Protocol
倫理声明：動物に関わるすべての手順は、ケアと科学的な目的のための動物の使用と眼科と視覚研究における動物の使用に関するARVOステートメントの指針の実践のためのオーストラリアの規範に従って行われ、によって承認されましたマッコーリー大学の動物倫理委員会。
1. VEP電極移植
- 腹腔内ケタミンの注射（75 mgの/ kg）およびメデトミジン（0.5ミリグラム/ kg）で動物を麻酔。
、麻酔の誘導後に手術を開始する指標として離脱反射（ピンチ試験、角膜および眼瞼反射など）と、その不在を守ってください。注意してください。継続的に手術を通して動物を監視し、反射神経が存在する場合、追加の麻酔薬（トップアップあたりの初期ケタミン投与量の10％）を管理。成体ラット（> 12週間）の実験で使用されています。 - 手術領域の皮膚を剃ります。手術中の体温を維持するために加温パッド（37°C）で動物を置きます。ポビドンヨードの局所適用によって皮膚を準備します。手術用ドレープを適用します。全身麻酔下で角膜の乾燥を防ぐために、局所眼軟膏を適用します。滅菌器具を使用して無菌状態を維持します。
- 頭皮の正中線上に縦方向の皮膚切開を行います。頭蓋骨の良い露出を達成するために、結合組織をクリアします。
- 慎重に、ブレグマの後ろに7ミリメートルと正中線に横3ミリメートルでマイクロハンドドリルを使用して手動で小さなバーホールを開けます。
- 約0.5mmの深さに皮質を貫通皮質（領域17）に頭蓋骨を介してインプラントネジ電極。ブレグマに正中線3mmの吻側の基準スクリュー電極を埋め込みます。ネジを包み込むと固定する歯科用セメントを適用します（必ずしも必要ではありません）。
- 頭部の皮膚を縫合、皮膚に抗生物質軟膏を投与し、動物がRECOすることができます温暖化パッドの麻酔からの版。
注：皮膚が各記録に再オープンする必要がないようにあるいは、電極は、露出したままことができます。手術直後の停止時が、麻酔回復に先立って、非ステロイド性抗炎症薬（NSAID）（術前に投与されていない場合）、またはオピオイド鎮痛薬を投与します。麻酔薬と完全に歩行から完全に回復するまで、常に動物を監視します。 - 動物は前VEP記録に手術から回復するために、少なくとも1週間を許可します。
2.視神経インジェクション
- 、動物を麻酔皮膚を準備し、（1.1と1.2）上記のように立体裁断適用されます。
- ランダムに選択された目の軌道上の皮膚で1〜1.5 cmの切開を行います。微細なアイリスはさみを使用して眼窩に到達するために皮下組織を開きます。結膜を開き、手術用顕微鏡下でテノン嚢を前方。
- 外眼を撤回筋肉やintraobital涙腺は、視神経の約3mmの長さを露出させます。縦方向に眼科ブレードを用いて視神経の周りの硬膜とくも膜物質層を開きます。
- 地球に2mmの後方の距離で視神経にガラスピペットを挿入します。ガラスマイクロピペットは、ハミルトンシリンジに取り付けられています。
- 約30秒の期間にわたって神経にゆっくりと - （髄鞘形成に影響を持っていない0.02％エバンスブルーで、1.0μlの0.4）1％リゾレシチンを注入します。
- 皮膚切開を縫合。感染を防ぐために抗生物質軟膏を適用します。フェロー目は電気生理学の記録のための内部コントロールとして提供することができます。
- 麻酔から回復するために加温パッド上に動物を配置します。
3. VEPの記録
- 動物を麻酔し、1.1や1.2のように肌を準備します。
注：麻酔薬の低用量は、電気RECOのために使用することができますrding（ケタミン40 mgの/ kg及び0.25ミリグラム/ kgでメデトミジン）。 - 暗い部屋で、ラットを置き、それは5のために闇に適応することができます - 30分。いくつかのケースでは、ラットは、それぞれ明所視VEPの記録8に適合さ暗順応または光に対する暗順応O / Nとすることができます。
- 直腸体温計プローブと恒温ブランケットシステムにより37±0.5℃の体温を維持。
- 1.0％トロピカミド点眼剤と生徒を拡張。 その場でのスクリュー電極に事前配置にアクセスするために頭蓋骨の上の皮膚を開きます。
- 刺激眼の反対側の視覚皮質とアンプへの基準ネジの上にネジを接続します。グランドとして尾に針電極を挿入します。 5kΩの下の電極インピーダンスを測定し、維持します。
- 優れた目の分離7を提供するために、まぶたの周りの皮膚に直接ミニ全体野の刺激を配置します。刺激装置の照度を予め較正する必要があります光度計による。
- それぞれ、1〜100ヘルツの低域と高域通過フィルタの設定で、1ヘルツの周波数の光が点滅を通じて100回光刺激を提供します。信号のサンプリングレートは5kHzです。
注：信号は少なくとも約250でサンプリングされるべきである - 3つ以上のサンプルが、各サイクル中に収集されることを保証するために、300ヘルツ。 - 背中の皮膚を縫合し、麻酔から回復するために加温パッド上で動物を飼います。録音を繰り返し、ある期間にわたって機能的変化を監視するために、個々の動物に記録することができます。
- エンドポイントで、動物を安楽死させるためにナトリウムペントバルビトン（100mg / kg、腹腔内）の過剰投与の注射を投与します。心停止、呼吸停止や体温の低下によって安楽死を確認します。
4.組織調製および組織学
- 顕微鏡下で安楽死させた動物から視神経を削除し、1％パラホルムアルデヒドO / Nで組織を固定します。 <李>は、生理食塩水で十分に組織を洗ってください。自動組織プロセッサで組織を処置し、パラフィンに埋め込むことができます。回転式ミクロトームを用いて - （10ミクロン5）のセクションをカット。
- 56℃で、このようなルクソール（95％エタノール）O / Nとして0.1％ファーストブルー溶液中でのセクションをインキュベートします。 30秒間0.05％の炭酸リチウムと他の30秒間、次いで70％エタノールで切片を差別。最後に、切片をマウントする前に30秒間、0.1％クレシルバイオレット溶液で対比染色。視神経5にミエリンを識別するためにファーストブルー染色を使用してください。
免疫組織化学研究のために、1％パラホルムアルデヒド中で組織を固定し、生理食塩水で洗浄し、30％スクロース、O / Nでインキュベート：注意してください。 10月に埋め込む組織がメディアを埋め込み、クライオスタットを用いて、凍結切片を作成します。
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Representative Results
再現内会合VEPトレースは、 図1に示されており、N1潜時の有意な遅延は、視神経の注射後に見られます。脱髄の部分視神経病変は、ルクソールファーストブルー染色5を用いて、組織切片上で観察することができる。 図2は、視神経の中心部にある小さな焦点脱髄病変を持つ代表的な断面を示しています。断面は、病変の総体積を表すものではありませんので注意してください。脱髄の領域は、三次元再構成を用いて病変容積を推定するために、神経の各連続した断面で測定することができます。我々は、我々の以前の研究で、このモデルを使用して、待ち時間遅延および損傷体積の間に強い相関関係を示したし、生理食塩水を注射した対照5にはVEPの待ち時間遅延はありませんでした。
これは、フラッシュ照明後の初期VEP成分がより安定であると考えられている7 5における脱髄との最強の線形関係を有することが示されています。したがって、我々は、N1の待ち時間は、データ分析のためおよび療法を再ミエリン化の影響を評価する際に縦VEPモニタリングに使用することをお勧めします。 VEPの振幅は、待ち時間に比べ変数が、視神経6における軸索の機能をさらに示します。脳波ベースのスケーリングは、振幅分析の9を検討することができます。
視神経注入後の図1 VEP遅延。代表VEPは、個々の前に、ラットおよび視神経マイクロインジェクション（0.8μlのリゾレシチン）2日後からトレースします。 VEPの記録は、各日に繰り返した（イントラ会期トレースはショーですこのVEP記録プロトコルの再現性を実証するために、同じ色のN）。 （垂直スケールバー：10μV、水平スケールバー：10ミリ秒）。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
視神経図2.脱髄。マイクロインジェクションをリゾレシチン後のラットから視神経の代表断面。ミエリン成分は、ルクソールファーストブルーを用いて青色に染色されます。脱髄の小さな焦点病変部の中心に見ることができます。脱髄面積は3次元スケールで病変体積を推定するために、長手方向連続断面上で測定することができる。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
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Acknowledgments
この研究は、オーストラリアの眼科研究所（ORIA）によってサポートされていました。私たちは当初、VEP記録技術を開発するために私たちを助けるため、教授Algis Vingrys博士バンブイ、メルボルン大学に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine 100 mg/ml (Ketamil) | Troy Laboratories | AC 116 | |
| Medetomidine 1 mg/ml (Domitor) | Pfizer | sc-204073 | |
| Tropicamide 1.0% (Mydriacyl) | Alcon | sc-202371 | |
| Homoeothermic blanket system | Harvard Apparatus | NC9203819 | |
| Impedance meter | Grass | F-EZM5 | |
| Screw electrodes | Micro Fasteners | M1.0×3mm Csk Slot M/T 304 S/S | |
| Subdermal needle electrodes | Grass | F-E3M-72 | |
| Rapid Repair | DeguDent GmbH | ||
| Light-emitting diode | Nichia | NSPG300A | |
| Bioamplifier | CWE, Inc. | BMA-400 | |
| CED system | Cambridge Electronic Design, Ltd. | Power1401 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 87930 | |
| Lysolecithin | Sigma | L4129 | |
| Evan’s blue | Sigma | E2129 |
References
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