim ad libitum sağlayarak bir ay boyunca hayvanları davranın. Tedavi su, iki haftalık dönemde düşük alırsa, daha fazla su ekleyin. Aksi takdirde, iki hafta şişe değiştirin.
- Treat sahte-ışınlanmış kontrolfareler aynı. Ayrı bir "temiz" bir odada veya havadan trityum çapraz bulaşmayı önlemek için pozitif hava basıncı altında ayrı bir "temiz" raf tutun.
- Dış γ-Radyasyon Fareler Kronik Maruz
Not: γ-ışınlama tesisi / ekipman konumuna bağlı olarak değişir. - Dozimetri mevcut yöntemler kullanarak, istenilen doz oranlarını üreten radyasyon alanlarına sahip bir γ-radyasyon kaynağından mesafeleri belirler. Hayvan kafesleri kapsayan alanlarda radyasyon alanlarının homojenliği sağlamak.
Not: 1.7 μGy / h 1 MBq / gövde L tritium ile üretilen bir doz hızı eşdeğerdir. - Bir ay boyunca adım 1.3.1 belirlenen mesafelerde fare kafesleri koyarak fareler Açığa. 30 dakika γ-ışınlama günlük kesinti en aza indirin. Toplam absorbe doz ölçmek için termolüminesans dozimetreleri kullanın.
2. Kurbanlar ve Örnekleme
Not: Çıkarılan dalak medya ile 60 mm yemekleri tutulabilir farelerin kalan feda iken (en fazla 2 saat boyunca)ed. 5 ve 15 fareler arasında, katılan insan sayısına bağlı olarak, bir gün içinde işlenebilir.
Splenosit kültürleri 3. hazırlanması
- Kavisli ucu ile steril forseps ile bir hücre süzgeç içine kıyma ile dalak homojenleştirin.
- Hücre süzgecinden çıkarın ve 15 ml'lik bir tüp içine 60 mm çanak filtre hücre süspansiyonu toplanır.
- Hücrelerin geri kalanı toplamak için ortam 5 ml hücre süzgecinden durulayın.
- Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj tüpleri.
- Boşaltın süpernatan ve RPMI, 10 ml pelet yeniden askıya.
- Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj tüpleri.
- Boşaltın süpernatan ve RPMI, 5 ml tam içinde topağın tekrar askıya.
- 25 ml'lik bir doku kültürü şişesi içine Aktarım hücre süspansiyonu, 4 ml bir CO2 inkübatör kaldırma (37 ° C,% 5 CO2,% 80 nem)
4. Radyasyon Zorlu ve Sabitleme
- Transferi4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g buz ve santrifüj üzerinde 1.5 ml'lik bir tüp içine adım 3.8 hücre süspansiyonu 1 ml kalmıştır. Bu örnek ölçülen DNA hasarı, bir DNA onarım eğrisinin oluşturulması için, her iki tedavi kaynaklı hasar ve t = 0, veri noktasını temsil eder.
- Dikkatle bir vakum pompası kullanılarak süpernatant aspire. Yavaşça TBS tamponu (20 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCI, 2.7 mM KCI) 1 ml pelet yeniden askıya.
- 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj tüpleri. Dikkatle bir vakum pompası kullanılarak süpernatant aspire. Yavaşça TBS 300 ul pelet yeniden askıya.
- Düşük hızda bir girdap ile karıştırılarak birlikte, -20 ° C,% 100 etanol içinde 700 ul ilave edin. Kapağı kapatın ve karıştırmak için birkaç kez ters çevirin.
- -20 ° C'de örnekleri saklayın. Etanol içinde sabit splenositler γH2AX sinyal içerisinde herhangi önemli bir kayıp olmadan en az 12 ay boyunca -20 ° C 'de muhafaza edilebilir.
- Zorlu bir γ-rad ile adım 3,8 splenosit kültürleri saçmak Mevcut ışınlama cihazı kullanarak bir doz hızı ≥ 200 mGy / dk 2 Gy iation dozu.
Not: Bu ışınlama amacı tamir makineleri meydan DNA DSB ikna etmektir. X-ışınları, aynı zamanda bu amaç için kullanılabilir. - Hemen bir CO 2 inkübatör kültürleri dönün.
- 1 saat zorlu 2 Gy radyasyon sonrası, biyolojik güvenlik kabini için inkübatör kültürleri kaldırın. Temsili bir numune kısım toplamak için, yavaşça buz üzerinde 1.5 ml tüp bir pipet ve hücre süspansiyonu transferi 1 ml kullanarak hücrelerin yeniden askıya. CO 2 inkübatör hücre kültürleri dönün.
- 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj tüpleri. Dikkatle bir vakum pompası kullanılarak süpernatant aspire. Yavaşça TBS 1 ml pelet yeniden askıya.
- Tekrarlayın 4.3 adımları - 4.5.
- 24 saat zorlu 2 Gy γ-radyasyon, hasattan sonra ve adım 4.8 açıklandığı gibi 24 saat numunenin = at düzeltmek - 4.10.
Not: Genellikle, 15 - 30 günlük örnekler immunofluorescently etiketlenmiş ve tek seferde akış sitometresi ile analiz edilebilir. Tedavi grupları arasında bir karşılaştırma sağlamak için her bir gruptan bir örnek (ler) içerir. Ayrıca daha detaylı bilgi için 16 referans bakın.
- Buz üzerinde etiketli numune sayısı için tüplerin seti işlenecek ve yer hazırlayın. 12 x 75 mm kapatılmamış cam tüpler kullanın. Sterilite, bu iş için gerekli değildir. ("2nd Ab sadece") Sadece ikincil antikor ile etiketleme için bir ek tarihsel kontrol örneği ekleyin. Bir çalışma içinde çalıştırmak sitometri her akışında bu tarihi kontrol örneği kullanın.
- Her tüpe buz soğukluğunda TBS 0.5 ml ilave edilir.
- 5 saniye süreyle -20 ° C'de, girdap gelen sabit splenositlerin çıkarın ve TBS ile hazırlanan borular için 0.5 ml'lik bir şişe aktarılır. -20 ° C depolama geri numunelerin kalanını yerleştirin veYedek örnek olarak tutun.
- 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj splenositler. Süpernatant boşaltacaktır ve yavaşça% 1 FBS içeren buz gibi soğuk TBS içinde 1 ml pelet yeniden askıya
- 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüje hücreleri. TST tamponunda (TBS içinde% 0.05 Triton X-100,% 2 FBS) 1 ml pelet yeniden askıya hafifçe süpernatant boşaltacaktır ve. Buz üzerinde 20 dakika süreyle inkübe edin.
- 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüje hücreleri. Süpernatant boşaltacaktır ve yavaşça 1 seyreltilmiş birincil anti-γH2AX antikoru 200 ul pelet yeniden askıya: TCT tampon maddesi içinde 150. "2nd Ab sadece" kontrol numunesi için TDT 200 ul kullanın.
- 45 'lik bir açıda dönen bir çalkalayıcı üzerinde Pozisyon borular - 60 ° ve oda sıcaklığında 300 xg'de 1.5 saat çalkalanır.
- TCT tampon maddesi içinde 200 seyreltme: tüpler kuluçka iken, bir 1 Alexa-488 ile konjüge edilmiş keçi anti-fare ikincil antikoru yeterli bir hacmi (200 ul / numune) hazırlanması.
Not: Alexa-488 içeren tüm çalışmakonjuge antikor (5.10 aşağıda 5.16 adımları) loş ışık koşullarında yapılmalı ve etiketli örnekler alüminyum folyo tüpler sararak ışıktan korunmalıdır. - 1.5 saat inkübasyon işlemi tamamlandıktan sonra, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de Her bir tüp ve santrifüj% 2 FBS içeren buz gibi soğuk TBS içinde 1 ml. % 2 FBS içeren TBS içinde 1 ml pelet yeniden askıya hafifçe süpernatant boşaltacaktır ve.
- 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin. Aşama 5.8 ile ilgili ikincil antikor çözeltisinin 200 ul pelet yeniden askıya hafifçe süpernatant boşaltacaktır ve.
- Aşama 5.7 olarak 1 saat süre ile bir çalkalama platformu üzerinde inkübe edin.
- % 1 FBS içeren buz gibi soğuk TBS 1 ml ilave edilir.
- 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin. Süpernatant boşaltacaktır ve yavaşça buz soğukluğunda TBS içinde 1 ml pelet yeniden askıya.
- 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin. Süpernatant boşaltacaktır ve yavaşça 50 ug / ml ihtiva eden TBS içinde 0.5 ml pelet yeniden askıyapropidiyum iyodür.
- Işıktan korunan, oda sıcaklığında 5 dakika süreyle inkübe edilir.
- Alet özgü protokoller 16 kullanarak bir akış sitometresinde örnekleri analiz edin. Numune başına en az 10.000 hücre okuyun.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Splenosit için beklenen grafikler burada açıklanan yöntem kullanılarak hazırlandı sitometrisi Şekil 2, akış örneklerini göstermektedir. Hücreler ilk <elektronik hacim tarafı dağılım> scatter plot dayalı kapılı (Şekil 2A ve 2B, elektronik hacim forward scatter eşdeğerdir). FL3 / propidyum iyot histogramlar (Şekil 2B ve 2E), normal hücre döngüsü dağılımı onaylayın. FL1 kanalı kullanılarak hesaplanır γH2AX sinyal ortalama tedavi edilmemiş kontrol (Şekil 2C) ile karşılaştırıldığında hücrelerin (Şekil 2F) ışımaya 2-Gy DNA DSB bir> 2-kat artış teyit etmektedir. Sonra, immunofluorescently, fare splenositlerinde akış sitometrisi ile γH2AX etiketli ölçme tarif edilen yöntemin duyarlılığı incelenmiştir. Şekil 3A, fare splenositlerinde γH2AX seviyeleri DNA DSB göstergesi gösterir ex vivo maruz bırakıldıktan sonra 1 saat ya düşük (0.1Gy) veya işlenmemiş kontrole γ-radyasyon nisbetle yüksek (2 Gy) doz. 0.1 Gy DSB düzeyinde hafif bir artışa yol açtığı ve bu artışın istatistiksel olarak anlamlı olduğu görülmektedir. Güçlü 3 kat indüksiyon beklenen ve 2 Gy maruz kaldıktan sonra tespit edildi. Protokolde tarif edildiği gibi γH2AX immünofloresan etiketleme özgüllüğünü doğrulamak için, etiketli hücreler bir floresan mikroskobu ile incelenmiştir. gözlenen belirgin odaklar benzeri desen floresan sinyali kromatin içinde tek tek bir DNA DSB (Şekil 3B) kaynaklı olduğunu gösterir.
DNA DSB oranının değerlendirilmesi ve tritiye su, çok düşük konsantrasyonlarda (10 kBq / L) bir ay boyunca maruz kalan farelerin splenositleri içindeki tamir Örnek sonuçlar Şekil 4'te sunulmaktadır. Bu (Şekil 4A) olduğu görülebilir, ancak Tedavi bazal γH2AX seviyesinin% 10 artışla sonuçlanmıştır, değişiklik yok oldut istatistiksel olarak anlamlı (N = 5, tek örnek Student t testi). Dahası, DNA DSB onarım kinetik temsil zorlu 2 Gy ışınlama sonrası ölçülen oluşumu ve γH2AX kaybı, kontrol ve HTO-tedavi edilen farelerde (Şekil 4B) hücreleri arasında farklı değildi.
Şekil 1. Deneysel diyagramdır DNA hasarı ve DNA onarımı kronik in vivo ışınlama etkilerini değerlendirmek. Istenen bir zaman dönemi için, kronik ışımasıyla farelerde in vivo işlemden sonra, fareler kurban edilmiş ve splenosit kültürleri zorlu kurulmuş ve maruz ışınlama. Splenocyte örnekler toplanır ve zorlu dozdan sonra çeşitli zamanlarda tespit edilir. ΓH2AX Düzeyleri sonra immunofluorescent la kullanılarak ölçülürBeling ve akış sitometrisi ile tespiti. Şekil altındaki arsa beklenen veri şematik bir görünümüdür. DNA tamir tamamlandığında ise Gama-H2AX seviyesi büyük ölçüde, erken geri kontrol değerine azalma ardından zorlu ışınlama sonrası artar. DNA hasarı Δ DNA DSB onarım kapasitesine farelerin tedavinin etkisini gösterir fare ve DNA onarım Δ deneysel tedavi nedeniyle üretilen hasarı temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. Temsilcisi ham veriler flow sitometri. (A, D) dalak ve hücre artıkları ve eritrositler için Dağılım araziler ve yolluk bölgeleri. (B, E) hücre döngüsü dağılımları temsil DNA histogramları.
Akış sitometrisi ile γ H2AX Şekil 3. Algılama duyarlı ve spesifik olan. (A), taze bir erkek CBA farelerinden yalıtılmış splenositlerin γ-radyasyon veya plasebo ile muamele edilmiş ve 1 saat süreyle γH2AX tepkisini geliştirmek için izin 0.1 ya da 2 ya da Gy ile ışınlandı. Hücreler daha sonra immunofluorescently, sabitlenmişAnti-γH2AX antikor ile etiketlenir ve akış sitometrisi ile analiz edilmiştir. ± SD Normalize ortalama değerleri (N = 12) gösterilmektedir. * Ve *** p <0.05 ve p <0.001, saygıyla (tek örnek Student t-testi) ile istatistiksel fark anlamına gelir. (B) işlem görmemiş kontrol Temsilcisi Microphotographs (UT) veya 2 Gy immunofluorescently anti-γH2AX ile etiketlenmiş splenositlerin ışınlanmış antikordur. Yeşil floresan odakları gibi desen γH2AX için immunofluorescent etiketleme özgünlüğünü teyit etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Trityumlu wate farelerin 1 aylık maruz tarafından üretilen etkinin eksikliği gösteren Şekil 4. Temsilcisi sonuçlarıDNA DSB seviyesi ve onarım r (YTO). (A), splenositler, su ve kontrol hayvanları içme 10 kBq tibial osteotomi / L ile tedavi edilen farelerden izole edilmiştir. γH2AX seviyesi immünofloresan etiketleme kullanılarak ölçülmüş ve protokolde tarif edildiği gibi akış sitometrisi edildi. ± SD kontrol kişilerce göre γH2AX floresan seviyeleri gösterilmektedir ortalama (n = 5). Bu veriler DNA DSB onarım değerlendirilmesi için Şekil 3B'de kullanılan t = 0 zaman noktası elde edildi. (B), yalıtılmış splenositlerin γ-radyasyon zorlu 2 Gy dozuna maruz bırakılmış ve hücrelerin alikoları sabitlendi kez t = 0, zorlu ışınlama sonrası 1 ve 24 saat. Kendi t = 0 kontrole γH2AX göreli floresan ortalama ± SD gösterilir (N = 5). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu makalede sunulan protokol iyonize radyasyon dahil olmak üzere çeşitli kimyasal ve fiziksel ajanların düşük seviyelerde, genotoksik etkilerini inceleyen in vivo çalışmalar büyük ölçekli fare yürütülmesi için yararlıdır. Bizim eşsiz spesifik patojen içermeyen bir hayvan tesisi GammaBeam 150 ışınlayıcılar ile donatılmış ve 30 metre uzunluğundaki ışınlama salonu yüzlerce ya da farelerin hatta binlerce düşük ya da çok düşük doz oranı aydınlatılmasını kapsayan yaşam boyu çalışmalar yürütmektedir verir. Kronik düşük doz ışınlama için küçük ışınlama tesisleri radyobiyoloji çalışmalar rutin olarak yapılmaktadır ve radyasyondan korunma kurallar / düzenlemeler uygulanır bir üniversite veya hastane ortamında kurulabilir. Bununla birlikte, daha sıkı yönetmelikler normal trityum gibi radyonüklitler ele alınması, gerçekleştirilir iç hayvan ışınlama için tasarlanmış tesisleri için de geçerlidir. Nadir olmakla birlikte, bu tür iç radyasyona maruz kalma çalışmaları için sertifikalı laboratuarlar çeşitli yeniden varArama kurumları dünya çapında ve kendilerine özgü yetenekleri bu protokolü açıklanan çalışmalar için de kullanılabilir.
Protokol kapsamında, biz doğru deneysel maruz kalma tarafından üretilen DNA DSB oranlarını değerlendirmek γH2AX immunofluorescent etiketleme kullanın. Kıyasla 24 saatte Daha da önemlisi, zorlu bir ışınlama giriş ayıklanır splenositlere ex vivo teslim DNA DSB yanıtı (γH2AX düzey mücadeleden sonra 1 saat sonra) itibaren, bütünlüğü değerlendirmek mümkün ve DNA DSB onarım yapar (γH2AX seviyesi 0 saat). Bu floresan mikroskobu ile hücre başına γH2AX odaklarının miktar akış sitometrisi ile karşılaştırıldığında daha yüksek bir duyarlılık sağlayan hususu not edilmelidir. Örneğin, Gy hücre başına γH2AX odaklarının sayısında önemli artışlar üretmek bildirildi düşük 0.001 olarak dozlar. Bununla birlikte, γH2AX akış sitometri tabanlı algılama kullanımı floresan mikroskopi analizi beca fazla avantajlar sağlar;Bu ölçümler için daha az zaman gerektirir kullanın, bu son derece uzmanlaşmış / eğitimli personel gerektirmez ve sübjektif karar γH2AX ilgili tanıma ve sayma odaklarındaki önler. Bu avantajlar, büyük ölçekli hayvan çalışmaları için önemlidir. Yöntem, takip edilir (Şekil 1) önerilmektedir halinde 10 tedavi grupları ve grup başına 10 fare ile tipik bir hayvan deneyi, 100 x 3 = 300 dalak örnekleri neden olur. Numunelerin bu numaradan, veri üretebilmek için yaklaşık 100 saat flow sitometri kullanılarak gerekli olacaktır. Manuel mikroskobik analizler yapılır Alternatif olarak, eğer aynı görev numune başına son derece zorlu mikroskop süresi 40 dakika muhafazakar bir tahminini kullanarak, en az 300 saat alacaktı. ΓH2AX odaklarının analizi ve puanlama otomatikleştirmek için girişimleri 17-19 yapılmış olmasına rağmen, hepsi sınırlamalar bir dizi var. Özellikle, yuvarlak şekli ve fare dalak ve lenfositlerin küçük boyutlu indiv bu pratik bütün çözmek için yaparidual γH2AX mikroskopik odaklarındaki. Yapışan hücreler başarılı γH2AX odaklar için otomatik mikroskopi sistemlerinin attı edilmiş olmakla beraber, herhangi bir başarı fare dalak veya lenfositlere biri için gösterilmiştir.
flow sitometri ile γH2AX sinyali ölçülen değerler gün-gün değişkenliği ortadan kaldırmak için en iyi yolu, aynı dönemde deney grubu ve kontrol örnekleri içerecek şekilde ve her çalışma içinde göreceli γH2AX değişiklikleri hesaplamak etmektir. Ek öneriler şunlardır: a) tedavi edilmemiş ve 2 Gy oluşan tarihsel kontrol numunesi her vadede kullanılır ışınlanmış; b) bir kişi tüm antikor etiketleme işlemleri gerçekleştirir; c) birincil ve ikincil tamponlar ve antikorun tek bir toplu, tek bir stoku, bir deney içinde numune, tüm küme için kullanılır. Bu örneklerin her çalıştırmak için rutin ve önceki enstrüman üreticisi tarafından tavsiye edilen kalite kontrol testi bir akış sitometresinin gerçekleştirmek için de hayati önem taşımaktadır. Bu req olduğunuCihazın optik hizalama ve fluidik sistemini doğrulamak için edinilmiş ve de karşılaştırıldı veya bir grup toplanmış olan örnekler arasında ölçülen γH2AX floresan gün-gün varyasyonu minimize yardımcı olur.
Bu işaret gerektiğini zaman noktalarında (örneğin, 1, 2, 4, 6 saat) sonrası zorlu ışınlama analiz edilmesine yardımcı ve daha detaylı 16 kısa süreli DNA DSB onarım kinetik ölçmek olabilir daha çok sayıda kullanımı. Ancak, genel onarım potansiyeli ve gecikmiş sağlık etkileri olasılığından, 24 saat sadece ölçülen ve ilk zaman noktasında (t = 0) 13-15 (Şekil 4) gözlemlenen bir oranla artık hasar ile temsil edilecektir.
Bazal γH2AX kat, inci tarif edilen yöntem kullanılarak, uzun süre maruz kalma fare deneylerinde (> 6 ay) 'de elde edilen sonuçlar daha doğru yorumlanması için, yaşlı hayvanlarda ya da yaşlanmış hücrelerde 20 arttığı bilinmektedir yanaküçük, muamele edilmemiş grubun e kullanımı, yaş-uyumlu kontrolüne ek olarak, tavsiye edilmektedir. Bazı raporlar, γH2AX DNA DSB ile ilişkili değildir çoğalan hücrelere artabilir göstermektedir, ancak, bu kolayca S-fazı ve G2 ölçülerek kontrol edilebilir / M faz DNA, histogramlar kullanılarak hücre fraksiyonları (Şekil 2A, d). Bazı deneysel koşullar hala DNA hasarının bir göstergesi olarak γH2AX kullanarak bir araştırmacı önlemek Eğer böyle 53BP1 gibi başka protein oluşturan DNA hasarı odaklarının, (nedeniyle kombine veya üstünde özetlenen nedenlerle), 21 kullanılabilir.
Böyle kası, kalp, beyin ve diğerleri gibi Lenfoid olmayan dokular için bu yöntemi kullanarak teşebbüs olmasına rağmen, akış sitometrisi için bunları işlemek zor görünmektedir. Bu tür doku analizi gerekli ise γH2AX odakları sayımı için doku kesitleri ve mikroskopi, tercih edilen bir yöntem olacaktır. Bununla birlikte, bu periferal kan l gibi diğer lenfoid hücreleri,ymphocytes, kemik iliği lenfositleri veya timositleri, tarif edilen yöntemle γH2AX seviyelerini ölçmek için kullanılabilir. dalak lenfositleri kullanmanın avantajı, hücre süspansiyonu hazırlanması ve dalak izole edilebilir hücrelerin çok sayıda nispeten basit olmasıdır. Ek son noktaları çalışmaya dahil edilmiştir, bu daha da avantajlı hale gelir. , Akış sitometrisi gen veya MiRNA ifadesi, western blot için RT-qPCR CpG metilasyon için genomik DNA, Deneyimlerimize göre, fare başına splenositlerin tipik bir verimi, aşağıdaki deneylerden herhangi biri için, her biri uygun, en az 10 alikotları toplanmasına olanak deneyi. Bu nedenle, γH2AX son nokta kişilerce paralel toplanan ilave splenosit alikotları DNA hasarı sinyal ve onarım yanıtlarında rol oynayan genlerin ekspresyonunu ölçmek için kullanılabilir. Uyandırmak için sitotoksik tedavi 22 yanıt olarak ayarlanır kadar transkripsiyonel normal olarak GADD45A ve CDKN1A gibi genler, bir anahtar sağlayabilirOnun hücrelerin düzgün zorlu stres etkisi tepki veriyorlar. Benzer şekilde, stres tepkileri ile bağlantılı olan protein seviyeleri ve post-translasyonel modifikasyonlar değerlendirilebilir. Son olarak, bu ekstraksiyon prosedürü herhangi bir aşaması, burada tarif edildiği gibi yapıldı, eğer, splenositlerde γH2AX uyarabilir beklenmemektedir.
Bu faydalı ve son derece diğer uç noktaları ile sunulmaktadır protokole göre dalak için elde edilen DNA hasarı ve onarımı verilerini desteklemek için kurban sırasında ek organ ve dokuları örneklemek için tavsiye olurdu. Örneğin, rutin olarak kemik iliği, in vivo kemik iliği mikronükleus deneyi için hücreler, yaşlanmayla ilişkili β-galaktosidaz ve DNA onarım geni sentezleme ölçümleri için, çeşitli dokuların toplar. kurban sırasında kullanılabilir teknik destek bağlı olacağını, diğer dokulara toplamak için yeteneği; Ancak, önemli ölçüde sonuçların doğru yorumlanması ve bir mu yapımında yardımcı olabilirch biyolojik olarak daha düşük seviyede tedaviye yanıtın ilgili sistemik resim araştırılmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HTO: tritiated water, [3H] | locally obtained from a nuclear reactor | stock activity 3.7 GBq/mL; can be substituted with HTO from Perkin Elmer | |
| OBT: Alanine, L-[3-3H]: organically bound tritium (OBT) | Perkin Elmer | NET348005MC | 1 mCi/ml (185 MBq) |
| OBT: Glycine, [2-3H]: organically bound tritium | Perkin Elmer | NET004005MC | 1 mCi/ml (185 MBq) |
| OBT: Proline, L-[2,3-3H]: organically bound tritium (OBT) | Perkin Elmer | NET323005MC | 1 mCi/ml (185 MBq) |
| tritiated water, [3H] (HTO) | Perkin Elmer | NET001B005MC | substitute for HTO of local origin |
| GammaBeam 150 irradiator | Atomic Energy of Canada Limited | locally manufactured | can be substituted with another g-radiation source of sufficiently low activity |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379-500ML | |
| RPMI | Fisher Scientific | SH3025501 | Hyclone RPMI 1640 with L-Glutamine and HEPES 500mL |
| fetal bovine serum | Sigma Aldrich | F1051-100ML | |
| anti-gH2AX antibody, clone JBW301 | Millipore | 05-636 | |
| Alexa fluor-488 goat anti-mouse antibody | Life Technologies (formerly Invitrogen) | A21121 | |
| propidium iodine | Sigma Aldrich | P4864-10ML | 1 mg/ml |
| ethanol | Commercial Alcohols | P006-EAAN | 500 ml bottles Absolute Ethanol |
| 1.5 ml tubes | Fisher Scientific | 2682550 | microcentrifuge tubes |
| 15 ml tubes | Fisher Scientific | 05-539-5 | sterile polypropylene centrifuge tubes |
| liquid nitrogen | Linde | P110403 | |
| 12 x 75 mm uncapped glass tubes | Fisher Scientific | K60B1496126 | disposable borosilicate glass tubes with plain end |
| T25 flasks | VWR | CA15708-120 | nunc tisue culture 25ml flask (supplier no. 156340) |
| scissors | Fine Science Tools | 14068-12 | Wagner scissors 12 cm sharp/sharp |
| forceps, straight | Fine Science Tools | 11008-13 | Semken forceps 13 cm, straight |
| forceps, curved | Fine Science Tools | 11003-12 | Narrow Pattern forceps 12 cm, curved |
| 60 mm petri dishes | VWR | CA25382-100 | BD Falcon tissue culture dish 60 x 15 mm |
| cell strainers, 70 mm | Fisher Scientific | 08-771-2 | Falcon cell strainers 50/case |
| PBS recipe: 1 tablet dissolved in 200 ml of deionized water, adjust pH to 7.4 if needed. | Sigma Aldrich | P4417-100TAB | Phosphate Buffered Saline Tablets |
| TBS recipe: to make 10x stock | |||
| 30 g TRIS HCl | Sigma Aldrich | T3253-1KG | Trizma hydrochloride |
| 88 g NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | Sodium Chloride |
| 2 g KCl | Fisher Scientific | P217-500 | Potassium Chloride |
| Dissolve in 1 L of deionized water, adjust pH to 7.4 |
References
- Mitchel, R. E., Jackson, J. S., McCann, R. A., Boreham, D. R. The adaptive response modifies latency for radiation-induced myeloid leukemia in CBA/H mice. Radiat Res. 152 (3), 273-279 (1999).
- Shadley, J. D. Chromosomal adaptive response in human lymphocytes. Radiat Res. 138 (Suppl 1), S9-12 (1994).
- Wiencke, J. K., Afzal, V., Olivieri, G., Wolff, S. Evidence that the [3H]thymidine-induced adaptive response of human lymphocytes to subsequent doses of X-rays involves the induction of a chromosomal repair mechanism). Mutagenesis. 1 (5), 375-380 (1986).
- Mitchel, R. E. The dose window for radiation-induced protective adaptive responses. Dose-Response. 8 (2), 192-208 (2010).
- Tubiana, M., Feinendegen, L. E., Yang, C., Kaminski, J. M. The linear no-threshold relationship is inconsistent with radiation biologic and experimental data. Radiology. 251 (1), 13-22 (2009).
- Gent, D. C., Hoeijmakers, J. H., Kanaar, R. Chromosomal stability and the DNA double-stranded break connection. Nat Rev Genet. 2 (3), 196-206 (2001).
- Jackson, S. P. Sensing and repairing DNA double-strand breaks. Carcinogenesis. 23 (5), 687-696 (2002).
- Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).
- Schultz, L. B., Chehab, N. H., Malikzay, A., Halazonetis, T. D. p53 binding protein 1 (53BP1) is an early participant in the cellular response to DNA double-strand breaks. J Cell Biol. 151 (7), 1381-1390 (2000).
- Kinner, A., Wu, W., Staudt, C., Iliakis, G. Gamma-H2AX in recognition and signaling of DNA double-strand breaks in the context of chromatin. Nucleic Acids Res. 36 (17), 5678-5694 (2008).
- Sedelnikova, O. A., Rogakou, E. P., Panyutin, I. G., Bonner, W. M. Quantitative detection of (125)IdU-induced DNA double-strand breaks with gamma-H2AX antibody. Radiat Res. 158 (4), 486-492 (2002).
- Yuan, J., Adamski, R., Chen, J. Focus on histone variant H2AX: to be or not to be. FEBS Lett. 584 (17), 3717-3724 (2010).
- Taneja, N., et al. Histone H2AX phosphorylation as a predictor of radiosensitivity and target for radiotherapy. J Biol Chem. 279 (3), 2273-2280 (2004).
- Olive, P. L., Banath, J. P., Sinnott, L. T. Phosphorylated histone H2AX in spheroids, tumors, and tissues of mice exposed to etoposide and 3-amino-1,2,4-benzotriazine-1,3-dioxide. Cancer Res. 64 (15), 5363-5369 (2004).
- Banath, J. P., Klokov, D., MacPhail, S. H., Banuelos, C. A., Olive, P. L. Residual gammaH2AX foci as an indication of lethal DNA lesions. BMC Cancer. 10, 4 (2010).
- Blimkie, M. S., Fung, L. C., Petoukhov, E. S., Girard, C., Klokov, D. Repair of DNA double-strand breaks is not modulated by low-dose gamma radiation in C57BL/6J mice. Radiat Res. 1815 (5), 548-559 (2014).
- Runge, R., et al. Fully automated interpretation of ionizing radiation-induced gammaH2AX foci by the novel pattern recognition system AKLIDES(R). Int J Radiat Biol. 88 (5), 439-447 (2012).
- Jucha, A., et al. FociCounter: A freely available PC programme for quantitative and qualitative analysis of gamma-H2AX foci. Mutat Res. 696 (1), 16-20 (2010).
- Garty, G., et al. The RABIT: a rapid automated biodosimetry tool for radiological triage. Health Phys. 98 (2), 209-217 (2010).
- Kovalchuk, I. P., et al. Age-dependent changes in DNA repair in radiation-exposed mice. Radiat Res. 182 (6), 683-694 (2014).
- Rube, C. E., et al. DNA repair in the context of chromatin: new molecular insights by the nanoscale detection of DNA repair complexes using transmission electron microscopy. DNA Repair. 10 (4), 427-437 (2011).
- Amundson, S. A., Do, K. T., Fornace, A. J. Induction of stress genes by low doses of gamma rays. Radiat Res. 152 (3), 225-231 (1999).
