Abstract
Bu çalışmada, bakteri Gluconacetobacter xylinus tarafından üretilen bakteriyel nanocellulose (BNC) sentezlenir ve manyetik bakteriyel nanocellulose (MBNC) elde etmek için demir oksit nanopartiküllerinin (IONP) (4 Fe 3 O) ile in situ olarak emprenye. MBNC sentezi hassas ve özel olarak tasarlanmış, çok-aşamalı bir işlemdir. Özet olarak, bakteri nanocellulose (BNC) ince zarlar korunmuş G. oluşturulmaktadır büyüklüğü ve morfolojisi deneysel ihtiyaçlarına göre xylinus süzün. Demir (III) klorür heksahidrat (FeCl3 · 6H 2 O) ve 2 demir (II) klorür tetrahidrat (FeCl 2 · 4H 2 O) ihtiva eden bir çözelti, 1 mol oranında hazırlanmış ve oksijenden arındırılmış yüksek saflıkta su ile seyreltilir. BNC zar daha sonra reaksiyona giren maddeler ile bir kap içinde sokulur. Bu karışım çökeltilmesi için bırakarak karıştırılmış ve daha sonra ilave edilir, bir silikon yağı banyosu ve amonyum hidroksit (% 14), 80 ° C'de ısıtılırDemir BNC düzenek içine iyonlarının. Bu son adım BNC tabakasına manyetik özellikleri kazandırmak için bakteri nanocellulose örgü içinde in situ manyetit nanopartiküller (O 4 Fe 3) şekillendirme sağlar. Toksikolojik deney BNC IONP ince tabakanın biyouyumluluk değerlendirmek için kullanıldı. Polietilen glikol (PEG) kendi biyouyumluluk geliştirmek için IONPs kapsayacak şekilde kullanılmıştır. Taramalı elektron mikroskobu (SEM) görüntüleri IONP BNC matrisi boşluk interlacing fibril tercihli bulunduğu, ama bazıları da BNC şeritler boyunca bulundu olduğunu göstermiştir. MBNC üzerinde yapılan manyetik kuvvet mikroskobu ölçümleri MBNC ince tabakanın manyetik doğasını teyit yüksek ve zayıf yoğunluklu manyetik alan ile varlığı manyetik etki tespit edildi. Bu çalışmada elde edilen Young modülü değerleri önceki çalışmalarda birçok kan damarları için bildirilenler ile makul uyum içindedir.
Introduction
Bacteria nanocellulose (BNC), aynı zamanda Gluconacetobacter xylinus şekilde bilinmektedir Acetobacter xylinum soyu, sentezlenebilir ve sabit kültür sırasında hava-sıvı arayüzünde filmler veya ince zarlar şeklinde tatbik edilir. Bunlar BNC zarlarına yetiştirildiği kabın şeklini benimsemek ve onların kalınlığı kültüründe gün sayısına bağlıdır. A. xylinus Polimerizasyon ve takip eden kristalleştirme süreciyle selüloz mikro-iplikçiklerinin sentezi için ortam içinde glükoz kullanılır. glukoz çökeltilerinin polimerizasyonu glukan zincirleri hücre zarfı dağılmış tek gözeneklerin ekstrüde bakteriyel hücre dışı membran gerçekleştirilir. Selüloz mikro-iplikçiklerinin kristalizasyon H-bağı 1 tabakaların istif ardından van der Waals bağı ile glukan zincirli tabakaların oluşumu ile hücre dışı alanı oluşur.
MıknatısBNC matrisine entegre IC nanopartiküller arter duvarının hasar yerinde manyetik nanopartikülleri içeren doğrudan ve düz kas hücrelerinin sınırlandırmak için gerekli kuvveti (SMC'lere) arttırmak için harici bir manyetik alan tarafından kolayca manipüle edilebilir. Bu strateji SMC'lere uzak diğer dokulardan tutar ve kan akışı tarafından uygulanan kuvvete karşı hücrelerin sabitlenmesi. SMC'lere da tunika medya 2 esas olarak merkezi bir bol tabakaları oluşturmak damar, bir vasoelasticity önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir.
MBNC sentezi için kullanılan yöntem BNC pelikül daldırılmış ve 80 ° C 'de, demir (III) klorür heksahidrat ve demir (II) klorid tetrahidrat çözeltisi içinde karıştırılmıştır içerir. Amonyum hidroksit BNC örgü içindeki demir oksit nano-tanecikleri meydana getirmek üzere ilave edilir. amonyum hidroksit eklenmesi siyah turuncu çözelti rengini değiştirir. Birlikte BNC fibril boyunca IONPs kompaktüniform olmayan bir dağılımı ile s.
Bu protokol eksik, bozuk veya yaralı küçük çaplı kan damarları için bir yedek olarak kullanmak üzere tasarlanmıştır manyetik bakteriyel nanocellulose (MBNC) adında var bakteriyel nanocellulose-manyetik nanoparçacık ince tabakanın, tasarım üzerinde duruluyor. HS Barud ve arkadaşları, en son PEG ve süperparamanyetik demir oksit nanopartiküllerinin 3 stabil bir sulu dispersiyon içinde BNC zarlarına karıştırılarak BNC tabanlı esnek manyetik kağıt üretmek için benzer bir çalışma yayınlamışlardır. Burada, bakteriyel selüloz üretimi ve manyetik nanopartiküller ile yerinde olan emprenye açıklar. tek bir DNA şeridi kınklan tespitine dayanan bir sitotoksisite tahlili BNC ve MBNC ince zarlar biyouyumluluk test etmek için kullanıldı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bakteriyel Nanocellulose 1. Hazırlama (BNC)
Not: Aksi belirtilmedikçe aşamaların tümü, aseptik koşullar altında gerçekleştirilir.
- kültür ortamı hazırlayın.
- maya ekstresi, 25 g pepton 15 g, manitol 125.0 g, yüksek saflıkta su 500 mi birleştirerek sıvı kültür ortamında 500 ml hazırlayın. 4 ° C'de 20 dakika ve mağaza 120 ° C'de bu karışım otoklava.
- maya ekstresi, 5.0 g, pepton 3.0 g, manitol 25.0 g, ve yüksek saflıkta, 100 ml su için agar 15 g eklenerek yarı katı ortam 100 ml hazırlayın. 20 dakika boyunca 120 ° C 'de bu karışımı otoklava. Bir kez 90 mm x 16 mm plastik Petri tabağı içine yatırma karışımı 5 ml otoklava. sonraki kullanıma kadar bu sıcaklıkta 4 ° C'de jel çözeltisi ve mağaza izin verin.
- G. rehydrate xylinus soyu sıvı kültür ortamında 1 ml ekleme ve pipetleme dondurularak kurutuldu şişelerde korunmuşaşağı olarak üreticinin talimatlarına göre belirtti.
- Bir aşılama döngü kullanarak bakteriyel süspansiyon küçük damlacıklar ile yarı katı ortam içeren Petri kapları aşılamak. inokulum çanağı kenarından merkezine Zig zag yönünde döngü hareket ettirerek tüm Petri kabı kapsar emin olun.
- CO2 olmayan bir kuluçka 72 saat boyunca 26 ° C 'de Petri kapları inkübe edin. Kuluçka süresi tamamlandıktan sonra, küçük, beyaz koloniler görebilir. koloniler hemen kullanılmazsa, Parafilm ile kapağı sızdırmazlık ve baş aşağı yemekleri koyarak 4 ° C'de Petri kapları saklayın. koloniler 6 aya kadar bu şekilde saklanabilir.
- Transfer 24 oyuklu doku kültür plakasının her bir oyuğuna aşama (1.1.1) 'de hazırlanan sıvı kültür ortamı 2 mi. Aşama aşılandı Petri kapları bir inokülasyon iğne (1.3) ile iki koloni alın ve doku kültür plakasının birinci oyuk içine yerleştirin. RGeri kalan 23 Kuyular için aynı prosedürü EPEAT.
- 7 gün boyunca 30 ° C'de doku kültürü plakası inkübe edin. Şekil 1 'de gösterildiği gibi bu 16 mm çapında ve yaklaşık 2-3 mm çapında, kalınlığı 24 BNC ince zarlar toplam verecektir.
Not: plakaları sallayarak, örneğin kuluçka dönemi sırasında herhangi bir noktada bakteri kültürü rahatsız etmeyin. Kuluçka süresinin, G. boyunca xylinus statik kültür koşulları altında şeklini ve şişe büyüklüğü kabul hava-sıvı arayüzü, bir polimerik kristalin örgü oluşturulması için glukopiranoz şeker molekülleri ekstrüde. Bakteriyel nanocellulose (BNC) olarak bilinen bu polimerik matris, kuluçka döneminin sonunda dikkat çekici olduğunu. - Büyüme ortamından BNC zarlarına toplayın ve G tüm izlerini ortadan kaldırmak için, 50 ° C 'de 1 saat süre ile,% 1 NaOH çözeltisi, 200 ml sterilize xylinus. İsteğe bağlı olarak, manyetik bir çubuk kullanarak 300 rpm'de bu çözüm karışmayave karıştırıcı plaka. NaOH çözeltisi atılır ve taze hazırlanmış% 1 NaOH çözeltisi, 200 ml ekle. bir kez daha aynı işlemi tekrarlayın veya çözelti içinde BNC ince zarlar kadar saydam bir görünüm kazanır.
- su ile üç kez BNC zarlarına durulayın ve oda sıcaklığında, yüksek saflıkta su saklayın. BNC zarlarına tamamen suya batmış ve herhangi bir zamanda kurumasına izin olmadığından emin olun.
- 20 dakika boyunca 121 ° C'de BNC zarlarına otoklav.
Not: Märtson ve çalışma arkadaşları tarafından yapılan farede bir in vivo deri altı çalışma 60 hafta implantasyondan sonra BNC olmayan bozunma belirtileri gösterdi. Gerçekten de, BNC memelilerde mevcut olan mikrop ve mantar enzimleri, doğada olarak parçalanabilir. Öte yandan, BNC maddesinin biyolojik, mekanik, kimyasal ve in vivo 4 mikrofibril ağını zayıflatan biyolojik işlemlerin bir sonucu olabilir.
2. Sentezi Polimer kaplamalıDemir Oksit Nanopartiküller ve Bakteriyel Nanocellulose Membran Onun Biriktirme
- Kabarcık su içinde çözünmüş oksijenin ayrılması ve azot ile değiştirmek için azot gazı ile yüksek saflıkta su 1000 mi.
- 2 bir çözelti hazırlamak için, bir üç boyunlu yuvarlak tabanlı bir şişeye kullanın: demir (III) klorür heksahidrat (FeCl3 · 6H 2 O) ve demir (II) klorid tetrahidrat 1 mol oranında (FeCI 2 · 4H 2 O) ile seyreltilmiş deoxygenated yüksek saflıkta su ile. Örneğin, FeCl3 5.4 g · kullanımı 6H 2 O ve oksijenden arındırılmış yüksek saflıkta 10 ml su içinde FeCl 2 · 4H 2 O 1.98 g. Bu hazırlık karışmaya çok viskoz ve zor dönerse, oksijenden arındırılmış yüksek saflıkta su, 20 ml FeCl3 0.54 g · FeCl 2 6H 2 O ve 0.198 g · 4H 2 O kullanın.
Not: Bu ch tartarak 2 O havaya FeCl 2 · 4H pozlama süresini azaltınMümkün olduğunca hızlı emical bileşik. azot gaz temini ve yoğunlaştırıcı borusuna bağlı kadar sonra, üç boyunlu yuvarlak tabanlı bir şişe içine, septum stoper üç boyunlu yuvarlak dipli bir şişeye kapatın. - Geminin boyunlarına bir septum tıpa yumruk ve sabit bir iğneye azot gazı kaynağı bağlayarak sabit giriş ve azot gazı çıkış sağlamak için geminin iki boyunlarını kullanın.
- reaksiyona giren maddeler ile bir kap içinde, daha önce adım 1.5 (çapı 15.6 mm ve kalınlığı 2-3 mm) elde edilmiştir 1 BNC film tabakası yerleştirin. Numune tamamen sıvıya olduğundan emin olun.
- Bir kondansatör tüp geminin kalan boyun bağlayın. Buna ek olarak, kondansatör tüpünün üzerine, susuz kalsiyum sülfat ile doldurulmuş bir kurutma tüpü kullanın. kondansatör tüp aracılığıyla su çalıştırın.
- vakum gres ile cam eklemlerin tüm Seal.
- Bir karıştırma ile 80 ° C'ye kadar bir silikon yağı banyosu içinde çözelti Isıocak gözü ve adım 2.10 kadar bu sıcaklığı tutun. 5 dakika için 350 rpm'de reaktantları karıştırmak için küçük bir manyetik karıştırıcı çubuğu kullanın. emin olun BNC uygun demir solüsyonu ile emprenye edilir ve reaktifler tamamen eritilir. deneyin sonuna kadar karıştırıldıktan tutun.
Not: silikon yağı sıcaklığını kontrol etmek için bir termometre yararlanın. 80 ° C'ye kadar kararlı olmalıdır. - Olan bir pipetleme iğne kullanılarak demir solüsyonu, 10 ml, 5 dakika, amonyum hidroksit, 5 ml bir zaman aralığı (NH4OH,% 14), 700 rpm karıştırma işlemi hızını arttırmak ve (bırakarak) ekleyin Ayrıca septum stoper delikli. amonyum hidroksit ilave edildikten sonra, solüsyonun rengi siyaha, sarı / turuncu değişir.
- 5 dakika daha 80 ° C'da, çözelti karıştırmaya devam edin. numunenin bütünlüğünü korumak için yüksek hızlı kıpırtılar kaçının. Yüksek hızlar, yani daha yüksek 1,000 rpm, yok edebilirörnek.
- karıştırıldıktan ocak sıcaklık kontrolü alt kullanarak 30 ° C'ye kadar çözeltinin sıcaklığını düşürmek ve 5 dakika boyunca karıştırmaya devam edin. Sonra, sıcak plaka kapatın. Bu noktada, IONP BNC düzenek içine dahil edilmiştir.
- RT aşağı Karışımı soğutun ve güçlü bir kalıcı mıknatıs (örneğin, 1 Tesla) kullanılarak manyetik nanopartiküller (MNP) ve BNC ayırın. Bunu yapmak için, bir gemi şişeye karışımı aktarın ve kaba mıknatıs yakın tutarak süpernatan ayrıldı Daha sonra, bir yer MNPS ve BNC tutun.
Not: Yanlış kullanıldığında zararlı olabilir çünkü güçlü mıknatıslar tutarken dikkatli olun. adımlar (2.12) için - (2.14) ve (2.16) oksidasyon partikülleri önlemek için (2.1) 'de daha önce hazırlanmış deoksijenlenmedeki yüksek saflıkta su kullanın. - 100 mL su içinde MNPS ve BNC süspanse edin. Yavaşça güçlü BNC dahil olmayan tüm MNPS kaldırmak için çözüm sallayın. s Durusumıknatıs kullanılarak yerinde MNPS ve BNC tutarak tekrar upernatant.
- Süpernatan nötral pH'a (pH-7) ulaşana kadar kolorimetrik şeridi kullanılarak ölçülen, su ile MNPS ve BNC birkaç kez yıkayın.
- cımbız kullanarak MNPS gelen BNC fonksiyonalize-manyetik ya da manyetik bakteri nanocellulose (MBNC) ayırın ve su berrak bitene kadar su ile MBNC birkaç kez durulayın.
- UV (110-280 nm) MBNC O / N teşhir ederek MBNC sterilize edin.
- 20 dakika boyunca 120 ° C de deoksijene yüksek saflıktaki su Otoklav 500 mi ve 20 ml su içinde MBNC saklayın.
- Aseptik, PEG% 1 örnek daldırın ve oda sıcaklığında 2 saat (37 ° C) karıştırılmıştır. Bu prosedür BNC yatırılır demir oksit nano yüzey 5-7 maruz özellikle olanların biyouyumluluk ve kararlılığını geliştirir. PEG kaplama MBNC 3D ağ üzerinden dağıtılacak.
Not: Çıplak IONP kolayca havada oksitleniryüksek kimyasal aktivitesi 8 çünkü. PEG, bir biyolojik olarak çözülemez bir malzeme olarak kabul edilir olsa da, kimyasal stabilite, su içeriği, pH, sıcaklık, enzimler varlığında reaktif oksijen türleri, reaktif nitrojen ve diğerleri 9 olarak uygulanan biyolojik koşullarına bağlıdır.
BNC ve MBNC ince zarlar 3. karakterizasyonu
- Mekanik özellikler
- Normal yükleme ve Berkovich dişinin kullanarak boşaltma nanoindentation testi yapın. Berkovich elmas indenter yarıçapı 20 nm.
- Oda sıcaklığında, kertme derinliğinin bir fonksiyonu olarak temas alanını kalibre etmek için, erimiş silis ve tungsten kullanın. Test sırasında, tutkal kullanarak girinti örnekleri monte edin. batıcı kalınlığı yönünde örnekleri yaklaştı.
- Numuneler yüzeylerde rasgele seçme girinti yerleri. 200-300 mm arasında 2 girintiler arasındaki boşluğu tutun.
- Yükü uygulaadımda örnekler ve indenter karşılık gelen yer değiştirme kaydedin. Young modülü bulmak için derinlik vs yükün arsa analiz edin.
- 0.01 mN ve 0.60 mN arasında pik yük, 0.0001 mN / sn ve 0.005 mN / sn arasında yük oranları uygulanarak deiyonize su (DI su), ve test varlığında örneklerinin nanoindentation testi yapınız.
- bir sıvı hücre kullanın ve sıvı ortamında örnekleri tutmak. bir sıvı ortamda dalmış nanomechanical karakterizasyonu için bu benzersiz kurulum etkin bir BNC ve MBNC membranların ulaşmak biyomekanik işlevlerini taklit etmek idealdir.
- SEM ile yapısal karakterizasyonu
- elektron mikroskobu (SEM) tarayarak nanocellulose lif yapısını karakterize eder.
- -80 ° C'de 24 saat süre ile örneklerin liyofilize edin. Sonra, SEM saplamalar üzerine monte 10 saniye boyunca Au-Pd film ile çıtırtı ve SEM ile analiz edin.
- 22,000X büyütmede görüntüleri alırve 60,000X, 5 kV bir hızlandırma voltajı ile.
- manyetik alanlar
- Oda sıcaklığında kuruması için MBNC zarlarına izin verin ve daha sonra sürekli mıknatıs (1 Tesla) 5 dakika boyunca maruz kalmaktadır.
- Hemen sonra, üreticinin protokolüne uygun olarak bir biyo-AFM kullanılarak manyetik kuvvet ölçümleri yapın.
- Her ölçüm için, öncelikle topografya özellikleri yakalamak ve bir ikinci geçişte manyetik etki kazanır. Temassız modunda biyo-AFM ile hem ölçümleri alın.
- Nanopartiküllerin manyetik karakterizasyonu -10,000 10,000 Oe aralığında bir manyetik alan ile oda sıcaklığında (300 ° K), fiziksel özellik ölçümleri sistemi Kuantum Design (PPMS) titreşen Örnek manyetometre (VSM) kullanılarak yapılır.
- hücre proliferasyonu
- 1.0x10 yoğunluğunda 6 oyuklu doku kültürü plakası Tohum, insan aortik düz kas hücreleri (HASMC)
- sırasıyla negatif ve pozitif kontroller olarak, işlemden geçirilmemiş ve hidrojen peroksit ile muamele edilmiş hücreler popülasyonunu kullanın.
- Üreticinin protokolleri ve A. Azqueta & AR Collins 10 tarafından önerilen kılavuzlara göre Comet tahlil gerçekleştirin.
- birleştirmek için bu deneyde nükleik asit boya SYBR altın kullanmak ve floresan üreticinin protokolüne göre elektroforeze numunelerde bulunan DNA etiketleyin.
Not: BNC ve MBNC örneklerinin varlığında herhangi bir DNA hasarını uğramayan Hücreler DNA hasarlı hücreler uzun kuyruklu olacak, oysa, bir floresan yuvarlak yeşil Nükleoitte gösterecektir - pozitif örnekler nükleotidler (kuyruklu başkanı) sahip olacak ve ardından (kuyruk DNA yüzdesi) parçalanmış DNA malzeme içeren kuyrukları.
- 1.0x10 yoğunluğunda 6 oyuklu doku kültürü plakası Tohum, insan aortik düz kas hücreleri (HASMC)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
G. kuluçka dönemi xylinus 9 günlük bir toplam, ama ince zarlar daha önce oluşmaya başladı ve yaklaşık 2 gün sonra belirgindi. BNC makroskopik görünümü, Şekil 1 'de gösterilir, bu bulaşık yetiştirilen kültürün taklit eden şekli. Şekil 2 ve yukarıdaki protokole dahil ana aşamaları özetlemektedir olan BNC IONP zarlarına üretilmesi için işlemi tarif ana bileşenlerin konfigürasyonu.
SEM görüntüleri, mikro, morfoloji, ve BNC (Şekil 3) ve fonksiyonalize BNC bölgesindeki IONP dağıtım liflerinin dağılımını (Şekil 4) gidermek için kullanılmıştır. BNC tanımlanmış bir model olmadan tüm ağ üzerinden açık gözenekler oluşturan ince şeritler (çapı yaklaşık 50 nm) ile oluşturulmaktadır. IONP tercihen vardır locATED boyutu 100 nm ya da daha fazla küme oluşturan fibril birbirine geçme tarafından oluşturulan gözenekler arasındaki. Bireysel IONP ayrıca şeritler boyunca bağlanmıştır. IONP BNC adlı şeritler araya getirmek muhtemelen çünkü MBNC, BNC kıyasla daha az sıkıştırılmış fibril yapısı sergiler. Manyetik kuvvet mikroskobu MBNC topografyası manyetik profil yeniden kullanılabilir (Şekil 5A, B). 500 nm çaplı ve daha büyük geniş gözeneklerin işlenmemiş BNC (Şekil 5A) gözlenmemiştir MBNC, oluşturulur. Bu MBNC değiştirilmemiş BNC daha gözenekli yapısını görüntüler SEM microphotographs, gözlemler ile uyum içindedir. Farklı manyetizasyon iki alan ile manyetik kuvvet degrade olan kontrast MBNC topografik görüntüler (Şekil 5A) 'de IONP zengin bölgeler tarafından oluşturulan tepeler ve vadiler ile ilişkili değildir MBNC yüzeyi (Şekil 5B), karşısında tespit edildi. Yüksek ve zayıf intensity manyetik alanlar sırasıyla Şekil 5B sarı ve yeşil olarak gösterilir. Bakteriyel nanocellulose gömülü ölçülür nanopartıküllerınin histerezis eğrisi, her IONPs Resim Histerisizli oda sıcaklığında süperparamanyetik olduğu kanıt temin Şekil 5 'de gösterilmiştir.
HASMC, bu yabancı maddelerin maruz kalma sonucunda tek tek hücrelerin canlılığı üzerinde herhangi bir zararlı etkisi test etmek için BNC mevcudiyetinde ve MBNC arasında kültürlenmiştir. Ayrı ayrı hücrelerde hasar ölçüde DNA kırıklarının saptanması (Şekil 6) ile nicelendirildi. Sonuçlar, 37 ° C,% 95 hava ve% 5 CO2 (negatif kontrol) ve 30 dakika boyunca hidrojen peroksit kaynaklı genotoksisite (100 uM H2O 2) ile HASMC kadar normal kültür koşulları altında (büyüyen HASMC karşılaştırılmıştır pozitif kontrol). t-testi kullanılarak eşleştirilmiş karşılaştırmalar th gösterdiMBNC etkilerinin hücre canlılığı üzerindeki HASMC (s-değeri <0.001, ***) ile hidrojen peroksit, tedaviden uyarılanlardan belirgin olarak farklı idi.
Bakteriyel nanocellulose 1. makroskopik yönlerini Şekil. BNC zarlarına yaklaşık olduğu bir 11 günlük kuluçka döneminden sonra elde edilmiştir. kalınlıkta, 3 mm. Kuluçka dönemi amaçlanan kullanım için gereksinimlerine bağlıdır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Demir oksit nanopartiküller monte edilir. Manyetik fonksiyonalize bakteri nanocellulose 2. Fabrikasyon Şekil ve ben BNC içinde in situ ncorporated, bir MBNC elde edildi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
BNC Şekil 3. SEM görüntüsü. BNC 50 nm veya daha az boyutları ile ince bir ağ ve toplu olmayan şeritler görüntüler. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4. BNC IONP pelikül. Demir oksit nanopartiküllerinin (IONP) tercihen birbirine geçme şeritler arasında konumlandırılır SEM görüntüsü.d / 52951 / 52951fig4large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
MBNC ve manyetik alan yapıların Şekil 5. AFM topoğrafya. Nanofibril yapısı üzerinde durmak son derece paketlenmiş nanopartiküller, lekeler gösteren MBNC (A) Yüzey topoğrafyası. (B) Sarı ve yeşil alanlar, yüksek ve zayıf yoğunluklu manyetik alanın farklı mıknatıslanma iki bölgesini belirtmek sırasıyla. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Maruz kaldıktan sonra HASMC DNA hasarı Şekil 6. kapsamısırasıyla BNC ve MBNC için. PosCtl karşılaştırma amaçlı hidrojen peroksit tedavisi uygulandı HASMC gösterir. NegCtl HASMC, normal kültür koşulları altında büyüyen belirtir. MBNC HASMC üzerinde canlılığı olumsuz etkileri PosCtl (p-değeri <0.001 ***) gözlenen anlamlı olarak farklı idi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
BNC ince tabakanın kalınlığı ve büyüklüğü kolayca inkübasyon süresi ve statik yetiştirilmesi sırasında yetiştirilen olduğu şişe boyutunu değiştirerek kontrol edilebilir. BNC microproperties, porozite gibi statik bir kültür oksijen oranı değiştirilerek değiştirilebilir. Yüksek oksijen konsantrasyonu BNC 11 sert verim. A. Bodin ve arkadaşları G. fermantasyon işlemi sırasında% 100 oksijene atmosferik oksijen oksijen oranını değiştirerek 880 mm Hg kadar bir patlama basıncı ile BNC tüplerini üretti xylinus 12. Benzer şekilde, BNC gözenekliliği ayrıca fermentasyon işlemine parafin mikro-küreler olarak porogens katılmasıyla sokulabilir. Bu durumda, elde edilen gözeneklilik ve gözenek birleştiricisi porojen boyutu 13 bağlıdır.
BNC gözenekli ağ ilaç verilmesi için, bunların örneğin nano partiküller ile fonksiyonalize sağlarajanlar. Çalışmamızda, biz BNC tabanlı iskeleleri hızlı hücre alımı ve eki için bir manyetik protokolü uygulamak için, BNC zarı içine nanopartiküller sentezlenmesi ve yerinde büyüyerek IONP ile BNC fonksiyonelleştirilmiş var. Nanomechanical testler BNC nano tepkisi çok düşük Young modülü, E BNC = yüzeyde 0.04 GPa numunelerin içinde 0.0025 GPa ile kan damarları 14 ile aynı şekilde davranır ortaya koymaktadır. Elde edilen değerler Fu et al. 15 ile gözlenen ile aralığındadır.
IONP aşırı kolay, malzemenin yüksek gözeneklilik BNC çıkarılabilir olabilir. SEM fotoğrafları nanopartiküller şeritler boyunca fibril birleşmelerin tarafından oluşturulan ve dağınık alanlarda ağırlıklı olarak dağıtılır olduğunu gösterdi. Bu protokolde kullanılan demir türlerin konsantrasyonu yüksek yoğun araya BNC en şeritler getirdi IONP, paketlenmiş rastlanmıştır. Bu sonuçlandımodifiye edilmemiş BNC göre daha büyük gözeneklere sahip MBNC. Bunlar ferromanyetik kobalt ferrit hacim fraksiyonu değişince Olsson ve ark., FeSO 4 farklı konsantrasyonlar / CoCl selüloz nanofibril aerojellerin sentezinde BNC aynı hacim bölümü 2 tuzlan BNC gözenekli olan bir artış rapor % 5.7 16-,7 den% nanopartiküller. MBNC Bu yüksek gözeneklilik kurtarma süresini arttıran ilaçların birikimi için avantajlı ve hasarlı arter duvarlarında restenozu önleyebilirsiniz.
Topografik özellikleri ve manyetik faz görüntüler arasındaki korelasyon eksikliği de B. Torre ve ark., 17, topoğrafya ve seyrek nanoparçacık filmlerin manyetik sinyaller arasındaki bağımsızlık işaret tarafından tarif edilmiştir. Ayrıntılı karakterizasyon çalışmaları mıknatıslanma histerezis (MH) KALAMAR-VSM sy yoluyla MBNC halkaları belirlemek amacıyla yapılmıştır gerekirkaynaklanmaktadır.
MBNC bu malzeme hücreler ile temas halinde kullanmak için biyolojik olarak uyumlu olduğuna işaret Comet testinde gözlemlenen sonuçlara göre, toksik etkiler için potansiyeli düşüktür göstermiştir.
prosedürde en kritik adım amonyum hidroksit miktarı ve ilave edilme hızı, hem de reaksiyon sırasında çözelti içinde BNC tam daldırma ve karıştırma sağlanması ile ilgilidir. ikinci nanopartiküller BNC matrisi boyunca dağıtılan nasıl etki ise birinci yaklaşımın sonuçta oluşan demir oksit nanopartiküllerinin boyutunu belirler. daha MNPS boyutunu kontrol etmek için bir vana ile büret reaksiyonuna amonyum hidroksit bırakarak ilave regüle etmek için kullanılabilir. Solüsyon içinde tamamen daldırılabilir BNC küçük parçalar, tavsiye edilir, örneğin, çözelti, 10 ml toplam hacim için yaklaşık 1.9 cm2'lik boyutları. Bir limiBu tekniğin tation BNC örgü içinde IONP homojen olmayan dağılımıdır.
Bu protokol, bileşik oluşturmak üzere BNC demir oksit nano-tanecikleri içeren bir yöntem tarif eder. Çünkü biyouyumluluk ve BNC ve demir oksit nanopartiküllerinin hem fiziksel ve mekanik özellikleri, MBNC hücresel büyüme için ilaç ulaştırma sistemleri ve iskeleler gibi biyomedikal uygulamalar çeşitli kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glucoacetobacter xylinus | ATCC | 700178 | |
| Agar | Sigma Aldrich | A1296-500G | |
| D-Mannitol Bioxtra | Sigma Aldrich | M9546-250G | |
| Yeast Extract | BD Biosciences | 212750 | |
| Bacteriological Peptone | Sigma Aldrich | P0556 | |
| Sodium Hydroxide, 50% Solution In Water | Sigma Aldrich | 158127-100G | |
| Iron(III) Chloride Hexahydrate | Sigma Aldrich | 236489-100G | |
| Ammonium Hydroxide | Macron Fine Chemicals | 6665-46 | |
| Poly(Ethylene Glycol), Average Mn 400 | Sigma Aldrich | 202398-250G | |
| Iron (II) chloride tetrahydrate | Sigma Aldrich | 44939-250G | |
| Disposable Petri dish | Sigma Aldrich | BR452000 | |
| Disposable Inoculating Loop | Fisher Scientific | 22-363-604 | |
| Anhydrous Calcium Sulfate | W.A. Hammond Drierite | 13001 | |
| High vacuum grease | Sigma Aldrich | Z273554-1EA | |
| Laboratory pipetting needle with 90° blunt ends | Sigma Aldrich | CAD7937-12EA | |
| pH test strips | Sigma Aldrich | P4786-100EA | |
| Round-bottom three neck angle type distilling flask | Sigma-Aldrich | CLS4965250 | |
| Silicone oil for oil baths | Sigma-Aldrich | 85409-250ML | |
| Drying Tube | Chemglass | CG-1295-01 | |
| Septum Stopper, Sleeve Type | Chemglass | CG-3022-98 | |
| Magnetic stir bar | Chemglass | CG-2001-05 | |
| Condenser | Chemglass | CG-1218-01 | |
| Temperature Controller | BriskHeat | SDC120JC-A | |
| Stirring Hotplate | Fisher Scientific | 11-100-49SH | |
| Comet Assay Kit | Trevigen | 4250-050-K | |
| SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain | Life Technologies | S-11494 | |
| bio-AFM | JPK Instruments | NanoWizard 4a BioScience AFM | |
| Nanoindenter | Micro Materials Ltd | Multi-module mechanical tester | |
| Scanning electron microscopy (SEM) | Hitachi High Technologies America | Hitachi S-4800 |
References
- Saxena, I. M., Brown, R. M. Biosynthesis of bacterial cellulose. Bacterial Nanocellulose: A Sophisticated Multifunctional Material. , 1-18 (2012).
- Chan-Park, M. B., Shen, J. Y. Biomimetic control of vascular smooth muscle cell morphology and phenotype for functional tissue-engineered small-diameter blood vessels. J.Biomed.Mater.Res.A. 88, 1104-1121 (2009).
- Barud, H. S., et al.
- Märtson, M., Viljanto, J., Hurme, T., Laippala, P., Saukko, P. Is cellulose sponge degradable or stable as implantation material? An in vivo subcutaneous study in the rat. Biomaterials. 20, 1989 (1999).
- Illésa, E., Tombácza, E., Szekeresa, M., Tótha, I., Szabób, Á, Iván, B. Novel carboxylated PEG-coating on magnetite nanoparticles designed for biomedical applications. J. Magn. Magn. Mater. 380, 132 (2015).
- Torrisi, V., et al. Preventing corona effects: multiphosphonic acid poly(ethylene glycol) copolymers for stable stealth iron oxide nanoparticles. Biomacromolecules. 15, 3171 (2014).
- Cai, Z., Kim, J. Bacterial cellulose/poly(ethylene glycol) composite: characterization and first evaluation of biocompatibility. Cellulose. 17, 83 (2010).
- Wu, W., He, Q., Jiang, C. Magnetic iron oxide nanoparticles: synthesis and surface functionalization strategies. Nanoscale Res. Lett. 3, 397-415 (2009).
- Ulbricht, J., Jordan, R., Luxenhofer, R. On the biodegradability of polyethylene glycol, polypeptoids and poly (2-oxazoline)s. Biomaterials. 35, 4848 (2014).
- Azqueta, A., Collins, A. R. The essential comet assay: a comprehensive guide to measuring DNA damage and repair. Arch. Toxicol. 87 (6), 949-968 (2013).
- Scherner, M., et al. In vivo application of tissue-engineered blood vessels of bacterial cellulose as small arterial substitutes: proof of concept. J. Surg. Res. 189, 340 (2014).
- Bodin, A., et al. Influence of cultivation conditions on mechanical and morphological properties of bacterial cellulose tubes. Biotechnol Bioeng. 97, 425 (2007).
- Zaborowska, M., et al. Microporous bacterial cellulose as a potential scaffold for bone regeneration. Acta Biomaterialia. 6, 2540 (2010).
- Karimi, A., et al. A comparative study on the mechanical properties of the umbilical vein and umbilical artery under uniaxial loading. Artery Res. 8, 51 (2014).
- Lina, F., Ping, Z., Shengmin, Z., Guang, Y. Evaluation of bacterial nanocellulose-based uniform wound dressing for large area skin transplantation. Mater. Sci. Eng. C. 33, 2995 (2013).
- Olsson, R. T., et al. Making flexible magnetic aerogels and stiff magnetic nanopaper using cellulose nanofibrils as templates. Nature Nanotech. 5 (8), 584-588 (2010).
- Torre, B., et al. Magnetic force microscopy and energy loss imaging of superparamagnetic iron oxide nanoparticles. Sci. Rep. 1 (202), 1-8 (2011).
