Protocol
Etik Beyanı: hayvanlarla ilgili tüm işlemler Bakım ve Bilimsel Amaçlarla Hayvanların Kullanımı ve Oftalmik ve Vizyon Araştırma Hayvanların Kullanım ARVO Tablosu kılavuzlar için Uygulama Avustralyalı Kanunu'na göre yapılmıştır ve ile kabul edildi Macquarie Üniversitesi Hayvan Etik Kurul.
1. VEP Elektrot İmplantasyonu
- Bir intraperitonal ketamin enjeksiyonu (75 mg / kg) ve medetomidin (0.5 mg / kg) ile hayvan anestezisi.
Anestezi indüksiyonu takiben ameliyat başlamak için bir gösterge olarak çekilme refleksler (tutam testi, korneal ve palpebral refleks, vb) ve bunların yokluğu dikkat: Not. Sürekli ameliyat boyunca hayvanları izlemek ve refleksleri varsa ek anestezik ilaç (kontör başına ilk ketamin dozunun% 10) yönetmek. Yetişkin sıçanlarda (> 12 haftalık) deneylerde kullanılır. - Cerrahi alanın cildi tıraş.Ameliyat sırasında vücut sıcaklığının muhafaza edilmesi için bir ısıtma pedi (37 ° C) hayvan yerleştirin. Povidon-iyot topikal uygulama sayesinde cildi hazırlayın. Cerrahi dökümlü uygulayın. Genel anestezi altında kornea kuruluğunu önlemek için topikal oftalmik merhem sürün. Steril aletler kullanarak asepsi koruyun.
- Kafa derisinin orta hat üzerinde uzunlamasına bir cilt kesi olun. Kafatasının iyi pozlama elde etmek için bağ dokusu temizleyin.
- Dikkatle, el bregma arkasında 7 mm ve orta hatta 3 mm yanal bir mikro el matkabı kullanarak küçük çapak delik.
- Yaklaşık 0.5 mm'lik bir derinliğe kadar korteksi penetre korteks (bölge 17) içerisine kafatası yoluyla implant vidalı elektrotlar. Bregma orta hat, 3 mm rostral bir referans vida elektrot implante. Vidaları örtmek ve düzeltmek için diş çimento uygulayın (her zaman gerekli değildir).
- Reco hayvan, baş derisini dikin cilde antibiyotik merhem yönetmek ve izinver bir ısınma pad üzerinde anesteziden.
Not: Alternatif olarak, elektrotlar maruz sol olabilir, bu cilt, her kayıt yeniden açılması gerekmez böylece. Ameliyattan hemen ancak önceden anestezi kurtarma kesilmesiyle, bir steroid olmayan anti-enflamatuar ilaç (NSAID), (eğer Ameliyat öncesi tatbik) veya bir opioid analjezik uygulayın. Anestezi ve tamamen ayaktan tam iyileşme kadar sürekli hayvanların izleyin. - Hayvanlar ameliyat öncesi VEP kayıt kurtarmak için en az 1 hafta izin verin.
2. Optik Sinir Enjeksiyon
- , Hayvan anestezisi cildi hazırlar ve (1.1 ve 1.2) yukarıdaki gibi dökümlü uygulayın.
- Rasgele seçilen bir göz yörüngede üzerinde deri bir 1- 1.5 cm kesi olun. İnce iris makas kullanarak yörünge boşluğuna ulaşmak için deri altı doku açın. Konjonktiva açın ve işletim mikroskop altında Tenon kapsülü anterior.
- Ekstraokuler geri çekinkas ve intraobital gözyaşı bezleri optik sinirin yaklaşık 3 mm uzunluk ortaya çıkarmak. Uzunlamasına bir göz bıçak kullanarak optik sinir etrafında dura ve araknoid madde katmanları açın.
- Dünyanın 2 mm'lik posterior mesafeden optik sinir içine cam pipet yerleştirin. cam mikropipet Hamilton şırınga takılır.
- Yaklaşık 30 saniyelik bir süre boyunca sinir yavaşça - (miyelinasyon üzerinde etkiye sahip değildir% 0.02 Evan Mavisi ile, 1.0 ul 0.4),% 1 lisolesitin enjekte edilir.
- Cilt kesisi dikin. Enfeksiyonu önlemek için antibiyotik merhem sürün. Fellow gözler elektrofizyoloji kayıtları için iç kontroller olarak servis edilebilir.
- Anestezi kurtarmak için bir ısınma pad üzerinde hayvanları yerleştirin.
3. VEP Kaydı
- Hayvan anestezisi ve 1.1 ve 1.2 olarak cildi hazırlar.
Not: anestetiklerin daha düşük doz elektrofizyolojik reco için kullanılabilirrding (ketamin 40 mg / kg ve 0.25 mg / kg medetomidin). - Karanlık bir odada sıçan yerleştirin ve 5 için karanlığa uyum sağlayacak - 30 dakika. Bazı durumlarda fareler sırasıyla Fotopik VEP kayıtları 8 için uyarlanmış scotopic veya ışık karanlık adapte O / N olabilir.
- Rektal termometre probu ile homoeothermic battaniye sistemi tarafından 37 ± 0.5 ° C'de vücut ısısını korumak.
- % 1.0 tropikamid göz damlaları ile öğrencileri dilate. Erişmek için kafatası üzerindeki deriyi açıp önceden yerleştirilmiş in situ vida elektrotlar.
- Uyarılmış gözün kontralateral görme korteksine ve amplifikatör referans vida üzerine vidayı takın. Zemin olarak kuyruk içine bir iğne elektrot yerleştirin. Tedbir ve 5 kohm altında elektrot empedansı korumak.
- Üstün göz izolasyonu 7 sağlamak için göz kapaklarının etrafında cilt üzerinde doğrudan bir mini Ganzfeld uyarıcı yerleştirin. stimülatörü aydınlatma önceden kalibre edilmesi gerekirBir fotometre ile.
- Sırasıyla 1 ve 100 Hz düşük ve yüksek bant-geçiren filtre ayarları ile, 1 Hz frekansta ışığı yanıp aracılığıyla 100 kez fotik uyarımı sunun. Sinyal örnekleme hızı 5 kHz olduğunu.
Not: Sinyaller, en az yaklaşık 250 örneklenmelidir - en fazla iki numuneler, her döngü sırasında toplanan sağlamak için 300 Hz. - Geri cildi dikin ve anestezi kurtarmak için bir ısınma pad üzerinde hayvanları tutmak. Kayıt sürekli bir zaman süresi boyunca, fonksiyonel değişiklikleri izlemek için, ayrı ayrı hayvanlar üzerine kaydedilebilir.
- Son noktada, hayvan euthanize sodyum pentobarbıton (100 mg / kg, ip) aşırı dozda enjeksiyon uygulayın. Kardiyak arrest, solunum durması ve vücut sıcaklığının düşmesi ile ötenazi onaylayın.
4. Doku hazırlanması ve Histoloji
- Mikroskop altında ötenazi hayvanlardan optik sinirleri çıkarın ve% 1 paraformaldehid O / N doku çözmek. <li> tuz çözeltisi ile iyice doku yıkayın. Otomatik doku işlemci doku davranın ve parafin embed. Bir döner mikrotom kullanılarak - (10 mikron 5) Kesim bölümleri.
- 56 ° C 'de bu Luxol (% 95 etanol) O / N olarak% 0.1, hızlı mavi çözelti içinde bölümleri inkübe edin. Daha sonra başka bir 30 saniye için% 70 etanol, 30 saniye için% 0.05 lityum karbonat bölümleri ayırt eder ve. Son olarak, bölümler monte etmeden önce 30 saniye için% 0.1 cresyl mor çözeltisi içinde counterstain. Optik sinir 5 miyelini tanımlamak için hızlı mavi boyama kullanın.
Not: immünohistokimya çalışması için,% 1 paraformaldehid doku çözmek tuzlu su ile yıkayın ve% 30 sukroz O / N ile kuluçkaya yatmaktadır. Ekim göm doku gömme orta ve Kriyostat kullanarak cryosections yapmak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tekrarlanabilir içi oturumlar VEP izleri Şekil 1'de gösterilmiştir ve N1 gecikme önemli bir gecikme optik sinir enjeksiyonundan sonra görülebilir. Demiyelinizasyonun Kısmi optik sinir lezyonları Luxol hızlı mavi boyama 5 ile histolojik kesitlerde görülebilir. 2 optik sinir merkezinde küçük fokal demiyelinize lezyonu olan temsili bir bölümü göstermektedir. Kesit lezyonun toplam hacmi temsil unutmayın. demiyelinize alan üç boyutlu rekonstrüksiyon kullanarak lezyon hacmini anlamak için sinir her ardışık kesitine üzerinde ölçülebilir. Bizim daha önceki çalışmalarda bu model kullanılarak gecikme gecikme ve lezyon hacmi arasında güçlü bir korelasyon göstermiştir ve tuzlu-enjekte kontrollerde 5 hiçbir VEP gecikme gecikme oldu.
Bu flaş aydınlatma aşağıdaki erken VEP bileşenleri daha kararlı olduğuna inanılmaktadır 7 5 demyelinasyonla güçlü doğrusal bir ilişki olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, biz N1 gecikme veri analizi için ve remyelinating tedavilerin etkisini değerlendirirken boyuna VEP izlenmesi için kullanılması gerektiğini tavsiye ediyoruz. VEP genliği, gecikme ile karşılaştırıldığında rağmen daha değişken, optik sinir 6 akson fonksiyonunun daha göstergesidir. Elektroensefalogram bazlı ölçekleme amplitüd analiz 9 için kabul edilebilir.
Optik sinir enjeksiyonundan sonra Şekil 1. VEP gecikmesi. Temsilci VEP bireysel önce sıçan ve optik sinir mikroenjeksiyon (0.8 ul lisolesitin) 2 gün sonra gelen izler. VEP kayıtları her gün tekrarlandı (intra-sessional izleri göstermek vardırn aynı renkte) Bu VEP kayıt protokolünün tekrarlanabilirliği göstermek için. (Dikey ölçek çubuğu: 10 mV; yatay ölçek çubuğu: 10 milisaniye). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Optik sinirdeki Şekil 2. demeyelinizasyon. Mikroenjeksiyon lisolesitin sonra sıçandan, optik sinirin Örnek kesiti. miyelin bileşeni luxol hızlı mavi ile mavi lekeli. Demiyelinasyon küçük bir fokal lezyonun kesitinin merkezinde görülebilir. Demiyelinize alan üç boyutlu bir ölçekte lezyon hacmini tahmin etmek uzunlamasına seri kesitler üzerinde ölçülebilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu çalışma Avustralya Oftalmik Araştırma Enstitüsü (ORIA) tarafından desteklenmiştir. Biz başlangıçta VEP kayıt tekniğini geliştirmek için bize yardımcı olduğunuz için Prof. Algis Vingrys Dr. Bang Bui, University of Melbourne teşekkür ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine 100 mg/ml (Ketamil) | Troy Laboratories | AC 116 | |
| Medetomidine 1 mg/ml (Domitor) | Pfizer | sc-204073 | |
| Tropicamide 1.0% (Mydriacyl) | Alcon | sc-202371 | |
| Homoeothermic blanket system | Harvard Apparatus | NC9203819 | |
| Impedance meter | Grass | F-EZM5 | |
| Screw electrodes | Micro Fasteners | M1.0×3mm Csk Slot M/T 304 S/S | |
| Subdermal needle electrodes | Grass | F-E3M-72 | |
| Rapid Repair | DeguDent GmbH | ||
| Light-emitting diode | Nichia | NSPG300A | |
| Bioamplifier | CWE, Inc. | BMA-400 | |
| CED system | Cambridge Electronic Design, Ltd. | Power1401 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 87930 | |
| Lysolecithin | Sigma | L4129 | |
| Evan’s blue | Sigma | E2129 |
References
- Balcer, L. J.
- Lassmann, H. Multiple sclerosis as a neuronal disease. Waxman, S. G. , Elsevier. 153-164 (2005).
- Fahle, M., Bach, M. Principles and practice of clinical electrophysiology of vision. Heckenlively, J., Arden, G. , MIT Press. 207-234 (2006).
- Halliday, A. M., McDonald, W. I., Mushin, J. Delayed visual evoked response in optic neuritis. Lancet. 1, 982-985 (1972).
- You, Y., Klistorner, A., Thie, J., Graham, S. L. Latency delay of visual evoked potential is a real measurement of demyelination in a rat model of optic neuritis. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (9), 6911-6918 (2011).
- You, Y., Klistorner, A., Thie, J., Gupta, V. K., Graham, S. L. Axonal loss in a rat model of optic neuritis is closely correlated with visual evoked potential amplitudes using electroencephalogram based scaling. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 3662 (2012).
- You, Y., Klistorner, A., Thie, J., Graham, S. L. Improving reproducibility of VEP recording in rats: electrodes, stimulus source and peak analysis. Doc Ophthalmol. 123 (2), 109-119 (2011).
- Heiduschka, P., Schraermeyer, U. Comparison of visual function in pigmented and albino rats by electroretinography and visual evoked potentials. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 246 (11), 1559-1573 (2008).
- You, Y., Thie, J., Klistorner, A., Gupta, V. K., Graham, S. L. Normalization of visual evoked potentials using underlying electroencephalogram levels improves amplitude reproducibility in rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (3), 1473-1478 (2012).
- Levkovitch-Verbin, H. Animal models of optic nerve diseases. Eye (Lond). 18 (11), 1066-1074 (2004).
- Henry, K. R., Rhoades, R. W. Relation of albinism and drugs to the visual evoked potential of the mouse). J Comp Physiol Psychol. 92 (2), 271-279 (1978).
- Murrell, J. C., Waters, D., Johnson, C. B. Comparative effects of halothane, isoflurane, sevoflurane and desflurane on the electroencephalogram of the rat. Lab Anim. 42 (2), 161-170 (2008).
- Makela, K., Hartikainen, K., Rorarius, M., Jantti, V. Suppression of F-VEP during isoflurane-induced EEG suppression. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 100 (3), 269-272 (1996).
- Boyes, W. K., Padilla, S., Dyer, R. S. Body temperature-dependent and independent actions of chlordimeform on visual evoked potentials and axonal transport in optic system of rat. Neuropharmacology. 24 (8), 743-749 (1985).
- Hetzler, B. E., Boyes, W. K., Creason, J. P., Dyer, R. S. Temperature-dependent changes in visual evoked potentials of rats. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 70 (2), 137-154 (1988).
- Mitchell, J. The effects of lysolecithin on non-myelinated axons in vitro. Acta Neuropathol. 58 (4), 243-248 (1982).
- Meyer, R., et al. Acute neuronal apoptosis in a rat model of multiple sclerosis. J Neurosci. 21 (16), 6214-6220 (2001).
- Lachapelle, F., et al. Failure of remyelination in the nonhuman primate optic nerve. Brain Pathol. 15 (3), 198-207 (2005).
