Protocol
आचार कथन: जानवरों को शामिल सभी प्रक्रियाओं की देखभाल और वैज्ञानिक प्रयोजनों के लिए जानवरों के इस्तेमाल और नेत्र और विजन रिसर्च में जानवरों के इस्तेमाल के लिए ARVO वक्तव्य के दिशा निर्देशों के लिए प्रैक्टिस के ऑस्ट्रेलियाई संहिता के अनुसार आयोजित की गई, और द्वारा अनुमोदित किया गया मैक्वेरी विश्वविद्यालय के पशु आचार समिति।
1. VEP इलेक्ट्रोड आरोपण
- एक intraperitoneal ketamine का इंजेक्शन (75 मिग्रा / किग्रा) और medetomidine (0.5 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ पशु anesthetize।
संज्ञाहरण के शामिल होने के बाद सर्जरी शुरू करने के लिए एक संकेत के रूप में वापसी सजगता (चुटकी परीक्षण, कॉर्निया और नेत्रच्छद पलटा, आदि) और उनकी अनुपस्थिति का निरीक्षण: ध्यान दें। लगातार सर्जरी भर पशुओं पर नजर रखने और सजगता मौजूद हैं, अगर अतिरिक्त संवेदनाहारी दवा (टॉप-अप के अनुसार प्रारंभिक ketamine खुराक का 10%) प्रशासन। वयस्क चूहों (> 12 सप्ताह) प्रयोगों में इस्तेमाल कर रहे हैं। - शल्य चिकित्सा के क्षेत्र की त्वचा दाढ़ी।सर्जरी के दौरान शरीर का तापमान बनाए रखने के लिए एक वार्मिंग पैड (37 डिग्री सेल्सियस) पर पशु रखें। Povidone आयोडीन की सामयिक आवेदन के माध्यम से त्वचा तैयार करें। शल्य draping लागू करें। सामान्य संज्ञाहरण के तहत कॉर्निया सूखापन को रोकने के लिए सामयिक नेत्र मरहम लागू करें। बाँझ उपकरणों का उपयोग करके अपूतिता बनाए रखें।
- सिर की त्वचा के midline पर एक अनुदैर्ध्य त्वचा चीरा बनाओ। खोपड़ी के अच्छे प्रदर्शन को प्राप्त करने के लिए संयोजी ऊतक को साफ़ करें।
- ध्यान से, मैन्युअल पर्वबिन्दु के पीछे 7 मिमी और midline के लिए 3 मिमी पार्श्व में एक माइक्रो हाथ ड्रिल का उपयोग छोटे गड़गड़ाहट छेद ड्रिल।
- लगभग 0.5 मिमी की गहराई तक कॉर्टेक्स मर्मज्ञ कॉर्टेक्स (क्षेत्र 17) में खोपड़ी के माध्यम से प्रत्यारोपण पेंच इलेक्ट्रोड,। पर्वबिन्दु को midline के 3 मिमी व्याख्यान चबूतरे पर एक संदर्भ पेंच इलेक्ट्रोड इम्प्लांट। शिकंजा डिब्बे में बंद है और ठीक करने के लिए दंत सीमेंट लागू करें (हमेशा के लिए आवश्यक नहीं है)।
- Reco करने के लिए पशु, सिर की त्वचा सीवन त्वचा पर एंटीबायोटिक मलहम के लिए प्रशासन की अनुमतिदेखें एक वार्मिंग पैड पर संज्ञाहरण से।
नोट: वैकल्पिक रूप से, इलेक्ट्रोड उजागर छोड़ा जा सकता है, कि त्वचा प्रत्येक रिकॉर्डिंग में फिर से खोल होने की जरूरत नहीं है। तुरंत सर्जरी लेकिन पूर्व संवेदनाहारी वसूली करने के लिए की समाप्ति पर, एक गैर स्टेरायडल विरोधी भड़काऊ दवा (NSAID) (नहीं तो पूर्व operatively प्रशासित) या एक opioid एनाल्जेसिक प्रशासन। संवेदनाहारी और पूरी तरह से चल से पूरी वसूली तक लगातार पशुओं की निगरानी करें। - जानवरों की सर्जरी से पूर्व VEP रिकॉर्डिंग करने के लिए ठीक करने के लिए कम से कम 1 सप्ताह की अनुमति दें।
2. ऑप्टिक तंत्रिका इंजेक्शन
- , पशु anesthetize त्वचा को तैयार करने और (1.1 और 1.2) के रूप में ऊपर draping लागू होते हैं।
- एक बेतरतीब ढंग से चुनी आंख की कक्षा से ऊपर की त्वचा में एक 1- 1.5 सेमी चीरा बनाओ। ठीक आईरिस कैंची का उपयोग कक्षीय गुहा तक पहुंचने के लिए चमड़े के नीचे ऊतक खोलें। कंजाक्तिवा खोलें और ऑपरेटिंग माइक्रोस्कोप के तहत चूल कैप्सूल पूर्वकाल।
- दृष्टितर वापस लेनामांसपेशियों और intraobital अश्रु ग्रंथियों ऑप्टिक तंत्रिका के लगभग 3 मिमी लंबाई को बेनकाब करने के लिए। अनुलंबीय एक नेत्र ब्लेड का उपयोग ऑप्टिक तंत्रिका आसपास ड्यूरा और मकड़ी का मामला परतों खोलें।
- दुनिया के लिए 2 मिमी पीछे की दूरी पर ऑप्टिक तंत्रिका में कांच पिपेट डालें। कांच micropipette एक हैमिल्टन सिरिंज से जुड़ी है।
- लगभग 30 सेकंड की अवधि में तंत्रिका में धीरे - (myelination पर प्रभाव नहीं है, जो 0.02% इवान ब्लू के साथ, 1.0 μl 0.4) 1% lysolecithin इंजेक्षन।
- त्वचा चीरा सीवन। संक्रमण को रोकने के लिए एंटीबायोटिक मलहम लागू करें। बंदे आँखों इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी रिकॉर्डिंग के लिए आंतरिक नियंत्रण के रूप में कार्य किया जा सकता है।
- संज्ञाहरण से उबरने के लिए एक वार्मिंग पैड पर जानवरों रखें।
3. VEP रिकॉर्डिंग
- पशु anesthetize और 1.1 और 1.2 के रूप में त्वचा तैयार करते हैं।
नोट: एनेस्थेटिक्स की कम खुराक electrophysiological सिफारिश के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैrding (ketamine 40 मिलीग्राम / किलो और 0.25 मिलीग्राम / किग्रा medetomidine)। - एक अंधेरे कमरे में चूहे प्लेस और यह 5 के लिए अंधेरे के लिए अनुकूल करने की अनुमति देते हैं - 30 मिनट। कुछ मामलों में चूहों क्रमशः photopic VEP रिकॉर्डिंग 8 के लिए अनुकूलित scotopic या प्रकाश के लिए अंधेरे अनुकूलित हे / एन किया जा सकता है।
- एक गुदा थर्मामीटर जांच के साथ homoeothermic कंबल प्रणाली द्वारा 37 ± 0.5 डिग्री सेल्सियस पर शरीर का तापमान बनाए रखें।
- 1.0% tropicamide आई ड्रॉप के साथ विद्यार्थियों को चौड़ा करना। का उपयोग करने की खोपड़ी पर त्वचा ओपन के प्री-रखा सीटू पेंच इलेक्ट्रोड में।
- उत्तेजित आंख की प्रतिपक्षी दृश्य प्रांतस्था और एम्पलीफायर के संदर्भ पेंच पर पेंच कनेक्ट करें। जमीन के रूप में पूंछ में एक सुई इलेक्ट्रोड डालें। उपाय और 5 kΩ नीचे इलेक्ट्रोड प्रतिबाधा बनाए रखें।
- बेहतर आंख अलगाव 7 प्रदान करने के लिए पलकों के आसपास की त्वचा पर सीधे एक मिनी Ganzfeld उत्तेजक रखें। उत्तेजक की रोशनी पहले से calibrated किया जा करने की जरूरत हैएक दीप्तिमापी द्वारा।
- क्रमश: 1 और 100 हर्ट्ज के निम्न और उच्च बैंड पास फिल्टर सेटिंग्स के साथ, 1 हर्ट्ज की एक आवृत्ति पर प्रकाश चमक के माध्यम से 100 गुना रोशनी का उत्तेजना उद्धार। संकेत नमूना दर 5 kHz पर है।
नोट: सिग्नल कम से कम 250 के बारे में जांचा जाना चाहिए - अधिक है कि दो नमूने प्रत्येक चक्र के दौरान एकत्र कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए 300 हर्ट्ज। - वापस त्वचा सिवनी और संज्ञाहरण से उबरने के लिए एक वार्मिंग पैड पर पशुओं को रखने के। रिकॉर्डिंग बार-बार समय की अवधि में कार्यात्मक परिवर्तन की निगरानी के लिए अलग-अलग जानवरों पर दर्ज किया जा सकता है।
- अंत बिंदु पर, पशु euthanize करने के लिए सोडियम pentobarbitone (100 मिलीग्राम / किग्रा, आईपी) की एक ज्यादा इंजेक्शन प्रशासन। हृदय की गिरफ्तारी, सांस की गिरफ्तारी और शरीर के तापमान की कमी से इच्छामृत्यु की पुष्टि करें।
4. ऊतक तैयारी और प्रोटोकॉल
- खुर्दबीन के नीचे euthanized जानवरों से ऑप्टिक नसों निकालें और 1% paraformaldehyde के ओ / एन में ऊतक तय कर लो। <ली> नमक के साथ अच्छी तरह से ऊतक धो लें। एक स्वत: ऊतक प्रोसेसर में ऊतक समझो और आयल में एम्बेड। एक रोटरी सूक्ष्म का उपयोग कर - (10 माइक्रोन 5) कट वर्गों।
- 56 डिग्री सेल्सियस पर इस तरह के Luxol (95% इथेनॉल) हे / एन के रूप में 0.1% तेजी से नीले समाधान में वर्गों सेते हैं। फिर एक और 30 सेकंड के लिए 70% इथेनॉल के 30 सेकंड के लिए 0.05% लिथियम कार्बोनेट में वर्गों के अंतर और। अंत में, वर्गों बढ़ते से पहले 30 सेकंड के लिए 0.1% cresyl बैंगनी समाधान में counterstain। ऑप्टिक तंत्रिका 5 में माइलिन की पहचान करने के लिए तेजी से नीले रंग धुंधला का प्रयोग करें।
नोट: immunohistochemistry के अध्ययन के लिए, 1% paraformaldehyde में ऊतक को ठीक खारा से धो लें और 30% सूक्रोज हे / एन के साथ सेते हैं। अक्टूबर में शामिल करें ऊतक मध्यम एम्बेड और एक cryostat का उपयोग cryosections बनाते हैं।
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Representative Results
प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य इंट्रा-सत्र VEP निशान चित्र 1 में दिखाया जाता है और एन 1 विलंबता में एक महत्वपूर्ण देरी ऑप्टिक तंत्रिका इंजेक्शन के बाद देखा जा सकता है। Demyelination का आंशिक ऑप्टिक तंत्रिका घावों Luxol तेजी से नीले रंग धुंधला 5 का उपयोग कर histological वर्गों पर देखा जा सकता है। 2 ऑप्टिक तंत्रिका के केंद्र में एक छोटे फोकल demyelinated घाव के साथ एक प्रतिनिधि अनुभाग पता चलता है। क्रॉस सेक्शन घाव की कुल मात्रा का प्रतिनिधित्व नहीं करता है ध्यान दें। demyelinated क्षेत्र के तीन आयामी पुनर्निर्माण का उपयोग करके घाव मात्रा परिणाम निकालना तंत्रिका के प्रत्येक लगातार पार अनुभाग पर मापा जा सकता है। हम अपने पिछले अध्ययनों में इस मॉडल का उपयोग विलंबता देरी और घाव मात्रा के बीच मजबूत संबंध का प्रदर्शन किया है और खारा इंजेक्शन नियंत्रण 5 में कोई VEP विलंबता देरी हुई थी।
यह फ्लैश रोशनी निम्नलिखित जल्दी VEP घटकों और अधिक स्थिर माना जाता है कि 7 5 में demyelination के साथ मजबूत रैखिक संबंध नहीं है कि दिखाया गया है। इसलिए, हम एन 1 विलंबता डेटा विश्लेषण के लिए और remyelinating उपचारों के प्रभाव का आकलन करने में अनुदैर्ध्य VEP निगरानी के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए कि सलाह देते हैं। VEP के आयाम, विलंबता की तुलना में हालांकि अधिक चर, ऑप्टिक तंत्रिका 6 में axons की समारोह के अधिक संकेत है। Electroencephalogram आधारित स्केलिंग आयाम विश्लेषण 9 के लिए विचार किया जा सकता है।
ऑप्टिक तंत्रिका इंजेक्शन के बाद चित्रा 1. VEP देरी। प्रतिनिधि VEP एक व्यक्ति से पहले चूहे और ऑप्टिक तंत्रिका microinjection (0.8 μl lysolecithin) के बाद 2 दिनों से बताते हैं। VEP रिकॉर्डिंग प्रत्येक दिन पर दोहराया गया (इंट्रा-सत्र निशान दिखा रहे हैंएन एक ही रंग में) इस VEP रिकॉर्डिंग प्रोटोकॉल के reproducibility प्रदर्शित करने के लिए। (ऊर्ध्वाधर पैमाने पर पट्टी: 10 μV; क्षैतिज पैमाने पर पट्टी: 10 मिसे)। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
ऑप्टिक तंत्रिका में चित्रा 2. Demyelination। Microinjection के lysolecithin के बाद एक चूहे से ऑप्टिक तंत्रिका के प्रतिनिधि पार अनुभाग। माइलिन घटक luxol तेजी से नीले रंग का उपयोग करके नीला दाग है। Demyelination के एक छोटे फोकल घाव खंड के केंद्र में देखा जा सकता है। Demyelinated क्षेत्र एक तीन आयामी पैमाने में घाव मात्रा का अनुमान लगाने के अनुदैर्ध्य धारावाहिक पार वर्गों पर मापा जा सकता है। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Acknowledgments
इस अध्ययन में ऑस्ट्रेलिया के नेत्र अनुसंधान संस्थान (ORIA) द्वारा समर्थित किया गया। हम शुरू में VEP रिकॉर्डिंग तकनीक विकसित करने के लिए हमें मदद करने के लिए, प्रो Algis Vingrys और डॉ बैंग Bui, मेलबोर्न विश्वविद्यालय को धन्यवाद।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine 100 mg/ml (Ketamil) | Troy Laboratories | AC 116 | |
| Medetomidine 1 mg/ml (Domitor) | Pfizer | sc-204073 | |
| Tropicamide 1.0% (Mydriacyl) | Alcon | sc-202371 | |
| Homoeothermic blanket system | Harvard Apparatus | NC9203819 | |
| Impedance meter | Grass | F-EZM5 | |
| Screw electrodes | Micro Fasteners | M1.0×3mm Csk Slot M/T 304 S/S | |
| Subdermal needle electrodes | Grass | F-E3M-72 | |
| Rapid Repair | DeguDent GmbH | ||
| Light-emitting diode | Nichia | NSPG300A | |
| Bioamplifier | CWE, Inc. | BMA-400 | |
| CED system | Cambridge Electronic Design, Ltd. | Power1401 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 87930 | |
| Lysolecithin | Sigma | L4129 | |
| Evan’s blue | Sigma | E2129 |
References
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