Abstract
In dieser Studie, die durch die Bakterien produziert Gluconacetobacter bakterielle Nanocellulose (BNC) xylinus synthetisiert wird und in situ mit Eisenoxid - Nanopartikel (IONP) (Fe 3 O 4) imprägniert , um ein magnetisches bakterielle Nanocellulose (MBNC) zu ergeben. Die Synthese von MBNC ist eine präzise und insbesondere mehrstufiges Verfahren entwickelt. Kurz gesagt, werden bakterielle Nanocellulose (BNC) Häutchen aus konservierten G. gebildet xylinus Stamm nach unseren experimentellen Anforderungen der Größe und Morphologie. Eine Lösung von Eisen (III) -chlorid - Hexahydrat (FeCl 3 · 6 H 2 O) und Eisen (II) -chlorid - Tetrahydrat (FeCl 2 · 4H 2 O) mit einem 2: 1 - Molverhältnis in sauerstoffarmes Wasser mit hoher Reinheit hergestellt und verdünnt. A BNC Häutchen wird dann in den Behälter mit den Reaktanten eingeführt. Diese Mischung wird gerührt und bei 80 ° C in einem Silizium Ölbad und Ammoniumhydroxid (14%) erhitzt wird dann durch Fallenlassen der auszufällenEisenionen in die BNC-Mesh. Dieser letzte Schritt ermöglicht in situ Magnetit - Nanopartikel (Fe 3 O 4) innerhalb der bakteriellen Nanocellulose - Mesh Bildung zu magnetischen Eigenschaften zu BNC Häutchen verleihen. Ein toxikologischer Test wurde verwendet, um die Biokompatibilität des BNC-IONP Häutchen zu bewerten. Polyethylenglykol (PEG) wurde verwendet, um die IONPs zu decken, um ihre Biokompatibilität zu verbessern. Rasterelektronenmikroskopie (SEM) Bilder zeigten, dass die IONP Räume der BNC-Matrix vorzugsweise in der Fibrille angeordnet waren Interlacing, aber einige von ihnen wurden auch entlang der BNC Bändern gefunden. Magnetkraftmikroskop-Messungen auf dem MBNC ausgeführt erfasst die Anwesenheit magnetischen Domänen mit hoher und schwache Intensität Magnetfeld, die magnetische Natur des MBNC Häutchen bestätigt. Young-Modul-Werte in dieser Arbeit erhaltenen auch in angemessener Übereinstimmung mit denen für mehrere Blutgefäße in früheren Studien berichtet.
Introduction
Die bacterian Nanocellulose (BNC) durch Acetobacter xylinum - Stamm synthetisiert, die auch als Gluconacetobacter xylinus bekannt und in Form von Filmen oder Häutchen auf der Luft-Flüssigkeit - Grenzfläche während des stationären Kultur abgeschieden. Diese BNC Häutchen nehmen die Form des Behälters , wo sie angebaut werden, und ihre Dicke ist abhängig von der Anzahl der Tage in der Kultur. A. xylinus verwendet die Glucose in dem Medium für die Synthese der Cellulose - Mikrofibrillen durch einen Prozess der Polymerisation und anschließender Kristallisation. Die Polymerisation der Glucosereste an der bakteriellen extrazellulären Membran durchgeführt, wobei Glucanketten aus einzelnen Poren über die Zellhülle verteilt extrudiert werden. Die Kristallisation der Cellulose - Mikrofibrillen auftritt , in den extrazellulären Raum mit der Bildung von Glucankette Blätter durch van der Waals - Bindung , gefolgt von 1 durch H-Bindung der Blätter zu stapeln.
Magnetic Nanopartikel zu einer BNC-Matrix integriert kann durch ein externes Magnetfeld, um die Kraft zu erhöhen, leicht manipuliert werden, die notwendig zu lenken und glatten Muskelzellen (SMCs) mit magnetischen Nanopartikeln beschränken, an der beschädigten Stelle der Arterienwand. Diese Strategie hält aus anderen Geweben der SMCs weg und hält die Zellen an Ort und Stelle gegen die Kraft, die durch den Blutfluss ausgeübt wird. Es hat sich gezeigt , dass SMCs eine wichtige Rolle in der vasoelasticity des Blutgefäßes spielen gezeigt, wo sie reichlich Schichten befinden sich hauptsächlich in der Tunica media 2 bilden.
Das Verfahren zur Synthese von MBNC verwendet beinhaltet BNC Häutchen eingetaucht und in einer Lösung von Eisen (III) -chlorid-Hexahydrat und Eisen (II) -chlorid-tetrahydrat bei 80 ° C gerührt. Ammoniumhydroxid zugegeben Eisenoxid-Nanopartikel im Inneren des BNC Netz zu bilden. Die Zugabe von Ammoniumhydroxid ändert sich die Farbe der Lösung von orange bis schwarz. Die IONPs kompakt zusammen entlang der BNC-Fibrillens mit einer ungleichmäßigen Verteilung.
Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Konstruktion eines bakteriellen Nanocellulose magnetische Nanopartikel Häutchen, die wir magnetische bakterielle Nanocellulose (MBNC) genannt haben, die als Ersatz für die Verwendung fehlen, beschädigt oder verletzt kleinem Durchmesser Blutgefäßen bestimmt ist. HS Barud und Mitarbeiter haben kürzlich eine ähnliche Arbeit veröffentlicht 3 eine BNC-basierte flexible Magnet Papier durch Mischen BNC Häutchen in einer stabilen wäßrigen Dispersion von PEG und superparamagnetische Eisenoxid - Nanopartikel zu erzeugen. Hier beschreiben wir die Produktion von bakterieller Cellulose und ihre Imprägnierung in situ mit magnetischen Nanopartikeln. Ein Zytotoxizitätstest auf Detektion von einzelnen DNA-Strangbrüche auf Basis verwendet, um die Biokompatibilität der BNC und MBNC Häutchen zu testen.
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Protocol
1. Herstellung von bakteriellen Nanocellulose (BNC)
Anmerkung: Alle Schritte werden unter aseptischen Bedingungen durchgeführt, wenn nicht anders angegeben.
- Bereiten Kulturmedium.
- Bereiten 500 ml flüssiges Kulturmedium durch 25 g Hefeextrakt kombinieren, 15 g Pepton, 125,0 g Mannit und 500 ml vollentsalztem Wasser auf. Autoklav diese Mischung bei 120 ° C für 20 min und bei 4 ° C.
- Herstellung von 100 ml halbfesten Medien durch Zugabe von 15 g Agar und 5,0 g Hefeextrakt, 3,0 g Pepton, 25,0 g Mannit und 100 ml vollentsalztem Wasser auf. Autoklaviert diese Mischung bei 120 ° C für 20 min. Sobald autoklaviert Ablagerung 5 ml der Mischung in einem 90 mm x 16 mm Kunststoff-Petrischale. Lassen Sie die Lösung zu Gel bei 4 ° C und lagern bei dieser Temperatur bis zur weiteren Verwendung.
- Rehydrate G. xylinus erhaltenen Stamm in gefriergetrockneten Ampullen durch Zugabe von 1 ml des flüssigen Kulturmediums und Pipettieren undnach unten, wie durch den Anweisungen des Herstellers angegeben.
- Impfen die Petrischalen halbfest Medien mit kleinen Tröpfchen von bakteriellen Suspension, die Impföse. Stellen Sie sicher, dass der Impfstoff die gesamte Petrischale deckt durch die Schleife in einer Zick-Zack-Richtung vom Rand in die Mitte des Tellers zu bewegen.
- Inkubieren der Petrischalen bei 26 ° C für 72 Stunden in einem Inkubator ohne CO 2. Sobald der Inkubationsperiode abgeschlossen ist, kleine weiße Kolonien sichtbar. Wenn die Kolonien nicht sofort verwendet wird, speichern Sie die Petrischalen bei 4 ° C durch den Deckel mit Parafilm Versiegelung und das Geschirr legen den Kopf. Die Kolonien können für bis zu 6 Monate in dieser Weise gespeichert werden.
- Transfer 2 ml des flüssigen Kulturmedium in Stufe (1.1.1) in jede Vertiefung einer 24-Well-Gewebekulturplatte. Nehmen Sie zwei Kolonien mit einer Impfnadel von den geimpften Petrischalen in Schritt (1.3) und legen Sie sie in die erste Vertiefung der Gewebekulturplatte. Ran wiederholen das gleiche Verfahren für die restlichen 23 Bohrlöcher.
- Inkubieren der Gewebekulturplatte bei 30 ° C für 7 Tage. Dies wird insgesamt 24 BNC Häutchen mit einem Durchmesser von 16 mm und einer Dicke von ca. 2-3 mm Durchmesser ergeben , wie in Abbildung 1 dargestellt.
Hinweis: Verwenden Sie nicht die Bakterienkultur zu irgendeinem Zeitpunkt während Inkubationszeit stören, zum Beispiel durch die Platten schütteln. Während der Inkubationszeit, G. xylinus extrudieren glucopyranose Zuckermoleküle ein polymeres kristallinen mesh in der Luft-Flüssigkeit - Grenzfläche zu bilden, die die Form und Größe des Kolbens unter statischen Kultivierungsbedingungen annimmt. Diese polymere Matrix, wie bakterielle Nanocellulose (BNC) bekannt ist, ist auffällig am Ende der Inkubationszeit. - Sammeln Sie die BNC - Häutchen von den Wachstumsmedien und sterilisieren sie in 200 ml einer 1% igen NaOH - Lösung für 1 h bei 50 ° C, um alle Spuren von G. zu entfernen xylinus. Optional rühren diese Lösung bei 300 Umdrehungen pro Minute eine Magnetleisteund eine Rührplatte. Entsorgen Sie die NaOH-Lösung und mit 200 ml frisch 1% NaOH-Lösung hergestellt. Wiederholen Sie diesen Vorgang einmal mehr, oder bis die BNC Häutchen in Lösung erwirbt ein durchscheinendes Aussehen.
- Spülen Sie die BNC-Häutchen dreimal mit Wasser und speichern sie in hochreinem Wasser bei RT. Machen Sie den BNC Häutchen sicher im Wasser vollständig untergetaucht und nicht erlaubt, jederzeit zu trocknen.
- Autoklave mit BNC Häutchen bei 121 ° C für 20 min.
Hinweis: Eine in vivo subkutan Studie an Ratten durchgeführt von Märtson und Mitarbeiter zeigten , nicht Abbau Zeichen des BNC nach 60 Wochen der Implantation. Tatsächlich ist BNC abbaubar in der Natur durch mikrobielle und Pilzenzyme, die bei Säugetieren fehlen. Auf der anderen Seite kann die biologische Abbaubarkeit des BNC das Ergebnis von mechanischen, chemischen und biologischen Prozesse, die die Mikrofibrillen Netzwerk in vivo 4 schwächen.
2. Synthese von polymerbeschichtetenEisenoxid-Nanopartikel und seiner Ablagerung in einer bakteriellen Membran Nanocellulose
- Blase 1000 ml hochreinem Wasser mit Stickstoffgas, um jeglichen gelösten Sauerstoff im Wasser zu entfernen und ersetzen Sie es mit Stickstoff.
- Verwenden Sie einen Dreihalsrundkolben , eine Lösung in einem 2 vorzubereiten: 1 - Molverhältnis von Eisen (III) -chlorid - Hexahydrat (FeCl 3 · 6 H 2 O) und Eisen (II) -chlorid - Tetrahydrat (FeCl 2 · 4H 2 O) verdünnt mit dem sauerstoffarmes Wasser mit hoher Reinheit. Verwenden Sie zum Beispiel 5,4 g FeCl 3 · 6 H 2 O und 1,98 g FeCl 2 · 4H 2 O in 10 ml sauerstoffarmes Wasser mit hoher Reinheit. Wenn diese Zubereitung zu viskos und schwierig dreht sich zu rühren, verwenden Sie 0,54 g FeCl 3 · 6 H 2 O und 0,198 g FeCl 2 · 4H 2 O in 20 ml sauerstoffarmes Wasser mit hoher Reinheit.
Hinweis: Reduzieren Sie die Belichtungszeit der FeCl 2 · 4H 2 O , um Luft durch diese ch mit einem Gewicht vonemical Verbindung so schnell wie möglich. Einmal im Rundkolben Dreihals eingeführt, schließen Sie das Dreihalsrundkolben mit Septum Stopper, bis sie an das Stickstoffgasversorgung und dem Kondensatorrohr verbunden ist. - Verwenden Sie zwei Hälse des Schiffes einen konstanten Eingang und Ausgang von Stickstoffgas zu schaffen, durch den Stickstoffgaszufuhr zu einer Nadel in Septumstopfen und fixiert ist, um die Schiffs Hälse gestanzt verbindet.
- Platzieren 1 BNC Häutchen, die zuvor in Schritt hergestellt wurde, 1,5 (15,6 mm Durchmesser und 2-3 mm Dicke) in dem Gefäß mit den Reaktanden. Stellen Sie sicher, dass die Probe vollständig in die Flüssigkeit eingetaucht ist.
- Verbinden des verbleibenden Hals des Gefäßes zu einem Kondensatorrohr. Zusätzlich verwenden ein Trockenrohr mit wasserfreiem Calciumsulfat auf dem Kondensatorrohr gefüllt. Führen Sie Wasser durch das Kondensatorrohr.
- Siegel alle Glasfugen mit Vakuumfett.
- Die Lösung wird in einem Siliconöl-Bad auf 80 ° C ein Rühren unter Verwendung vondiese Temperatur bis Schritt 2.10 Heizplatte und zu halten. Verwenden Sie einen kleinen magnetischen Rührstab die Reaktanden für 5 Minuten bei 350 Umdrehungen pro Minute zu mischen. Stellen Sie sicher, dass der BNC wird in geeigneter Weise mit der Eisenlösung und die Reaktanden werden vollständig gelöst imprägniert. Halten der Mischung, bis zum Ende des Experiments gerührt.
Anmerkung: Man verwendet eine Thermometer die Temperatur des Silikonöls zu verifizieren. Es sollte auf 80 ° C stabil sein. - Erhöhen Sie die Rührgeschwindigkeit auf 700 rpm und füge (durch Fallenlassen), in einem Zeitintervall von 5 min wurden 5 ml Ammoniumhydroxid (NH 4 OH, 14%) zu der 10 ml Eisenlösung mit einer Pipettiernadel verwendet, die gewesen auch in Septumstopfen gestanzt. Nach der Zugabe des Ammoniumhydroxids, ändert sich die Farbe der Lösung von gelb / orange bis schwarz.
- Weiterhin die Lösung bei 80 ° C für weitere 5 min gerührt wurde. Vermeiden Sie hohe Geschwindigkeit Regungen, um die Integrität der Probe zu erhalten. Hohe Drehzahlen, dh höher als 1000 Umdrehungen pro Minute, kann zerstörendie Probe.
- Senken Sie die Temperatur der Lösung auf 30 ° C, um die Temperaturregelung Boden des Rühren Heizplatte mit und halten für weitere 5 min gerührt wurde. Dann schalten Sie die Kochplatte aus. Zu diesem Zeitpunkt haben die IONP wurde in die BNC-Mesh eingebaut.
- Man kühlt die Mischung auf RT und trennen die magnetischen Nanopartikel (MNP) und BNC einen starken Permanentmagneten mit ( zum Beispiel 1 Tesla). Dazu übertragen Sie die Mischung in einen Kolben vorgelegt und dann, während der Magnet der Nähe des Schiffes zu halten, halten Sie die MNPs und die BNC an Ort und Stelle, während der Überstand dekantiert.
Hinweis: Seien Sie vorsichtig, wenn starken Magneten Handhabung, da sie bei falscher Anwendung schädlich sein kann. Für die Schritte (2.12) - (2.14) und (2.16) verwenden, um die sauerstoffarmes Wasser mit hoher Reinheit hergestellt zuvor in (2.1) Teilchen vor Oxidation zu verhindern. - Resuspendieren MNPs und BNC in 100 ml Wasser. Schütteln Sie die Lösung, die alle MNPs zu entfernen, die nicht stark in die BNC aufgenommen werden. Dekantiert die supernatant wieder durch die MNP und den BNC an Ort und Stelle hält den Magneten verwendet wird.
- Waschen Sie die MNPs und die BNC mehrmals mit Wasser, bis der Überstand neutralen pH-Wert (pH ~ 7) erreicht, wie mit Hilfe eines kolorimetrischen Streifen gemessen.
- Trennen Sie die magnetische funktionalisierte BNC oder magnetische bakterielle Nanocellulose (MBNC) von der MNP mit einer Pinzette und spülen Sie die MBNC mehrmals mit Wasser, bis das Wasser klar ist.
- Sterilisieren Sie die MBNC durch die MBNC O / N mit UV-Belichtungs (110-280 nm).
- Autoklav 500 ml deoxygenated hochreinem Wasser bei 120 ° C für 20 min und speichern Sie die MBNC in 20 ml dieses Wassers.
- Aseptisch, tauchen Sie die Probe in 1% PEG und rühre 2 Stunden bei RT (37 ° C). Dieses Verfahren verbessert die Biokompatibilität und Stabilität der Nanopartikel Eisenoxid in der BNC abgeschieden, insbesondere 5-7 die an der Oberfläche freigelegt. Die PEG-Beschichtung wird über die MBNC 3D-Netzwerk verteilt werden.
Hinweis: Naked IONP werden an der Luft leicht oxidiertwegen ihrer hohen chemischen Aktivität 8. Obwohl PEG ein nicht-biologisch abbaubares Material betrachtet wird, hängt die chemische Stabilität der angewandten biologischen Bedingungen wie Wassergehalt, pH, Temperatur, Gegenwart von Enzymen, reaktive Sauerstoffspezies, reaktive Stickstoffspezies und andere 9.
3. Charakterisierung des BNC und MBNC Pellikel
- Mechanische Eigenschaften
- Führen normalen Be- und Entladen Nanoindentierung Test Berkovich Indenter verwenden. Der Radius des Berkovich Diamant-Eindringkörper ist 20 nm.
- Verwenden Sie Fused Silica und Wolfram Kontaktfläche als Funktion der Eindringtiefe bei RT kalibrieren. Während des Tests montieren Sie die Proben auf der Vertiefung unter Verwendung von Klebstoff. Der Eindringkörper näherte sich den Proben, die in ihrer Dickenrichtung.
- Randomly wählen Vertiefung Stellen an Proben Oberflächen. Halten Sie den Abstand zwischen zwei Einzüge zwischen 200-300 mm.
- Tragen Sie die Last auf dieProben in den Schritten und die entsprechende Verschiebung des Eindringkörpers aufzuzeichnen. Analysieren Sie den Plot der Last vs Tiefe der Young-Modul zu finden.
- Führen Sie die Nanoindentierung Test der Proben in Gegenwart von entsalztem Wasser (VE-Wasser) und Test durch Anwendung Lastraten zwischen 0,0001 mN / s und 0,005 mN / sec, mit Spitzenbelastung zwischen 0,01 mN und 0,60 mN.
- Verwenden Sie eine flüssige Zelle und halten Proben unter der Flüssigkeiten Umwelt. Diese einzigartige Einrichtung in einer flüssigen Umgebung eingetaucht nanome- Charakterisierung ist ideal, um effektiv die Reichweite biomechanische Funktionalität von BNC und MBNC Membranen simulieren.
- Strukturelle Charakterisierung von SEM
- Charakterisieren Sie die Nanocellulose Faserstruktur durch Rasterelektronenmikroskopie (SEM).
- Lyophilisieren die Proben für 24 Stunden bei -80 ° C. Montieren Sie dann auf SEM-Bolzen, Sputter mit Au-Pd-Film für 10 sec und analysieren REM.
- Nimmt Bilder bei einer Vergrößerung von 22,000Xund 60,000X, mit einer Beschleunigungsspannung von 5 kV.
- magnetische Domänen
- Erlauben, die MBNC Häutchen vollständig trocken bei RT und anschließend 5 min zu einem Permanentmagneten belichten (1 Tesla).
- Sofort durchführen, die magnetischen Kraftmessungen eine Bio-AFM gemäß dem Protokoll des Herstellers.
- Für jede Messung erfassen die Topografiemerkmale erste und die magnetischen Domänen während eines zweiten Durchlauf erhalten. Erhalten Sie beide Messungen mit dem Bio-AFM in der berührungslosen Modus.
- Magnet Charakterisierung der Nanopartikel verwendet Vibrationsprobenmagnetometers (VSM) in dem physikalischen Eigenschaftsmessungen System (PPMS) von Quantum Design, mit einem Magnetfeld im Bereich von -10.000 bis 10.000 Oe bei RT (300 K), durchgeführt.
- Cytocompatibility
- Seed menschliche Aorta-Glattmuskelzellen (HASMC) in einer 6-Well-Gewebekulturplatte in einer Dichte von 1,0x10
- Verwenden Populationen von unbehandeltem und Wasserstoffperoxid behandelte Zellen als negative und positive Kontrollen.
- Führen Sie die Comet - Assay nach Herstellerprotokollen und den Richtlinien vorgeschlagen von A. Azqueta & AR Collins 10.
- Verwenden Sie die Nukleinsäure Farbstoff SYBR Gold in diesem Test zu interkalieren und beschriften fluoreszenz die in den elektrophoresiert Proben enthielten DNA nach dem Protokoll des Herstellers.
Hinweis: Zellen, die durchlaufen keine DNA-Schäden in Gegenwart von BNC und MBNC Proben, eine fluoreszierende runde grüne Nucleoid zeigen wird, während DNA geschädigte Zellen lange Kometen haben - positive Proben Nukleoide haben (der Kopf des Kometen), gefolgt von Endstücke, die fragmentierte DNA-Material (Anteil der DNA in die Schwanzvene) enthalten.
- Seed menschliche Aorta-Glattmuskelzellen (HASMC) in einer 6-Well-Gewebekulturplatte in einer Dichte von 1,0x10
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Representative Results
Die Inkubationszeit von G. xylinus war insgesamt 9 Tage, aber die Häutchen begann früher zu bilden , und waren nach ca. 2 Tagen evident. Das makroskopische Erscheinungsbild des BNC ist in Figur 1 angezeigt, dessen Form nachahmt , dass der schalen gewachsenen Kultur. 2 beschreibt das Verfahren zur Herstellung von BNC-IONP Häutchen, welches die Hauptschritte in dem obigen Protokoll ebenfalls beteiligt Zusammenfassungen als die Anordnung der Hauptkomponenten.
SEM - Bilder wurden verwendet , um die Mikrostruktur, Morphologie und räumliche Verteilung der Fasern des BNC (Abbildung 3) und IONP Verteilung in funktionalisierten BNC (4) zu lösen. Der BNC wird durch feine Bänder (ca. 50 nm im Durchmesser) gebildet, die ohne definiertes Muster über das gesamte Netzwerk offenen Poren bilden. Die IONP sind bevorzugt located zwischen den von Fibrillen gebildeten Poren Interlacing, Clustern von 100 nm oder mehr in der Größe zu bilden. Einzelne IONP sind auch entlang der Bänder gebunden. Die MBNC weist eine weniger verdichtete Struktur Fibrillen an den BNC-Vergleich, wahrscheinlich, weil IONP der BNC die Bänder zusammen zu bringen. Magnetkraftmikroskop die Magnetprofil an der Topographie der MBNC (5A, B) zu rekonstruieren , wurde verwendet. Große Poren von 500 nm Durchmesser oder größer sind , in der MBNC gebildet, die in unbehandelten BNC wurden nicht beobachtet (5A). Dies ist in Übereinstimmung mit den Beobachtungen in den SEM-Mikroaufnahmen, in denen die MBNC zeigt eine poröse Struktur als die unmodifizierte BNC. Ein magnetischer Kraftverlauf mit zwei Domänen unterschiedlicher Magnetisierung wurde über die MBNC Oberfläche (5B) erfasst, deren Kontrast korreliert nicht mit den Hügeln und Tälern von IONP reiche Regionen in der topographischen Bilder (5A) MBNC gebildet. Hohe und schwache intensity Magnetfelder werden als gelb und grün in 5B jeweils bezeichnet. Die Hystereseschleife der Nanopartikel, die in der Bakterien- Nanocellulose eingebettet gemessen wird, ist in Figur 5 Nachweis über gezeigt , dass alle IONPs bei RT ohne Hysterese superparamagnetisch sind.
HASMC wurden in Gegenwart von BNC und MBNC kultiviert für jede nachteilige Wirkung auf die Lebensfähigkeit der einzelnen Zellen als Ergebnis der Exposition gegenüber diesen Fremdmaterialien zu testen. Das Ausmaß der Schäden in einzelnen Zellen wurde durch den Nachweis von DNA - Strangbrüche (6) quantifiziert. Die Ergebnisse wurden mit HASMC Vergleich wächst unter normalen Kultivierungsbedingungen von 37 ° C, 95% Luft und 5% CO 2 (negative Kontrolle) und mit Wasserstoffperoxid induzierte Genotoxizität (100 & mgr; M H 2 O 2) für 30 min bis HASMC ( Positive Kontrolle). Gepaart Vergleiche t-Test zeigte thbei den Auswirkungen der MBNC auf die Lebensfähigkeit der Zellen waren von denjenigen signifikant verschieden induziert mit Wasserstoffperoxid - Behandlung auf HASMC (p - Wert <0,001, ***).
Abbildung 1. Makroskopische Aspekte bakterieller Nanocellulose. BNC Häutchen haben nach einer 11-tägigen Inkubationszeit erhalten worden, die ca. sind. 3 mm in der Dicke. Die Inkubationszeit hängt von den Anforderungen für die beabsichtigte Verwendung. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Die Herstellung von magnetisch funktionalisierten bakterielle Nanocellulose. Eisenoxid - Nanopartikel werden montiert und i ncorporated in situ innerhalb des BNC, ein MBNC nachgebend. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. REM - Aufnahme von BNC. Der BNC zeigt ein feines Netz und nicht aggregierter Bänder mit Größen von 50 nm oder weniger. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. REM - Aufnahme von BNC-IONP Häutchen. Eisenoxid - Nanopartikel (IONP) zwischen den Verflechtungs Bänder bevorzugt positioniert.d / 52951 / 52951fig4large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. AFM Topographie von MBNC und magnetischen Domänenstrukturen. (A) Oberflächentopographie von MBNC Flecken von stark gebündelte Nanopartikeln zeigt, die über dem Nanofibrillenstruktur stehen. (B) Gelbe und grüne Bereiche bezeichnen zwei Bereiche unterschiedlicher Magnetisierung von hoher und schwache Intensität Magnetfeld auf. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 6. Ausmaß der DNA - Schäden in HASMC nach der Exposition zu seinBNC und MBNC sind. PosCtl bezeichnet HASMC die zu Vergleichszwecken Wasserstoffperoxid - Behandlung unterzogen. NegCtl bezeichnet HASMC unter normalen Kulturbedingungen wachsen. Die schädlichen Auswirkungen der MBNC auf HASMC Lebensfähigkeit waren signifikant verschieden von denen in der PosCtl (p-Wert <0,001 ***) beobachtet. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Die Dicke und Größe des BNC Häutchen kann leicht durch Änderung der Inkubationszeit und die Größe des Kolbens betätigt werden, in der sie während des statischen Kultivierungs angebaut wird. Die microproperties des BNC, wie Porosität, kann durch Veränderung des Sauerstoffanteils in der statischen Kultur modifiziert werden. Höhere Sauerstoffkonzentrationen ergeben härter BNC 11. A. Bodin und Mitarbeitern hergestellten Röhren BNC mit einem Berstdruck von bis zu 880 mm Hg durch die Sauerstoff - Verhältnis von atmosphärischem Sauerstoff zu 100% Sauerstoff während des Fermentationsprozesses von G. ändernden xylinus 12. In ähnlicher Weise kann die Porosität des BNC auch durch Einarbeiten Porogene, wie Paraffinwachs-Mikrokugeln in das Fermentationsverfahren eingebracht werden. Die sich ergebende Porosität und Poren Zusammenschaltbarkeit in diesem Fall 13 an der Porogen Größe abhängen.
Das poröse Netzwerk des BNC ermöglicht es ihnen , mit Nanopartikeln funktionalisiert werden, beispielsweise für die ArzneimittelzufuhrMittel. In unserer Studie haben wir BNC mit IONP funktionalisiert durch Synthese und wächst in situ , die Nanopartikel in die BNC - Membran, um ein magnetisches Protokoll für eine schnelle Zellrekrutierung und Anlage in BNC-basierten Gerüste zu implementieren. Nanomechanische Tests belegen , dass nanoskalige Reaktion von BNC verhält sich ähnlich mit Blutgefäßen 14 mit einem sehr niedrigen Elastizitätsmodul, E BNC = 0,0025 GPa innerhalb der Proben auf 0,04 GPa an der Oberfläche. Die erhaltenen Werte sind in dem Bereich mit den von Fu beobachtet et al. 15.
Der Überschuß an IONP konnte leicht von der BNC aufgrund der hohen Porosität des Materials entfernt werden. SEM-Aufnahmen zeigten, dass die Nanopartikel vor allem in den durch Fibrillen interlacing gebildeten Räume verteilt sind und entlang der Schleife verteilt sind. Die Konzentration der Eisenspezies in diesem Protokoll verwendet lieferte hohe dicht IONP verpackt, die zusammen die Bänder BNC gebracht. Dies führte zu einerMBNC mit größeren Poren als die des unmodifizierten BNC. Olsson et al., Die verschiedene Konzentrationen von FeSO 4 / CoCl 2 - Salze mit dem gleichen Volumenanteil an BNC in der Synthese von Cellulose - Nanofibrillen Aerogele verwendet, berichtet eine ähnliche Erhöhung der Porosität BNC wenn sie den Volumenanteil des ferromagnetischen Kobaltferrit verändert Nanopartikel von 0,7% bis 5,7% 16. Diese hohe Porosität im MBNC können für die Ablagerung von Arzneimitteln vorteilhaft sein, dass die Wiederherstellungszeit und zur Vermeidung von Restenose bei beschädigten Arterienwände zu erhöhen.
Der Mangel an Korrelation zwischen den topographischen Merkmalen und magnetischen Phasenbilder wurden auch von B. Torre et al. 17, der die Unabhängigkeit zwischen der Topographie aufgezeigt und die magnetischen Signale sparse Nanoteilchenfilme. Die weitere Charakterisierung Studien müssen durchgeführt werden, um die Magnetisierung Hysterese (MH) Schleifen des MBNC über SQUID-VSM sy zu bestimmenStielen.
Die MBNC zeigten geringes Potential für toxische Wirkungen, entsprechend den Ergebnissen in der Comet-Assay beobachtet, was darauf hinweist, dass dieses Material für die Verwendung in Kontakt mit Zellen biokompatibel ist.
Die kritischsten Schritte in dem Verfahren sind auf die Menge an Ammoniumhydroxid bezogen und die Geschwindigkeit, mit der sie hinzugefügt wird, sowie die Gewährleistung der vollständigen Eintauchen und Rühren der BNC in der Lösung während der Reaktion. Der erste Aspekt bestimmt die Größe der resultierenden Eisenoxid-Nanopartikel, während der zweite beeinflussen, wie die Nanopartikel in der BNC-Matrix verteilt sind. Um eine Bürette mit einem Absperrhahn kann, um besser die Größe des MNP steuern, verwendet werden, die zusätzlich zu regulieren, indem Ammoniumhydroxid in das Reaktions fallen. Kleine Stücke von BNC , die vollständig in die Lösung eingetaucht werden können , wird empfohlen, beispielsweise Größen von etwa 1,9 cm 2 für ein Gesamtvolumen von 10 ml Lösung. Ein Limitation dieser Technik ist die inhomogene Verteilung des IONP innerhalb des BNC mesh.
Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren Eisenoxid-Nanopartikel in BNC zum Einarbeiten einen Verbundstoff zu bilden. Aufgrund der Biokompatibilität und die physikalischen und mechanischen Eigenschaften sowohl der BNC und die Eisenoxid-Nanoteilchen kann die MBNC in einer Vielzahl von biomedizinischen Anwendungen verwendet werden, wie beispielsweise Arzneimittelabgabesysteme und Gerüsten für Zellwachstum.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glucoacetobacter xylinus | ATCC | 700178 | |
| Agar | Sigma Aldrich | A1296-500G | |
| D-Mannitol Bioxtra | Sigma Aldrich | M9546-250G | |
| Yeast Extract | BD Biosciences | 212750 | |
| Bacteriological Peptone | Sigma Aldrich | P0556 | |
| Sodium Hydroxide, 50% Solution In Water | Sigma Aldrich | 158127-100G | |
| Iron(III) Chloride Hexahydrate | Sigma Aldrich | 236489-100G | |
| Ammonium Hydroxide | Macron Fine Chemicals | 6665-46 | |
| Poly(Ethylene Glycol), Average Mn 400 | Sigma Aldrich | 202398-250G | |
| Iron (II) chloride tetrahydrate | Sigma Aldrich | 44939-250G | |
| Disposable Petri dish | Sigma Aldrich | BR452000 | |
| Disposable Inoculating Loop | Fisher Scientific | 22-363-604 | |
| Anhydrous Calcium Sulfate | W.A. Hammond Drierite | 13001 | |
| High vacuum grease | Sigma Aldrich | Z273554-1EA | |
| Laboratory pipetting needle with 90° blunt ends | Sigma Aldrich | CAD7937-12EA | |
| pH test strips | Sigma Aldrich | P4786-100EA | |
| Round-bottom three neck angle type distilling flask | Sigma-Aldrich | CLS4965250 | |
| Silicone oil for oil baths | Sigma-Aldrich | 85409-250ML | |
| Drying Tube | Chemglass | CG-1295-01 | |
| Septum Stopper, Sleeve Type | Chemglass | CG-3022-98 | |
| Magnetic stir bar | Chemglass | CG-2001-05 | |
| Condenser | Chemglass | CG-1218-01 | |
| Temperature Controller | BriskHeat | SDC120JC-A | |
| Stirring Hotplate | Fisher Scientific | 11-100-49SH | |
| Comet Assay Kit | Trevigen | 4250-050-K | |
| SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain | Life Technologies | S-11494 | |
| bio-AFM | JPK Instruments | NanoWizard 4a BioScience AFM | |
| Nanoindenter | Micro Materials Ltd | Multi-module mechanical tester | |
| Scanning electron microscopy (SEM) | Hitachi High Technologies America | Hitachi S-4800 |
References
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