Abstract
Strålning Låg dos kan producera en mängd biologiska effekter som skiljer sig i kvantitet och kvalitet från de effekter som höga stråldoser. Att ta itu med frågor som rör miljö, arbetsmiljö och folkhälsa säkerhet på ett korrekt och vetenskapligt motiverat sätt är starkt beroende av förmågan att noggrant mäta de biologiska effekterna av låga doser föroreningar, såsom joniserande strålning och kemiska ämnen. DNA-skador och reparation är de viktigaste tidiga indikatorer på hälsorisker på grund av deras potentiella konsekvenser på lång sikt, såsom cancer. Här beskriver vi ett protokoll för att studera effekten av kronisk in vivo exponering för låga doser av γ- och β-strålning på DNA-skador och reparation i musmjältceller. Med hjälp av en allmänt accepterad markör för DNA dubbel-strängbrott, fosforylerad histon H2AX kallas γH2AX visar vi hur det kan användas för att utvärdera inte bara nivåerna av DNA-skada, men även förändringari DNA-reparation kapacitet potentiellt produceras av låg dos in vivo exponeringar. Flödescytometri möjliggör snabb, korrekt och tillförlitlig mätning av immunofluorescently märkt γH2AX i ett stort antal prover. DNA dubbelsträngbrott reparation kan utvärderas genom att exponera extraherade splenocyter till en utmanande dos av 2 Gy för att producera ett tillräckligt antal DNA-brott för att utlösa reparation och genom att mäta den inducerade (1 h efter bestrålning) och kvarvarande DNA-skada (24 tim efter bestrålning). Återstående DNA-skada skulle vara ett tecken på ofullständig reparation och risken för långsiktiga genomisk instabilitet och cancer. I kombination med andra analyser och slutpunkter som lätt kan mätas på ett sådant in vivo-studier (t.ex., kromosomavvikelser, mikrokärnor frekvenser i benmärg retikulocyter, genuttryck, etc.), kan detta tillvägagångssätt en noggrann och kontextuell utvärdering av de biologiska effekterna med låg nivå stress.
Introduction
Betydande kontroverser över de potentiella skadliga effekterna av antingen låga eller mycket låga doser av joniserande strålning och allmänhetens rädsla för strålning, som drivs av bilder av Hiroshima och Nagasaki atombombningar och av sällsynta kärnkraftverk olyckor (förvärras av massmedia), har lett till mycket strikt strålskydd reglering och standarder som är potentiellt inte är vetenskapligt motiverat. Under de senaste tre decennierna har ett stort antal rapporter dokumenterat både bristen på skadliga och förekomsten av potentiellt fördelaktiga biologiska effekter induceras av låg stråldos 1-4. Den största risken strålningshälsofaktor är sannolikheten för cancer, uppskattas baserat på epidemiologiska studier av atombomben överlevande får höga eller medel stråldoser. Linjär extrapolering av dessa data (sk linjär-no-tröskel eller LNT modell) används för att beräkna risken för cancer vid låga doser. Dock har denna metod inte fått världsomfattande vetenskaplig acceptansoch är starkt debatt 5.
Det är uppenbart att fler studier behövs för att klargöra denna fråga och eventuellt förbättra normer för strålskydd. Sådana studier bör omfatta kroniska behandlingar (bästa tillnärmning av miljö- och yrkesmässig exponering), in vivo djurmodeller (bäst för att extrapolera effekter på människors) och sådana slutpunkter som DNA skada priser, DNA-reparation och mutagenes. Det är känt att DNA är det primära målet för skada strålningseffekter och ofullständig eller felaktig reparation kan leda till mutagenes och cancerutveckling 6.
DNA dubbel-strängbrott (DSB) är en av de mest skadliga typer av DNA-lesioner och kan leda till celldöd och tumorigenes 7. Det är därför viktigt att kunna pålitligt och noggrant mäta graden av DSB efter exponering för låga stråldosen och / eller andra stressfaktorer, såsom kemiska föroreningar. En av de mest känsliga och specifika markörerDNA DSB fosforyleras histon H2AX, kallas γH2AX 8, men andra markörer och metoder har föreslagits 9,10. Det beräknas att tusentals H2AX molekyler, i närheten av en inducerad DSB, är involverade i bildandet av γH2AX möjliggör detektion av enskilda DSB genom immunofluorescens märkning med en anti-γH2AX antikropp och fluorescensmikroskopi 11. Responsen är mycket snabb och nådde sitt maximum mellan 30 och 60 minuter. Det finns belägg för att γH2AX underlättar reparation av DNA DSB genom att locka andra reparations faktorer till platserna för raster och genom att modifiera kromatinstruktur att förankra brutna DNA ändar och ge tillträde för andra reparationsproteiner (granskas i 12). Efter avslutad reparation av DNA DSB, blir γH2AX de-fosforylerad och / eller genomgår nedbrytning, och nysyntetiserade H2AX molekyler ersätter γH2AX i de drabbade områdena i kromatin 10. Monitorering och förlust av γH2AX kan,Därför ger en korrekt uppskattning av DNA DSB reparation kinetik. Denna metod har använts för att studera reparation av DSB i olika humana tumörcellinjer bestrålas med höga doser av strålning och dess hastighet och rest DSB nivåer har visat sig korrelera med strålkänslighet 13-15.
Vi ändrade detta experimentella tillvägagångssätt och tillämpat den på en in vivo-studie musen för att undersöka effekterna av låga doser av kronisk γ- och β-strålning på DNA DSB nivåer och reparation (Figur 1). För det första visar vi en metod för att göra en långsiktig kronisk exponering av möss för att β-strålning antingen utsänds av tritium (väte-3) i form av tritierat vatten (HTO) eller som organiskt bundet tritium (OBT) upplöst i dricksvatten . De två formerna förväntas ackumuleras och / eller distribuera olika i kroppen och därför producerar olika biologiska effekter. Båda formerna är potentiella faror i kärnkraftsindustrin. Denna behandlingär parallellt med kronisk exponering för γ-strålning vid en ekvivalent dos hastighet för att tillåta en korrekt jämförelse av de två typerna strålnings, vilket är avgörande för utvärdering av deras relativa biologiska effektiviteten. Beta-strålning består av elektroner, vilket gör det mycket olikt från γ-strålning, hög energi fotoner. På grund av denna skillnad, representerar Β-strålning mestadels inre hälsorisk och kan ge olika biologiska effekter jämfört med γ-strålning. Denna komplikation lett till betydande kontroverser över regleringen av exponering för β-strålning från HTO. Således, regulatoriska nivåer av HTO i dricksvatten för allmänheten varierar från 100 Bq / L i Europa till 75.000 Bq / L i Australien. Det är därför viktigt att jämföra biologiska effekterna av HTO för likvärdiga doser av γ-strålning. För det andra är graden av DNA DSB mätt i isolerade splenocyter vid slutförandet av kronisk exponering använder immunofluorescently märkt γH2AX upptäckaed med flödescytometri. Detta möjliggör utvärdering av omfattningen av DNA-skador som orsakats av de in vivo-exponering. Det är emellertid förnuftigt att förvänta sig att sådan låg nivå exponeringar inte kan ge några detekterbara hastigheter av DNA-DSB; istället, vissa dolda förändringar / svar kan förväntas att detta skulle påverka cellernas förmåga att reparera DNA-skada. Dessa förändringar, om den påträffas, kan antingen vara stimulerande (som producerar en gynnsam effekt) eller hämmande (som producerar en skadlig effekt). Den föreslagna protokollet tillåter avslöjar sådana förändringar genom att utmana de extraherade splenocyterna med en hög dos av strålning som ger en betydande mängd skador (t.ex. 2 Gy producerar cirka 50 DNA DSB per cell eller en 3 -. 5-faldig ökning av den totala γH2AX nivå) . Därefter, bildandet och förlust av γH2AX, vilket återspeglar den initiering och slutförande av DSB-reparation, övervakas genom flödescytometri. På detta sätt kan inte bara basal och behandlings inducerade nivåer av DNA-DSB mätas, menäven dess potentiella inverkan på cellernas förmåga att reagera och reparera DNA-skador som induceras av mycket högre stressnivåer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla mus hantering och behandling förfaranden bör hålla sig till regler som anges av lagstiftaren och / eller djur vårdprogram och godkänts av en lokal djuromsorg kommitté. Alla metoder som beskrivs i detta protokoll genomfördes i enlighet med riktlinjerna i kanadensiska rådet om Animal Care med godkännande av den lokala djurvård kommitté.
VARNING: Allt arbete med radioaktivitet (inklusive, men inte begränsat till hantering av tritium, extern γ-strålning, hantering av radioaktivt djurvävnader, sängkläder avfall) bör följa de regler som anges av lagstiftaren och / eller strålskyddsmyndigheter och utföras av auktoriserad personal i ett certifierat laboratorium och / eller anläggningen.
1. Animaliska Arbete
- Djur Gruppering
- Om möss kommer från en extern organisation, acklimatisera djur under minst 10 dagar i djuranläggning. Om studien innehåller flera behandlingsgrupperna, se till att djuret leverantören kan skicka all djur som ett enda parti.
- Slumpvis fördela möss till behandlingsgrupper om 10 möss per grupp. Om du använder hanmöss av C57BL / 6 stam, har djur leverantör pre-arrange randomisering av mycket unga C57BL / 6 män i deras möjlighet att minska aggression frågor.
- Kronisk Exponering av möss till inre β-strålning
- Bered arbets koncentrationer av tritium (10 kBq / L och 1 MBq / L) i mus dricksvatten genom att späda den ursprungliga beståndet av HTO och OBT (en blandning av tritierat prolin, alanin och glycin aminosyror) lösningar.
- Validera de slutliga koncentrationerna av tritium i dricksvattnet genom mätning av radioaktiviteten med användning av en vätskescintillationsräknare. Justera koncentrationer, om det behövs.
- Behandla djur för en månad genom att ge tillgång ad libitum till tritium vatten. Om behandlingen vattnet blir låg under två veckor, tillsätt mer vatten. Annars ändra flaskor på två veckor.
- Behandla sken bestrålat kontrollmöss identiskt. Förvara dem i en separat "ren" rum eller på en separat "ren" rack under positivt lufttryck för att undvika tritium korskontaminering från luften.
- Kronisk Exponering av möss till extern γ-strålning
Obs: γ-bestrålningsanläggning / utrustning kommer att variera beroende på platsen. - Använda tillgängliga metoder för dosimetri, bestämma avstånden från en γ-strålkälla som har strålningsfält som producerar de önskade dosering. Se till homogenitet av strålningsfält inom de områden som täcker djurburar.
Anm: 1,7 μGy / h är ekvivalent med en doseringshastighet som produceras av en MBq / L tritium i kroppen. - Exponera möss genom att placera musen burar vid de avstånd som bestäms i steg 1.3.1 för en månad. Minimera dagliga avbrott i γ-strålning till 30 minuter. Använd termoluminiscens dosimetrar för mätning av den totala stråldoserna.
2. Offer och Provtagning
Obs: Extraherade mjältar kan hållas i 60 mm skålar med media (upp till 2 timmar) medan resten av mössen är sacrificred. Beroende på antalet personer som deltar, mellan 5 och 15 möss kan bearbetas i en dag.
3. Framställning av splenocyt kulturer
- Homogeni mjälten genom finhacka inuti en cell sil med sterila pincett med en böjd ände.
- Avlägsna cellfilter och samla det filtrerade cellsuspensionen från 60 mm skål i en 15 ml tub.
- Skölj cellfilter med 5 ml medium för att samla resten av cellerna.
- Centrifugera rören vid 300 xg under 5 min vid RT.
- Dekantera supernatanten och återsuspendera pelleten i 10 ml RPMI.
- Centrifugera rören vid 300 xg under 5 min vid RT.
- Dekantera supernatanten och återsuspendera pelleten i 5 ml RPMI.
- Överföring 4 ml cellsuspension i en 25 ml vävnadsodlingskolv och flytta det till en CO2-inkubator (37 ° C, 5% CO2, 80% fuktighet)
4. Utmanande bestrålning och fastställande
- Överföråterstående 1 ml cellsuspension från steg 3,8 i en 1,5 ml rör på is och centrifugera vid 300 xg under 5 min vid 4 ° C. Kommer att representera DNA-skada mätt på detta prov både behandling-inducerad skada och t = 0 datapunkten för konstruktion av en kurva DNA-reparation.
- Försiktigt aspirera supernatanten med användning av en vakuumpump. Försiktigt återsuspendera pelleten i 1 ml TBS-buffert (20 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 2,7 mM KCl).
- Centrifugera rören vid 300 xg under 5 min vid 4 ° C. Försiktigt aspirera supernatanten med användning av en vakuumpump. Försiktigt återsuspendera pelleten i 300 pl TBS.
- Under omblandning på en vortex i låg hastighet, tillsätt 700 | il av -20 ° C 100% etanol. Stäng locket och skaka för att blanda.
- Lagra proverna vid -20 ° C. Splenocyter fixerade i etanol kan lagras vid -20 ° C i minst 12 månader utan någon märkbar förlust i γH2AX signalen.
- Bestråla splenocyt kulturer från steg 3,8 med en utmanande γ-rad iation dos av 2 Gy vid en doshastighet ≥ 200 mGy / min med användning av tillgängliga bestrålningsanordning.
Obs: Syftet med denna strålning är att förmå DNA DSB att utmana reparations maskiner. Röntgenstrålar kan också användas för detta ändamål. - Omedelbart åter kulturerna till en CO 2 inkubator.
- 1 timme efter det utmanande 2 Gy bestrålning, ta bort kulturer från inkubatorn till en biologisk säkerhet skåp. För att samla in ett representativt urval alikvot, försiktigt återsuspendera celler med användning av en pipett och överföra en ml av cellsuspension till ett 1,5 ml rör på is. Återgå cellkulturerna till en CO 2 inkubator.
- Centrifugera rören vid 300 xg under 5 min vid 4 ° C. Försiktigt aspirera supernatanten med användning av en vakuumpump. Försiktigt återsuspendera pelleten i 1 ml TBS.
- Upprepa steg från 4,3 till 4,5.
- 24 timmar efter den utmanande 2 Gy γ-bestrålning, skörd och fixera på = 24 timmar prov som beskrivs i steg från 4,8 till 4,10.
Obs: Normalt 15 - kan 30 prover per dag vara immunofluorescently märkta och analyserades genom flödescytometri i en enda körning. För att säkerställa en korrekt jämförelse mellan behandlingsgrupperna, bland annat prov (er) från varje grupp. Se även Referens 16 för ytterligare information.
- Förbered en märkt uppsättning rör för antalet prover som skall bearbetas och lägg på is. Använd 12 x 75 mm uncapped glasrör. Sterilitet krävs inte för detta arbete. Inkludera ytterligare historiska kontrollprov för märkning med sekundär antikropp enbart ("bara 2 Ab"). Använd denna historiska kontrollprov i varje flödescytometri bedrivs inom en studie.
- Lägg 0,5 ml iskall TBS till varje rör.
- Ta fasta splenocyter från -20 ° C, virvel i 5 sek och överföra en 0,5 ml portion till preparerade rör med TBS. Placera resten av prover tillbaka till -20 ° C lagring ochbehålla som en backup prov.
- Centrifugera splenocyter vid 300 xg under 5 min vid 4 ° C. Dekantera supernatanten och försiktigt återsuspendera pelleten i 1 ml iskall TBS innehållande 1% FBS
- Centrifugera cellerna vid 300 xg under 5 min vid 4 ° C. Dekantera supernatanten och försiktigt återsuspendera pelleten i 1 ml TST-buffert (0,05% Triton X-100, 2% FBS i TBS). Inkubera i 20 minuter på is.
- Centrifugera cellerna vid 300 xg under 5 min vid 4 ° C. Dekantera supernatanten och försiktigt återsuspendera pelleten i 200 | il av primär anti-γH2AX antikropp utspädd 1: 150 i TST-buffert. Använd 200 pl TST för "2nd Ab endast" kontrollprov.
- Positions rören på en roterande skakanordning vid en vinkel av 45-60 ° och skaka i 1,5 h vid 300 xg vid rumstemperatur.
- Medan rören inkubera, förbereda en tillräcklig volym (200 | il / prov) av get-anti-mus sekundär antikropp konjugerad med Alexa-488 vid en 1: 200 utspädning i TST-buffert.
Obs: Allt arbete med Alexa-488konjugerad antikropp (steg 5,10-5,16 nedan) bör ske under dunkla ljusförhållanden och märkta prover bör skyddas från ljus genom att linda rör i aluminiumfolie. - När 1,5 h inkubation är klar, tillsätt 1 ml iskall TBS innehållande 2% FBS till varje rör och centrifugera vid 300 xg under 5 min vid 4 ° C. Dekantera supernatanten och försiktigt återsuspendera pelleten i 1 ml TBS innehållande 2% FBS.
- Centrifugera vid 300 xg under 5 min vid 4 ° C. Dekantera supernatanten och försiktigt återsuspendera pelleten i 200 | il av den sekundära antikroppen lösningen från steg 5,8.
- Inkubera proverna på en skakande plattform under 1 timme såsom i steg 5.7.
- Tillsätt 1 ml iskall TBS innehållande 1% FBS.
- Centrifugera vid 300 xg under 5 min vid 4 ° C. Dekantera supernatanten och försiktigt återsuspendera pelleten i 1 ml iskall TBS.
- Centrifugera vid 300 xg under 5 min vid 4 ° C. Dekantera supernatanten och försiktigt återsuspendera pelleten i 0,5 ml TBS innehållande 50 ^ g / mlpropidiumjodid.
- Inkubera under 5 min vid RT skyddad från ljus.
- Analysera prover på en flödescytometer använder instrumentspecifika protokoll 16. Läs minst 10.000 celler per prov.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2 visar exempel på flödescytometri grafer som förväntas för splenocyter ställdes med användning av metoden beskriven här. Celler först gated baserat på <elektroniska volymsidospridning> punktdiagram (Figur 2A och 2D, elektronisk volym motsvarar framåtspridning). FL3 / propidium jod histogram (Figur 2B och 2E) bekräftar normal cellcykelfördelning. Medelvärde γH2AX signal beräknas med hjälp av FL1 kanal bekräftar en> 2-faldig ökning i DNA-DSB i 2-Gy bestrålade celler (Figur 2F) jämfört med den obehandlade kontrollen (figur 2C). Därefter undersökte vi hur känslig den beskrivna metoden för mätning immunofluorescently märkt γH2AX genom flödescytometri i mus-splenocyter. Figur 3A visar γH2AX nivåer, som indikerar DNA-DSB, i mussplenocyter 1 h efter ex vivo exponering för antingen låg (0,1Gy) eller höga (2 Gy) doser av γ-strålning i förhållande till den obehandlade kontrollen. Det framgår att 0,1 Gy framkallade en liten ökning av DSB nivå och att ökningen var statistiskt signifikant. Den starka 3-faldig induktion förväntades och detekteras efter 2 Gy exponering. För att validera specificitet γH2AX immunofluorescent märkning som beskrivs i protokollet, märktes celler undersöktes med ett fluorescensmikroskop. Den markerade fokus liknande mönster som observerats tyder på att fluorescenssignalen härrör från enskilda DNA DSB inom kromatinet (Figur 3B).
Representativa resultat av bedömningen av DNA-DSB-takt och deras reparation i splenocyter från möss som exponerats för en månad till mycket låga koncentrationer av tritierat vatten (10 kBq / L) presenteras i Figur 4. Det kan ses (Figur 4A) att även om behandling resulterade i en ökning 10% av den basala γH2AX nivån, var förändringen intet statistiskt signifikant (N = 5, en-prov Students t-test). Vidare, den uppmätta bildning och förlust av γH2AX efter den utmanande 2 Gy bestrålning, som representerar kinetiken för DNA-DSB-reparation, skilde sig inte mellan cellerna från kontroll och HTO-behandlade möss (Figur 4B).
Figur 1. Experimentell diagram för att utvärdera effekten av kronisk in vivo-bestrålning på DNA-skador och DNA-reparation. Efter in vivo-behandling av möss med kronisk bestrålning för en önskad tidsperiod avlivas mössen och splenocyter kulturer är etablerade och exponeras för en utmanande bestrålning. Splenocyt portioner samlas och fixeras vid olika tidpunkter efter den utmanande dosen. Nivåer av γH2AX sedan mätas med hjälp av immunofluorescent laBeling och detektion genom flödescytometri. Handlingen på botten av figuren är ett schema av förväntade data. Gamma-H2AX nivå ökar drastiskt tidigt efter utmanande bestrålning följt av en minskning tillbaka till kontrollvärdet, om DNA-reparationen är klar. DNA-skador Δ representerar den skada som produceras på grund av experimentell behandling av möss och DNA-reparations Δ representerar effekten av behandlingen av möss på DNA DSB reparation kapacitet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Representant flödescytometri rådata. (A, D) Scatter tomter och grind regioner för splenocyter och cellrester och erytrocyter. (B, E) DNA histogram som representerar cellcykel distributioner.
Figur 3. Påvisande av γ H2AX med flödescytometri är känslig och specifik. (A) Splenocyter nyligen isolerade från manliga CBA-möss bestrålades med antingen 0,1 eller 2 Gy γ-strålning, eller skenbehandlade och fick utvecklas γH2AX svaret för en timme. Cellerna fixerades sedan, immunofluorescentlymärkt med anti-γH2AX antikropp och analyserades med flödescytometri. Normaliserade medelvärden ± SD visas (N = 12). * Och *** betecknar statistisk skillnad med p <0,05 och p <0,001, respektfullt (ett prov Students t-test). (B) Representativa mikrofotografier av obehandlad kontroll (UT) eller 2 Gy bestrålade splenocyter immunofluorescently märkta med anti-γH2AX antikropp. Den fokus liknande mönster av grön fluorescens bekräftar specificiteten av immunofluorescerande märkning av γH2AX. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Representativa resultat visar bristande effekt som produceras av 1 månad exponering av möss för tritium water (HTO) på DNA-DSB-nivå och reparation. (A) Splenocyter isolerades från möss som behandlats med 10 kBq / L av HTO i dricksvattentäkter och kontrolldjur. Halten γH2AX mättes med användning av immunofluorescens märkning och flödescytometri såsom beskrivs i protokollet. Mean γH2AX fluorescens nivåer i förhållande till de kontroll ± SD visas (N = 5). Dessa data alstrades från t = 0 tidspunkt som användes i figur 3B för utvärdering av DNA-DSB-reparation. (B) Isolerade splenocyter exponerades för en utmanande 2 Gy dos av γ-strålning och alikvoter av cellerna fixerades vid tider t = 0, 1 och 24 timmar efter den utmanande bestrålning. Genomsnittlig fluorescens γH2AX i förhållande till sin egen t = 0 kontroll visas ± SD (N = 5). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet presenteras i detta dokument är användbar för att genomföra storskaliga mus in vivo-studier som undersöker de genotoxiska effekterna av låga halter av olika kemiska och fysikaliska medel, inklusive joniserande strålning. Vår unika specifika patogen-fria djur anläggning som är utrustad med en GammaBeam 150 bestrå och en 30 meter lång bestrålning hall kan genomföra livslånga studier med låga eller mycket låga doser ränta irradiations på hundratals eller tusentals möss. Mindre bestrålningsanläggningar för kronisk låg dos strålning kan ställas in i ett universitet eller sjukhusmiljö där radiobiologiska studier genomförs rutinmässigt och riktlinjer strålskydds / bestämmelser genomförs. Men strängare regler gäller normalt anläggningar avsedda för intern djur bestrålning där hantering av radionuklider, såsom tritium, genomförs. Även sällsynta, laboratorier certifierade för sådana interna undersökningar strålnings finns i olika resök institutioner över hela världen och deras unika funktioner kan användas för studier som beskrivs i detta protokoll.
Inom protokoll använder vi immunofluorescens märkning av γH2AX att noggrant utvärdera DNA DSB priser som produceras av experimentella exponeringar. Ännu viktigare, införande av en utmanande bestrålning levererade ex vivo för att extraherade splenocyter gör det möjligt att utvärdera intaktheten för DNA-DSB-svaret (γH2AX nivå vid en h efter utmaningen) och av DNA-DSB-reparation (γH2AX nivå vid 24 timmar jämfört med 0 h). Det bör noteras att kvantifieringen av γH2AX fokus per cell genom fluorescensmikroskopi kan ge högre känslighet jämfört med flödescytometri. Till exempel så låga doser som 0,001 Gy rapporterades att producera betydande ökningar i antalet γH2AX fokus per cell. Emellertid är användningen av flödescytometri-baserad detektering av γH2AX erbjuder fördelar jämfört med fluorescensmikroskopi analys becaanvända det kräver mindre tid för mätningar, kräver inte det högspecialiserade / utbildad personal och den undviker subjektivt beslutsfattandet till γH2AX härdar erkännande och räkna. Dessa fördelar är kritiska för storskaliga djurstudier. En typisk djurexperiment med 10 behandlingsgrupper och 10 möss per grupp kommer att resultera i 100 x 3 = 300 mjälte prover, om den metod som föreslås (figur 1) följs. För att generera data från detta antal prover, kommer cirka 100 timmar krävas med användning av flödescytometri. Alternativt, om det görs av manuella mikroskopiska analyser, skulle samma uppgift att ta minst 300 timmar, med hjälp av en konservativ uppskattning av 40 min av mycket krävande mikroskop tiden per prov. Även om försök att automatisera analys och poängsättning av γH2AX foci har gjorts 17-19, de har alla ett antal begränsningar. I synnerhet gör den runda formen och ringa storlek av mussplenocyter och lymfocyter det opraktiskt att lösa alla indidual γH2AX Foci mikroskopiskt. Medan vidhäftande celler har framgångsrikt görs av automatiserad mikroskopering system för γH2AX fokus, har ingen framgång visats för antingen mussplenocyter eller lymfocyter.
Det bästa sättet att eliminera dag till dag variationer i de uppmätta värdena för γH2AX signal genom flödescytometri är att inkludera försöksgruppen och kontrollprover i samma körning och för att beräkna relativa γH2AX förändringar inom varje körning. Ytterligare rekommendationer inkluderar: a) en historisk kontrollgrupp bestående av obehandlad och 2 Gy bestrålade provet används i varje körning; b) en person utför alla förfaranden märkningsantikroppen; c) en enda lager av buffertar och en enda sats av antikropp, både primära och sekundära, används för hela uppsättningen av prover inom ett experiment. Det är också viktigt att göra en flödescytometer kvalitetskontroll test som rekommenderas av instrumenttillverkaren rutinmässigt och före varje körning av prover. Detta är required att kontrollera instrumentets optisk inriktning och flödessystemet och även hjälper minimera dag till dag variation i uppmätt γH2AX fluorescens mellan prover som ska jämföras eller samlas i en grupp.
Det bör påpekas att användningen av ett större antal tidpunkter (t.ex., 1, 2, 4, 6 h) efter utmanande bestrålning kan hjälpa till att analysera och mäta kortsiktiga DNA-DSB-reparations kinetik mer i detalj 16. Men överlag reparationspotential och sannolikheten fördröjda hälsoeffekter representeras av den återstående skada mätt bara på 24 timmar och jämförs med den som observerats vid den initiala tidpunkten (t = 0) 13-15 (Figur 4).
Eftersom basala γH2AX nivåer är kända för att öka i gamla djur eller åldrande celler 20, för mer exakt tolkning av de resultat som uppnåtts i långtidsexponering mus studier (> 6 månader) med hjälp av den beskrivna metoden, the användningen av en ung obehandlad grupp, förutom en åldersmatchad kontroll, skulle vara tillrådligt. Även om vissa rapporter tyder på att γH2AX kan öka i celler som förökar, som inte skulle vara relaterade till DNA-DSB, kan detta lätt styras genom mätning av S-fas och G2 / M-fas cellfraktioner med hjälp av DNA-histogram (Figur 2A, D). Om vissa experimentella betingelser fortfarande hindrar forskare från att använda γH2AX som en markör för DNA-skada (på grund av de skäl som anges ovan, eller deras kombination), ett annat protein som bildar DNA-skador fokus, såsom 53BP1, kan användas 21.
Även om vi inte har försökt att använda denna metod för icke-lymfoida vävnader, såsom muskel, hjärta, hjärna och andra, skulle det vara svårt att bearbeta dem för flödescytometri. Vävnadssnitt och mikroskopi för γH2AX härdar räkning skulle vara metoden för val, om det krävs analys av sådana vävnader. Emellertid är andra lymfoida celler, såsom perifert blod lymphocytes, benmärgs lymfocyter eller tymocyter, kan användas för att mäta γH2AX nivåer genom den beskrivna metoden. Fördelen med att använda mjält-lymfocyter är den relativa enkelheten i framställning cellsuspensionen och det stora antalet celler som kan isoleras från en mjälte. Detta blir ännu mer fördelaktigt om ytterligare slutpunkter ingår i studien. I vår erfarenhet, en typiskt utbyte av splenocyter per mus möjliggör insamling av åtminstone 10 portioner, varje lämplig för någon av följande analyser: flödescytometri, RT-qPCR för genen eller miRNA uttryck, western blöt, genomiskt DNA för CpG-metylering analys. Sålunda kan ytterligare splenocyt alikvoter uppsamlade parallellt med de för γH2AX slutpunkt användas för att mäta uttrycket av gener involverade i DNA-skadesignalerande och reparationssvar. Sådana gener som GADD45A och CDKN1A, som normalt är transkription uppregleras som svar på cytostatikabehandling 22, kan ge en ledtråd som att vässahennes celler är korrekt svara på utmanande stressen inflytande. På liknande sätt kan proteinnivåer och posttranslationella modifieringar som är involverade i stressvar bedömas. Slutligen, är det inte troligt att något av stegen i extraktionsproceduren, om den utförs som beskrivs här, kan inducera γH2AX i splenocyter.
Det skulle vara fördelaktigt och rekommenderas att prova ytterligare organ och vävnader under uppoffringar för att komplettera DNA-skador och reparation data som erhållits för splenocyter som per presenterade protokoll med andra slutpunkter. Till exempel, vi rutinmässigt samla benmärgsceller för benmärgsmikrokärntest in vivo, olika vävnader för åldrande associerade β-galaktosidas och DNA-reparation genuttryck mätningar. Möjligheten att samla in andra vävnader skulle bero på den tillgängliga teknisk support under uppoffringar; men det kan avsevärt bidra till att den korrekta tolkningen av resultaten och byggandet av en much mer biologiskt relevanta system bild av svar på behandlingen låg nivå utreds.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HTO: tritiated water, [3H] | locally obtained from a nuclear reactor | stock activity 3.7 GBq/mL; can be substituted with HTO from Perkin Elmer | |
| OBT: Alanine, L-[3-3H]: organically bound tritium (OBT) | Perkin Elmer | NET348005MC | 1 mCi/ml (185 MBq) |
| OBT: Glycine, [2-3H]: organically bound tritium | Perkin Elmer | NET004005MC | 1 mCi/ml (185 MBq) |
| OBT: Proline, L-[2,3-3H]: organically bound tritium (OBT) | Perkin Elmer | NET323005MC | 1 mCi/ml (185 MBq) |
| tritiated water, [3H] (HTO) | Perkin Elmer | NET001B005MC | substitute for HTO of local origin |
| GammaBeam 150 irradiator | Atomic Energy of Canada Limited | locally manufactured | can be substituted with another g-radiation source of sufficiently low activity |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379-500ML | |
| RPMI | Fisher Scientific | SH3025501 | Hyclone RPMI 1640 with L-Glutamine and HEPES 500mL |
| fetal bovine serum | Sigma Aldrich | F1051-100ML | |
| anti-gH2AX antibody, clone JBW301 | Millipore | 05-636 | |
| Alexa fluor-488 goat anti-mouse antibody | Life Technologies (formerly Invitrogen) | A21121 | |
| propidium iodine | Sigma Aldrich | P4864-10ML | 1 mg/ml |
| ethanol | Commercial Alcohols | P006-EAAN | 500 ml bottles Absolute Ethanol |
| 1.5 ml tubes | Fisher Scientific | 2682550 | microcentrifuge tubes |
| 15 ml tubes | Fisher Scientific | 05-539-5 | sterile polypropylene centrifuge tubes |
| liquid nitrogen | Linde | P110403 | |
| 12 x 75 mm uncapped glass tubes | Fisher Scientific | K60B1496126 | disposable borosilicate glass tubes with plain end |
| T25 flasks | VWR | CA15708-120 | nunc tisue culture 25ml flask (supplier no. 156340) |
| scissors | Fine Science Tools | 14068-12 | Wagner scissors 12 cm sharp/sharp |
| forceps, straight | Fine Science Tools | 11008-13 | Semken forceps 13 cm, straight |
| forceps, curved | Fine Science Tools | 11003-12 | Narrow Pattern forceps 12 cm, curved |
| 60 mm petri dishes | VWR | CA25382-100 | BD Falcon tissue culture dish 60 x 15 mm |
| cell strainers, 70 mm | Fisher Scientific | 08-771-2 | Falcon cell strainers 50/case |
| PBS recipe: 1 tablet dissolved in 200 ml of deionized water, adjust pH to 7.4 if needed. | Sigma Aldrich | P4417-100TAB | Phosphate Buffered Saline Tablets |
| TBS recipe: to make 10x stock | |||
| 30 g TRIS HCl | Sigma Aldrich | T3253-1KG | Trizma hydrochloride |
| 88 g NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | Sodium Chloride |
| 2 g KCl | Fisher Scientific | P217-500 | Potassium Chloride |
| Dissolve in 1 L of deionized water, adjust pH to 7.4 |
References
- Mitchel, R. E., Jackson, J. S., McCann, R. A., Boreham, D. R. The adaptive response modifies latency for radiation-induced myeloid leukemia in CBA/H mice. Radiat Res. 152 (3), 273-279 (1999).
- Shadley, J. D. Chromosomal adaptive response in human lymphocytes. Radiat Res. 138 (Suppl 1), S9-12 (1994).
- Wiencke, J. K., Afzal, V., Olivieri, G., Wolff, S. Evidence that the [3H]thymidine-induced adaptive response of human lymphocytes to subsequent doses of X-rays involves the induction of a chromosomal repair mechanism). Mutagenesis. 1 (5), 375-380 (1986).
- Mitchel, R. E. The dose window for radiation-induced protective adaptive responses. Dose-Response. 8 (2), 192-208 (2010).
- Tubiana, M., Feinendegen, L. E., Yang, C., Kaminski, J. M. The linear no-threshold relationship is inconsistent with radiation biologic and experimental data. Radiology. 251 (1), 13-22 (2009).
- Gent, D. C., Hoeijmakers, J. H., Kanaar, R. Chromosomal stability and the DNA double-stranded break connection. Nat Rev Genet. 2 (3), 196-206 (2001).
- Jackson, S. P. Sensing and repairing DNA double-strand breaks. Carcinogenesis. 23 (5), 687-696 (2002).
- Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).
- Schultz, L. B., Chehab, N. H., Malikzay, A., Halazonetis, T. D. p53 binding protein 1 (53BP1) is an early participant in the cellular response to DNA double-strand breaks. J Cell Biol. 151 (7), 1381-1390 (2000).
- Kinner, A., Wu, W., Staudt, C., Iliakis, G. Gamma-H2AX in recognition and signaling of DNA double-strand breaks in the context of chromatin. Nucleic Acids Res. 36 (17), 5678-5694 (2008).
- Sedelnikova, O. A., Rogakou, E. P., Panyutin, I. G., Bonner, W. M. Quantitative detection of (125)IdU-induced DNA double-strand breaks with gamma-H2AX antibody. Radiat Res. 158 (4), 486-492 (2002).
- Yuan, J., Adamski, R., Chen, J. Focus on histone variant H2AX: to be or not to be. FEBS Lett. 584 (17), 3717-3724 (2010).
- Taneja, N., et al. Histone H2AX phosphorylation as a predictor of radiosensitivity and target for radiotherapy. J Biol Chem. 279 (3), 2273-2280 (2004).
- Olive, P. L., Banath, J. P., Sinnott, L. T. Phosphorylated histone H2AX in spheroids, tumors, and tissues of mice exposed to etoposide and 3-amino-1,2,4-benzotriazine-1,3-dioxide. Cancer Res. 64 (15), 5363-5369 (2004).
- Banath, J. P., Klokov, D., MacPhail, S. H., Banuelos, C. A., Olive, P. L. Residual gammaH2AX foci as an indication of lethal DNA lesions. BMC Cancer. 10, 4 (2010).
- Blimkie, M. S., Fung, L. C., Petoukhov, E. S., Girard, C., Klokov, D. Repair of DNA double-strand breaks is not modulated by low-dose gamma radiation in C57BL/6J mice. Radiat Res. 1815 (5), 548-559 (2014).
- Runge, R., et al. Fully automated interpretation of ionizing radiation-induced gammaH2AX foci by the novel pattern recognition system AKLIDES(R). Int J Radiat Biol. 88 (5), 439-447 (2012).
- Jucha, A., et al. FociCounter: A freely available PC programme for quantitative and qualitative analysis of gamma-H2AX foci. Mutat Res. 696 (1), 16-20 (2010).
- Garty, G., et al. The RABIT: a rapid automated biodosimetry tool for radiological triage. Health Phys. 98 (2), 209-217 (2010).
- Kovalchuk, I. P., et al. Age-dependent changes in DNA repair in radiation-exposed mice. Radiat Res. 182 (6), 683-694 (2014).
- Rube, C. E., et al. DNA repair in the context of chromatin: new molecular insights by the nanoscale detection of DNA repair complexes using transmission electron microscopy. DNA Repair. 10 (4), 427-437 (2011).
- Amundson, S. A., Do, K. T., Fornace, A. J. Induction of stress genes by low doses of gamma rays. Radiat Res. 152 (3), 225-231 (1999).
