Protocol
Etik uttalande: Alla som deltar i djurförsök genomfördes i enlighet med den svenska uppförandekoden för skötsel och användning av djur för vetenskapliga ändamål och riktlinjerna för Arvo uttalande för användning av djur i ögon och Vision Research, och har godkänts av Animal etikkommitté Macquarie University.
1. VEP Elektrod Implantation
- Söva djuret med en intraperitoneal injektion av ketamin (75 mg / kg) och medetomidin (0,5 mg / kg).
Obs: Efter induktion av anestesi, karens reflexer (nypa tester, ögon- och ögonlocksreflexer, etc.) och deras frånvaro som en indikation att börja operationen. Kontinuerligt övervaka djur i hela operationen och administrera ytterligare bedövningsmedel läkemedel (10% av ursprungligt ketamin dos per top-up) om reflexer är närvarande. Vuxna råttor (> 12 veckor) användes i experimenten. - Raka huden av det kirurgiska området.Placera djuret på en värmande dyna (37 ° C) för att upprätthålla kroppstemperaturen under operationen. Förbered huden genom topisk applicering av povidon-jod. Applicera kirurgisk drapering. Applicera topisk oftalmisk salva för att förhindra hornhinnan torrhet under narkos. Behåll aseptik med sterila instrument.
- Gör en longitudinell hudincision på mittlinjen på skinnet på huvudet. Rensa bindväv att uppnå god exponering av skallen.
- Försiktigt, borra små burr hål manuellt med en mikro handborr på 7 mm bakom bregma och 3 mm i sidled med mittlinjen.
- Implantatskruvelektroder genom skallen in i kortex (område 17), genomträngande hjärnbarken till ett djup av ca 0,5 mm. Implantera en referensskruvelektrod på mittlinjen 3 mm rostralt till bregma. Applicera dentalcement att innesluta och fixera skruvarna (inte alltid behövs).
- Sutur huden på huvudet, administrera antibiotisk salva på huden och tillåta djuret att recover från anestesi på en värmande dyna.
Obs: Alternativt kan elektroder lämnas exponerad, så att huden inte behöver tas upp på nytt i varje inspelning. Omedelbart efter upphörande av kirurgi men före anestesi återhämtning, administrera en icke-steroida antiinflammatoriska läkemedel (NSAID) (om den inte ges preoperativt) eller ett opioidanalgetikum. Övervaka djuren hela tiden tills fullständig återhämtning från narkos och helt rörlig. - Låt åtminstone 1 vecka för djuren att återhämta sig från operationen före VEP inspelning.
2. Optic Nerve Injection
- Söva djuret, förbereda huden och applicera drapering som ovan (1.1 och 1.2).
- Gör en 1- till 1,5-cm snitt i huden ovanför omloppsbana av ett slumpvis utvalt öga. Öppna den subkutana vävnaden för att nå omlopps kaviteten med fina iris sax. Öppna bindhinnan och främre Tenons kapsel under operationsmikroskop.
- Dra tillbaka extraocularmuskler och intraobital tårkörtlar att exponera ca 3 mm längd av synnerven. Öppna dura och spindelvävshinnan oavsett lager runt synnerven längdled med hjälp av en ögon blad.
- För in glaspipett in i synnerven på ett avstånd av 2 mm posteriort om i världen. Den glasmikropipett är fäst till en Hamilton-spruta.
- Spruta 1% lysolecitin (0,4-1,0 pl, med 0,02% Evans Blue som inte har effekt på myelinisering) långsamt in i nerven ungefär under en period av 30 sekunder.
- Sutur hudsnittet. Applicera antibiotisk salva för att förhindra infektion. Kolleger ögon kan serveras som interna kontroller för elektrofysiologiska inspelningar.
- Placera djur på en värmande pad att återhämta sig från anestesi.
3. VEP Inspelning
- Söva djuret och förbereda huden som 1.1 och 1.2.
Anm: Lägre dos av anestetika kan användas för elektrofysiologisk recording (ketamin 40 mg / kg och medetomidin 0,25 mg / kg). - Placera råttan i ett mörkt rum och tillåta den att anpassa sig till mörker i 5 till 30 minuter. I vissa fall råttor kan respektive vara mörk anpassad O / N för scotopic eller ljus anpassade för fotopiska VEP inspelningar 8.
- Hålla kroppstemperaturen vid 37 ± 0,5 ° C genom homoeothermic filt system med en rektal termometer sond.
- Vidga eleverna med 1,0% tropikamid ögondroppar. Öppna huden över skallen att få tillgång till på förhand placerats in situ skruvelektroder.
- Anslut skruven över den kontra syncentrum av den stimulerade ögat och referensskruven till förstärkaren. Sätt en nål elektroden i svansen som marken. Mät och underhålla elektrodimpedansen under 5 kW.
- Placera en mini-Ganzfeld stimulator direkt på huden runt ögonlocken för att ge överlägsen öga isolering 7. Belysningen av stimulatorn måste kalibreras i förväggenom en fotometer.
- Leverera fotiska stimulans genom blinkar 100 gånger med en frekvens på 1 Hz, med låga och höga bandpassfilterinställningar av 1 och 100 Hz, respektive. Samplingsfrekvensen signalen är vid 5 kHz.
Obs: Signaler bör provtas åtminstone vid ca 250-300 Hz för att säkerställa att mer än två prover som samlats in under varje cykel. - Sutur huden tillbaka och hålla djuren på en värmande pad att återhämta sig från anestesi. Inspelningen kan upprepade gånger registreras på enskilda djur för att övervaka funktionella förändringar under en tidsperiod.
- Vid slutpunkten, administrera en överdos injektion av natriumpentobarbiton (100 mg / kg, ip) för att avliva djuret. Bekräfta dödshjälp av hjärtstillestånd, andningsstillestånd och minskning av kroppstemperaturen.
4. Vävnadsberedning och histologi
- Ta synnerverna från avlivade djur under mikroskop och fixera vävnaden i 1% paraformaldehyd O / N. <li> Tvätta vävnaden noggrant med saltlösning. Behandla vävnaden i en automatisk vävnadsprocessor och bädda in i paraffin. Cut sektioner (5-10 ^ m) med användning av en roterande mikrotom.
- Inkubera sektioner i 0,1% snabb blå lösning, såsom Luxol (i 95% etanol) O / N vid 56 ° C. Differentiera sektioner i 0,05% litiumkarbonat för 30 sekunder och sedan 70% etanol under ytterligare 30 sek. Slutligen Motfärga i 0,1% kresylviolett lösning under 30 sekunder innan montering av sektionerna. Använd den snabba blåfärgning att identifiera myelin i synnerven 5.
Obs! För immunohistokemi studie, fixa vävnad i 1% paraformaldehyd, tvätta med koksaltlösning och inkubera med 30% sackaros O / N. Bädda vävnad i OCT inbäddningsmedium och göra kryosnitt med användning av en kryostat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Reproducerbara inom sessionerna VEP spår visas i figur 1 och en signifikant fördröjning i N1 latens kan ses efter synnerven injektion. Partiell synnerven lesioner av demyelinisering kan observeras på histologiska sektioner med hjälp Luxol snabb blåfärgning 5. Figur 2 visar en representativ sektion med en liten fokal demyelinerad skada i mitten av synnerven. Observera att tvärsnitt inte representerar den totala volymen av skada. Den demyelinerad område kan mätas på varje på varandra följande tvärsnitt av nerven att härleda lesionen volymen genom att använda tredimensionella rekonstruktionen. Vi har visat en stark korrelation mellan latens förseningar och skada volym med denna modell i våra tidigare studier och det fanns ingen VEP latens förseningar i saltlösning injicerade kontroller 5.
Man tror att tidiga VEP komponenter efter blixtbelysning är mer stabila 7 5. Därför rekommenderar vi att N1 latens ska användas för dataanalys och för längd VEP övervakning för att bedöma effekterna av remyelinating terapier. Amplituden av VEP, men mer varierande jämfört med latensen är mer vägledande funktion av axoner i synnerven 6. Elektroencefalogram baserad skalning kan övervägas för amplitud analys 9.
Figur 1. VEP dröjsmål efter synnerven injektion. Representant VEP spår från en enskild råtta före och 2 dagar efter synnerven mikroinjektion (0,8 pl lysolecitin). VEP inspelningar upprepades på varje dag (intra-sessionerna spår är shown i samma färg) för att visa reproducerbarhet denna VEP inspelning protokoll. (Vertikal skala bar: 10 μV, horisontella skalan bar: 10 msek). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Demyelinisering i synnerven. Representativt tvärsnitt av synnerven från en råtta efter lysolecitin mikroinjektion. Den myelin komponenten färgas blå med Luxol snabb blå. En liten brännskada av demyelinisering kan ses i mitten av avsnittet. Demyelinerade område kan mätas på longitudinella serie tvärsnitt för att uppskatta skadan volymen i en tredimensionell skala. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av Ophthalmic Research Institute i Australien (ORIA). Vi tackar Prof. Algis Vingrys och Dr. Bang Bui, University of Melbourne, för att inledningsvis att hjälpa oss att utveckla VEP inspelningstekniken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine 100 mg/ml (Ketamil) | Troy Laboratories | AC 116 | |
| Medetomidine 1 mg/ml (Domitor) | Pfizer | sc-204073 | |
| Tropicamide 1.0% (Mydriacyl) | Alcon | sc-202371 | |
| Homoeothermic blanket system | Harvard Apparatus | NC9203819 | |
| Impedance meter | Grass | F-EZM5 | |
| Screw electrodes | Micro Fasteners | M1.0×3mm Csk Slot M/T 304 S/S | |
| Subdermal needle electrodes | Grass | F-E3M-72 | |
| Rapid Repair | DeguDent GmbH | ||
| Light-emitting diode | Nichia | NSPG300A | |
| Bioamplifier | CWE, Inc. | BMA-400 | |
| CED system | Cambridge Electronic Design, Ltd. | Power1401 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 87930 | |
| Lysolecithin | Sigma | L4129 | |
| Evan’s blue | Sigma | E2129 |
References
- Balcer, L. J.
- Lassmann, H. Multiple sclerosis as a neuronal disease. Waxman, S. G. , Elsevier. 153-164 (2005).
- Fahle, M., Bach, M. Principles and practice of clinical electrophysiology of vision. Heckenlively, J., Arden, G. , MIT Press. 207-234 (2006).
- Halliday, A. M., McDonald, W. I., Mushin, J. Delayed visual evoked response in optic neuritis. Lancet. 1, 982-985 (1972).
- You, Y., Klistorner, A., Thie, J., Graham, S. L. Latency delay of visual evoked potential is a real measurement of demyelination in a rat model of optic neuritis. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (9), 6911-6918 (2011).
- You, Y., Klistorner, A., Thie, J., Gupta, V. K., Graham, S. L. Axonal loss in a rat model of optic neuritis is closely correlated with visual evoked potential amplitudes using electroencephalogram based scaling. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 3662 (2012).
- You, Y., Klistorner, A., Thie, J., Graham, S. L. Improving reproducibility of VEP recording in rats: electrodes, stimulus source and peak analysis. Doc Ophthalmol. 123 (2), 109-119 (2011).
- Heiduschka, P., Schraermeyer, U. Comparison of visual function in pigmented and albino rats by electroretinography and visual evoked potentials. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 246 (11), 1559-1573 (2008).
- You, Y., Thie, J., Klistorner, A., Gupta, V. K., Graham, S. L. Normalization of visual evoked potentials using underlying electroencephalogram levels improves amplitude reproducibility in rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (3), 1473-1478 (2012).
- Levkovitch-Verbin, H. Animal models of optic nerve diseases. Eye (Lond). 18 (11), 1066-1074 (2004).
- Henry, K. R., Rhoades, R. W. Relation of albinism and drugs to the visual evoked potential of the mouse). J Comp Physiol Psychol. 92 (2), 271-279 (1978).
- Murrell, J. C., Waters, D., Johnson, C. B. Comparative effects of halothane, isoflurane, sevoflurane and desflurane on the electroencephalogram of the rat. Lab Anim. 42 (2), 161-170 (2008).
- Makela, K., Hartikainen, K., Rorarius, M., Jantti, V. Suppression of F-VEP during isoflurane-induced EEG suppression. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 100 (3), 269-272 (1996).
- Boyes, W. K., Padilla, S., Dyer, R. S. Body temperature-dependent and independent actions of chlordimeform on visual evoked potentials and axonal transport in optic system of rat. Neuropharmacology. 24 (8), 743-749 (1985).
- Hetzler, B. E., Boyes, W. K., Creason, J. P., Dyer, R. S. Temperature-dependent changes in visual evoked potentials of rats. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 70 (2), 137-154 (1988).
- Mitchell, J. The effects of lysolecithin on non-myelinated axons in vitro. Acta Neuropathol. 58 (4), 243-248 (1982).
- Meyer, R., et al. Acute neuronal apoptosis in a rat model of multiple sclerosis. J Neurosci. 21 (16), 6214-6220 (2001).
- Lachapelle, F., et al. Failure of remyelination in the nonhuman primate optic nerve. Brain Pathol. 15 (3), 198-207 (2005).
