Abstract
לצד hepatocytes parenchymal, הכבד מכיל תאים שאינם parenchymal (NPC) כלומר תאים Kupffer (KC), תאי אנדותל הכבד (LEC) ותאי stellate הכבד (HSC). דו מימדי (2D) תרבות של hepatocyte אדם מן המעלה הראשונה (PHH) עדיין נחשב "תקן הזהב" במבחנה בדיקות של חילוף החומרים סמים הרעילות. זה ידוע היטב כי monoculture 2D של PHH סובל dedifferentiation ואובדן תפקוד. לאחרונה הודגם כי הכבד NPC למלא תפקיד מרכזי בכבד (patho-) פיזיולוגיה החזקת פונקציות PHH. המחקר הנוכחי מתמקד בשחזור של האדריכלות רקמות in vivo על ידי 3D- ומודלים לתרבות משותפת כדי להתגבר על המגבלות של monocultures 2D. בעבר פרסמנו שיטה לבודדת בתאי כבד אנושיים וחקרתי את התאמתו של תאים אלה לשימושם בתרביות תאים בביולוגיה ניסויית ורפואת 1. בהתבסס על הריבית הרחבה te זהchnique המטרה של מאמר זה הוא לספק פרוטוקול מפורט יותר על תהליך הבידוד כבד התא כולל וידאו, אשר יאפשר רבייה קלה של טכניקה זו.
בתאי כבד אנושיים בודדו מדגימות רקמת הכבד האנושי של התערבויות כירורגיות ידי טכניקה P זלוף שני שלבים EGTA / collagenase. PHH הופרד NPC ידי צנטריפוגה ראשונית ב 50 x ז. צעדי צנטריפוגה שיפוע צפיפות שמשו להסרת תאים מתים. אוכלוסיות תאים בכבד הפרט בודדו את שבר NPC מועשר באמצעות מאפייני תאים ספציפיים ונהלי מיון תא. לצד בידוד PHH הצלחנו להפריד KC, הבקר ואת HSC לגידול נוסף.
יחדיו, הפרוטוקול המובא מאפשר בידוד של PHH ו NPC באיכות ובכמות גבוהה ממדגם רקמות התורם אחד. הגישה אוכלוסיות תאים בכבד מטוהרים יכול לאפשר יצירה של in vivo כמו li אדםמודלים Ver.
Introduction
רקמת כבד אנושית היא מאוד מורכבת מורכבת משני גופי תאים שונים, תאי parenchymal ותאי הלא parenchymal (NPC). תאי כבד Parenchymal כוללים hepatocytes ו cholangiocytes. Hepatocytes מייצג 60 עד 70% של תאי כבד סכו להסביר את רוב הפונקציות הכבדות מטבולית, למשל, חומצות מרות ומשלים סינתזת גורם, biotransformation ואנרגית מטבוליזם 2,3.
שבר NPC הקטן מהווה 30-40% של תאים כבדים כוללים. NPC לכלול אוכלוסיות תאים שונות, כלומר תאי Kupffer (KC), תאי אנדותל כבדים (LEC) ותאי stellate הכבדים (HSC). שבריר תא הטרוגנית זו ממלאת תפקיד מרכזי בתהליכים פיסיולוגיים של הכבד. בנוסף, NPC להשתתף בתיווך נזק כבד חריפה, למשל, פגיעה בכבד הנגרמת התרופה (דילי) וכן לפציעת כבד כרונית, כגון שחמת 4.
בשנים האחרונות, hתאי כבד באומן הפכו יותר ויותר חיוני במחקר ופיתוח של בדיקות סמים, פיתוח תרופות וזיהוי הביוכימיים חדשים במחלות כבדות. עבור בדיקות במבחנה monocultures PHH עדיין נחשבים "תקן הזהב" 5. המגבלה העיקרית של מודלים כבדים homotypic הנוכחיים היא dedifferentiation ואובדן התפקוד של hepatocytes תוך מספר ימים 4. הקמת טכניקות תרבות 3-ממדי (3D) הוכיחה כי מגבלות אלה ניתן לפצות 4,6. עם זאת, אפילו טכניקות תרבות 3D מודרניות אינן מסוגלות להציג את כל מצבי hepatotoxic של פעולות 7. אוכלוסיות NPC חסרות במודלים במבחנה הקיימים נדונות כסיבה אפשרית לאי התאמה זו למצב vivo. הוכח כי תקשורת תאי תאים בין אוכלוסיות תאים בכבד השונות ממלא תפקיד מרכזי הומאוסטזיס פיסיולוגי אלא גם pathophysiologic מעבד 8. לכן את תשומת הלב המדעית מתמקדת יותר ויותר על NPC ואינטראקציות תאי התאים שלהם. שימוש ותכליתי במערכות שיתוף תרבות רקמות מהונדסות יכול להיות פתרון עבור הביקוש הרב של מודלים כבדים במבחנת 8,9 שהן קרובות ככל למצב in vivo ככל האפשר.
כרגע האתגר המרכזי הוא הפיתוח של מודל כבד אנושי סטנדרטי שיתוף תרבות, המכיל חלקים ברורים של PHH ו NPC. כתוצאה מכך, טכניקות לבידוד תאי הכבד הטרוגנית מאוד נדרשות ואלה צריכים להיות מותאמים על מנת לקבל אוכלוסיות תאים טהורות. בעוד פרוטוקולים סטנדרטיים עבור בידוד PHH קיימים 10, הבידוד הסטנדרטי של NPC אדם עדיין בפיתוח. רוב שפורסמו פרוטוקולי בידוד NPC מבוססים על ניסויים עם תאים שאינם בני אדם 11,12. רק כמה פרסומים לתאר את תהליך הבידוד של האדם NPC ורוב מכסים רקשיטות הבידוד של תא בודד מקלידים 11-16. מאפייני התא החשובים ביותר כי כבר רתמו להפרדה סלולרית הם גודל, צפיפות, התנהגות-הקשר, ואת הביטוי של חלבוני פני שטח. על סמך מאפיינים אלה פתחנו פרוטוקול פשוט לבודדים PHH, KC, בקר ואת HSC, אשר פורסם בעבר בביולוגיה ניסויית ורפואת 1. בגלל העניין הרחב בטכניקה זו, המטרה של מאמר זה היא לספק פרוטוקול מפורט יותר על תהליך הבידוד כבד התא כולל וידאו, אשר יאפשר לשחזר את הטכניקה יותר בקלות. הפרוטוקול כולל גם שיטות בקרה איכות להערכת תשואה ואת הכדאיות וכן להערכת זיהוי ורמת ניקיון באמצעות immunostainings הספציפי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: כל התאים היו מבודדים מרקמת כבד אנושית הלא tumorous שנקטעה, שנשאר לאחר כריתה חלקית כבדה עם גידולים בכבדים ראשוניים או משניים. הסכמה מדעת של החולים הושגה על פי הקווים המנחים האתיים של השריטה - Universitätsmedizin ברלין.
1. הכנת חומרים ופתרונות
- לעקר את כל המכשירים ואת החומרים מראש כדי למנוע זיהום חיידקים במהלך תהליך הבידוד.
- הכן את הפתרונות הנדרשים זלוף של המדגם רקמת הכבד, את תהליך הבידוד של hepatocytes ותאי הכבד הלא parenchymal וטיפוח בתאי כבד אנושיים ראשוניים על פי לוחות 1 ו -2, עם יוצא מן הכלל של פתרון העיכול אשר מוכן טרי לפני השימוש. כל הפתרונות יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס ומומלץ להשתמש בהם בתוך 4 שבועות לאחר ההכנה.
- לְעַקֵרכל הפתרונות באמצעות מסנן העליון 0.22 מיקרומטר הבקבוק.
2. הכנת ציוד זלוף
- הגדרה לציוד עבור זלוף ועיכול המדגם הכבד הרקמות כפי שמוצג באיור 1 א.
- כוונו את הטמפרטורה באמבט מים עד 39 ° C על מנת להבטיח פעילות P collagenase אופטימלי במהלך זלוף ועיכול.
3. זלוף ועיכול מדגם רקמת כבד (1.5 שעות)
- בחר דגימת רקמה עם הקפסולה של שלמי Glisson מרקמת כבד הכריתה. כאשר חיתוך דגימת רקמה, לנסות לקבל משטח חיתוך קטן עם כלי גלוי טוב. הימנע פעמים איסכמיה חמה על ידי הובלת וטיפול המדגם הכבד רקמות על הקרח עד זלוף.
- קח את משקל הרקמה בתנאים סטריליים ולמקם המדגם כבד רקמות בצלחת פטרי בזרימת האוויר למינרית. נקו את פני השטח של דגימת רקמה עם רטייה סטרילי מן מחדשmaining דם ולשטוף את סט הצינורית באמצעות שאני זלוף-פתרון 1x על מנת להבטיח כי כל הצינורית הייתה חדירה.
- השתמש רקמות דבקות לתקן את הזיתים של קנולות בחלק כלי דם גדול. בהתאם לגודל של המדגם כבד רקמות ומספר הכלי על פני השטח, להשתמש צינורית משובצת 3 עד 8 קנולות. בדוק את זלוף ולבדוק דליפות. סגור את כל כלי הדם, אשר להדליף לי 1x זלוף-פתרון ברור, עם דבק רקמות.
- מניח את מדגם רקמת כבד cannulated לתוך המשפך ביכנר על דיסק המסנן המחורר שלה (איור 1 א).
- הגדר את קצב הזרימה של המשאבה peristaltic בין 7.5 מ"ל / דק 'ו 14.6 מ"ל / דקה תלוי במספר קנולות משומשים על התנגדות של רקמת הכבד. התאם את קצב הזרימה בכל פעם על מנת להבטיח כי קיים זלוף נוכחי אבל איטי. Perfuse הרקמה עד הדם המלא סמוק החוצה אבל לפחות 20 דקות. שים את הרקמות הופכות בהיר באזורים עם perfusi הטובעַל.
הערה: במקרים מסוימים, ייתכן שיהיה צורך לצבוט אחד קנולות עם מהדק פלסטיק או להגביר את הלחץ הפנימי של שטח על ידי דחיפת ברכות עם מרית נגד הקפסולה הכבד, כדי לייעל את זלוף. שינוי צבע מלא בצהוב בהיר לצבע חום בהיר מציין זלוף טוב. - שנה את נוזל זלוף-פתרון העיכול המכיל collagenase P (טבלה 1).
- לסדר מחדש את ההתקנה (איור 1 א) עבור שלב העיכול. לכן לבצע זרימה מעגלית של פתרון העיכול על פי איור 1B עבור עד 15 דקות.
הערה: זה קריטי להפסיק זלוף מיד כאשר המדגם הכבד רקמות מתעכל מספיק. עיכול טוב ניתן לצפות, כשאף הרקמה מראה סימן של גמישות לפי הערכה ותחזוקה של דפורמציות כמוסה, כאשר הוא דחף עם מרית.
4. בידוד של hepatocytes (1 hr)
- Tכד משאבת peristaltic ונח המדגם כבד רקמות בצלחת זכוכית. יש לשטוף את החלק החיצוני של דגימת רקמה עם פתרון-Stop קרים כקרח (טבלה 1). הסר את קנולות מהדגימה כבדת הרקמות. השתמש אזמל כדי לפתוח את המדגם כבד רקמות, על ידי חריטה באמצע האזור שבו קנולות צורפו. שמור על עצמך כי הקפסולה Glisson's נשאר ללא פגע.
- יש לשטוף את החלק הפנימי של דגימת הרקמה ולאחר מכן לכסות את דגימת הרקמה השלמה עם פתרון-Stop קר כקרח. לנער את הרקמה בעדינות כדי לשחרר את התאים מתוך הרקמה.
- אסוף את השעית התא ולסנן אותו דרך משפך מבט (משפך פלסטיק מרופד תחבושות) לתוך 50 צינורות פלסטיק מיליליטר. הוסף עוד עצור-פתרון מדגם כבד הרקמה עד נפח סופי של 500 מיליליטר הוא נצרך.
- צנטריפוגה ההשעיה התא ב 50 XG, 5 דקות, 4 ° C. איסוף supernatant בידוד תא הלא parenchymal מאוחר יותר. שטוף את התא גלול עם PBS (איור 2א).
- צנטריפוגה השעית התא שוב ב 50 XG, 5 דקות, 4 ° C. אסוף את supernatant מחדש להשעות גלולה במדיום דגירה Hepatocyte (לוח 2, תרשים 2B).
- לקבוע את המספר הסלולרי ואת כדאיות השעית התא וכתוצאה מכך באמצעות מכתים trypan הכחול. לספור את החיים תאים מתים בתא לספור נויבאואר. לחשב את מספר הסלולרי, הכדאיות ואת התשואה של PHH תוך שימוש בנוסחאות להלן.
תשואה (נספר תאים) = תאים נספר x גורם לדילול נפח x של השעיה תא (מ"ל) x 10,000
תשואה (hepatocytes / (מדגם כבד גרם רקמה)) = (תשואה (hepatocytes / (תקשורת מיליליטר)) נפח x של השעית תא (מיליליטר)) / (משקל של מדגם כבד רקמות (ז))
כדאיות (%) = 100% x (מספר תאי חיים) / (מספר תאים כולל)
5. טיהור hepatocytes (1 hr)
הערה: שלב טיהור זו מומלצת, אם את הכדאיותנמוך מ -70%.
- ביצוע כל הצעדים על הקרח. הכן שיפוע צפיפות 25% על ידי ערבוב פתרון שיפוע צפיפות 5 מ"ל ו 15 מ"ל PBS עבור צנטריפוגה שיפוע צפיפות.
- שים מקסימום של 50 תאי Mio בסך הכל מתוך השעית התא העשירה hepatocyte בזהירות ובאיטיות על גבי שכבת שיפוע צפיפות 25% על מנת להבטיח כי הפרדה ברורה של שני השכבות מושגת (איור 2 ג). שים את הצינורות בזהירות לתוך צנטריפוגות צנטריפוגות ב 1,250 XG, 20 דק ', 4 ° C ללא בלם (איור 2 ד).
- לשאוב את ההשעיה תא הנותרים ואת התאים המתים שלבי הביניים. בהתאם אחד תכולת השומן עלול גם לשאוב שיפוע-פתרון צפיפות.
הערה: PHH עם תוכן שומנים נמוך צורה כדורית צפופה ואת שיפוע הצפיפות ניתן aspirated לחלוטין. PHH עם תוכן שומנים גבוה צורה כדורית מפוזרת יותר והרבה תאי קיימא עשוי להישאר פתרון שיפוע צפיפות מעל הגלולה. - Re- להשעות את כדורי hepatocyte עם PBS ו צנטריפוגות שוב ב 50 XG, 5 דקות, 4 ° C. פינת כדורי, לשטוף שוב עם PBS מחדש להשעות PHH מטוהרים במדיום דגירה Hepatocyte. בצעו ספירת תאים כפי שמתואר בשלב 4.6.
טיפוח 6. hepatocytes
- הכן את כלי תרבית תאים עבור זריעה של PHH על ידי ציפוי אותם עם תאי מטריקס עבור קולגן זנב חולדה למשל (אני סוג קולגן). כן קולגן עכברוש הזנב לפי הפרוטוקול הוקם על ידי רג'אן et al. 17
- לדלל את מניות קולגן עכברוש זנב פתרון 1: 200 ב PBS. העברת 100 μl / 2 ס"מ חולדה פתרון הזנב קולגן לתוך תרבות מנות, מטפלת כי כל פני השטח מכוסה. דגירת פלסטיק תרבית תאים עבור 20 דקות בטמפרטורת חדר. לשאוב את פתרון קולגן זנב חולדה הנותר.
- Seed 15 x 10 4 hepatocytes / 2 ס"מ במדיום Hepatocyte דגירה על תרבות disheשעות מצופות קולגן זנב חולדה. טפחו את התאים חממה humidified על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 לפחות שעה 4. לאחר 4 שעות את hepatocytes דבק והמדיום ניתן לשנות.
- לבצע חקירות תלויות בהגדרת הניסוי. זמן תרבות של 48 שעות מומלץ לאפשר לתאים להתאושש תהליך הבידוד.
7. בידוד של תאים בכבד ללא parenchymal (1.5-2 שעות)
- צנטריפוגה supernatant אסף (שלב 4.5 ו -4.6) בשעה 72 XG, 5 דקות, 4 ° C לחסל אריתרוציטים ו hepatocytes הנותרים. פינת את supernatants צנטריפוגות אותם פעמיים כדי לקבל שני כדורי תא: 300 XG, 5 דקות, 4 ° C עבור שקיעה של HSC, LEC ובחלקו KC ו -650 XG, 7 דקות, 4 מעלות צלזיוס במשך שקיעה של הנותרים KC.
- ברכה הן כדורים מחדש להשעות אותם HBSS. כן 25% לבין מפלי צפיפות 50% על ידי פתרון שיפוע צפיפות ערבוב PBS עבור centrif שיפוע צפיפותugation (שיפוע הפתרון צפיפות 25%: 5 מ"ל פתרון מפל צפיפויות 15 מ"ל PBS, פתרון שיפוע צפיפות 50%: 10 מ"ל פתרון מפל צפיפויות 10 מ"ל PBS, ראה איור 2). מניח את פתרון שיפוע צפיפות 25% בזהירות על גבי שכבת פתרון שיפוע צפיפות 50%.
- שים את ההשעיה NPC בזהירות ובאיטיות על גבי שכבת פתרון שיפוע צפיפות 25% באופן הפרדה ברורה של שתי שכבות מושגת.
- צנטריפוגה ההשעיה תא על שיפוע צפיפות 1,800 XG, 20 דק ', 4 ° C ללא בלם (איור 2.2).
- לשאוב תאים מתים ופסולת תא מהשכבה העליונה. ה NPC ממוקם ביניים בין שכבת שיפוע צפיפות 25% ו -50% (איור 2). אסוף NPC, לשטוף אותם עם HBSS צנטריפוגות ההשעיה תא החלת השלב צנטריפוגה כפול שתואר לעיל (שלב 7.2.).
הפרדת 8. של תאי Kupffer (דבקשלב ההפרדה) (1 hr)
- בצעו ספירת תאים עבור KC בשבריר NPC כמתואר בשלב 4.6. (לקבלת מראה של KC ההשעיה לראות איור 3B). צנטריפוגה השבר NPC עם הצעד צנטריפוגה כפול שתואר לעיל (שלב 7.2) מחדש להשעות את NPC ב Kupffer תא זריעת בינוני (טבלה 2).
- זרעים חלק KC המכיל על כלי תרבית תאים פלסטיק בצפיפות של 5 x 10 5 KC / 2 ס"מ. דגירת תרבויות KC במשך 20 דקות בתוך חממת humidified על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. KC הראשי לדבוק על פלסטיק תרבית תאים בתוך פרק הזמן קצר (איור 2.3).
- אסוף את supernatant המכיל אינו דבק NPC, המורכב בעיקר של הבקר ואת HSC. פינה את supernatants להפרדה מאוחרת של בקר (ראה סעיף 9) ו HSC (ראה סעיף 10). שטוף את KC החסיד עם HBSS ולטפח אותם במדיום תרבית תאי Kupffer (לוח 2) על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 בתוך חממה humidified.
9. הפרדה לתאי אנדותל (1.5 שעות)
- צנטריפוגה supernatant אסף (שלב 8.5.) ב 300 XG, 5 דקות, 4 ° C. שטפו את הכדור עם PBS. לאחר צנטריפוגה XG ב 300, 5 דקות, 4 ° C מחדש להשעות את התאים תא stellate / בינוני ההפרדה תא האנדותל ולבצע ספירת תאים עבור כל התאים הנותרים כמתואר בשלב 4.6.
- Re- להשעות 1 x 10 7 תאים Mio ב 1 מ"ל תא stellate / בינוני ההפרדה תא האנדותל, להוסיף 20 μl פתרון חסימת מן-KIT MACS ו -20 μl של חרוזים מיקרו CD31 עבור immunolabeling דגירה ההשעיה וכתוצאה מכך במשך 15 דקות ב 4 טמפרטורת ° C (איור 2.4).
- בקר בנפרד HSC כמתואר בפרוטוקול manufacturer's עבור מערכת מיון התא המופעלת המגנטי MACS (איור 2.5). Elute מגנטית שמר LEC CD31 חיובי, ולהשהות אותם stellate Cell / בינוני תרבות תא האנדותל (טבלה 2).
- בצע תא לספור עבור בקר כמתואר בשלב 4.6. בקר זרע בצפיפות של 1.25 x 10 5 תאים / 2 סנטימטר בכלי תרבית תאים מצופים קולגן זנב חולדה (ראה שלב 6.1). טפחו את התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור humidified.
10. הפרדת תאי stellate (0.5 שעות)
- HSC ללא תווית להעביר את עמודת ההפרדה במהלך הליך MACS. אסוף את שבריר HSC (ראה שלב 9.5, איור 2.5). בצעו ספירת תאים כפי שמתואר בשלב 4.6.
- HSC זרע עם צפיפות של 5 x 10 4 תאים / 2 ס"מ בכלי תרבית תאים מצופה קולגן זנב חולדה (ראה שלב 6.1) ב תא stellate / בינוני תרבות תא האנדותל (טבלה 2) ולטפח אותם על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור humidified.
טבלה 1: זלוף פתרון בידוד.
תקשורת ותרבות ובידוד: טבלה 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ההפרדה לתוך חלק parenchymal ולא parenchymal, באמצעות צנטריפוגה שיפוע צפיפות כהליך לנקות בשילוב עם השימוש של נכסים היצמדות MACS מובילה לבידוד PHH ו NPC מוצלח. PHH ו NPC ניתן לבודד באיכות ובכמות גבוהות. איור 1 מציג את התקנת נציג וציוד זלוף והעיכול כבדים. 10% FCS נוספה P collagenase המכיל זלוף - הפתרון השני להפחית פעילות חלבונים של פרוטאזות וכדי לייצב פעילות P collagenase בתמורה. בזמנים עיכול ארוך יותר מכך נדרש לבידוד NPC ניתן ליישם אותו ללא השפעה שלילית על יכולת הקיום של PHH.
איור 1:. זלוף והתקנת עיכול צעד זלוף הראשון מתבצע יורדr להסיר דם שיורית, לחמם את רקמות ולהסיר Ca 2+ לפזר תאים תאים-חיבורים באמצעות 1x perfusions פתרון אני (PI) (א). סחרור של פתרון העיכול (DG) מבוצע עיכול של רקמת הכבד במהלך שלב זלוף II (ב).
איור 2:. פשוט ייצוג סכמטי של תהליך בידוד PHH ו NPC השלם שונה מן פייפר ואח 1, 2014 עם רשות לביולוגיה ניסויית ורפואה.. ראשית, מדגם כבד רקמת perfused ולעכל ידי טכניקת זלוף שני שלבים EGTA / collagenase P (A). השעית תא צבר היא centrifuged לראשונה לפי 50 XG, 5 דקות, 4 ° C (B), כדי להפריד את PHH-החלק הגדול יותר (גלולה) מן NPC-החלק הקטן יותר (supernatant). במקרה של הכדאיות PHH מתחת ל -70%, את החלק היחסי PHH קיימא יכול להיות מועשר על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות ב 1,250 XG, 20 דק ', 4 ° C (C) וכתוצאה מכך שיקוע של PHH בתחתית הצינור, תוך מת תאים / תא פסולת ממוקמים על גבי שכבת שיפוע צפיפות (D). supernatants שנאסף של צנטריפוגה הראשונית (1) הם centrifuged באמצעות שני צעדים: 1) 300 XG, 5 דקות, 4 ° C ו -2) 650 XG, 7 דקות, 4 ° C.. לאחר צנטריפוגה הראשונה KC ממוקם בחלקו supernatant. בהקשר זה צעד הבידוד השני הוא הכרחי. כדורי תא צבר הם אספו מחדש המרחפים HBSS. בהמשך לכך, על השעיית התא הן שכבתית בזהירות על גבי שיפוע צפיפות דו שכבתי (25% / 50%). צינורות שיפוע צפיפות השכבתיים הם centrifuged ב 1,800 XG, 20 דק ', 4 ° C (2). תאים מתים על גבי שכבת שיפוע צפיפות 25% מבוטלים. NPC הממוקם בין השלבים של% 25 ואת ד 50%שכבת צבע ensity נאספת ותקווה. שבר NPC הוא זרע על פלסטיק תרבית תאים ללא ציפוי. שימוש זמן דגירה 20 דקות (שלב הפרדה דבק) KC מופרד אוכלוסיות תאים בכבד אחרות (3). בקר ואת HSC מופרדים באמצעות-kit MACS. לכן תאי הכבד הנותרים שנאספו supernatant הם centrifuged ב 300 XG, 5 דקות, 4 ° C, מסומנים עם microbeads CD31 מצומדות (4). רק CD31 השלילי HSC להעביר את עמודת הפרדת MACS (5). מקל הבקר CD31 חיובי לעמודה. לבסוף בעמודה יוסרה המכשיר המגנטי ואת הבקר חיובי-CD31 הם eluted מתוך הטור (5). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
PHH המבודד הראה תשואה של 14.2 x 10 6 ± 6.6 x 10 6 רקמת כבד קיימא PHH / g וכן כדאיות כ -76.6 ± 4.2% (לוח 3 1). תכונות מיקרוסקופיות גלויות היו נפח ציטופלסמית גדול טיפוסי בשילוב עם טיפות שומנים בין אחת לארבעה גרעינים, (איור 3 א). גודל התא משתנה בין 20 עד 30 מיקרומטר השעיה.
KC היה בסוג התא הנפוץ ביותר בשבריר NPC. בודדנו כ 1.9 x 10 6 ± 0.2 x 10 6 רקמת כבד קיימא KC / g עם כדאיות של 92.8 ± 3.5% (לוח 3 1). KC מאוד תאים קטנים (כ -5 מיקרומטר) עם יחס הציטופלסמה / גרעין נמוך microvilli טיפוסי על פני השטח (איור 3).
לבסוף השתמשנו בטכניקה ההפרדה MACS להפריד LEC חיובית-CD31 מן CD31 שלילי הנותרים HSC. התשואה של הבקר הייתה כ 2.7 x 10 5 ± 0.1 x 10 5 ליב בקר / g קיימארקמה אה ואת הכדאיות המושגת הייתה 95.6 ± 2.8% (לוח 3 1). קריטריוני זיהוי הם granulae המרובה בגודל של כ -10 מיקרומטר השעית תא (איור 3 ג), כמו גם את צורת הציר האופיינית אחרי זמן טיפוח קצר (האיור 3G).
תהליך הבידוד הניב תשואת HSC כ -4.7 x 10 5 ± 0.2 x 10 5 קיימא כבד HSC / g (N = 8) עם כדאיות של 89.6 ± 3.8% (לוח 3 1). מיקרוסקופי מאפיינים מזוהים היו בגודל של כ -20 מיקרומטר ו מראה מגורען טיפוסי עם כמות משתנה של טיפות שומנים (איור 3D).
טבלה 3: תשואות, כדאיות טוהרת PHH המבודד NPC. שלושה תורמים שונים הוערכו. הנתונים ניתנים כמו ממוצע ± סטיית תקן. לוח זה פורסם קודם לכן פייפר et al. 1, 2014, והוא נדפס באישור לביולוגיה ניסיונית ורפואה.
לזיהוי וקביעת טוהר תרבית תאים, כל שבריר תא מבודד טופל עם נוגדנים נגד אנטיגנים ספציפיים לסוגי תאים. התאים טופלו עם נוגדנים משני ניאון וחקרו ידי מיקרוסקופ immunofluorescence. טוהר נקבע על ידי ספירת תאים מוכתמים פלורסנט חיוביים ביחס למספר הכולל התא מדמיין ידי מכתים Hoechst.
לאחר 24 שעות של PHH הטיפוח הראו צורה מצולע אופיינית ולעתים קרובות polyploidy (3E איור). PHH היו חיוביות עבור CK 18 (3I איור) והראה טוהר 92.3 ± 3.2%(לוח 3 1).
KC דבק בתוך 20 דקות על משטחי פלסטיק תרבית תאים. לאחר זמן דגירה של תאים קטנים ועגולים 24 שעות עם גרעין התא עגול בולט נצפו (איור 3F). החלבון CD68 השטח שימש לזיהוי KC (איור 3J). הטוהר של תאים חיוביים CD68 הסתכם 81.0 ± 5.4% (לוח 3 1).
למרות הפרידה MACS באמצעות תיוג CD31 במהלך הפרידה NPC עוד אפשר היה להכתים LEC מבודד עם CD31. לכן הבקר המבודד וטפח הוכתם CD31 לזיהוי וקביעת הטוהר. בנוסף הבקר הראה immunoreactivity עבור vimentin סמן תא mesenchymal (איור 3K). צפינו כ 81.0 ± 1.7% של תאים מוכתמים חיוביים (לוח 3 1). HSC עם טיפות השומנים הבולטים טיפוסי שלהם (איור 3H) התאפיינו מכתים immunofluorescence עבור GFAP (איור 3L). טוהר HSC היה 93.0 ± 1.7% (לוח 3 1).
כל שבריר תא counterstained עם סמני NPC אחרים. כל שברי התא הכילו מספר קטן של סוגי תאים מסוימים כבדים אחרים, אבל היו שליליים על סמן hepatocyte CK18 ואת CK19 סמן cholangiocyte.
. איור 3: מורפולוגיה של parenchymal אדם בתא כבד הלא parenchymal השעיה ואחרי דבקות העמודה השמאלית (A - D) מראה את אוכלוסיות תאים בכבד מבודדות השונות ישירות לאחר תהליך הבידודלאור מיקרוסקופ לעומת שלב: PHH (א), KC (B), הבקר (C), ו HSC (D). העמודה האמצעית (E - H) מציגה דימויי PHH מבודד וטיפח (E), KC (F), הבקר (G) HSC (H) לאחר 24 שעות של (מיקרוסקופ לעומת שלב) טיפוח. אפיון מבוסס Immunofluorescence של שברי תאים השונים מוצג בעמודה האחרונה: PHH הראה אותות חיוביים עבור CK18 סמן hepatocyte (אני, 24 שעות לאחר בידוד), KC היו חיוביות עבור CD68 סמן (J, 24 שעות לאחר בידוד), הבקר הראה אותות חיוביים עבור vimentin (K, 72 שעות לאחר בידוד) ו HSC היה חיובי עבור GFAP (L, 72 שעות לאחר בידוד). גרעין התא הוכתמו Hoechst; גדלה: 400X. שונה מן פייפר et al. 1, 2014 עם אישור של Experביולוגית imental ורפואה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול שפורסם מתאר טכניקה לבודדת PHH הטהור NPC, כלומר KC, HSC ו בקר, בו זמנית באיכות גבוהה וטוהרים מאותה דגימת רקמת כבד אנושית. רוב הפרסומים העוסקים isolations תא כבד מכסים רק אחד מאותם אוכלוסיות תאי 18-20 ונהלי בידוד מבוצעים עם רקמה אנושית הם נדיר (נבדק על ידי Damm et al.) 21. התאמת שיטות הוקמו עם רקמה מן החי (למשל, חולדה כבדה) כדי כבד אנושי חשף מספר הבדלים במאפייני תא בין בעלי חי אוכלוסיות תאים אנושיים. הקמת שיטת בידוד תא כבד המכסה את אוכלוסיות תאים בכבד השונות גילתה כי שילוב של רקמת הריאה, בידוד התא הלא parenchymal הוא שלב קריטי בשל ההבדל בזמן עיכול הנדרש תוצאות אופטימיזציה. בהתמודדות זו פתחנו פרוטוקול בידוד תא כבד שילוב טכניקות שונות התאמתי אתse לפרוטוקול בידוד PHH שלנו 10.
על ידי תוספת של FCS 10% אל P collagenase המכיל פתרון שני הצלחנו לצמצם את פעילות החלבונים של פרוטאזות. שינוי זה אפשר פעמי עיכול ארוכות יותר, הכרחיות להשגת מספר רב של NPC. כתוצאה מכך הצלחנו לבודד PHH וכן NPC באיכות טובה בכמות גבוהה. בידוד תא כבד מוצלח מאוד תלוי באיכות הרקמה הראשונית. הנתונים התורמים אנמנזה יכולים להשפיע על איכות התא וכמות. מניסיוננו אין קורלציה עם גורמים תורמים ספציפיים וגם צוות מנוסה מאוד ניתן להתמודד לבידוד תא מוצלח. בגלל האיכות של הרקמות התורמות נקודה קריטית, כל מהמקורות החיצוניים, אשר עלול לפגוע באיכות הרקמות, צריכים להיות ממוזערים.
רוב הגורמים הקריטיים הם פעמים חמות איסכמיה לאחר ההתערבות כירורגית פעמים איסכמיה קרות במהלך ההובלה של t הרקמותo במעבדה. בנוסף כל מקורות עבור זיהומים חיידקיים יש להימנע. זה חייב לציין שלעתים האיבר עצמו יכול להכיל זיהום חיידקי, למשל, במקרה של מחלות בדרכי המרה. צעדים קריטיים בתוך הליך הבידוד לכסות את הפעמים זלוף צעדי צנטריפוגה שיפוע צפיפות. הצעד הראשון זלוף צריך להימשך 20-30 דקות. פעמי זלוף שורטר עלולות להוביל ניתוק שלם של קשר תאי תאים וכתוצאה מכך ההתרחשות של צבירי תאי השעית התא צברה. זלוף ראשון ממושך מפחיתת כדאי תא ומשרת מתח תא עקב דלדול 2+ Ca.
צעד זלוף השני בצע לעיכול רקמת האנזימטית דורש קצת ניסיון כדי לקבוע את מידת העיכול האופטימלית עבור לקיחת החלטה על הפסקת התגובה פרוטאוליטים בנקודת הזמן הנכונה. פעמי עיכול קצרות להוביל תשואות נמוכות פעמי עיכול ממושכות לתא לחץ ניזק לתאים.מניסיוננו מסגרת הזמן בין רקמה המעוכלת ו רקמות אשר ניזוקו במהלך העיכול לעתים קרובות נמצאת בתוך חלון של 1-3 דקות. זלוף שלם ניתן יהיה להתמודד ידי הסטה את הלחץ בתוך הרקמה לתוך תחום נוסף באמצעות מלחציים לצביטה את קנולות. בנוסף הלחץ רך עם מרית כלפי דגימת רקמה מוביל שינוי זלוף רקמות. הרקמה היא דחוסה ומגביר את הלחץ הפנימי. בהמשך לכך, כלי הדם הם דחוסים גם והרדיוס שלהם פוחת. עם ירידת רדיוס, עולה ההתנגדות (חוק האגן-Poiseuille) ופתרון זלוף מעדיפים את הדרך של תחומים אחרים התנגדות perfuses לפחות. בהתאם Baccarani ועמיתים לעבודה צפינו כי רקמות fibrotic או שחמת זקוקות לתקופת עיכול ארוכה יותר מובילה להנמיך viabilities תא 22. מסיבה זו אנו ממליצים להימנע רקמות של חולים עם פיברוזיס כבד או שחמת.
הכנהטיפול ההדרגתי הצפיפות כמו גם תאי קציר מתוך ההדרגתי (ראו שלב 5 ו -7) גם לכסות שלבים קריטיים. שכבות שיפוע צפיפות השונות השעית התא צריכות להיות מועברים בצורה איטית וזהירה ליצירת interphases חדה. בנוסף יש תמיד את הסיכון לפגוע שיפוע במהלך הטיפול, במיוחד בעת שעבדה התאים. במהלך הפרדת NPC צעד ההפרדה הדבקה הוא חיוני עבור תשואות מאוחר וטוהר של כל שברי NPC. כדי להגדיל את המספר הסלולרי של אינו דבק NPC ואת טוהר KC צעד כביסה נוסף יכול להיות מועיל. פתרון הכביסה של שלב זה ונקווה עם supernatants להפרדת NPC נוספת. כדי למנוע זיהום על ידי חיידקים, פטריות או תנאים ספטית קפדנים וירוס צריכים להיות מובטחות 23.
ב התלות של אוכלוסיות תאים נדרש בפרוטוקול ניתן לשנות ומותאמים תוך דילוג על צעדים ספציפיים. לדוגמה, אם רק KC הםניתן להפחית נדרש הצעד צנטריפוגה כפול עבור שקיעה NPC לשלב צנטריפוגה השני ואת הצעדים עבור HSC והפרדה הבקר יכול להיות ירד. פעמי זלוף כוח הג'י עבור צנטריפוגה יכולים גם להיות מגוונים ב תלות של רקמות ואיכות תא. רקמה פיברוטית דורש ממושכת פעמים העיכול, ולכן יש צורך לשלוט על גמישות הרקמה בזהירות. הצטברות של טיפות שומנים ב hepatocytes שומן מפחיתה את צפיפות תאים ולכן משנה נכסי שקיעה. על פי התצפיות שלנו זה יכול להיות שימושי כדי להתאים את הכח הג'י במהלך בידוד PHH בהתאם לתוכן השומנים של PHH, כאשר כמויות PHH גבוהות נדרשות. זה חייב לציין כי כל שינוי של שלב צנטריפוגה הראשוני יהיה להשפיע לרעה על בידוד NPC מבחינת איכות וכמות. עד כה, אנו ממליצים g-כוחות בין 50 XG (hepatocytes עם תכולת שומן נמוכה) ו -150 XG (hepatocytes עם תכולת שומן גבוהה). HEPA שומן בנוסףtocytes נוטה ליצור תא גלול קומפקטי פחות לאחר צנטריפוגה שיפוע צפיפות קצירת תא הנוספת צריך להיות שונים כמתואר בשלב 5.5.
כדי לזרז את הליך הבידוד כמה צעדים ניתן לעשות בו זמנית. לדוגמה במקביל הטיהור של hepatocytes המבודד אדם שני יכול להתחיל עם בידוד NPC. בנוסף פתרונות שיפוע הצפיפות ניתן להכין מראש. אם יש יותר משתי נפשות אפילו יותר צעדים יכול להתבצע בעת ובעונה אחת.
בהשוואת פרוטוקולי בידוד תא כבד אדם אחרים התוצאות שלנו מראות תשואות תא דומות או גבוהות יותר viabilities כפי שפורסמו בעבר בביולוגיה ניסויית ורפואת 1. עבור בידוד KC Alabraba ועמיתים לעבודה הראו תוצאות בידוד עם תשואה של 2.3 x 10 6 רקמות KC / g כבד קיימא בשילוב עם כדאיות של כ -98% 13, אשר דומה(מספר תאים: 1.9 x 10 6 רקמת הכבד קיימא KC / g, הכדאיות כ -93%) תוצאות KC שלנו. רוב הנתונים בבידוד LEC שפורסמו לתאר בידודים מהאיברים כולה 15,24. גרלך ועמיתים לעבודה וכן Lalor ועמיתים לעבודה מבודדת מספרים סלולריים בין 10 3 ו 10 6 תאים / איבר 15,24. נתונים אלה לא ניתן להשוות ישירות לתא בידודים מן דגימות רקמה. עם זאת, באמצעות הפרוטוקול שלנו הראינו תשואות הבקר של 2.7 x 10 5 רקמות בקר / g כבד קיימא, אשר הן ללא ספק גדול יותר כאשר אקסטרפולציה על איבר שלם. HSC בודד עם תשואה של כ -4.7 x 10 5 רקמות HSC / g כבד קיימא ואת כדאיות כ -90%. תוצאות קיימות בהוצאת פרידמן ועמיתיו הראו חצי תשואות תא תחתונות (2.3 x 10 5 HSC / g כבד), אלא טוהר דומה (91%) 14. לגבי הפרוטוקול שלנו, תשואות תא נמוכות יכולות להיגרם על ידי זלוף ועיכול רעים עקב נמוכה או ללא זרימה 1x זלוף-solution אני עיכול-פתרון בתוך הרקמה. בנוסף בועות הגז בתוך הרקמה יכולות להפריע את זרימת תוך רקמות של 1x זלוף-פתרון אני עיכול-פתרון. במקרים אלה, זלוף ניתן לשפר על ידי הגדלת לחץ זלוף החיסול של בועות גז על ידי כיווץ קנולות יחיד ו / או בעזרת מרית דוחפת נגד דגימת הרקמה. הכדאיות הרעות הן ברוב המקרים תוצאה של מתח התא. פעמים איסכמיה ממושכת, נזק על ידי Ca 2 + דלדול proteolysis של חלבונים בממברנה צמודות לתאים, גלוי ידי blebs של הממברנה התאית. מהתצפיות שלנו תאים אלה רגישים מאוד מאמץ גזירה וברוב המקרים למות במהלך ההליך בבידוד. לסיכום, בידוד והפרדה מוצלח של תאי כבד parenchymal ולא parenchymal דורשים כי שלבים קריטיים מבוצעים בתוך מסגרת הזמן הנכונה, צעדי pipetting מבוצעים בזהירות בדרך כלל הזמן עבור בידוד התא והפרדה שלhould להישמר קצר ככל האפשר 21. חסרון של הפרוטוקול המתואר הוא שתנאי הבידוד (למשל, פעמים זלוף) לא יכולים להיות סטנדרטיים לחלוטין, אבל צריכים להיות מותאם באופן אינדיבידואלי על איכות הרקמות. בנוסף, התשואה והטוהרת של אוכלוסיות תאי צבר יכולים להשתנות בתלות באיכות רקמות תוצאת העיכול.
אנו פרסמנו לאחרונה מחקר הוכחת השפעת תנאי גידול בשילוב עם אפיון פונקציונלי של כל סוג תא NPC מבודד על ידי שיטה זו 1. האפשרות לבודדת אוכלוסיות תאים שונות נפרדות של הכבד מאפשרות יצירה של תרבויות-שיתוף תא כבד אנושי חדשניות רקמות מהונדסות במודלים כבדים במבחנה. עובדה ידועה היא כי טיפוח PHH מונו-תרבויות 2D מוביל dedifferentiation ואובדן התא פונקציות טיפוסי 7. מסיבה זו יש צורך לחקות את Archi רקמות vivo בtecture בתוך מודלים כבדים במבחנה. קוסטדינובה ועמיתים לעבודה (2013 8,9) וכן מסנר ועמיתים לעבודה (2013 8,9) הוקמו בהצלחת מודלים כבדים שיתוף התרבות תפקודיים לצורך זיהוי של תופעות hepatotoxic. עם זאת, NPC לא התאפיין ופונקציות ספציפיות לא נחקרו במערכות אלו.
לכן מחקר נוסף צריך להתמקד חקירות על ההישרדות לטווח ארוך של NPC, המאפיינים הספציפיים שלהם ואת האינטראקציות בתוך שיתוף תרבויות. ללימודים כאלה, זה גם יכול להיות עניין להקים פרוטוקול לבידוד תרמי של cholangiocytes. מימוש במבחנת שיתוף תרבויות התפקודיות כוללות כל סוגי התאים כלולים הכבד היליד יכול להיות צעד אחד קדימה לכיוון של in vivo כמו מודלים כבדים אנושיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
ברצוננו להודות ג'יה לי ליו על תמיכתם בבריאה של איור 1. מחקר זה מומן על ידי המשרד הפדרלי הגרמני לחינוך ולמחקר (BMBF) פרויקט כבד וירטואלי: 0,315,741.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| General Equipment | |||
| PIPETBOY | Eppendorf | ||
| pipettes | Eppendorf | ||
| microscope | Carl Zeiss | ||
| microscope | Olympus | ||
| CO2-incubator | Binder | ||
| Lamin Air | Heraeus | ||
| Centrifuge Varifuge 3.0R | Heraeus | ||
| Urine Beaker | Sarstedt | 2041101 | |
| perfusor syringe 50 ml | B.Braun | 12F0482022 | |
| Bottle Top Filter | Nalgene | 1058787 | |
| Falcon 50 ml Polypropylene Conical Tube | BD Biosciences | 352070 | |
| Falcon 15 ml Polypropylene Conical Tube | BD Biosciences | 352096 | |
| Tissue Culture plate | BD Biosciences | 533047 | 24 well |
| serological pipettes | BD Biosciences | 357525, 357551, 357543 | 25 ml, 10 ml, 5 ml |
| pipette tips | SARSTEDT | 0220/2278014, 0005/2242011, 0817/2222011 | 100 µl, 200 µl, 1,000 µl |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isolation Equipment | |||
| water bath | Lauda | ||
| peristaltic pump | Carl Roth | ||
| circulation thermostat | Lauda | ||
| pH meter | Schott | ||
| fine scales | Sartorius | ||
| stand | |||
| Büchner funnel | Haldenwanger | ||
| plastic funnel | |||
| silicone tube | |||
| cannulae with olive tips | |||
| glass dish | |||
| forceps | |||
| scalpel | Feather | 12068760 | |
| Neubauer counting chamber | Optic Labor | ||
| cell lifter | Costar | ||
| Surgical Drape | Charité Universitätsmedizin Berlin | A2013027 | |
| compress | Fuhrmann | 40013331 | |
| sterile surgical gloves | Gammex PF | 1203441104 | |
| Tissue glue | B. Braun | 1050052 | |
| glass bottle | VWR | ||
| Collagenase P | Roche | 13349524 | |
| Percoll Separating Solution | Biochrom | L6145 | Density 1.124 g/ml |
| Hank’s BSS | PAA | H00911-3938 | |
| Dulbecco’s PBS | PAA | H15 - 002 | without Mg/Ca |
| Ampuwa | Plastipur | 13CKP151 | |
| Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| NaCl | Merck | 1,064,041,000 | |
| KCl | Merck | 49,361,000 | |
| Hepes Pufferan | Roth | 133196836 | |
| EDTA | Sigma | E-5134 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media Equipment | |||
| DMEM | PAA | E15-005 | Low Glucose (1 g/L) (without L-Glutamine) |
| HEPES Buffer Solution 1 M | GIBCO | 1135546 | |
| L-Glutamine | GIBCO | 25030-024 | 200 mM |
| MEM NEAA | GIBCO | 11140-035 | |
| penicillin/streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | PAA | E15 - 039 | without L-Glutamine |
| Sodium Pyruvate | GIBCO | 1137663 | 100 mM |
| Trypan Blue Solution | Sigma-Aldrich | T8154 | 0.4% |
| William’s E | GIBCO | 32551-020 | |
| with GlutaMAX™ | |||
| EGTA | Sigma-Aldrich | 03780-50G | |
| Fortecortin | Merck | 49367 | 8 mg/2 ml |
| Human-Insulin | Lilly | HI0210 | 100 I.E./ml |
| N-Acetyl cysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
| Fetal calf serum (FCS) | PAA | A15-101 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment for Immunostainings | |||
| CD 68 | R&D Systems, USA | monoclonal | |
| CK 19 | Santa Cruz | D2309 | polyclonal |
| CK18 | Santa Cruz | K2105 | monoclonal |
| Vimentin | Santa Cruz | monoclonal | |
| GFAP | Sigma Aldrich | monoclonal | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 23.472-9 | |
| Goat anti-Mouse IgG1-PE | Santa Cruz | C0712 | |
| Goat anti-rabbit IgG-FITC | Santa Cruz | L0412 | |
| Methanol | J.T.Baker | 1104509006 | |
| Formaldehyde 4% | Herbeta Arzneimittel | 200-001-8 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A7906-100G |
References
- Pfeiffer, E., et al. Isolation, characterization, and cultivation of human hepatocytes and non-parenchymal liver cells. Exp Biol Med. , Maywood. (2014).
- Si-Tayeb, K., Lemaigre, F. P., Duncan, S. A.
- Alpini, G., Phillips, J. O., Vroman, B., LaRusso, N. F. Recent advances in the isolation of liver cells. Hepatology. 20 (2), 494-514 (1994).
- Godoy, P., et al. Recent advances in 2D and 3D in vitro systems using primary hepatocytes, alternative hepatocyte sources and non-parenchymal liver cells and their use in investigating mechanisms of hepatotoxicity, cell signaling and ADME. Arch Toxicol. 87 (8), 1315-1530 (2013).
- Gómez-Lechón, M. J., Castell, J. V., Donato, M. T. Hepatocytes--the choice to investigate drug metabolism and toxicity in man: in vitro variability as a reflection of in vivo. Chem Biol Interact. 168 (1), 30-50 (2007).
- Ginai, M., et al. The use of bioreactors as in vitro models in pharmaceutical research. Drug Discov Today. 18 (19-20), 922-935 (2013).
- Schyschka, L., et al. Hepatic 3D cultures but not 2D cultures preserve specific transporter activity for acetaminophen-induced hepatotoxicity. Arch Toxicol. 87 (8), 1581-1593 (2013).
- Kostadinova, R., et al. A long-term three dimensional liver co-culture system for improved prediction of clinically relevant drug-induced hepatotoxicity. Toxicol Appl Pharmacol. 268 (1), 1-16 (2013).
- Messner, S., Agarkova, I., Moritz, W., Kelm, J. M. Multi-cell type human liver microtissues for hepatotoxicity testing. Arch Toxicol. 87 (1), 209-213 (2013).
- Nussler, A. K., Nussler, N. C., Merk, V., Brulport, M., Schormann, W., Yao, P., Hengstler, J. G. The Holy Grail of Hepatocyte Culturing and Therapeutic Use. Strategies in Regenerative Medicine. Santin, M. , Springer. New York. 1-38 (2009).
- Friedman, S. L., Roll, F. J. Isolation and culture of hepatic lipocytes, Kupffer cells, and sinusoidal endothelial cells by density gradient centrifugation with Stractan. Anal Biochem. 161 (1), 207-218 (1987).
- Knook, D. L., Blansjaar, N., Sleyster, E. C. Isolation and characterization of Kupffer and endothelial cells from the rat liver. Exp Cell Res. 109 (2), 317-329 (1977).
- Alabraba, E. B., et al. A new approach to isolation and culture of human Kupffer cells. J Immunol Methods. 326 (1-2), 139-144 (2007).
- Friedman, S. L., et al. Isolated hepatic lipocytes and Kupffer cells from normal human liver: morphological and functional characteristics in primary culture. Hepatology. 15 (2), 234-243 (1992).
- Lalor, P. F., Lai, W. K., Curbishley, S. M., Shetty, S., Adams, D. H. Human hepatic sinusoidal endothelial cells can be distinguished by expression of phenotypic markers related to their specialised functions in vivo. World J Gastroenterol. 12 (34), 5429-5439 (2006).
- Lee, S. M., Schelcher, C., Demmel, M., Hauner, M., Thasler, W. E. Isolation of human hepatocytes by a two-step collagenase perfusion procedure. J Vis Exp. (79), (2013).
- Rajan, N., Habermehl, J., Coté, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat Protoc. 1 (6), 2753-2758 (2006).
- Chang, W., et al. Isolation and culture of hepatic stellate cells from mouse liver. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 46 (4), 291-298 (2014).
- Zeng, W. Q., et al. A new method to isolate and culture rat kupffer cells. PLoS One. 8 (8), e70832 (2013).
- Tokairin, T., et al. A highly specific isolation of rat sinusoidal endothelial cells by the immunomagnetic bead method using SE-1 monoclonal antibody. J Hepatol. 36 (6), 725-733 (2002).
- Damm, G., et al. Human parenchymal and non-parenchymal liver cell isolation, culture and characterization. Hepatology International. 7, 915-958 (2013).
- Baccarani, U., et al. Isolation of human hepatocytes from livers rejected for liver transplantation on a national basis: results of a 2-year experience. Liver Transpl. 9 (5), 506-512 (2003).
- Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q., Liu, M. Isolation and primary culture of rat hepatic cells. J Vis Exp. (64), (2012).
- Gerlach, J. C., et al. Large-scale isolation of sinusoidal endothelial cells from pig and human liver. J Surg Res. 100 (1), 39-45 (2001).
