Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Fabricage van een gefunctionaliseerd Magnetic Bacterial Nanocellulose met ijzeroxide Nanodeeltjes

Published: May 26, 2016 doi: 10.3791/52951
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 5,6, 1,2,3,7
1Department of Bioengineering, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Department of Nuclear, Plasma and Radiological Engineering, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Micro and Nanotechnology Laboratory, University of Illinois at Urbana-Champaign, 4Program of Study and Control of Tropical Diseases (PECET), University of Antioquia, 5Sealy Center for Vaccine Development, University of Texas Medical Branch, 6WHO Collaborating Center for Vaccine Research, Evaluation and Training on Emerging Infectious Diseases, University of Texas Medical Branch, 7Beckman Institute, University of Illinois at Urbana-Champaign

Abstract

In deze studie wordt bacteriële nanocellulose (BNC) geproduceerd door de bacteriën Gluconacetobacter xylinus gesynthetiseerd en geïmpregneerd in situ met ijzeroxide nanodeeltjes (IONP) (Fe 3 O 4) een magnetische bacteriële nanocellulose (MBNC) werd verkregen. De synthese van MBNC is nauwkeurig en specifiek meerstapsproces. Kort samengevat, bacteriële nanocellulose (BNC) pellicles zijn gevormd uit bewaard G. xylinus stam volgens onze experimentele eisen van de grootte en morfologie. Een oplossing van ijzer (III) chloride hexahydraat (FeCl3 · 6H 2 O) en ijzer (II) chloride-tetrahydraat (FeCl2 · 4H 2 O) met een 2: 1 molaire verhouding wordt bereid en verdund in gedeoxygeneerd zuiver water. Een BNC vliesje wordt vervolgens ingebracht in het vat met de reactanten. Dit mengsel wordt geroerd en bij 80 ° C in een silicone oliebad en ammoniumhydroxide (14%) verhit wordt vervolgens druppelsgewijs toegevoegd aan het precipitaatferro-ionen in de BNC-mesh. Deze laatste stap maakt het vormen van in situ magnetiet nanodeeltjes (Fe 3 O 4) in de bacteriële nanocellulose gaas om magnetische eigenschappen te BNC vlies te verlenen. Een toxicologisch assay werd gebruikt om de biocompatibiliteit van het BNC-IONP vliesje evalueren. Polyethyleenglycol (PEG) werd gebruikt om de IONPs dekken om hun biocompatibiliteit te verbeteren. Scanning elektronenmicroscopie (SEM) foto's toonden aan dat de IONP voorkeur waren in het fibril interlacing ruimten van de BNC matrix, maar sommige van hen werden ook gevonden langs de BNC linten. Magnetic Force Microscopy metingen uitgevoerd op de MBNC gedetecteerde aanwezigheid magnetische domeinen met een hoge intensiteit en zwak magnetisch veld, de bevestiging van de magnetische aard van de MBNC vlies. Young's modulus waarden verkregen in dit werk zijn ook in redelijke overeenstemming met die gerapporteerd voor verschillende bloedvaten in eerdere studies.

Introduction

De bacterian nanocellulose (BNC) wordt gesynthetiseerd door Acetobacter xylinum stam, ook bekend als Gluconacetobacter xylinus en in de vorm van films of pellicles op de lucht-water grensvlak afgezet tijdens stationaire kweek. Deze BNC pellicles nemen de vorm van de container waar zij worden gekweekt, en de dikte is afhankelijk van het aantal dagen in kweek. A. xylinus gebruikt de glucose in het medium voor de synthese van de cellulose microfibrillen door een proces van polymerisatie en daaropvolgende kristallisatie. De polymerisatie van de glucose residuen bij de bacteriële extracellulaire membraan wanneer glucanketens geëxtrudeerd uit één poriën verdeeld over de celenvelop uitgevoerd. De kristallisatie van de cellulose microfibrillen plaatsvindt in de extracellulaire ruimte onder vorming van glucaanketen vellen door van der Waals binding, gevolgd door het stapelen van de vellen door H-binding 1.

Magneetic nanodeeltjes geïntegreerd zijn BNC matrix kan gemakkelijk worden gemanipuleerd door een extern magnetisch veld om de kracht die nodig is om directe en beperken gladde spiercellen (SMC) met magnetische nanodeeltjes, toenemen met de aangetaste locatie van de vaatwand. Deze strategie houdt de SMC buurt van andere weefsels, en houdt de cellen in plaats tegen de kracht uitgeoefend door de bloedstroom. Het is aangetoond dat SMC's een belangrijke rol spelen bij de vasoelasticity van het bloedvat, wanneer zij deel overvloedige lagen voornamelijk in de tunica media 2.

De werkwijze voor de synthese van MBNC omvat BNC vlies ondergedompeld en geroerd in een oplossing van ijzer (III) chloride hexahydraat en ijzer (II) chloride-tetrahydraat bij 80 ° C. Ammoniumhydroxide toegevoegd ijzeroxide nanodeeltjes binnen de BNC maas vormen. De toevoeging van ammoniumhydroxide verandert de kleur van de oplossing van oranje naar zwart. De IONPs compact bij elkaar langs de BNC fibrils met een niet-uniforme verdeling.

Dit protocol is gericht op het ontwerp van een bacteriële nanocellulose nanodeeltje vlies, die wij genoemd magnetisch bacteriële nanocellulose (MBNC), die bedoeld is om te gebruiken als vervanging voor ontbrekende, beschadigd of verwond kleine diameter bloedvaten. HS Barud en collega's hebben onlangs een soortgelijke werkzaamheden van een BNC-gebaseerde flexibele magnetische papier te produceren door het mengen van BNC pellicles in een stabiele waterige dispersie van PEG en superparamagnetische ijzeroxide nanodeeltjes 3 gepubliceerd. Hier beschrijven we de productie van bacterieel cellulose en impregnering in situ met magnetische nanodeeltjes. Een cytotoxiciteit-assay gebaseerd op detectie van enkelvoudige DNA breuken werd gebruikt om de biocompatibiliteit van de BNC en MBNC pellicles testen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Bereiding van Bacteriële Nanocellulose (BNC)

Opmerking: Alle stappen worden uitgevoerd onder aseptische omstandigheden, tenzij anders aangegeven.

  1. Bereid kweekmedium.
    1. Bereid 500 ml vloeibaar kweekmedium door het combineren van 25 g gistextract, 15 g pepton, 125,0 g mannitol en 500 ml zuiver water. Autoclaaf dit mengsel bij 120 ° C gedurende 20 min en bewaar bij 4 ° C.
    2. Bereid 100 ml halfvaste media door het toevoegen van 15 g agar 5,0 g gistextract, 3,0 g pepton, 25,0 g mannitol en 100 ml zuiver water. Autoclaaf dit mengsel bij 120 ° C gedurende 20 min. Eenmaal geautoclaveerd depot 5 ml van het mengsel in een 90 mm x 16 mm plastic petrischaal. Laat de oplossing gel bij 4 ° C en bewaar bij deze temperatuur tot verder gebruik.
  2. Rehydrateren G. xylinus stam bewaard in gevriesdroogde vials door toevoeging van 1 ml vloeibaar kweekmedium en pipetteren enomlaag, zoals aangegeven door de instructies van de fabrikant.
  3. Inoculeer de platen met semi-vaste media met kleine druppeltjes van bacteriële suspensie met behulp van een entnaald. Zorg ervoor dat het inoculum omvat het gehele petrischaal in door de lus in een zigzag richting vanaf de rand naar het midden van de schaal.
  4. Incubeer de Petrischalen bij 26 ° C gedurende 72 uur in een incubator zonder CO 2. Zodra de incubatietijd is voltooid, kleine witte kolonies zichtbaar. Indien de kolonies worden niet onmiddellijk wordt gebruikt, slaan de petrischaaltjes bij 4 ° C door het afdichten van het deksel met Parafilm en het plaatsen van de gerechten op zijn kop. De kolonies kunnen worden opgeslagen op die manier tot 6 maanden.
  5. Overdracht 2 ml van het kweekmedium vloeistof bereid in stap (1.1.1) in elk putje van een 24-well weefselkweek plaat. Neem twee kolonies met het enten naald uit de geënte petrischaaltjes in stap (1.3) en plaats ze in het eerste putje van de weefselkweek plaat. Repeat, herhaal dezelfde procedure voor de resterende 23 putten.
  6. Incubeer de weefselkweekplaat bij 30 ° C gedurende 7 dagen. Dit zal een totaal 24 BNC pellicles met diameter van 16 mm en een dikte van ongeveer 2-3 mm diameter werd verkregen als weergegeven in figuur 1.
    Opmerking: de bacteriecultuur niet storen op enig moment tijdens de incubatietijd, bijvoorbeeld door schudden van de platen. Tijdens de incubatieperiode G. xylinus extrudeert glucopyranose suikermoleculen een polymeer kristallijn maas in de lucht-vloeistof-grensvlak, waarbij de vorm en grootte van de kolf onder statische kweekomstandigheden vaststelt vormen. Deze polymère matrix, bekend als bacteriële nanocellulose (BNC), valt op aan het einde van de incubatieperiode.
  7. Verzamel de BNC pellicles de groeimedia en steriliseren in 200 ml 1% NaOH-oplossing gedurende 1 uur bij 50 ° C, teneinde alle sporen te verwijderen G. xylinus. Eventueel roer deze oplossing bij 300 rpm met een magneetstaafen een bewogen plaat. Gooi de NaOH-oplossing en voeg 200 ml vers bereide 1% NaOH-oplossing. Herhaal hetzelfde proces nog een keer of totdat de BNC pellicles in oplossing krijgt een doorschijnend uiterlijk.
  8. Spoel de BNC pellicles met water drie keer en bewaar ze in zuiver water bij kamertemperatuur. Zorg ervoor dat de BNC pellicles worden volledig ondergedompeld in het water en het is niet toegestaan ​​om te drogen op elk moment.
  9. Autoclaaf de BNC pellicles bij 121 ° C gedurende 20 min.
    Let op: Een in vivo subcutane studie in de rat uitgevoerd door Märtson en collega's toonden aan non-degradatie tekenen van de BNC na 60 weken implantatie. Inderdaad, BNC afbreekbaar karakter door microbiële en fungale enzymen, die afwezig zijn in zoogdieren. Aan de andere kant kan de biologische afbreekbaarheid van de BNC het resultaat van mechanische, chemische en biologische processen die de microfibril netwerk in vivo 4 verzwakken.

2. Synthese van polymeer-gecoateIjzeroxide Nanodeeltjes en haar Deposition in een bacteriële Nanocellulose Membrane

  1. Bubble 1000 ml van zuiver water met stikstofgas om eventuele opgeloste zuurstof in het water te verwijderen en te vervangen door stikstof.
  2. Gebruik een driehals rondbodem kolf die een oplossing bereid in een 2: 1 molaire verhouding van ijzer (III) chloride hexahydraat (FeCl3 · 6H 2 O) en ijzer (II) chloride-tetrahydraat (FeCl2 · 4H 2 O) verdund met de gedeoxygeneerd zuiver water. Gebruik bijvoorbeeld 5,4 g FeCl3 · 6H 2 O en 1,98 g FeCl2 · 4H 2 O in 10 ml gedeoxygeneerd zuiver water. Als dit preparaat wordt te viskeus en moeilijk te roeren, gebruiken 0,54 g FeCl3 · 6H 2 O en 0,198 g FeCl2 · 4H 2 O in 20 ml gedeoxygeneerd zuiver water.
    Opmerking: Verminder de belichtingstijd van de FeCl2 · 4H 2 O in de lucht door weging deze chemical verbinding zo snel mogelijk. Eenmaal geïntroduceerd in de drie-hals rondbodemkolf sluit de drie-hals rondbodemkolf met septum stoppen totdat het is verbonden met het stikstofatoom gastoevoer en de koeler.
  3. Gebruik twee halzen van het vaartuig naar een constante ingang en uitgang van stikstofgas te verschaffen door de stikstof verbindt gastoevoer naar een naaldvilt in een septum stop en bevestigd aan hals van het vaartuig.
  4. Plaats 1 BNC vlies dat was bereid eerder in stap 1,5 (15,6 mm diameter en 2-3 mm dikte) in het vat met de reactanten. Controleer het monster volledig ondergedompeld in de vloeistof.
  5. Sluit de resterende hals van het vaartuig naar een condensor buis. Bovendien gebruikt een droogbuis wordt gevuld met watervrij calciumsulfaat bovenop de koeler. Laat water door de condensor buis.
  6. Dicht alle van de glazen voegen met vacuüm vet.
  7. Verwarm de oplossing in een silicone oliebad tot 80 ° C onder toepassing van een geroerdekookplaat en houd deze temperatuur totdat stap 2.10. Gebruik een kleine magnetische roerstaaf om de reactanten te mengen bij 350 rpm gedurende 5 minuten. Controleer de BNC op geschikte wijze geïmpregneerd met het ijzerhoudende oplossing en de reactanten volledig opgelost. Blijf roeren het mengsel tot het einde van het experiment.
    Opmerking: Gebruik een thermometer om de temperatuur van de siliconenolie controleren. Het moet constant 80 ° C.
  8. Verhoging van de roersnelheid tot 700 rpm en voeg (druppelsgewijs), in een tijdsinterval van 5 minuten, 5 ml ammoniumhydroxide (NH4OH, 14%) aan de 10 ml van ijzerhoudende oplossing met een pipetteren naald, die is ook geperforeerd in een septum stopper. Na toevoeging van ammoniumhydroxide, de kleur van de oplossing verandert van geel / oranje naar zwart.
  9. Zet roeren van de oplossing bij 80 ° C gedurende nog 5 min. Vermijd snelle stirrings om de integriteit van het monster te handhaven. Hoge snelheden, dat wil zeggen hoger dan 1000 rpm, kan vernietigenhet voorbeeld.
  10. Verlaag de temperatuur van de oplossing tot 30 ° C met de temperatuur onderaan het roeren kookplaat en blijf roeren nog eens 5 minuten. Schakel dan de hete plaat. Op dit punt zijn de IONP opgenomen in de BNC-mesh.
  11. Koel het mengsel af tot kamertemperatuur en scheiden van de magnetische nanodeeltjes (MNP) en BNC behulp van een sterke permanente magneet (bijvoorbeeld 1 Tesla). Om dit te doen, breng het mengsel aan een kolf vat en vervolgens, terwijl de magneet in de buurt van het schip, houdt het MNP en de BNC in plaats terwijl decanteren van de bovenstaande vloeistof.
    Opmerking: Wees voorzichtig bij het hanteren van sterke magneten, omdat ze schadelijk kunnen zijn bij onjuist gebruik. Voor stappen (2.12) - (2.14) en (2.16) gebruik maken van de zuurstofarme hoge zuiverheid water eerder bereid in (2.1) om deeltjes van oxidatie te voorkomen.
  12. Resuspendeer de MNP en BNC in 100 ml water. Schud de oplossing voor al het MNP die niet sterk in het BNC zijn opgenomen te verwijderen. Schenk de supernatant weer door het houden van het MNP en de BNC in plaats met behulp van de magneet.
  13. Was de MNP's en de BNC meerdere malen met water tot de bovenste neutrale pH (pH ~ 7) bereikt, zoals gemeten met een colorimetrische strip.
  14. Scheid de magnetische-gefunctionaliseerde BNC of magnetische bacteriële nanocellulose (MBNC) uit het MNP met een pincet en spoel de MBNC meerdere malen met water tot het water helder is.
  15. Steriliseer de MBNC door het blootstellen van de MBNC O / N UV (110-280 nm).
  16. Autoclaaf 500 ml gedeoxygeneerd zuiver water bij 120 ° C gedurende 20 min en bewaar de MBNC in 20 ml van het water.
  17. Aseptisch dompel het monster in 1% PEG en roer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur (37 ° C). Deze werkwijze verbetert de biocompatibiliteit en de stabiliteit van het ijzeroxide nanodeeltjes afgezet in de BNC, in het bijzonder die blootgesteld aan het oppervlak 5-7. De PEG-coating wordt verdeeld over de MBNC 3D-netwerk.
    Opmerking: Naked IONP zijn gemakkelijk geoxideerd in luchtvanwege hun hoge chemische activiteit 8. Hoewel PEG wordt beschouwd als een niet-biologisch afbreekbaar materiaal, de chemische stabiliteit afhankelijk van de toegepaste biologische omstandigheden zoals vochtgehalte, pH, temperatuur, aanwezigheid van enzymen, reactieve zuurstof species, reactieve stikstof species en anderen 9.

3. Karakterisering van de BNC en MBNC Pellicles

  1. Mechanische eigenschappen
    1. Voer normaal laden en lossen nanoindentation test met een Berkovich indringlichaam. De straal van Berkovich diamant indringlichaam is 20 nm.
    2. Gebruik gesmolten silica en wolfraam contactgebied calibreren als functie van de indrukking diepte RT. Tijdens de test, monteer de monsters op de inspringen gebruik van lijm. Het indringlichaam benaderde de monsters in de dikterichting.
    3. Willekeurig inspringen locaties op monsters oppervlakken. Houd de afstand tussen 2 streepjes tussen de 200-300 mm.
    4. Kan de last naar demonsters stappen en vermelden de overeenkomstige verplaatsing van het druklichaam. Analyseer de plot van lading vs diepte aan de Young's modulus te vinden.
    5. Voer de nanoindentation test van de monsters in de aanwezigheid van gedemineraliseerd water (DI-water), en test door het toepassen van de belasting tarieven tussen 0,0001 mN / sec en 0,005 mN / sec, met een piek belasting tussen 0,01 Mn en 0,60 mN.
    6. Gebruik een vloeibare cel en houdt monsters in het kader van het milieu vloeistoffen. Deze unieke opstelling voor nanomechanical karakterisering ondergedompeld in een vloeibare omgeving is ideaal om effectief simuleren het bereik biomechanische functionaliteit van BNC en MBNC membranen.
  2. Structurele karakterisering door SEM
    1. Karakteriseren nanocellulose vezelstructuur door scanning elektronenmicroscopie (SEM).
    2. Lyofiliseren de monsters gedurende 24 uur bij -80 ° C. Monteer vervolgens op SEM studs, sputteren met Au-Pd film voor 10 sec en te analyseren met behulp van SEM.
    3. Neemt foto's bij een vergroting van 22,000Xen 60,000X, met een versnellingsspanning van 5 kV.
  3. magnetische domeinen
    1. Laat de MBNC pellicles om volledig droog bij kamertemperatuur, en vervolgens blootgesteld gedurende 5 minuten naar een permanente magneet (1 Tesla).
    2. Onmiddellijk, het uitvoeren van de magnetische kracht metingen met behulp van een bio-AFM volgens het protocol van de fabrikant.
    3. Voor elke meting vast te leggen voor het eerst de topografie functies en het verwerven van de magnetische domeinen in een tweede pass. Verkrijgen van beide metingen met de bio-AFM in non-contact mode.
    4. Magnetische karakterisering van de nanopartikels wordt met behulp magnetometer met vibrerend monster (VSM) in de fysische eigenschappen metingen systeem (PPM) van Quantum Design, bij kamertemperatuur (300 K), met een magnetisch veld in het bereik van -10.000 10.000 Oe.
  4. Cytocompatibility
    1. Zaad humane aortische gladde spiercellen (HASMC) in een 6-well weefselkweek plaat bij een dichtheid van 1.0x10 cm2 en incubeer 24 uur in aanwezigheid van de testmonsters: BNC en MBNC pellicles (elk met een 15,6 mm diameter).
    2. Gebruik populaties van onbehandelde en waterstofperoxide behandelde cellen als negatieve en positieve controles, respectievelijk.
    3. Voer de Comet assay volgens de protocollen van de fabrikant en de richtlijnen die door A. Azqueta & AR Collins 10 voorgesteld.
    4. Gebruik de nucleïnezuur kleurstof SYBR Gold in dit assay te intercaleren en fluorescent labelen van de DNA in de elektroforese monsters volgens protocol van de fabrikant.
      Opmerking: Cellen die geen DNA schade in aanwezigheid van BNC en MBNC monsters ondergaan, een fluorescent ronde groene nucleoid tonen dat DNA beschadigde cellen lang kometen moet - positieve monsters nucleoiden (de kop van het comet) hebben, gevolgd door staarten die gefragmenteerd DNA-materiaal (percentage van DNA in de staart) bevatten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De incubatietijd van G. xylinus was een totaal van 9 dagen, maar de pellicles begon vroegere vorm en waren duidelijk na ongeveer 2 dagen. Het macroscopische uiterlijk van de BNC wordt weergegeven in figuur 1, waarvan de vorm nabootst die van de schaal gekweekt kweek. Figuur 2 beschrijft de werkwijze voor het produceren BNC-IONP pellicles, die de belangrijkste stappen van de bovenstaande protocol en samenvattingen de configuratie van de hoofdcomponenten.

SEM beelden werden gebruikt om de microstructuur, morfologie en ruimtelijke verdeling van de vezels van BNC (figuur 3) en IONP verdeling gefunctionaliseerde BNC (figuur 4) op te lossen. De BNC wordt gevormd door fijne linten (ongeveer 50 nm in diameter) die open poriën in het gehele netwerk, zonder een bepaalde patroon te vormen. De IONP zijn voorkeur located tussen de poriën gevormd door fibril interlacing, clusters vormen van 100 nm of meer in omvang. Individuele IONP zijn ook gebonden aan de linten. De MBNC vertoont een minder verdicht vezelstructuur ten opzichte van het BNC, waarschijnlijk omdat IONP samen linten van de BNC brengen. Magnetic Force Microscopy werd gebruikt om de magnetische reconstrueren aan de topografie van de MBNC (Figuur 5A, B). Grote poriën van 500 nm diameter of groter zijn gevormd in de MBNC, die niet werden waargenomen in onbehandelde BNC (Figuur 5A). Dit is in overeenstemming met de opmerkingen in de SEM microfoto's, waar de MBNC toont een meer poreuze structuur dan de ongewijzigde BNC. Een magnetische kracht verloop met twee domeinen van verschillende magnetisatie werd gedetecteerd over het MBNC oppervlak (Figuur 5B), waarvan het contrast niet correleren met de heuvels en valleien gevormd door IONP-rijke regio's in de MBNC topografische afbeeldingen (figuur 5A). Hoge en zwakke intensity magnetische velden worden aangeduid als geel en groen in figuur 5B respectievelijk. De hysteresislus van de nanodeeltjes, die gemeten is ingebed in de bacteriële nanocellulose, wordt getoond in Figuur 5 te tonen dat alle IONPs superparamagnetische waren bij kamertemperatuur, zonder hysterese.

HASMC werden gekweekt in aanwezigheid van BNC en MBNC te testen op schadelijke effecten op de levensvatbaarheid van individuele cellen als gevolg van blootstelling aan deze vreemde stoffen. De omvang van de schade in individuele cellen werd gekwantificeerd door detectie van DNA breuken (figuur 6). De resultaten werden vergeleken met HASMC teelt onder normale kweekomstandigheden van 37 ° C, 95% lucht en 5% CO 2 (negatieve controle) en HASMC met waterstofperoxide geïnduceerde genotoxiciteit (100 uM H 2 O 2) gedurende 30 min ( positieve controle). Gepaarde vergelijkingen met behulp van t-test toonde thnaar de effecten van de MBNC op cellevensvatbaarheid aanzienlijk verschillen van die, die met waterstofperoxide behandeling bij HASMC (p-waarde <0,001, ***).

Figuur 1
Figuur 1. Macroscopische aspecten van bacteriële nanocellulose. BNC pellicles zijn verkregen na een 11-daagse incubatieperiode, die ongeveer zijn. 3 mm dik. De incubatietijd is afhankelijk van de vereisten voor het beoogde gebruik. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. Fabricage van magnetisch gefunctionaliseerde bacteriële nanocellulose. Ijzeroxide nanodeeltjes worden geassembleerd en i ncorporated in situ in het BNC, waardoor een MBNC. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3
Figuur 3. SEM beeld van BNC. De BNC geeft een fijn netwerk en niet-geaggregeerde linten met afmetingen van 50 nm of minder. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 4
Figuur 4. SEM beeld van de BNC-IONP vliesje. Ijzeroxide nanodeeltjes (IONP) worden bij voorkeur gepositioneerd tussen de interlacing linten.d / 52951 / 52951fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 5
Figuur 5. AFM topografie van MBNC en magnetisch domein structuren. (A) Oppervlakte topografie van MBNC tonen plekjes van zeer verpakte nanodeeltjes, die boven het nanofibril structuur staan. (B) Gele en groene gebieden duiden twee gebieden van verschillende magnetisatie van hoge en zwakke intensiteit magnetisch veld respectievelijk. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 6
Figuur 6. Omvang van DNA-schade in HASMC nadat blootstellingrespectievelijk BNC en MBNC. PosCtl geeft HASMC dat waterstofperoxide behandeling ondergaan voor vergelijkingsdoeleinden. NegCtl geeft HASMC teelt onder normale kweekomstandigheden. De nadelige effecten van de MBNC op HASMC levensvatbaarheid waren significant verschillend van die waargenomen in de PosCtl (p-waarde <0,001, ***). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De dikte en afmeting van de BNC vlies kan eenvoudig worden gemanipuleerd door het veranderen van de incubatietijd en de grootte van de kolf waarin zij gekweekt in statische kweek. De microproperties van de BNC, zoals poreusheid, kan worden gewijzigd door het veranderen van de zuurstof verhouding in de statische kweek. Hogere zuurstofconcentraties opleveren taaiere BNC 11. A. Bodin en medewerkers geproduceerde buizen BNC met een barstdruk tot 880 mm Hg door verandering van de zuurstof verhouding van zuurstof tot 100% zuurstof tijdens het fermentatieproces G. xylinus 12. Evenzo kan de porositeit van de BNC ook worden ingevoerd door het opnemen porogenen zoals paraffinewas microsferen in het fermentatieproces. De verkregen porositeit en interconnectiviteit in dit geval zal afhangen van de grootte 13 porogeen.

Het poreuze netwerk van de BNC kunnen ze worden gefunctionaliseerd met nanodeeltjes, bijvoorbeeld voor geneesmiddelafgifteagenten. In ons onderzoek hebben wij gefunctionaliseerd BNC met IONP door het synthetiseren en groeien in situ de nanodeeltjes in de BNC membraan, teneinde een magnetische protocol voor snelle celrecrutering en bevestiging in BNC-gebaseerde scaffolds voeren. Nanomechanical proeven blijkt dat nanoschaal respons van BNC gedraagt ​​zich zoals met bloedvat 14 met een zeer lage elasticiteitsmodulus, E BNC = 0,0025 GPa in de monsters 0,04 GPa aan het oppervlak. De verkregen waarden zijn in de range met die waargenomen door Fu et al. 15.

De overmaat IONP kan gemakkelijk uit de BNC vanwege de hoge porositeit van het materiaal. SEM foto's toonden aan dat de nanodeeltjes hoofdzakelijk verdeeld in en gevormd door fibril interlacing en verspreid langs de linten. De concentratie van de ijzerdeeltjes die in dit protocol opleverden hoge dichtbevolkte verpakt IONP, die linten van de BNC's bij elkaar gebracht. Dit resulteerde in eenMBNC met grotere poriën dan die van het ongemodificeerde BNC. Olsson et al., Die verschillende concentraties gebruikt van FeSO 4 / CoCl2 zouten met dezelfde volumefractie van BNC in de synthese van cellulose nanofibril aerogels, meldde een soortgelijke toename van de BNC porositeit wanneer ze veranderden de volumefractie van de ferromagnetische kobaltferriet nanodeeltjes van 0,7% tot 5,7% 16. Deze hoge porositeit in het MBNC kan voordelig zijn voor de afzetting van geneesmiddelen die de hersteltijd verhogen en restenose bij beschadigde vaatwanden te voorkomen.

Het ontbreken van correlatie tussen de topografische kenmerken en magnetische fasebeelden zijn ook beschreven door B. Torre et al. 17, die de onafhankelijkheid van de topografie en de magnetische signalen sparse nanodeeltjes films gewezen. Verdere karakterisering studies moeten worden uitgevoerd om de magnetisatie hysteresis (MH) lussen van de MBNC via SQUID-VSM sy bepalenstengels.

De MBNC bleek gering toxische effecten, volgens de resultaten waargenomen in de Comet Assay, wat aangeeft dat dit materiaal biologisch compatibel voor gebruik in contact met cellen.

De meest kritische stappen in de procedure zijn gerelateerd aan de hoeveelheid ammoniumhydroxide en de snelheid waarmee het wordt toegevoegd, en zorgen de volledige onderdompeling en het roeren van de BNC in de oplossing tijdens de reactie. Het eerste aspect bepaalt de grootte van de resulterende ijzeroxide nanodeeltjes, terwijl de tweede beïnvloeden de nanopartikels zijn verdeeld over de BNC matrix. Om de grootte van de MNP's betere controle kan een buret met een kraan worden gebruikt om de toevoeging druppelsgewijs ammoniumhydroxide in het reactiemengsel te reguleren. Kleine stukjes BNC die volledig kan worden ondergedompeld in de oplossing wordt geadviseerd, bijvoorbeeld afmetingen van ongeveer 1,9 cm 2 voor een totaal volume van 10 ml oplossing. Eén limising van deze techniek is de inhomogene IONP in de BNC mesh.

Dit protocol beschrijft een werkwijze voor het opnemen ijzeroxide nanodeeltjes BNC een composiet te vormen. Vanwege de biocompatibiliteit en de fysische en mechanische eigenschappen van zowel de BNC en ijzeroxide nanodeeltjes, kan de MBNC worden gebruikt in uiteenlopende biomedische toepassingen als geneesmiddelafgiftesystemen en scaffolds voor celgroei.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glucoacetobacter xylinus ATCC 700178
Agar Sigma Aldrich A1296-500G 
D-Mannitol Bioxtra Sigma Aldrich M9546-250G 
Yeast Extract BD Biosciences 212750
Bacteriological Peptone Sigma Aldrich P0556
Sodium Hydroxide, 50% Solution In Water Sigma Aldrich 158127-100G
Iron(III) Chloride Hexahydrate Sigma Aldrich 236489-100G 
Ammonium Hydroxide  Macron Fine Chemicals 6665-46
Poly(Ethylene Glycol), Average Mn 400 Sigma Aldrich 202398-250G 
Iron (II) chloride tetrahydrate Sigma Aldrich 44939-250G
Disposable Petri dish Sigma Aldrich BR452000
Disposable Inoculating Loop Fisher Scientific 22-363-604 
Anhydrous Calcium Sulfate W.A. Hammond Drierite  13001
High vacuum grease Sigma Aldrich Z273554-1EA
Laboratory pipetting needle with 90° blunt ends Sigma Aldrich CAD7937-12EA
pH test strips   Sigma Aldrich P4786-100EA
Round-bottom three neck angle type distilling flask Sigma-Aldrich CLS4965250
Silicone oil for oil baths Sigma-Aldrich 85409-250ML 
Drying Tube Chemglass CG-1295-01
Septum Stopper, Sleeve Type Chemglass CG-3022-98
Magnetic stir bar Chemglass CG-2001-05
Condenser Chemglass CG-1218-01
Temperature Controller BriskHeat SDC120JC-A
Stirring Hotplate Fisher Scientific 11-100-49SH 
Comet Assay Kit Trevigen 4250-050-K
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain Life Technologies S-11494
bio-AFM JPK Instruments NanoWizard 4a BioScience AFM
Nanoindenter Micro Materials Ltd Multi-module mechanical tester 
Scanning electron microscopy (SEM) Hitachi High Technologies America Hitachi S-4800

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Saxena, I. M., Brown, R. M. Biosynthesis of bacterial cellulose. Bacterial Nanocellulose: A Sophisticated Multifunctional Material. , 1-18 (2012).
  2. Chan-Park, M. B., Shen, J. Y. Biomimetic control of vascular smooth muscle cell morphology and phenotype for functional tissue-engineered small-diameter blood vessels. J.Biomed.Mater.Res.A. 88, 1104-1121 (2009).
  3. Barud, H. S., et al. Biocellulose-based flexible magnetic paper. J. Appl. Phys. 117, (2015).
  4. Märtson, M., Viljanto, J., Hurme, T., Laippala, P., Saukko, P. Is cellulose sponge degradable or stable as implantation material? An in vivo subcutaneous study in the rat. Biomaterials. 20, 1989 (1999).
  5. Illésa, E., Tombácza, E., Szekeresa, M., Tótha, I., Szabób, Á, Iván, B. Novel carboxylated PEG-coating on magnetite nanoparticles designed for biomedical applications. J. Magn. Magn. Mater. 380, 132 (2015).
  6. Torrisi, V., et al. Preventing corona effects: multiphosphonic acid poly(ethylene glycol) copolymers for stable stealth iron oxide nanoparticles. Biomacromolecules. 15, 3171 (2014).
  7. Cai, Z., Kim, J. Bacterial cellulose/poly(ethylene glycol) composite: characterization and first evaluation of biocompatibility. Cellulose. 17, 83 (2010).
  8. Wu, W., He, Q., Jiang, C. Magnetic iron oxide nanoparticles: synthesis and surface functionalization strategies. Nanoscale Res. Lett. 3, 397-415 (2009).
  9. Ulbricht, J., Jordan, R., Luxenhofer, R. On the biodegradability of polyethylene glycol, polypeptoids and poly (2-oxazoline)s. Biomaterials. 35, 4848 (2014).
  10. Azqueta, A., Collins, A. R. The essential comet assay: a comprehensive guide to measuring DNA damage and repair. Arch. Toxicol. 87 (6), 949-968 (2013).
  11. Scherner, M., et al. In vivo application of tissue-engineered blood vessels of bacterial cellulose as small arterial substitutes: proof of concept. J. Surg. Res. 189, 340 (2014).
  12. Bodin, A., et al. Influence of cultivation conditions on mechanical and morphological properties of bacterial cellulose tubes. Biotechnol Bioeng. 97, 425 (2007).
  13. Zaborowska, M., et al. Microporous bacterial cellulose as a potential scaffold for bone regeneration. Acta Biomaterialia. 6, 2540 (2010).
  14. Karimi, A., et al. A comparative study on the mechanical properties of the umbilical vein and umbilical artery under uniaxial loading. Artery Res. 8, 51 (2014).
  15. Lina, F., Ping, Z., Shengmin, Z., Guang, Y. Evaluation of bacterial nanocellulose-based uniform wound dressing for large area skin transplantation. Mater. Sci. Eng. C. 33, 2995 (2013).
  16. Olsson, R. T., et al. Making flexible magnetic aerogels and stiff magnetic nanopaper using cellulose nanofibrils as templates. Nature Nanotech. 5 (8), 584-588 (2010).
  17. Torre, B., et al. Magnetic force microscopy and energy loss imaging of superparamagnetic iron oxide nanoparticles. Sci. Rep. 1 (202), 1-8 (2011).

Tags

Bioengineering , Bacterieel cellulose ijzeroxide nanodeeltjes bloedvat biomateriaal
Fabricage van een gefunctionaliseerd Magnetic Bacterial Nanocellulose met ijzeroxide Nanodeeltjes
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Arias, S. L., Shetty, A. R., Senpan, … More

Arias, S. L., Shetty, A. R., Senpan, A., Echeverry-Rendón, M., Reece, L. M., Allain, J. P. Fabrication of a Functionalized Magnetic Bacterial Nanocellulose with Iron Oxide Nanoparticles. J. Vis. Exp. (111), e52951, doi:10.3791/52951 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter