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Bioengineering

Fabrication d'un fonctionnalisés magnétique bactérienne nanocellulose avec oxyde de fer Nanoparticules

Published: May 26, 2016 doi: 10.3791/52951
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 5,6, 1,2,3,7
1Department of Bioengineering, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Department of Nuclear, Plasma and Radiological Engineering, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Micro and Nanotechnology Laboratory, University of Illinois at Urbana-Champaign, 4Program of Study and Control of Tropical Diseases (PECET), University of Antioquia, 5Sealy Center for Vaccine Development, University of Texas Medical Branch, 6WHO Collaborating Center for Vaccine Research, Evaluation and Training on Emerging Infectious Diseases, University of Texas Medical Branch, 7Beckman Institute, University of Illinois at Urbana-Champaign

Abstract

Dans cette étude, nanocellulose bactérienne (BNC) produite par la bactérie Gluconacetobacter xylinus est synthétisé in situ et on l' imprègne avec des nanoparticules d'oxyde de fer (Fe) (IONP 3 O 4) pour donner une nanocellulose bactérienne magnétique (MBNC). La synthèse de MBNC est un processus à plusieurs étapes précises et spécialement conçu. En bref, la nanocellulose bactérienne (BNC) pellicules sont formées à partir préservé G. souche xylinus selon nos exigences expérimentales de la taille et de la morphologie. Une solution de fer (III) hexahydraté (FeCl 3 · 6H 2 O) et de fer (II) tétrahydrate de chlorure (FeCl 2 · 4H 2 O) avec un ratio de 2: 1 molaire est préparé et dilué dans de l' eau de haute pureté désoxygéné. Une pellicule BNC est ensuite introduit dans le récipient avec les réactifs. Ce mélange est agité et chauffé à 80 ° C dans un bain d'huile de silicone et de l'hydroxyde d'ammonium (14%) est ensuite ajouté en laissant tomber pour précipiter leferreux ions dans la maille BNC. Cette dernière étape permet de former dans des nanoparticules de magnétite in situ (Fe 3 O 4) dans le treillis nanocellulose bactérien pour conférer des propriétés magnétiques à pellicule BNC. Une analyse toxicologique a été utilisé pour évaluer la biocompatibilité du BNC IONP pelliculaire. Le polyéthylène glycol (PEG) a été utilisé pour couvrir les IONPs afin d'améliorer leur biocompatibilité. La microscopie électronique à balayage (MEB) a montré que le IONP étaient situés de préférence dans la fibrille entrelacer les espaces de la matrice BNC, mais certains d'entre eux ont également été trouvées le long des rubans BNC. mesures de microscope de force magnétiques effectuées sur le MBNC détecté les domaines magnétiques de présence avec le champ magnétique de haute intensité et faible, ce qui confirme la nature magnétique de la pellicule MBNC. module les valeurs des jeunes obtenus dans ce travail sont également en accord raisonnable avec celles rapportées pour plusieurs vaisseaux sanguins dans les études précédentes.

Introduction

La nanocellulose bactérienne (BNC) est synthétisé par Acetobacter souche xylinum, également connu sous le nom Gluconacetobacter xylinus, et déposé sous la forme de films ou de pellicules sur l'interface air-liquide pendant la culture stationnaire. Ces pellicules BNC adoptent la forme du conteneur dans lequel elles sont cultivées, et leur épaisseur dépend du nombre de jours de culture. A. xylinus utilise le glucose dans le milieu de synthèse des microfibrilles de cellulose par un procédé de polymérisation et la cristallisation ultérieure. La polymérisation des résidus de glucose est effectuée à la membrane bactérienne extracellulaire, où les chaînes de glycane sont extrudés à partir des pores individuels répartis sur l'enveloppe de la cellule. La cristallisation des microfibrilles de cellulose se produit dans l'espace extracellulaire à la formation de feuilles à chaîne glycane par van der Waals , suivie par l' empilement des feuilles par liaison H 1.

Aimantnanoparticules iques intégrées à une matrice BNC peuvent être manipulés facilement par un champ magnétique externe afin d'augmenter la force nécessaire pour diriger et limiter les cellules musculaires lisses (CML) contenant des nanoparticules magnétiques, sur le site endommagé de la paroi artérielle. Cette stratégie maintient le CML loin des autres tissus, et détient les cellules en place contre la force exercée par le flux sanguin. Il a été démontré que les CML jouent un rôle important dans la vasoelasticity du vaisseau sanguin, où ils forment des couches abondantes situées principalement dans la média 2.

Le procédé utilisé pour la synthèse de MBNC comporte pelliculaire BNC immergée et agitée dans une solution de fer (III) hexahydraté et de fer (II) tétrahydraté à 80 ° C. L'hydroxyde d'ammonium est ajoutée pour former des nanoparticules d'oxyde de fer à l'intérieur de la maille BNC. L'addition d'hydroxyde d'ammonium change la couleur de la solution de l'orangé au noir. Le compact IONPs ensemble le long de la fibrille BNCs avec une distribution non uniforme.

Ce protocole met l'accent sur la conception d'une nanoparticule pellicule bactérienne nanocellulose magnétique, que nous avons nommé nanocellulose bactérienne magnétique (MBNC), qui vise à utiliser comme substitut manquants, les vaisseaux sanguins de petit diamètre endommagés ou blessés. HS Barud et ses collègues ont récemment publié un travail similaire pour produire un papier magnétique flexible à base de BNC en mélangeant dans une BNC pellicules dispersion aqueuse stable de PEG et superparamagnétiques nanoparticules d'oxyde de fer 3. Ici, nous décrivons la production de cellulose bactérienne et son imprégnation in situ avec des nanoparticules magnétiques. Un test de cytotoxicité sur la base de la détection de ruptures de brins d'ADN simple a été utilisé pour tester la biocompatibilité des pellicules BNC et MBNC.

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Protocol

1. Préparation de bactéries nanocellulose (BNC)

Remarque: Toutes les étapes sont effectuées dans des conditions aseptiques, sauf indication contraire.

  1. Préparer un milieu de culture.
    1. Préparer 500 ml de milieu de culture liquide en combinant 25 g d'extrait de levure, 15 g de peptone, 125,0 g de mannitol et 500 ml d'eau de haute pureté. Autoclave ce mélange à 120 ° C pendant 20 minutes et conserver à 4 ° C.
    2. Préparer 100 ml de milieu semi-solide en y ajoutant 15 g d'agar à 5,0 g d'extrait de levure, 3,0 g de peptone, 25,0 g de mannitol et 100 ml d'eau de haute pureté. Autoclaver ce mélange à 120 ° C pendant 20 min. Une fois l'autoclave, le dépôt de 5 ml du mélange dans un 90 mm x 16 mm boîte de Petri en plastique. Laisser la solution à un gel à 4 ° C et conserver à cette température jusqu'à utilisation ultérieure.
  2. Réhydrater G. xylinus souche conservée dans des flacons lyophilisés par addition de 1 ml de milieu de culture liquide et d' aspiration etvers le bas, comme indiqué par les instructions du fabricant.
  3. Inoculer les boîtes de Pétri contenant des milieux semi-solides avec de petites gouttelettes de suspension bactérienne en utilisant une boucle d'inoculation. Assurez-vous que l'inoculum couvre toute la boîte de Pétri en déplaçant la boucle dans une direction en zigzag à partir du bord vers le centre du plat.
  4. Incuber les boîtes de Pétri à 26 ° C pendant 72 heures dans un incubateur sans CO 2. Une fois que la période d'incubation est terminée, les petites colonies blanches sont visibles. Si les colonies ne sont pas utilisés immédiatement, conserver les boîtes de Petri à 4 ° C en soudant le couvercle avec du Parafilm et en plaçant les plats à l'envers. Les colonies peuvent être stockés de cette manière pendant 6 mois.
  5. Transfert 2 ml de milieu de culture liquide préparée dans l'étape (1.1.1) dans chaque puits d'une plaque de culture tissulaire à 24 puits. Prenez deux colonies avec une aiguille inoculer des boîtes de Pétri inoculées à l'étape (1.3) et les placer dans le premier puits de la plaque de culture de tissus. REPEAT la même procédure pour les 23 puits restants.
  6. Incuber la plaque de culture tissulaire à 30 ° C pendant 7 jours. Cela donne un total de 24 BNC avec des pellicules diamètre de 16 mm et une épaisseur d'environ 2-3 mm de diamètre , comme cela est représenté sur la figure 1.
    Note: Ne pas déranger la culture bactérienne à tout moment au cours de la période d'incubation, par exemple en secouant les plaques. Au cours de la période d'incubation, G. xylinus expulse les molécules de sucre glucopyranose pour former une maille cristalline de polymère à l'interface air-liquide, qui adopte la forme et la taille du flacon dans des conditions de culture statique. Cette matrice polymère, connue sous le nom nanocellulose bactérienne (BNC), est visible à la fin de la période d'incubation.
  7. Recueillir les pellicules BNC des milieux de croissance et de les stériliser dans 200 ml d' une solution de NaOH à 1% pendant 1 heure à 50 ° C, afin d'éliminer toute trace de G. xylinus. Eventuellement, mélanger cette solution à 300 tpm en utilisant une barre magnétiqueet une plaque d'agitation. Jeter la solution de NaOH et 200 ml d'une solution fraîchement préparée de NaOH à 1%. Répétez le même processus une fois de plus ou jusqu'à ce que les pellicules BNC en solution acquiert un aspect translucide.
  8. Rincer les pellicules BNC à l'eau trois fois et de les stocker dans de l'eau de haute pureté à la température ambiante. Assurez-vous que les pellicules BNC sont complètement immergés dans l'eau et ne sont pas autorisés à sécher à tout moment.
  9. Autoclave les pellicules BNC à 121 ° C pendant 20 min.
    Remarque: Une étude sous - cutanée in vivo chez le rat , effectué par Martson et ses collaborateurs ont montré des signes de non-dégradation de la BNC après 60 semaines d' implantation. En effet, BNC est dégradable dans la nature par des enzymes microbiennes et fongiques, qui sont absentes chez les mammifères. D'autre part, la biodégradabilité du BNC peut être le résultat de processus biologiques qui affaiblissent le réseau de microfibrilles in vivo 4 mécanique, chimique et.

2. Synthèse du polymère revêtuOxyde de fer Nanoparticules et son dépôt dans une bactérienne nanocellulose Membrane

  1. Bubble 1000 ml d'eau de haute pureté avec de l'azote gazeux afin d'éliminer tout l'oxygène dissous dans l'eau et le remplacer avec de l'azote.
  2. Utilisez un ballon à trois cols à fond rond pour préparer une solution dans un rapport de 2: 1 molaire de fer (III) hexahydraté (FeCl 3 · 6H 2 O) et de fer (II) tétrahydraté (FeCl 2 · 4H 2 O) dilué avec l'eau de haute pureté désoxygéné. Par exemple, utiliser 5,4 g de FeCl 3 · 6H 2 O et 1,98 g de FeCl 2 · 4H 2 O dans 10 ml d'eau de haute pureté désoxygéné. Si cette préparation tourne trop visqueux et difficile à agiter, utiliser 0,54 g de FeCl 3 · 6H 2 O et 0,198 g de FeCl 2 · 4H 2 O dans 20 ml d'eau de haute pureté désoxygéné.
    Remarque: Réduire le temps d'exposition du FeCl 2 · 4H 2 O à l' air par pesée de cette chcomposé emical aussi vite que possible. Une fois introduit dans le trois cols de flacon à fond rond, fermer le ballon à trois cols à fond rond avec un bouchon à septum jusqu'à ce qu'elle soit raccordée à l'alimentation en gaz d'azote et le tube de condenseur.
  3. Utiliser deux cols du navire pour fournir une entrée et une sortie d'azote gazeux constant en reliant l'alimentation en gaz d'azote à une aiguilleté dans un bouchon à septum et fixé sur le cou du navire.
  4. Placez 1 pelliculaire BNC qui a été préparé précédemment à l'étape 1.5 (15,6 mm de diamètre et de 2-3 mm d'épaisseur) dans le récipient avec les réactifs. Assurez-vous que l'échantillon est complètement immergé dans le liquide.
  5. Connecter le goulot restant du récipient à un tube de condenseur. En outre, utiliser un tube de séchage rempli anhydre, le sulfate de calcium sur la partie supérieure du tube du condenseur. Faites couler l'eau à travers le tube du condenseur.
  6. Sceller tous les joints de verre avec de la graisse à vide.
  7. Chauffer la solution dans un bain d'huile de silicone à 80 ° C en utilisant une agitationplaque de cuisson et maintenez cette température jusqu'à ce que l'étape 2.10. Utilisez une petite barre d'agitation magnétique pour mélanger les réactifs à 350 rpm pendant 5 min. Assurez-vous que la BNC est correctement imprégné de la solution ferreux et les réactifs sont complètement dissous. Continuer à agiter le mélange jusqu'à la fin de l'expérience.
    Remarque: Utiliser un thermomètre pour vérifier la température de l'huile de silicone. Elle devrait être stable à 80 ° C.
  8. Augmenter la vitesse d'agitation à 700 tours par minute et ajouter (en laissant tomber), dans un intervalle de temps de 5 minutes, 5 ml d'hydroxyde d'ammonium (NH4OH, 14%) à 10 ml de solution ferreuse en utilisant une aiguille de pipetage, qui a été également percé dans un bouchon de septum. Après addition de l'hydroxyde d'ammonium, la couleur de la solution vire du jaune / orange au noir.
  9. Continuer d'agiter la solution à 80 ° C pendant encore 5 min. Évitez frémissements à grande vitesse afin de maintenir l'intégrité de l'échantillon. Des vitesses élevées, soit supérieure à 1000 tours par minute, peuvent détruirel'échantillon.
  10. Abaisser la température de la solution à 30 ° C en utilisant le fond de la régulation de la température de la plaque chauffante sous agitation et maintenir l'agitation pendant encore 5 min. Ensuite, éteignez la plaque chauffante. À ce stade, l'IONP ont été incorporés dans le maillage BNC.
  11. Refroidir le mélange jusqu'à la température ambiante et on sépare les nanoparticules magnétiques (MNP) et BNC au moyen d' un fort aimant permanent (par exemple, 1 tesla). Pour ce faire, transférer le mélange dans un ballon de vaisseau, puis, tout en maintenant l'aimant à proximité du navire, tenir le MNP et la BNC en place tout en décantant le surnageant.
    Remarque: Soyez prudent lors de la manipulation des aimants puissants, car ils peuvent être dangereux lorsqu'ils sont utilisés de manière incorrecte. Pour les étapes (2.12) - (2.14) et (2.16) utilisent l'eau de haute pureté désoxygénée préparée précédemment dans (2.1) pour empêcher les particules de l'oxydation.
  12. Reprendre le MNP et BNC 100 de l'eau. secouer la solution pour éliminer tous les MNP qui ne sont pas fortement incorporés dans la BNC doucement. Décanter les supernatant à nouveau en tenant le MNP et la BNC en place en utilisant l'aimant.
  13. Laver le MNP et plusieurs fois BNC avec de l'eau jusqu'à ce que le surnageant atteigne un pH neutre (pH ~ 7), telle que mesurée en utilisant une bande colorimétriques.
  14. Séparer la nanocellulose bactérienne magnétique fonctionnalisé BNC ou magnétique (MBNC) à partir du MNP en utilisant des pinces et rincer le MBNC plusieurs fois avec de l'eau jusqu'à ce que l'eau soit claire.
  15. Stériliser le MBNC en exposant le MBNC O / N à UV (110-280 nm).
  16. Autoclaves 500 ml d'eau de haute pureté désoxygéné à 120 ° C pendant 20 min et stockent le MBNC dans 20 ml de cette eau.
  17. Aseptique, immerger l'échantillon dans 1% de PEG et remuer pendant 2 heures à la température ambiante (37 ° C). Cette procédure améliore la biocompatibilité et la stabilité des nanoparticules d'oxyde de fer déposées dans la BNC, en particulier ceux qui sont exposés à la surface 07/05. Le revêtement PEG sera distribué sur le réseau MBNC 3D.
    Remarque: Nu IONP sont facilement oxydé dans l'airen raison de leur activité chimique élevée 8. Même si le PEG est considéré comme un matériau non biodégradable, sa stabilité chimique dépend des conditions appliquées biologiques telles que la teneur en eau, le pH, la température, la présence d'enzymes, les espèces réactives de l' oxygène, les espèces réactives de l' azote, et d' autres 9.

3. Caractérisation des pellicules BNC et MBNC

  1. Propriétés mécaniques
    1. Effectuer une charge normale et un test de déchargement de nanoindentation en utilisant un pénétrateur Berkovich. Le rayon de Berkovich diamant pénétrateur est de 20 nm.
    2. Utiliser la silice fondue et du tungstène pour calibrer la zone de contact en fonction de la profondeur d'enfoncement à la température ambiante. Pendant l'essai, le montage des échantillons sur l'indentation à l'aide de la colle. Le pénétrateur a approché les échantillons dans son épaisseur.
    3. Sélectionner au hasard des emplacements d'indentation sur les surfaces des échantillons. Gardez l'espacement entre les 2 tirets entre 200-300 mm.
    4. Appliquer la charge à laéchantillons dans les étapes et enregistrer le déplacement correspondant du pénétrateur. Analyser le tracé de la charge vs profondeur pour trouver le module de Young.
    5. Effectuer le test de nanoindentation des échantillons en présence d'eau déminéralisée (eau DI), et d'essai en appliquant les taux de charge entre 0,0001 mN / s et 0,005 mN / sec, avec une charge maximale entre 0,01 mN et 0,60 mN.
    6. Utiliser une cellule liquide et conserver des échantillons dans l'environnement de liquides. Cette configuration unique pour la caractérisation nanomécanique immergé dans un environnement fluide est idéal pour simuler efficacement la portée des fonctionnalités biomécanique des membranes BNC et MBNC.
  2. Caractérisation structurale par SEM
    1. Caractérisation de la structure des fibres de nanocellulose par microscopie électronique à balayage (MEB).
    2. Lyophiliser les échantillons pendant 24 heures à -80 ° C. Montez ensuite sur les goujons SEM, par pulvérisation cathodique avec le film Au-Pd pendant 10 secondes et à analyser en utilisant SEM.
    3. Prend des images à un grossissement de 22,000Xet 60,000X, avec une tension d'accélération de 5 kV.
  3. domaines magnétiques
    1. Autoriser les pellicules MBNC à sécher complètement à température ambiante, et d'exposer ensuite pendant 5 min à un aimant permanent (1 Tesla).
    2. Immédiatement, effectuer les mesures de force magnétique à l'aide d'un bio-AFM selon le protocole du fabricant.
    3. Pour chaque mesure, la capture d'abord les caractéristiques de la topographie et à acquérir les domaines magnétiques au cours d'un second passage. Obtenir les deux mesures avec le bio-AFM en mode non-contact.
    4. La caractérisation magnétique des nanoparticules est réalisée à l' aide de vibration magnétomètre à échantillon (VSM) dans le système de mesure de propriétés physiques (PPMS) de Quantum Design à la température ambiante (300 K), avec un champ magnétique dans la plage de -10 000 à 10 000 Oe.
  4. cytocompatibilité
    1. Graine humaine aortiques cellules musculaires lisses (HASMC) dans un tissu plaque de culture 6 puits à une densité de 1,0x10 2 et incuber pendant 24 heures en présence des échantillons d'essai: pellicules BNC et MBNC (chacune avec un 15,6 mm de diamètre).
    2. Utiliser les populations de cellules non traitées et traitées peroxyde d'hydrogène en tant que témoins négatifs et positifs, respectivement.
    3. Effectuer le test Comet selon les protocoles du fabricant et les lignes directrices proposées par A. Azqueta & AR Collins 10.
    4. Utiliser l'acide nucléique colorant SYBR Gold cet essai d'intercaler et l'étiquette fluorescente de l'ADN contenu dans les échantillons par électrophorèse selon le protocole du fabricant.
      Note: Les cellules qui ne subissent pas de dommages à l'ADN en présence d'échantillons BNC et MBNC, va montrer un tour nucleoid vert fluorescent, alors que les cellules endommagées ADN auront de longues comètes - échantillons positifs auront nucléoïdes (la tête de la comète) suivie queues qui contiennent du matériel d'ADN fragmenté (pourcentage d'ADN dans la queue).

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Representative Results

La période d'incubation de G. xylinus était un total de 9 jours, mais les pellicules ont commencé à former plus tôt et étaient évidents après environ 2 jours. L'aspect macroscopique de la BNC est affichée dans la figure 1, dont la forme imite celle de la culture de plat cultivés. Figure 2 décrit le procédé de production de pellicules BNC-IONP, qui résume les principales étapes impliquées dans le protocole ci - dessus, ainsi que la configuration des composants principaux.

Images MEB ont été utilisés pour résoudre la microstructure, la morphologie et la répartition spatiale des fibres du connecteur BNC (figure 3) et la distribution dans IONP fonctionnalisés BNC (figure 4). La BNC est formée par des rubans fines (environ 50 nm de diamètre) qui forment des pores ouverts à travers l'ensemble du réseau sans motif défini. Le IONP sont préférentiellement locATED entre les pores formés par entrelacement fibrillaire, formant des grappes de 100 nm ou plus en taille. Individuel IONP sont également tenus le long des rubans. Le MBNC présente une structure de fibrilles moins compacté par rapport à la BNC, probablement parce que IONP réunir les rubans de la BNC. Magnétique microscope à force a été utilisé pour reconstituer le profil magnétique au niveau de la topographie de la MBNC (figure 5A, B). Grands pores de diamètre 500 nm ou plus sont formées dans la MBNC, qui ne sont pas observés dans BNC non traité (figure 5A). Ceci est en accord avec les observations dans les microphotographies SEM, où le MBNC affiche une structure plus poreuse que la BNC non modifiée. Un gradient de force magnétique avec deux domaines d'aimantation différente a été détectée sur la surface MBNC (figure 5B), dont le contraste ne correspond pas avec les collines et les vallées formées par les régions IONP riches en MBNC images topographiques (figure 5A). Haut et faible intechamps magnétiques nsity sont appelés jaune et vert sur ​​la figure 5B , respectivement. La boucle d'hystérésis des nanoparticules, mesurée noyées dans la nanocellulose bactérienne, est représentée sur la figure 5 qui démontre que tous les IONPs étaient superparamagnétique à température ambiante, sans hystérésis.

HASMC ont été cultivées en présence de BNC et de MBNC pour tester un effet nuisible sur la viabilité des cellules individuelles à la suite d'une exposition à ces matériaux étrangers. L'étendue des dommages dans des cellules individuelles a été quantifiée par la détection de ruptures de brins d' ADN (figure 6). Les résultats ont été comparés à HASMC de plus en plus dans des conditions de culture normales de 37 ° C, 95% d' air et 5% de CO 2 (contrôle négatif) et HASMC avec génotoxicité induite par le peroxyde d'hydrogène (100 pM H 2 O 2) pendant 30 min ( contrôle positif). comparaisons par paires à l'aide du test t ont montré thles effets de la MBNC sur la viabilité cellulaire ont été significativement différents de ceux induits par le traitement avec du peroxyde d'hydrogène sur HASMC (valeur p <0,001, ***).

Figure 1
Figure 1. Aspects macroscopiques de nanocellulose bactérienne. Pellicules BNC ont été obtenus après une période d'incubation de 11 jours, qui sont environ. 3 mm d'épaisseur. La période d'incubation dépend des exigences de l'utilisation prévue. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Fabrication de nanocellulose bactérienne magnétiquement fonctionnalisés. Nanoparticules d'oxyde de fer sont assemblés et i ncorporated in situ au sein de la BNC, ce qui donne un MBNC. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Image MEB de BNC. La BNC affiche un fin réseau et des rubans non agrégées avec des tailles de 50 nm ou moins. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4. image SEM de la BNC IONP pelliculaire. Nanoparticules d'oxyde de fer (IONP) sont de préférence positionnées entre les rubans entrelacés.d / 52951 / 52951fig4large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
La figure 5. La topographie de l' AFM et MBNC structures de domaines magnétiques. Topographie (A) de la surface de MBNC montrant des taches de nanoparticules hautement emballés, qui se dressent au- dessus de la structure de nanofibrilles. (B) domaines jaunes et verts indiquent deux régions différentes aimantation du champ magnétique à haute intensité et faible respectivement. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6
Figure 6. Ampleur des dommages de l' ADN dans HASMC après avoir été l' expositionBNC et MBNC respectivement. PosCtl représente HASMC qui a subi un traitement de peroxyde d'hydrogène à des fins de comparaison. NegCtl désigne HASMC croissante dans des conditions de culture normales. Les effets néfastes de la viabilité MBNC sur HASMC étaient significativement différentes de celles observées dans le PosCtl (valeur p <0,001, ***). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

L'épaisseur et la taille de la pellicule BNC peuvent être facilement manipulées en modifiant le temps d'incubation et la taille du récipient dans lequel elle est cultivée pendant la culture statique. Les micropropriétés du BNC, tels que la porosité, peuvent être modifiés en changeant le rapport de l'oxygène dans la culture statique. Des concentrations plus élevées d'oxygène donnent plus difficile BNC 11. A. Bodin et ses collaborateurs ont produit des tubes de type BNC , avec une pression d'éclatement allant jusqu'à 880 mm Hg en modifiant le rapport de l' oxygène à partir de l' oxygène atmosphérique à 100% d' oxygène au cours du procédé de fermentation de G. xylinus 12. De même, la porosité de la BNC peut également être introduit par incorporation d'agents porogènes tels que des microsphères de cire de paraffine dans le processus de fermentation. La porosité et la porosité interconnectivité dans ce cas , résultant dépendra de la taille de l' agent porogène 13.

Le réseau poreux de la BNC leur permet d'être fonctionnalisés avec des nanoparticules, par exemple pour l' administration de médicamentsagents. Dans notre étude, nous avons fonctionnalisé BNC avec IONP en synthétisant et en croissance in situ des nanoparticules dans la membrane BNC, afin de mettre en œuvre un protocole magnétique pour le recrutement cellulaire rapide et pièce jointe dans échafauds à base de BNC. Les tests montrent que la réponse nanomécaniques nanométrique de BNC comporte de façon similaire avec les vaisseaux sanguins 14 avec un module d'élasticité très faible Young, E BNC = 0,0025 GPa à l' intérieur des échantillons à 0,04 GPa à la surface. Les valeurs obtenues sont comprises avec celles observées par Fu et al. 15.

L'excès de IONP pourrait facilement être retiré de la BNC en raison de la forte porosité du matériau. photographies MEB ont montré que les nanoparticules sont réparties principalement dans les espaces formés par fibrilles entrecroisement et dispersées le long des rubans. La concentration des espèces de fer utilisées dans ce protocole a abouti à haute densité emballé IONP, qui a réuni les rubans de la BNC. Il en est résulté uneMBNC avec des pores plus grands que ceux de la BNC non modifiée. Olsson et al., Qui a utilisé des concentrations différentes de FeSO 4 / CoCl2 sels formés avec la même fraction volumique de BNC dans la synthèse des aérogels de cellulose nanofibrilles, fait état ​​d' une augmentation similaire de la porosité BNC quand ils ont changé la fraction volumique de la ferrite de cobalt ferromagnétique des nanoparticules de 0,7% à 5,7% 16. Cette forte porosité dans la MBNC peut être avantageux pour le dépôt de médicaments qui augmentent le temps de récupération et d'éviter la resténose dans les parois artérielles endommagées.

L'absence de corrélation entre les caractéristiques topographiques et des images de phases magnétiques ont également été décrits par B. Torre et al. , 17 qui signale l'indépendance entre la topographie et les signaux magnétiques de couches de nanoparticules creuses. D'autres études de caractérisation doivent être menées pour déterminer l'aimantation hystérésis (MH) boucles de la MBNC via SQUID-VSM sytiges.

Le MBNC a montré un faible potentiel pour les effets toxiques, en fonction des résultats observés dans l'essai de comète, ce qui indique que ce matériau est biocompatible pour l'utilisation en contact avec les cellules.

Les étapes les plus critiques dans la procédure sont liés à la quantité d'hydroxyde d'ammonium et la vitesse à laquelle il est ajouté, ainsi que d'assurer l'immersion complète et l'agitation du BNC dans la solution pendant la réaction. Le premier aspect détermine la taille des nanoparticules d'oxyde de fer résultantes, tandis que la seconde influence sur la façon dont les nanoparticules sont réparties dans la matrice BNC. Afin de mieux contrôler la taille des MNP, une burette avec un robinet d'arrêt peut être utilisé pour réguler l'addition par goutte de l'hydroxyde d'ammonium dans le mélange réactionnel. Il est conseillé de petits morceaux de BNC qui peut être complètement immergé dans la solution, par exemple, des tailles d'environ 1,9 cm 2 pour un volume total de 10 ml de solution. Un limition de cette technique est la répartition inhomogène de la IONP à l'intérieur du maillage BNC.

Ce protocole décrit un procédé d'incorporation des nanoparticules d'oxyde de fer dans BNC pour former un composite. En raison de la biocompatibilité et les propriétés physiques et mécaniques des deux BNC et les nanoparticules d'oxyde de fer, le MBNC peut être utilisé dans une variété d'applications biomédicales telles que les systèmes d'administration de médicaments et des échafaudages pour la croissance cellulaire.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glucoacetobacter xylinus ATCC 700178
Agar Sigma Aldrich A1296-500G 
D-Mannitol Bioxtra Sigma Aldrich M9546-250G 
Yeast Extract BD Biosciences 212750
Bacteriological Peptone Sigma Aldrich P0556
Sodium Hydroxide, 50% Solution In Water Sigma Aldrich 158127-100G
Iron(III) Chloride Hexahydrate Sigma Aldrich 236489-100G 
Ammonium Hydroxide  Macron Fine Chemicals 6665-46
Poly(Ethylene Glycol), Average Mn 400 Sigma Aldrich 202398-250G 
Iron (II) chloride tetrahydrate Sigma Aldrich 44939-250G
Disposable Petri dish Sigma Aldrich BR452000
Disposable Inoculating Loop Fisher Scientific 22-363-604 
Anhydrous Calcium Sulfate W.A. Hammond Drierite  13001
High vacuum grease Sigma Aldrich Z273554-1EA
Laboratory pipetting needle with 90° blunt ends Sigma Aldrich CAD7937-12EA
pH test strips   Sigma Aldrich P4786-100EA
Round-bottom three neck angle type distilling flask Sigma-Aldrich CLS4965250
Silicone oil for oil baths Sigma-Aldrich 85409-250ML 
Drying Tube Chemglass CG-1295-01
Septum Stopper, Sleeve Type Chemglass CG-3022-98
Magnetic stir bar Chemglass CG-2001-05
Condenser Chemglass CG-1218-01
Temperature Controller BriskHeat SDC120JC-A
Stirring Hotplate Fisher Scientific 11-100-49SH 
Comet Assay Kit Trevigen 4250-050-K
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain Life Technologies S-11494
bio-AFM JPK Instruments NanoWizard 4a BioScience AFM
Nanoindenter Micro Materials Ltd Multi-module mechanical tester 
Scanning electron microscopy (SEM) Hitachi High Technologies America Hitachi S-4800

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References

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Bioengineering numéro 111, La cellulose bactérienne des nanoparticules d'oxyde de fer le vaisseau sanguin biomatériau
Fabrication d&#39;un fonctionnalisés magnétique bactérienne nanocellulose avec oxyde de fer Nanoparticules
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Arias, S. L., Shetty, A. R., Senpan, … More

Arias, S. L., Shetty, A. R., Senpan, A., Echeverry-Rendón, M., Reece, L. M., Allain, J. P. Fabrication of a Functionalized Magnetic Bacterial Nanocellulose with Iron Oxide Nanoparticles. J. Vis. Exp. (111), e52951, doi:10.3791/52951 (2016).

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