Protocol
הצהרת אתיקה: כל הנהלים הקשורים בעלי חיים נערכו בהתאם לקוד האוסטרלי עיסוק לטיפול והשימוש בבעלי חיים למטרות מדעיות וההנחיות של הצהרת ארוו לשימוש בבעלי חיים ברפואת עיניים ומחקר חזון, ואושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים מאוניברסיטת Macquarie.
1. VEP אלקטרודה השרשה
- להרדים את החיה עם זריקת intraperitoneal של קטמין (75 מ"ג / קילוגרם) וmedetomidine (0.5 מ"ג / קילוגרם).
שים לב: בעקבות אינדוקציה של הרדמה, להתבונן רפלקסים נסיגה (מבחן קמצוץ, רפלקס מצמוץ וpalpebral, וכו ') והיעדרם כאינדיקציה לניתוח מתחילה. הרף לפקח בעלי החיים במהלך הניתוח ולנהל תרופה נוספת הרדמה (10% ממינון קטמין הראשוני לעליון למעלה) אם רפלקסים נמצאים. חולדות בוגרות (> 12 שבועות) משמשות בניסויים. - לגלח את העור של אזור הניתוח.מניחים את החיה על כרית חימום (37 מעלות צלזיוס) כדי לשמור על טמפרטורת גוף במהלך הניתוח. להכין את העור באמצעות יישום מקומי של povidone- יוד. החל כורך כירורגית. החל משחת עיניים אקטואלי למנוע יובש בקרנית בהרדמה כללית. לשמור asepsis ידי שימוש במכשירים סטריליים.
- לעשות חתך בעור אורך על קו האמצע של עור הראש. נקה את רקמת חיבור כדי להשיג חשיפה טובה של הגולגולת.
- זהירות, לקדוח חורים בר קטנים באמצעות מקדח יד מיקרו באופן ידני בשעה 7 מ"מ מאחורי גבחת ו -3 מ"מ לרוחב קו האמצע.
- אלקטרודות שתל בורג דרך הגולגולת לקליפת המוח (אזור 17), חודר הקליפה עד לעומק של כ -0.5 מ"מ. שתל אלקטרודה בורג התייחסות בקו האמצע מקורי מ"מ 3 לגבחת. החל מלט שיניים ללשים בארגז ולתקן את הברגים (לא תמיד חובה).
- לתפור את העור של הראש, לנהל משחה אנטיביוטית על העור ומאפשר לבעלי החיים לRecoVer מהרדמה על כרית חימום.
הערה: לחלופין, ניתן להשאיר חשופות אלקטרודות, כך עור שלא צריך להיות מחדש בכל הקלטה. מייד עם ההפסקה של ניתוח, אבל לפני התאוששות הרדמה, לנהל תרופה שאינה סטרואידים אנטי דלקתית (NSAID) (אם לא מנוהל מראש אופרטיבי) או משככי כאבים אופיואידים. צג בעלי החיים כל הזמן עד להחלמה מלאה מההרדמה ואמבולטורי באופן מלא. - הרשה שבוע לבעלי החיים להתאושש מהניתוח לפני הקלטת VEP לפחות 1.
2. הזרקת עצב הראייה
- להרדים את החיה, להכין את העור ולהחיל כורך כאמור לעיל (1.1 ו -1.2).
- לעשות חתך 1 ל -1.5 סנטימטר בעור מעל המסלול של עין שנבחרה באקראי. פתח את הרקמה התת עורית להגיע חלל מסלולית באמצעות מספריים איריס בסדר. פתח את הלחמית וקדמית הכמוסה של שֶׁגֶם מתחת למיקרוסקופ ההפעלה.
- לחזור extraocularשרירים ובלוטות דמעות intraobital לחשוף אורך מ"מ כ 3 של עצב הראייה. פתח את שכבות דורה ועניין הארכניאיד סביב עצב הראייה longitudinally באמצעות להב עיניים.
- הכנס את פיפטה הזכוכית לעצב הראייה במרחק של 2 מ"מ אחורי לגלובוס. Micropipette הזכוכית מחובר למזרק המילטון.
- הזרק lysolecithin 1% (0.4 - 1.0 מיקרוליטר, עם 0.02% הכחול של אוון שאין לי השפעות על myelination) לאט לתוך העצב על פני תקופה של 30 שניות בערך.
- לתפור את החתך בעור. החל משחה אנטיביוטית למניעת זיהום. יכולות להיות מוגשות עיני בחור כמו בקרות פנימיות להקלטות אלקטרופיזיולוגיה.
- מניחים את בעלי החיים על כרית חימום להתאושש מהרדמה.
3. VEP הקלטה
- להרדים את החיה ולהכין את העור כמו 1.1 ו -1.2.
הערה: במינון נמוך יותר של חומרי הרדמה יכול לשמש לReco אלקטרוrding (40 מ"ג / קילוגרם קטמין וmedetomidine 0.25 מ"ג / קילוגרם). - מניחים את החולדה בחדר חשוך ולאפשר לו להסתגל לחשכה במשך 5 - 30 דקות. במקרים מסוימים חולדות יכולות להיות בהתאמה O הכהה מותאם / N לscotopic או אור מותאם להקלטות VEP photopic 8.
- לשמור על טמפרטורת הגוף על 37 ± 0.5 מעלות צלזיוס על ידי שמיכת מערכת homoeothermic עם בדיקה מדחום רקטלי.
- להרחיב את התלמידים עם טיפות עיני tropicamide 1.0%. פתח את העור מעל הגולגולת לגשת באלקטרודות בורג אתר-הונח מראש.
- חבר את הבורג מעל נגדי קליפת הראייה של העין מגורה ובורג ההתייחסות למגבר. הכנס אלקטרודה מחט לתוך הזנב כקרקע. למדוד ולשמור על עכבת אלקטרודה להלן 5 ק"ג-אוהם.
- הנח ממריץ מיני Ganzfeld ישירות על העור סביב העפעפיים לספק בידוד עין מעולה 7. הארת ממריץ צריכה להיות מכוילת מראשעל ידי פוטומטר.
- לספק גירוי photic באמצעות הבזקי אור פי 100 בתדירות של 1 הרץ, עם הגדרות מסנן להקה עוברת נמוכות וגבוהות של 1 הרץ ו -100, בהתאמה. קצב דגימת האות הוא בשעה 5 kHz.
הערה: יש שנדגמו אותות לפחות בכ 250-300 הרץ על מנת להבטיח שיותר ששתי דגימות שנאספו במהלך כל מחזור. - לתפור את העור בחזרה ולשמור על בעלי החיים על כרית חימום להתאושש מהרדמה. הקלטה ניתן להקליט שוב ושוב על בעלי חיים בודדים לעקוב אחר שינויים פונקציונליים על פני תקופה של זמן.
- בנקודת הסיום, לנהל הזרקה מנת יתר של pentobarbitone נתרן (100 מ"ג / קילוגרם, IP) להרדימו. לאשר המתת חסד על ידי דום לב, דום נשימה וירידה של טמפרטורת גוף.
4. רקמות הכנה והיסטולוגיה
- הסר את עצבי ראייה מבעלי חיים מומתים מתחת למיקרוסקופ ולתקן הרקמות ב1% O paraformaldehyde / N. <li> לשטוף את הרקמה ביסודיות עם מי מלח. פנק את הרקמות במעבד רקמות אוטומטיות ולהטביע בפרפין. חלקים חתוכים (5 - 10 מיקרומטר) באמצעות microtome סיבובי.
- סעיפי דגירה בפתרון 0.1% כחולים מהיר כגון Luxol O (באתנול 95%) / N ב 56 מעלות צלזיוס. להבדיל הסעיפים ב0.05% ליתיום קרבונט למשך 30 שניות ולאחר מכן אתנול 70% למשך 30 שניות נוספות. לבסוף, counterstain 0.1% בפתרון סגול cresyl למשך 30 שניות לפני ההרכבה החלקים. השתמש בכתמים הכחולים מהירים לזהות המיאלין בעצב הראייה 5.
הערה: מחקר אימונוהיסטוכימיה, לתקן רקמות בparaformaldehyde 1%, לשטוף עם מי מלח ודגירה עם 30% O סוכרוז / N. רקמת שבץ ב אוקטובר הטבעה בינונית ולעשות cryosections באמצעות cryostat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
עקבות VEP התוך sessional שחזור מוצגות באיור 1 ועיכוב משמעותי בהשהית N1 ניתן לראות לאחר הזרקת עצב הראייה. נגעי עצב ראייה חלקיים של demyelination ניתן לצפות בקטעים היסטולוגית באמצעות מכתים הכחול מהיר Luxol 5. איור 2 מראה קטע נציג עם נגע demyelinated מוקדי קטן במרכז של עצב הראייה. שים לב שהחתך אינו מייצג נפח כולל של נגע. אזור demyelinated ניתן למדוד בכל חתך ברציפות של העצב להסיק באמצעות שחזור תלת ממדי נפח הנגעים. אנחנו הוכחנו מתאם חזק בין עיכוב חביון ונפח נגעים באמצעות מודל זה במחקרים הקודמים שלנו ולא היה שום עיכוב חביון VEP בבקרה-הזריק המלוח 5.
הוא האמין כי רכיבי VEP הראשונים שלאחר הארת הבזק הם יציבים יותר 7 5. לפיכך, אנו ממליצים חביון N1 צריך לשמש לניתוח נתונים וניטור VEP אורך בהערכת ההשפעה של טיפולי remyelinating. המשרעת של VEP, למרות שמשתנה יותר בהשוואה להשהיה, היא יותר מעיד על תפקוד של האקסונים בעצב הראייה 6. דרוג מבוסס אלקטרואנצפלוגרם יכול להיחשב לניתוח משרעת 9.
איור 1. עיכוב VEP לאחר הזרקת עצב ראייה. נציג VEP עקבות מעכברוש בודד לפני ואחרי 2 ימים microinjection עצב הראייה (0.8 lysolecithin μl). הקלטות VEP חזרו על כל יום (עקבות התוך sessional הן מופעn באותו הצבע) כדי להדגים את שחזור של פרוטוקול הקלטה זו VEP. (בר אנכי בקנה מידה: 10 μV; סרגל קנה מידה אופקי: 10 אלפיות שנייה). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור demyelination 2. בעצב הראייה. חתך המייצג של עצב הראייה מעכברוש לאחר lysolecithin microinjection. רכיב המיאלין מוכתם כחול באמצעות כחול מהיר luxol. נגע מוקדי קטן של demyelination ניתן לראות במרכז הקטע. אזור Demyelinated ניתן למדוד בחתכי אורך סידוריים להעריך את נפח הנגעים בקנה מידה תלת-ממדית. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי רפואת עיניים מכון המחקר של אוסטרליה (אוריה). אנו מודים לפרופ 'Algis Vingrys וד"ר המפץ וי, אוניברסיטת מלבורן, בתחילה עוזר לנו לפתח את טכניקת הקלטת VEP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine 100 mg/ml (Ketamil) | Troy Laboratories | AC 116 | |
| Medetomidine 1 mg/ml (Domitor) | Pfizer | sc-204073 | |
| Tropicamide 1.0% (Mydriacyl) | Alcon | sc-202371 | |
| Homoeothermic blanket system | Harvard Apparatus | NC9203819 | |
| Impedance meter | Grass | F-EZM5 | |
| Screw electrodes | Micro Fasteners | M1.0×3mm Csk Slot M/T 304 S/S | |
| Subdermal needle electrodes | Grass | F-E3M-72 | |
| Rapid Repair | DeguDent GmbH | ||
| Light-emitting diode | Nichia | NSPG300A | |
| Bioamplifier | CWE, Inc. | BMA-400 | |
| CED system | Cambridge Electronic Design, Ltd. | Power1401 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 87930 | |
| Lysolecithin | Sigma | L4129 | |
| Evan’s blue | Sigma | E2129 |
References
- Balcer, L. J.
- Lassmann, H. Multiple sclerosis as a neuronal disease. Waxman, S. G. , Elsevier. 153-164 (2005).
- Fahle, M., Bach, M. Principles and practice of clinical electrophysiology of vision. Heckenlively, J., Arden, G. , MIT Press. 207-234 (2006).
- Halliday, A. M., McDonald, W. I., Mushin, J. Delayed visual evoked response in optic neuritis. Lancet. 1, 982-985 (1972).
- You, Y., Klistorner, A., Thie, J., Graham, S. L. Latency delay of visual evoked potential is a real measurement of demyelination in a rat model of optic neuritis. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (9), 6911-6918 (2011).
- You, Y., Klistorner, A., Thie, J., Gupta, V. K., Graham, S. L. Axonal loss in a rat model of optic neuritis is closely correlated with visual evoked potential amplitudes using electroencephalogram based scaling. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 3662 (2012).
- You, Y., Klistorner, A., Thie, J., Graham, S. L. Improving reproducibility of VEP recording in rats: electrodes, stimulus source and peak analysis. Doc Ophthalmol. 123 (2), 109-119 (2011).
- Heiduschka, P., Schraermeyer, U. Comparison of visual function in pigmented and albino rats by electroretinography and visual evoked potentials. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 246 (11), 1559-1573 (2008).
- You, Y., Thie, J., Klistorner, A., Gupta, V. K., Graham, S. L. Normalization of visual evoked potentials using underlying electroencephalogram levels improves amplitude reproducibility in rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (3), 1473-1478 (2012).
- Levkovitch-Verbin, H. Animal models of optic nerve diseases. Eye (Lond). 18 (11), 1066-1074 (2004).
- Henry, K. R., Rhoades, R. W. Relation of albinism and drugs to the visual evoked potential of the mouse). J Comp Physiol Psychol. 92 (2), 271-279 (1978).
- Murrell, J. C., Waters, D., Johnson, C. B. Comparative effects of halothane, isoflurane, sevoflurane and desflurane on the electroencephalogram of the rat. Lab Anim. 42 (2), 161-170 (2008).
- Makela, K., Hartikainen, K., Rorarius, M., Jantti, V. Suppression of F-VEP during isoflurane-induced EEG suppression. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 100 (3), 269-272 (1996).
- Boyes, W. K., Padilla, S., Dyer, R. S. Body temperature-dependent and independent actions of chlordimeform on visual evoked potentials and axonal transport in optic system of rat. Neuropharmacology. 24 (8), 743-749 (1985).
- Hetzler, B. E., Boyes, W. K., Creason, J. P., Dyer, R. S. Temperature-dependent changes in visual evoked potentials of rats. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 70 (2), 137-154 (1988).
- Mitchell, J. The effects of lysolecithin on non-myelinated axons in vitro. Acta Neuropathol. 58 (4), 243-248 (1982).
- Meyer, R., et al. Acute neuronal apoptosis in a rat model of multiple sclerosis. J Neurosci. 21 (16), 6214-6220 (2001).
- Lachapelle, F., et al. Failure of remyelination in the nonhuman primate optic nerve. Brain Pathol. 15 (3), 198-207 (2005).
