Protocol
윤리 문 : 동물과 관련된 모든 절차는 관리 및 과학적인 목적을위한 동물의 사용 및 안과 및 비전 연구에서 동물의 사용에 대한 ARVO 방침의 지침 연습 호주 코드에 따라 수행되었으며, 승인했다 맥쿼리 대학의 동물 윤리위원회.
1. VEP 전극 주입
- 복강 내 주사 케타민 (75 ㎎ / ㎏) 및 메데 토미 (0.5 밀리그램 / kg)으로 동물을 마취.
마취의 유도에 따라 수술을 시작하는 표시로 철수 반사 (핀치 검사, 각막과 눈꺼풀 반사 등)과 부재을 준수합니다. 수술 내내 계속 동물을 모니터링하고 반사가 존재하는 경우 추가 마취약 (상위 - 업 케타민 당 초기 용량의 10 %)을 관리. 성인 쥐 (> 12주)는 실험에 사용된다. - 외과 영역의 피부를 면도.수술 중 체온을 유지하기 위해 온난화 패드 (37 ° C)에서 동물을 놓습니다. 포비돈 - 요오드의 국소 응용 프로그램을 통해 피부를 준비합니다. 수술 입체 재단을 적용합니다. 전신 마취하에 각막 건조를 방지하기 위해 국소 안과 연고를 적용합니다. 멸균 악기를 사용하여 무균을 유지한다.
- 헤드 피부의 중간 선에 길이의 피부 절개를합니다. 두개골의 좋은 노출을 달성하기 위해 결합 조직을 취소합니다.
- 조심스럽게, 수동으로 브레 그마 뒤에 7mm과 중간 선에 3mm 측면에서 마이크로 핸드 드릴을 사용하여 작은 버 구멍을 드릴.
- 약 0.5 mm의 깊이로 피질을 관통하는 피질 (영역 (17))에 두개골을 통해 임플란트 나사 전극. 브레 그마로 정중선 3mm의 입쪽에 기준 나사 전극을 이식. 나사를 싸는하고 해결하기 위해 치과 시멘트를 적용합니다 (항상 필요하지 않음).
- RECO하는 동물을 머리의 피부 봉합 피부에 항생제 연고를 관리 허용버전 온난화 패드에 마취에서.
주 : 대안 적으로, 전극이 노출 남아있을 수 있다는 것을 피부에서 각각의 기록 재개 할 필요가없는, 그래서. 수술 전에 즉시하지만 마취 회복의 정지시에, 비 스테로이드 성 항 염증 약물 (NSAID) (아니라면 사전에 동작 투여) 또는 아편 유사 진통제를 투여. 마취 완전히 외래에서 완전히 회복 될 때까지 지속적으로 동물을 모니터링합니다. - 동물이 수술의 사전 VEP 기록을 복구하는 적어도 일주 허용합니다.
2. 시신경 주입
- , 동물을 마취 피부를 준비하고 (1.1 및 1.2) 이상으로 드레이프 적용됩니다.
- 무작위로 선택된 눈의 궤도 위의 피부에 1 - 1.5 cm의 절개를합니다. 미세 홍채 가위를 사용하여 궤도 캐비티에 도달하기 위해 피하 조직을 엽니 다. 결막을 열고 운영 현미경으로 장부의 캡슐을 전방.
- 안구 후퇴근육과 intraobital 눈물 분비는 시신경의 약 3mm 길이를 노출합니다. 길이 방향으로 안과 블레이드를 사용하여 시신경 주위의 경막과 지주막 물질 층을 엽니 다.
- 세계에 2mm 후방의 거리에서 시신경에 유리 피펫을 삽입합니다. 유리 마이크로 피펫은 해밀턴 주사기에 부착된다.
- 약 30 초에 걸쳐 천천히 신경으로 - (수초에 효과가없는 0.02 % 에반 블루와, 1.0 μL, 0.4), 1 % 리소 레시틴을 주입한다.
- 피부 절개 봉합. 감염을 방지하기 위해 항생제 연고를 적용합니다. 동료의 눈은 전기 생리학 레코딩을위한 내부 통제 역할을 할 수있다.
- 마취에서 회복 온난화 패드에 동물을 놓습니다.
3. VEP 기록
- 동물을 마취하고 1.1 및 1.2로 피부를 준비합니다.
참고 : 마취제의 낮은 복용량은 전기 생리 RECO 사용할 수 있습니다rding (케타민 40 ㎎ / ㎏과 0.25 ㎎ / ㎏을 메데 토미). - 어두운 방에서 쥐를 놓고는 5 어둠에 적응 할 수 - 30 분. 어떤 경우에는 쥐가 각각 포토 픽 VEP 녹음 8 적응 암순응 또는 빛 어두운 적응 O / N이 될 수 있습니다.
- 직장 온도계 프로브 homoeothermic 블랭킷 시스템에 의해 37 ± 0.5 ℃의 체온을 유지한다.
- 1.0 % tropicamide 눈 방울과 학생들을 팽창. 액세스하기 위해 두개골을 통해 피부를 열고 사전 배치 현장 나사 전극에서.
- 자극 눈의 반대편 시각 피질과 앰프에 대한 참조 나사를 통해 나사를 연결합니다. 지상으로 꼬리에 바늘 전극을 삽입합니다. 측정하고 5 kΩ의 아래 전극 임피던스를 유지한다.
- 뛰어난 눈 절연 (7)을 제공하기 위해 눈꺼풀 주위의 피부에 직접 미니 Ganzfeld 자극을 놓습니다. 자극기의 조명이 미리 보정해야광도계에 의해.
- 각각 1 내지 100 Hz의 낮은 및 높은 밴드 패스 필터 설정을 1 Hz의 주파수에서 빛을 깜박 100 회 빛의 자극을 전달한다. 신호 샘플링 레이트는 5 kHz에서이다.
참고 : 신호는 적어도 약 250 샘플링한다 - 더 두 개의 샘플은 각주기 동안 수집되는 것을 보장하기 위해 300 Hz에서. - 다시 피부를 봉합하고 마취에서 회복하기 온난화 패드에 동물을 유지. 녹화 반복 시간 기간 동안에 기능적 변화를 모니터링하기 위해 각각의 동물에 기록 될 수있다.
- 최종 시점에서, 동물을 안락사 나트륨 펜토 바르비 톤 (100 밀리그램 / kg, IP)의 과다 주사를 관리. 심장 마비, 호흡 정지 및 체온의 감소에 의해 안락사를 확인합니다.
4. 조직 준비 및 조직학
- 현미경으로 안락사 동물에서 시신경을 제거하고 1 % 파라 포름 알데히드의 O / N의 조직을 고정합니다. <리> 식염수로 철저하게 조직을 씻으십시오. 자동 조직 프로세서에서 처리하고, 조직을 파라핀에 포함. 회전식 마이크로톰을 사용하여 - (10 μm의 5) 컷 섹션.
- 56 ° C에서 같은 룩솔 (95 % 에탄올) O / N으로 0.1 % 빠른 블루 솔루션 섹션을 품어. 다음 다른 30 초 70 % 에탄올을 30 초 동안 0.05 %의 탄산 리튬의 섹션을 차별화하고. 마지막 섹션을 장착하기 전에 30 초 동안 0.1 % 크레 실 바이올렛 용액 Counterstain과. 시신경 5 수초를 식별하기 위해 빠른 파란색 염색을 사용합니다.
참고 : 면역 조직 화학 연구를 들어, 1 % 파라 포름 알데히드에 조직을 고정 식염수로 세척하고 30 % 자당 O / N로 품어. OCT에서 임베드 조직 매체를 포함하고 저온 유지 장치를 사용하여 저온부을합니다.
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Representative Results
재현성 인트라 셔널 VEP 트레이스는도 1에 도시되어 있으며 대기 N1에서 상당한 지연은 시신경 주입 후에 알 수있다. 탈수 초화의 부분 시신경 병변 룩솔 패스트 블루 염색법을 이용하여 조직 학적 5 절에서 발견 될 수있다. 2 시신경의 중심에 작은 초점 탈수 초 병변 대표적인 부분을 도시한다. 단면은 병변의 총 부피를 대표하지 않습니다. 탈수 초 영역 삼차원 재구성을 사용하여 병소 용적을 추론 신경의 각 연속 단면에서 측정 될 수있다. 우리는 우리의 이전 연구에서이 모델을 사용하여 대기 시간 지연 및 병변 볼륨 사이에 강한 상관 관계를 증명하고 식염수 주입 컨트롤 5에는 VEP 대기 시간 지연이 없었다.
이것은 플래시 조명 다음 초기 VEP 성분보다 안정한 것으로 여겨진다 7 5 탈수 초화와 강한 선형 관계가 있음을 보여 주었다. 따라서, 우리는 N1 레이턴시는 데이터 분석 및 remyelinating 치료법의 효과를 평가하는 길이 VEP 모니터링을 위해 사용하는 것을 추천한다. VEP의 진폭, 비록 대기 시간에 비해 더 많은 변수, 시신경 6 축삭의 기능을 더 나타낸다. 뇌파 계 스케일링 진폭 분석 9이 고려 될 수있다.
시신경 주입 후 그림 1. VEP 지연. 대표 VEP는 개별 전에 쥐와 시신경 미세 주입 (0.8 μL의 리소 레시틴) 후 이일에서 추적합니다. VEP 녹음은 하루에 반복 (내 셔널 흔적 쇼입니다N 동색)이 VEP 기록 프로토콜의 재현성을 입증한다. (수직 스케일 바 : 10 μV, 수평 스케일 바 : 10 밀리 초). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
시신경 그림 2. 탈수 초화. 미세 주사를 리소 레시틴 후 쥐에서 시신경의 대표 단면. 미엘린 성분 룩솔 패스트 블루를 사용하여 청색 염색된다. 탈수 초화의 작은 국소 병변 부의 중심에서 볼 수있다. 탈수 초 영역이 3 차원 규모의 병변 볼륨을 추정하는 길이 직렬 단면에 측정 할 수있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Acknowledgments
이 연구는 호주 안과 연구소 (오리 아)에 의해 지원되었다. 우리는 처음에 VEP 기록 기술을 개발하기 위해 우리를 도와, 교수 Algis Vingrys 박사 빅뱅 부이, 멜버른 대학 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine 100 mg/ml (Ketamil) | Troy Laboratories | AC 116 | |
| Medetomidine 1 mg/ml (Domitor) | Pfizer | sc-204073 | |
| Tropicamide 1.0% (Mydriacyl) | Alcon | sc-202371 | |
| Homoeothermic blanket system | Harvard Apparatus | NC9203819 | |
| Impedance meter | Grass | F-EZM5 | |
| Screw electrodes | Micro Fasteners | M1.0×3mm Csk Slot M/T 304 S/S | |
| Subdermal needle electrodes | Grass | F-E3M-72 | |
| Rapid Repair | DeguDent GmbH | ||
| Light-emitting diode | Nichia | NSPG300A | |
| Bioamplifier | CWE, Inc. | BMA-400 | |
| CED system | Cambridge Electronic Design, Ltd. | Power1401 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 87930 | |
| Lysolecithin | Sigma | L4129 | |
| Evan’s blue | Sigma | E2129 |
References
- Balcer, L. J.
- Lassmann, H. Multiple sclerosis as a neuronal disease. Waxman, S. G. , Elsevier. 153-164 (2005).
- Fahle, M., Bach, M. Principles and practice of clinical electrophysiology of vision. Heckenlively, J., Arden, G. , MIT Press. 207-234 (2006).
- Halliday, A. M., McDonald, W. I., Mushin, J. Delayed visual evoked response in optic neuritis. Lancet. 1, 982-985 (1972).
- You, Y., Klistorner, A., Thie, J., Graham, S. L. Latency delay of visual evoked potential is a real measurement of demyelination in a rat model of optic neuritis. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (9), 6911-6918 (2011).
- You, Y., Klistorner, A., Thie, J., Gupta, V. K., Graham, S. L. Axonal loss in a rat model of optic neuritis is closely correlated with visual evoked potential amplitudes using electroencephalogram based scaling. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 3662 (2012).
- You, Y., Klistorner, A., Thie, J., Graham, S. L. Improving reproducibility of VEP recording in rats: electrodes, stimulus source and peak analysis. Doc Ophthalmol. 123 (2), 109-119 (2011).
- Heiduschka, P., Schraermeyer, U. Comparison of visual function in pigmented and albino rats by electroretinography and visual evoked potentials. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 246 (11), 1559-1573 (2008).
- You, Y., Thie, J., Klistorner, A., Gupta, V. K., Graham, S. L. Normalization of visual evoked potentials using underlying electroencephalogram levels improves amplitude reproducibility in rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (3), 1473-1478 (2012).
- Levkovitch-Verbin, H. Animal models of optic nerve diseases. Eye (Lond). 18 (11), 1066-1074 (2004).
- Henry, K. R., Rhoades, R. W. Relation of albinism and drugs to the visual evoked potential of the mouse). J Comp Physiol Psychol. 92 (2), 271-279 (1978).
- Murrell, J. C., Waters, D., Johnson, C. B. Comparative effects of halothane, isoflurane, sevoflurane and desflurane on the electroencephalogram of the rat. Lab Anim. 42 (2), 161-170 (2008).
- Makela, K., Hartikainen, K., Rorarius, M., Jantti, V. Suppression of F-VEP during isoflurane-induced EEG suppression. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 100 (3), 269-272 (1996).
- Boyes, W. K., Padilla, S., Dyer, R. S. Body temperature-dependent and independent actions of chlordimeform on visual evoked potentials and axonal transport in optic system of rat. Neuropharmacology. 24 (8), 743-749 (1985).
- Hetzler, B. E., Boyes, W. K., Creason, J. P., Dyer, R. S. Temperature-dependent changes in visual evoked potentials of rats. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 70 (2), 137-154 (1988).
- Mitchell, J. The effects of lysolecithin on non-myelinated axons in vitro. Acta Neuropathol. 58 (4), 243-248 (1982).
- Meyer, R., et al. Acute neuronal apoptosis in a rat model of multiple sclerosis. J Neurosci. 21 (16), 6214-6220 (2001).
- Lachapelle, F., et al. Failure of remyelination in the nonhuman primate optic nerve. Brain Pathol. 15 (3), 198-207 (2005).
