Abstract
Помимо паренхимы гепатоцитов, печень состоит из не паренхимных клеток (NPC), а именно Купфера клетки (KC), печень эндотелиальные клетки (LEC) и звездчатые клетки печени (HSC). Двумерная (2D) культуры первичных человеческих гепатоцитов (ФН) до сих пор считается «золотым стандартом» для тестирования в пробирке метаболизма лекарственных средств и гепатотоксичности. Хорошо известно, что 2D монокультуры ФН страдает от дифференцировке и потерей функции. Недавно было показано, что печеночная NPC играют центральную роль в печени (патологической физиологии) и поддержание функций ФН. В настоящее время исследование фокусируется на реконструкции естественных условиях тканевой архитектуры в 3D- и по совместной культуре моделей , чтобы преодолеть ограничения 2D монокультур. Ранее мы опубликовали способ выделения клеток печени человека и исследовали пригодность этих клеток для их использования в культурах клеток в экспериментальной биологии и медицины 1. На основе широкого интереса к этому тэchnique цель этой статьи заключалась в обеспечении более подробный протокол для процесса выделения клеток печени, включая видео, что позволит легко воспроизведение этой техники.
Клетки печени человека были выделены из образцов ткани печени человека хирургических вмешательств с помощью двухступенчатого EGTA / коллагеназы техники Р перфузионного. PHH были отделены от NPC начальным центрифугированием при 50 х г. были использованы в градиенте плотности стадии центрифугирования для удаления мертвых клеток. популяции клеток печени Индивидуальные были выделены из обогащенном NPC фракции с использованием специфических свойств ячеек и сортировка клеток процедур. Помимо изоляции PHH мы смогли отделить KC, LEC и HSC для дальнейшего выращивания.
Взятые вместе, представленный протокол позволяет изоляции ФН и NPC в высоком качестве и количестве от одного донора образца ткани. Доступ к очищенным популяций клеток печени может позволить создать в естественных условиях , как человека Liвер моделей.
Introduction
ткань печени человек очень сложна и состоит из двух различных сущностей клеток, паренхимных клеток и не-паренхиматозных клеток (NPC). клетки печени паренхиматозных включают гепатоциты и холангиоцитов. Гепатоцитов представляют от 60 до 70% от общего количества клеток печени и составляют большую часть метаболических функций печени, например, желчные кислоты и дополняют синтез фактора, биотрансформации и энергетический метаболизм 2,3.
Чем меньше фракция NPC составляет 30-40% от общего количества клеток печени. NPC включают в себя различные клеточные популяции, а именно клетки Купфера (KC), печеночная эндотелиальные клетки (LEC) и звездчатых клеток печени (HSC). Эта гетерогенная фракция клеток играет центральную роль в физиологических процессах печени. Кроме того, NPC участвует в опосредовании острого повреждения печени, например, вызванный лекарственными средствами поражения печени (ДИЛИ), а также в хронических повреждений печени, такие как цирроз печени 4.
В последние годы, чУмань клетки печени становятся все более и более важное значение в области исследований и разработки, тестирования на наркотики разработки лекарственных средств и выявление новых биохимических путей, при заболеваниях печени. Для тестирования в пробирке ФН монокультуры по - прежнему считаются «золотым стандартом» 5. Основное ограничение тока гомотипических моделей печени является дедифференцировка и потеря функции гепатоцитов в течение нескольких дней 4. Создание 3-мерных технологий (3D) культуры показал , что эти ограничения могут быть компенсированы 4,6. Тем не менее, даже современные 3D технологии культуры не в состоянии отобразить все режимы гепатотоксических действий 7. Недостающие популяции NPC в существующих моделях в пробирке рассматриваются как возможная причина этого несоответствия ситуации в естественных условиях. Было показано, что связь между клетками между различными популяциями клеток печени играет центральную роль в гомеостазе физиологическом, но и в pathophysiologic обрабатывает 8. Поэтому научное внимание уделяет больше и больше на NPC и их межклеточных взаимодействий. Их целенаправленное использование в совместной культуре и тканевой инженерии систем может быть решением для высокого спроса на модели 8,9 печени в пробирке , которые как можно ближе к ситуации в естественных условиях , как это возможно.
В настоящее время основной задачей является разработка стандартной модели печени совместно культуры человека, которая содержит четко определенные участки ФН и NPC. В результате, методы изоляции для очень гетерогенные клеток печени необходимы, и те должны быть оптимизированы, чтобы получить чистые популяции клеток. В то время как стандартные протоколы для PHH изоляции существуют 10, стандартизированная изоляция человека NPC еще находится в стадии разработки. Большинство опубликованных протоколов изоляции NPC основаны на экспериментах с клетками нечеловеческих 11,12. Лишь немногие публикации описывают процесс изоляции человека NPC и наиболее охватывает толькометоды выделения одной ячейки типа 11-16. Наиболее важные клеточные характеристики, которые были впряженные для разделения клеток являются размер, плотность, поведение привязанности, и экспрессии поверхностных белков. На основе этих характеристик мы разработали упрощенную протокол для выделения ФН, KC, LEC и HSC, которая была опубликована ранее в экспериментальной биологии и медицины 1. Из-за широкого интереса к этой технике, цель этой статьи заключалась в обеспечении более подробный протокол для процесса выделения клеток печени, включая видео, которое позволит воспроизводить технику более легко. Протокол также включает в себя методы контроля качества для оценки урожайности и жизнеспособности, а также для выявления и оценки степени чистоты с использованием специфических immunostainings.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Все клетки были выделены из резецированным неопухолевой человеческой ткани печени, которая осталась после частичной резекции печени с первичными или вторичными опухолей печени. Информированное согласие пациентов было получено в соответствии с этическими принципами Шарите - Universitätsmedizin Берлин.
1. Подготовка материалов и решений
- Стерилизовать все инструменты и материалы заранее, чтобы избежать бактериального загрязнения в процессе выделения.
- Готовят растворы , необходимые для перфузии образца ткани печени, процессе выделения гепатоцитов и не-паренхиматозных клеток печени и культивирование первичных клеток печени человека в соответствии с таблицами 1 и 2, за исключением переваривания раствором , который получают свеже Перед использованием. Все растворы можно хранить при температуре 4 ° С, и рекомендуется использовать их в течение 4-х недель после приготовления.
- стерилизоватьвсе решения с использованием бутылки 0,22 мкм верхний фильтр.
2. Подготовка Perfusion оборудования
- Установить оборудование для перфузии и переваривания образца ткани печени , как показано на рисунке 1А.
- Отрегулируйте температуру водяной бане до 39 ° С для обеспечения оптимальной активности P коллагеназы в течение перфузии и пищеварения.
3. Кровоснабжение и переваривание ткани печени образца (1,5 ч)
- Выберите образец ткани с капсулы интактной Глиссон в из резекцию ткани печени. При резке образца ткани, попытаться получить небольшую режущую поверхность с хорошими видимых сосудов. Избегайте теплых раз с ишемией по транспортировке и обращению образца ткани печени на льду до перфузии.
- Возьмите вес ткани в стерильных условиях и поместить образец ткани печени в чашке Петри в ламинарном потоке воздуха. Очистите поверхность образца ткани со стерильным компрессом от повторногокровь и остальной ее промывать набор с помощью полой иглы 1x-перфузии решение, которое я, чтобы убедиться, что все канюлю были проницаемыми.
- Используйте клей ткани, чтобы исправить маслины канюли в некоторых крупных кровеносных сосудов. В зависимости от размера образца ткани печени, и количество сосудов на поверхности, используют канюлю набор с 3-х до 8 канюль. Проверьте перфузию и проверить на герметичность. Закройте все кровеносные сосуды, которые просачиваются ясный 1x перфузии-решение, которое я, с клеем ткани.
- Поместите каннюлирован образец ткани печени в воронку Бюхнера на его перфорированного фильтра диска (рис 1А).
- Установка скорости потока перистальтического насоса от 7,5 мл / мин и 14,6 мл / мин, в зависимости от количества используемых канюль и на сопротивление ткани печени. Регулировка скорости потока каждый раз, чтобы убедиться, что в настоящее время существует, но медленно перфузия. Заливать ткани, пока вся кровь не смывается, но по крайней мере, 20 мин. Обратите внимание на ткани становятся ярче в районах с хорошими perfusiна.
Примечание: В некоторых случаях может оказаться необходимым, чтобы зажать один из канюль с пластиковыми зажимами или увеличить внутреннее давление в зоне путем мягко толкая шпателем против капсулы печени, для оптимизации перфузию. Полное изменение цвета в виде светло-желтого до светло-коричневого цвета указывает на хорошую перфузию. - Изменение перфузионной жидкости к перевариванию-раствора , содержащего коллагеназы P (таблица 1).
- Перестановка установки (рисунок 1А) для стадии пищеварения. Поэтому выполнить круговой поток Пищеварение-раствора согласно фигуре 1В до 15 мин.
Примечание: Очень важно, чтобы немедленно остановить перфузии, когда образец ткани печени достаточно переваривается. Хорошее пищеварение можно наблюдать, когда ткань не проявляет никаких признаков эластичности по оценке содержания капсулы деформаций, когда она выталкивается с помощью шпателя.
4. Выделение гепатоцитов (1 час)
- Tурну перистальтический насос и поместить образец ткани печени в стеклянной посуде. Промыть наружную поверхность образца ткани охлажденным льдом Стоп-раствор (таблица 1). Удалите канюль из образца ткани печени. Используйте скальпель, чтобы открыть образец ткани печени, путем надреза в середине области, где были прикреплены Канюли. Держите уход, что капсула Glisson's остается неповрежденным.
- Промыть внутреннюю часть образца ткани, а затем покрывают образец цельной ткани ледяным Стоп-раствор. Встряхните ткань осторожно, чтобы освободить клетки из ткани.
- Сбор клеточной суспензии и фильтруют ее через воронку (взгляд пластиковой воронки выровненной с марлевым компрессом) в 50 мл пластиковых труб. Добавить еще Стоп-раствор для образца ткани печени до конечного объема 500 мл не расходуется.
- Центрифуга клеточной суспензии при 50 мкг, 5 мин, 4 ° C. Соберите супернатант для последующего без паренхимы выделения клеток. Промыть осадок клеток с PBS (рис 2А).
- Центрифуга клеточной суспензии снова при 50 мкг, 5 мин, 4 ° C. Соберите супернатант и повторно приостанавливать осадок в гепатоцитов инкубационной среде (таблица 2, рис 2B).
- Определить количество клеток и их жизнеспособность в полученной суспензии клеток с использованием окрашивания трипановым синим. Количество живых и мертвых клеток в счетной камере Neubauer. Подсчитайте количество клеток, жизнеспособность и выход ФН, используя приведенные ниже формулы.
выход (подсчитывали клетки) = подсчитаны клетки х коэффициент разбавления х объем клеточной суспензии (мл) х 10000
выход (гепатоциты / (г печени образец ткани)) = (выход (гепатоциты / (мл среды)) х Объем клеточной суспензии (мл)) / (вес образца ткани печени (г))
Жизнеспособность (%) = 100% х (число живых клеток) / (общее число клеток)
5. Очистка гепатоцитов (1 час)
Примечание: Эта стадия очистки рекомендуется, если жизнеспособностьниже, чем на 70%.
- Выполните все шаги на льду. Готовят градиент плотности на 25% путем смешивания 5 мл раствора в градиенте плотности и 15 мл PBS для центрифугирования в градиенте плотности.
- Поместите максимум 50 Mio клеток в общей сложности из гепатоцитов богатых клеточной суспензии осторожно и медленно на вершине 25% слоя с градиентом плотности , чтобы гарантировать , что четкое разделение обоих слоев достигается (фиг.2С). Поместите пробирки осторожно в центрифугу и центрифугируют при 1250 х г , 20 мин, 4 ° C без тормоза (рис 2D).
- Аспирируйте оставшейся суспензии клеток и мертвых клеток в интерфазе. В зависимости от содержания жира можно также аспирация плотности градиентной раствора.
Примечание: PHH с низким содержанием липидов образуют плотный осадок и градиент плотности пунктируются полностью. PHH с высоким содержанием липидов образуют более диффузный гранулы и много жизнеспособных клеток может оставаться в растворе в градиенте плотности над осадком. - Повторное приостановить гепатоцитов окатышей с PBS и центрифугировать снова при 50 мкг, 5 мин, 4 ° C. Бассейн гранулы, мыть снова PBS и повторно приостанавливать очищенный PHH в гепатоцитов инкубационной среде. Выполнение подсчета клеток, как описано на стадии 4.6.
6. Выращивание гепатоцитов
- Готовят блюда клеточной культуры для посева ФН путем покрытия их с внеклеточного матрикса, например, крысы хвост коллагена (коллаген типа I). Подготовьте крысиный хвост коллагена в соответствии с протоколом , установленным Rajan и др. 17
- Развести крысиного хвоста коллагена маточного раствора 1: 200 в PBS. Передача 100 мкл / см 2 раствор крысиного хвоста коллагена в блюда культуры, следя за тем, что покрыта вся поверхность. Инкубируйте пластмасс клеточной культуры в течение 20 мин при комнатной температуре. Аспирируйте оставшуюся крысиный хвост раствора коллагена.
- Семенной 15 х 10 4 гепатоциты / см 2 в гепатоцитов инкубационной среде на культуре disheы покрыты крысиный хвост коллагена. Культивировать клетки в увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° С в атмосфере 5% СО 2 в течение по меньшей мере 4 ч. Через 4 часа гепатоциты присоединились, и среда может быть изменена.
- Выполнение исследований в зависимости от экспериментальной установки. Время культуры 48 часов рекомендуется, чтобы позволить клеткам восстановиться от процесса выделения.
7. Выделение клеток печени Non-паренхимы (1,5-2 ч)
- Центрифуга собранный супернатант (шаг 4,5 и 4,6) при 72 мкг, 5 мин, 4 ° C, чтобы устранить оставшиеся эритроцитах и гепатоцитах. Объединяют супернатанты и центрифугировать их дважды, чтобы получить две клеточные гранулы: 300 XG, 5 мин, 4 ° С для осаждения HSC, LEC и частично KC и 650 мкг, 7 мин, 4 ° С для осаждения оставшегося KC.
- Бассейн как гранулы и повторно приостанавливать их в HBSS. Приготовьте 25% и градиенты 50% плотности путем смешивания раствора с градиентом плотности и PBS для градиента плотности Центробежнаяugation (25% раствор градиента плотности: 5 мл плотности раствора градиент и 15 мл PBS, 50% -ный раствор градиента плотности: раствор градиента плотности 10 мл и 10 мл PBS, смотри Рисунок 2). Поместите 25% раствор градиента плотности тщательно поверх слоя раствора в градиенте плотности на 50%.
- Помещенный подвеску NPC осторожно и медленно поверх слоя раствора в градиенте плотности на 25% таким образом, что четкое разделение обоих слоев достигается.
- Центрифуга клеточной суспензии на градиенте плотности при 1800 х г , 20 мин, 4 ° C без тормоза (рисунок 2.2).
- Отберите мертвые клетки и клеточные осколки от самого верхнего слоя. NPC находятся в интерфазе между слоем с градиентом плотности на 25% и 50% (рисунок 2). Сбор NPC, моют их с HBSS и центрифуге суспензии клеток, применяя описанный выше двойной стадии центрифугирования (этап 7.2.).
8. Разделение клеток Купфера (ПриверженностьРазделение Шаг) (1 час)
- Выполнить подсчет клеток для KC во фракции NPC, как описано на стадии 4.6. (Для появления KC в суспензии рис 3B). Центрифуга фракция NPC , с описанной выше двойной стадии центрифугирования (этап 7.2) и ресуспендируйте NPC в Купфера посева клеток среду (таблица 2).
- Семя KC фракцию , содержащую на пластиковой емкости для культивирования клеток при плотности 5 × 10 5 KC / см 2. Инкубацию культуры KC в течение 20 мин в увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° С, 5% СО 2. Первичный КЦ прилипать на клеточной культуре пластмасс в течение короткого периода времени (рисунок 2.3).
- Соберите супернатант, содержащий не приклеенный NPC, состоящие в основном из LEC и ГСК. Объединяют супернатанты для последующего разделения LEC (смотри раздел 9) и HSC (смотрите раздел 10). Промыть прилипшие KC с HBSS и культивируют их в купферовских среде для культивирования клеток (таблица 2) при 37 ° C, 5% CO2 в увлажненном инкубаторе.
9. Разделение эндотелиальных клеток (1,5 ч)
- Центрифуга собранный супернатант (шаг 8,5.) При 300 х г, 5 мин, 4 ° C. Вымойте гранул с PBS. После центрифугирования при 300 х г, 5 мин, 4 ° С вновь приостановить клетки в звездчатых Cell / эндотелиальной среде разделения клеток и выполнять подсчет клеток для всех остальных клеток, как описано на стадии 4.6.
- Повторное приостановить 1 × 10 7 Mio клеток в 1 мл Stellate клеток / Эндотелиальная среднего разделения клеток, добавляют 20 мкл блокирующего раствора из MACS-KIT и 20 мкл CD31 микрошарики для иммунноокрашивания и инкубировать полученную суспензию в течение 15 мин при 4 ° C температура (Рисунок 2.4).
- Отдельные LEC из ГСК , как описано в протоколе постав для магнитно - активированной клеточной сортировки системы MACS (рисунок 2.5). Элюции магнитно-удерживаемой CD31-положительных LEC и приостановить их в звездчатые CELL / эндотелиальной клеточной культуральной среды (таблица 2).
- Выполните ячейку подсчета для LEC, как описано в пункте 4.6. Семенной LEC при плотности 1,25 х 10 5 клеток / см 2 в культуре клеток сосудов , покрытых коллагеном хвоста крыс (этап 6.1). Выращивают клетки при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2 в увлажненном инкубаторе.
10. Разделение звездчатых клеток (0,5 ч)
- Немеченому HSC проходят колонны разделения во время процедуры MACS. Собирают фракцию HSC (см шаг 9.5, рисунок 2.5). Выполнение подсчета клеток, как описано на стадии 4.6.
- Семенной ГСК с плотностью 5 х 10 4 клеток / см 2 в культуре клеток сосудов , покрытых крысиного хвоста коллагена (этап 6.1) в звездчатые Cell / эндотелиальных клеток культуральной среды (таблица 2) и культивируют их при температуре 37 ° С, 5% СО 2 в увлажненном инкубаторе.
Таблица 1: Перфузия и решение изоляции.
Таблица 2: Культура и изолирующие средства массовой информации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Разделение в паренхимы и не паренхимы фракции, с использованием центрифугирования в градиенте плотности в качестве очищающей процедуры в сочетании с использованием свойств адгезии и MACS приводит к успешному PHH и NPC изоляции. PHH и NPC могут быть выделены в высоком качестве и количестве. На рисунке 1 показана репрезентативную настройку оборудования для перфузии печени и пищеварения. 10% FCS, добавляли к коллагеназы P, содержащей перфузии - Раствор II для снижения протеолитической активности протеаз и стабилизации P активности коллагеназы в ответ. В результате более длительное время пищеварения, необходимых для NPC изоляции может быть применен без негативного влияния на жизнеспособность ФН.
Рисунок 1:. Перфузию и настройка переваривание Первый шаг перфузия осуществляется в Ordeг , чтобы удалить остатки крови, разогревают ткани и удалить Ca 2+ , чтобы растворить межклеточных-соединения с помощью 1x перфузий Раствор I (PI) (A). Рециркуляция Пищеварение-Solution (DG) выполняется для переваривания ткани печени во время перфузионной стадии II (В).
Рис . 2: Упрощенная схематическое представление полного процесса выделения PHH и NPC Измененный Пфайфер и др 1, 2014 г. с разрешения экспериментальной биологии и медицины.. Во- первых, образец ткани печени перфузию и переваривают с помощью двухступенчатого EGTA / коллагеназы техники Р перфузионного (А). Приобретенный клеточную суспензию центрифугировали сначала при 50 мкг, 5 мин, 4 ° С (В), чтобы отделить большую ФН-фракции (осадок) от меньшего НФК-фракции (supernatant). В случае жизнеспособности PHH ниже 70%, жизнеспособный PHH фракция может быть обогащен центрифугированием в градиенте плотности при 1250 х г , 20 мин, 4 ° С (С) , что приводит к проседание ФН в нижней части трубы, в то время как мертвый клетки клеточных остатков / расположены на верхней части градиента плотности слоя (D). Накопленные супернатанты первоначального центрифугирования (1) центрифугируют с использованием двух шагов: 1) 300 XG, 5 мин, 4 ° С и 2) 650 XG, 7 мин, 4 ° C. После первого центрифугирования KC частично расположены в надосадочной жидкости. В этом контексте второй стадии выделения необходимо. Приобретенный клеточный осадок собирают и повторно суспендируют в HBSS. Затем клеточную суспензию тщательно слой поверх градиента плотности двухслойный (25% / 50%). Слоистые градиент плотности Пробирки центрифугируют при 1800 х г, 20 мин, 4 ° С (2). Мертвые клетки на верхней части 25% слоя с градиентом плотности отбрасываются. NPC расположен между интерфазы 25% и 50% Density градиентный слой собирают и объединяют. Фракция NPC высевают на непокрытых пластиков клеточных культур. С помощью 20-минутную инкубацию (прилипание стадия разделения) KC отделены от других популяций клеток печени (3). LEC и HSC отделены друг от друга с помощью MACS-набора. Поэтому собранные оставшиеся клетки печени в супернатант центрифугируют при 300 х г, 5 мин, 4 ° С, и помечены с CD31-конъюгированные микрошарики (4). Только CD31-отрицательные HSC проходят колонны разделения MACS (5). CD31-положительная LEC прилипает к колонке. Наконец столбец удаляется из магнитного устройства и CD31-положительных LEC вымываются из колонки (5). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Выделенную PHH показал выход 14,2 х 10 6 ± 6,6 × 10 6 жизнеспособных PHH / г ткани печени и жизнеспособность около 760,6 ± 4,2% (Таблица 3 1). Микроскопически видны черты были типичной большой цитоплазматический объем в сочетании с липидных капель и от одного до четырех ядер, (рис 3А). Размер ячейки колеблется от 20 до 30 мкм в виде суспензии.
KC были наиболее распространенным типом клеток во фракции NPC. Мы выделили около 1,9 × 10 6 ± 0,2 × 10 6 жизнеспособными KC / г ткани печени с жизнеспособностью 92,8 ± 3,5% (таблица 3 1). KC очень маленькие клетки (около 5 мкм) с низким отношением цитоплазма / ядра и типичной микроворсинок на поверхности (рис 3B).
Наконец, мы использовали технику разделения MACS, чтобы отделить CD31-положительных LEC из оставшегося CD31-негативных HSC. Выход LEC составлял примерно 2,7 х 10 5 ± 0,1 × 10 5 жизнеспособными LEC / г Livэр ткани и достигаемому жизнеспособность была 95,6 ± 2,8% (Таблица 3 1). Критерии идентификации являются многократный Granulae и размер около 10 мкм в клеточной суспензии (рис 3C), а также характерной формы шпинделя через короткий промежуток времени культивирования (рис 3G).
Процесс изоляции привело к выходу HSC около 4,7 х 10 5 ± 0,2 х 10 5 жизнеспособных HSC / г печени (N = 8) с жизнеспособностью 89,6 ± 3,8% (таблица 3 1). Микроскопически идентифицируемые характеристики были размером около 20 мкм и типичный внешний вид гранулируют с различным количеством капелек липидов (рис 3D).
Таблица 3: Урожайность, жизнеспособность и чистота изолированной ФН и NPC. Оценивались три различных доноров. Данные приведены в виде среднего значения ± SD. Эта таблица была опубликована ранее в Пфайфер и соавт. 1, 2014 и перепечатано с разрешения экспериментальной биологии и медицины.
Для идентификации и определения чистоты клеточной культуры, каждая изолированная клетка фракцию обрабатывают с антителами против специфических антигенов типа клеток. Клетки обрабатывали с помощью флуоресцентных вторичными антителами, и исследовали с помощью иммунофлюоресценции микроскопии. Чистоту определяли путем подсчета положительных флуоресцентных окрашенных клеток по отношению к общему числу клеток визуализировали с помощью Hoechst окрашивания.
После 24 ч культивирования ФН показал характерную полигональную форму и часто полиплоидии (рисунок 3e). PHH были положительными для CK 18 (рис 3I) и показывает чистоту 92,3 ± 3,2%(Таблица 3 1).
KC придерживалась в течение 20 мин на клеточной культуре пластиковых поверхностей. После того, как наблюдалось времени инкубации 24 ч маленьких круглых клеток с выпуклым круглым ядром клетки (рис 3F). Поверхностный белок CD68 использовали для идентификации KC (рис 3J). Чистота CD68 - положительных клеток составила 81,0 ± 5,4% (таблица 3 1).
Несмотря на разделение MACS с использованием маркировки CD31 во время разделения NPC еще можно было окрасить изолированное LEC с CD31. Поэтому выделяют и культивируют LEC окрашивали CD31 для идентификации и определения чистоты. Кроме LEC показали иммунореактивность для мезенхимальных клеток маркера виментину (рис 3K). Мы наблюдали приблизительно 81,0 ± 1,7% положительных окрашенных клеток (таблица 3 1). HSC с их типичными известных липидных капель (рис 3H) были отмечены иммунофлуоресценции окрашивания для GFAP (рис 3 л). Чистота ГСК была 93,0 ± 1,7% (Таблица 3 1).
Каждая клетка фракцию контрастно с другими маркерами NPC. Все фракции клеточных содержали небольшое количество других специфических типов клеток печени, но были отрицательными для гепатоцитов маркера CK18 и cholangiocyte маркера CK19.
. Рисунок 3: Морфология человека паренхимы и не-паренхиматозных клеток печени в виде суспензии , так и после соблюдения В левой колонке (А - Д) показывает различные группы населения , не клетки печени непосредственно после процесса выделенияв фазовом зрения контрастной микроскопии: ФН (A), KC (В), LEC (С), и ГСК (D). В средней колонке (Е - Н) представляет образы изолированном и культивируемого ФН (E), KC (F), LEC (G) и ГСК (H) после 24 ч культивации (фазово - контрастной микроскопии). Иммунофлуоресценции на основе характеристики различных фракций клеток показано в последнем столбце: ПГГ показали положительные сигналы для гепатоцитов маркера CK18 (I, 24 ч после выделения), KC были положительными для маркера CD68 (J, 24 ч после выделения), LEC показали положительные сигналы для виментину (к, 72 ч после выделения) и ГСК были положительными на GFAP (L, 72 ч после выделения). Ядра клеток окрашивали Hoechst; увеличение: 400X. Измененный Пфайфер и др. , 1, 2014 г. с разрешения EXPERментальные биологии и медицины. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Опубликованный протокол описывает метод для выделения чистого ФН и NPC, а именно KC, HSC и LEC, одновременно с высоким качеством и чистотой из того же образца ткани печени человека. Большинство публикаций , посвященных клеток печени выделениями охватывают только один из этих клеточных популяций 18-20 и изоляции процедур , выполненных с человеческими тканями являются редкими (обзор Дамм и др.) 21. Адаптация методов , созданных с животной ткани (например, печени крысы) в печени человека было выявлено несколько различий в свойствах ячейки между животным и клеточных популяций человека. Установление последовательности операций способа выделения клеток печени, охватывающей различные клеточные популяции печени показало, что комбинирование выделение клеток паренхимы и не паренхиматозные является важным шагом из-за разницы во времени, необходимого для переваривания оптимизированных результатов. Столкнувшись с этой проблемой, мы разработали протокол выделения клеток печени, комбинируя различные методы и адаптированасе к нашему протоколу изоляции PHH 10.
При добавлении 10% FCS до коллагеназы P, содержащую раствор II, мы смогли снизить протеолитическую активность протеаз. Эта модификация позволила более длительное время пищеварения, необходимые для получения высокого числа NPC. В результате мы смогли изолировать ФН, а также NPC хорошего качества и в высоком количестве. Успешная изоляция клеток печени в значительной степени зависит от качества исходной ткани. Данные доноров и анамнез может влиять на качество и количество клеток. Исходя из нашего опыта нет никакой корреляции с донорскими специфических факторов, а также очень опытный персонал может быть обращен к изоляции безуспешной клеток. Поскольку качество донорской ткани является критической точкой, все внешние источники, которые могут ухудшить качество ткани, должны быть сведены к минимуму.
Большинство критических факторов теплые времена ишемия после хирургического вмешательства и холодное время ишемии во время транспортировки ткани то лаборатории. Кроме того, источники бактериальных инфекций следует избегать. Следует отметить , что иногда сам орган может содержать бактериальное загрязнение, например, при заболеваниях желчных путей. Критические шаги в рамках процедуры выделения покрытия раз перфузию и стадии центрифугирования с градиентом плотности. Первый шаг перфузия должна длиться 20-30 мин. Более короткое время перфузионные может привести к неполному отсоединении контактов межклеточных что приводит к возникновению кластеров клеток в полученной суспензии клеток. Длительная первый перфузия уменьшает жизнеспособность клеток и индуцирует клеточный стресс из - за истощения Ca 2+.
Второй этап перфузия выполняется для переваривания ферментативной ткани требует некоторого опыта, чтобы определить оптимальную степень переваривания для принятия решения об остановке протеолитических реакций в нужный момент времени. Короткое время пищеварения приводит к низкой урожайности и длительного времени переваривания, чтобы клеточный стресс и повреждение клеток.Исходя из нашего опыта временные рамки между непереваренной ткани и поврежденной ткани во время пищеварения часто лежит в пределах окна 1-3 мин. Неполным перфузия можно противопоставить сдвигая давление внутри ткани в другой области с помощью зажимов для отщипывая канюль. Кроме того мягкое давление с помощью шпателя к образцу ткани приводит к изменению в тканевую перфузию. Ткань сжимается и увеличивается внутреннее давление. Впоследствии, кровеносные сосуды сжимаются и их радиус уменьшается. С уменьшением радиуса, сопротивление возрастает (Хаген-Пуазейля закона) и решение перфузия предпочитает путь наименьшего сопротивления и perfuses других областей. В соответствии с Baccarani и сотрудниками , мы наблюдали , что фиброзный или циррозом ткани необходим более длительный период переваривание приводит к снижению клеток viabilities 22. По этой причине мы рекомендуем, чтобы избежать ткани пациентов с фиброзом печени или цирроза печени.
Подготовка иобработка градиентов плотности, а также сбора клеток из градиентов (см шаг 5 и 7) также охватывают важные шаги. Различные слои градиента плотности и суспензии клеток должны быть переданы в медленной и осторожной манере для создания резких межфазных. Кроме того, всегда есть риск повредить градиент во время обработки, особенно в то время как сбор клеток. Во время разделения NPC стадии разделения приверженность имеет решающее значение для последующих выходов и чистоты всех фракций NPC. Для увеличения числа клеток не приклеена NPC и чистоту KC дополнительный этап промывки может быть полезным. Моющий раствор этого шага объединяют с супернатантах для дальнейшего разделения NPC. Для того, чтобы избежать заражения бактериями, грибами или вирусом строгие асептические условия должны быть обеспечены 23.
В зависимости от требуемых клеточных популяций протокол может быть изменен и корректироваться, пропуская конкретные шаги. Например, если только КС являютсятребуется двойной шаг центрифугирования для осаждения NPC может быть уменьшено до второй стадии центрифугирования и шаги для ГСК и LEC разделения можно опустить. раз перфузию и г-силы для центрифугирования также можно варьировать в зависимости от ткани и качества клеток. Фиброзной ткани требует длительного времени пищеварение, поэтому существует необходимость тщательно контролировать эластичность тканей. Накопление липидных капель в жировых гепатоцитов уменьшает плотность клеток и, следовательно, изменяет свойства седиментации. По нашим наблюдениям, это может быть полезно для настройки G-силы во время PHH изоляции в зависимости от содержания липидов в ФН, когда требуются большие количества ФН. Следует отметить, что любые изменения начальной стадии центрифугирования окажет негативное влияние на изоляцию NPC с точки зрения качества и количества. До сих пор, мы рекомендуем G-силы в диапазоне от 50 мкг (гепатоцитов с низким содержанием жира) и 150 мкг (гепатоцитов с высоким содержанием жира). Кроме жирных HEPAtocytes имеют тенденцию образовывать менее компактный осадок клеток после центрифугирования в градиенте плотности и сбор дальнейшей клеток должен быть изменен, как это описано в шаге 5.5.
Для ускорения процедуры выделения некоторые шаги можно сделать одновременно. Например, параллельно с очисткой изолированных гепатоцитов второй человек может начинаться с выделения NPC. Кроме того растворы градиент плотности могут быть подготовлены заранее. Если есть более двух человек даже больше шагов могут быть выполнены одновременно.
По сравнению с другими протоколами выделения клеток печени человека наши результаты показывают , что аналогичные или более высокие урожаи и viabilities клеток, опубликованной ранее экспериментальной биологии и медицины 1. Для KC изоляции Alabraba и его коллеги продемонстрировали результаты изоляции с выходом 2,3 × 10 6 жизнеспособных KC / г ткани печени в сочетании с жизнеспособность около 98% 13, которые сопоставимы снаш KC (номер ячейки: 1,9 × 10 6 жизнеспособными KC / г ткани печени, жизнеспособность около 93%) результаты. Большинство опубликованных данных LEC изоляции описывают обособления от целых органов 15,24. Герлах и его коллеги, а также Lalor и его коллеги изолированных числа клеток между 10 3 и 10 6 клеток / органа 15,24. Эти данные нельзя сравнивать непосредственно к ячейке изоляций из образцов ткани. Тем не менее, с помощью нашего протокола мы показали доходность для LEC 2,7 х 10 5 жизнеспособных / г ткани печени LEC, которые намного больше , когда экстраполируется на весь орган. HSC выделяли с выходом около 4,7 × 10 5 жизнеспособных / г ткани печени HSC и жизнеспособность около 90%. Существующие результаты , опубликованные Фридмана и его коллег показали половину снижение урожайности клеток (2,3 × 10 5 HSC / г печенки), но такой же чистоты (91%) 14. Что касается нашего протокола, дает низкие клеток могут быть вызваны плохой перфузии и пищеварения из-за низкой или вообще без циркуляции 1x Perfusion-SOLUTIOп я и Переваривание-решение в ткани. Кроме того, пузырьки газа в ткани может нарушить циркуляцию внутри тканевое 1x Perfusion-Solution I и переваривания-Solution. В этих случаях перфузия может быть повышена за счет увеличения перфузионного давления и устранение пузырьков газа путем зажима одиночных канюль и / или с помощью шпателя для упираясь образца ткани. Плохая жизнеспособность в большинстве случаев является следствием клеточного стресса. Пролонгированные раз ишемия, повреждение Ca 2+ истощению и протеолиза мембранных белков связаны с повреждения клеток, видимый с помощью пузырьков клеточной мембраны. Из наших наблюдений эти клетки очень чувствительны к напряжению сдвига и в большинстве случаев умирают во время процедуры изоляции. Таким образом, успешная изоляция и разделение паренхимы и не паренхиматозных клетках печени требует, чтобы критические этапы выполняются в правом сроки, этапы пипетирующие выполняются тщательно и в целом время для выделения клеток и разделения should быть как можно короче 21. Недостатком описанного протокола является то , что условия изоляции (например, раз перфузионные) не могут быть полностью стандартизированы, но должны быть адаптированы индивидуально к качеству ткани. Кроме того, выход и чистота полученных клеточных популяций могут варьироваться в зависимости от качества ткани и результатом пищеварения.
Мы недавно опубликовали исследование , демонстрирующее влияние условий культивирования в сочетании с функциональной характеристикой каждого типа NPC клеток , выделенной с помощью этого метода 1. Возможность выделить и отдельные различные клеточные популяции печени позволяет создавать инновационные клеток печени человека со-культур и тканевой инженерии пробирке моделей печени в. Хорошо известно , что культивирование PHH в 2D моно-культур приводит к дифференцировке и потере типичных функций клеток 7. По этой причине необходимо , чтобы имитировать естественных условиях Archi ткани вхитектура в моделях печени в пробирке. Костадинова и его коллеги (2013) 8,9, а также Месснер и его сотрудники (2013) 8,9 успешно созданы функциональные модели совместного культивирования печени для выявления гепатотоксических эффектов. Тем не менее, NPC не были охарактеризованы и конкретные функции не были исследованы в этих системах.
Поэтому дальнейшие исследования должны быть сосредоточены на исследованиях по долгосрочному выживанию NPC, их специфических особенностей и взаимодействия в совместных культурах. Для таких исследований, он может также представлять интерес для установления протокола для выделения холангиоцитов. Реализация функциональных совместных культур в пробирке , включая все типы клеток , содержащихся в нативном печени может стать еще одним шагом в направлении в естественных условиях , как модели человеческой печени.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить Цзя Ли Лю за их поддержку в создании на Рисунке 1. Это исследование было поддержано Федеральным министерством образования и научно-исследовательского проекта (BMBF) Виртуальный Печень: 0315741.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| General Equipment | |||
| PIPETBOY | Eppendorf | ||
| pipettes | Eppendorf | ||
| microscope | Carl Zeiss | ||
| microscope | Olympus | ||
| CO2-incubator | Binder | ||
| Lamin Air | Heraeus | ||
| Centrifuge Varifuge 3.0R | Heraeus | ||
| Urine Beaker | Sarstedt | 2041101 | |
| perfusor syringe 50 ml | B.Braun | 12F0482022 | |
| Bottle Top Filter | Nalgene | 1058787 | |
| Falcon 50 ml Polypropylene Conical Tube | BD Biosciences | 352070 | |
| Falcon 15 ml Polypropylene Conical Tube | BD Biosciences | 352096 | |
| Tissue Culture plate | BD Biosciences | 533047 | 24 well |
| serological pipettes | BD Biosciences | 357525, 357551, 357543 | 25 ml, 10 ml, 5 ml |
| pipette tips | SARSTEDT | 0220/2278014, 0005/2242011, 0817/2222011 | 100 µl, 200 µl, 1,000 µl |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isolation Equipment | |||
| water bath | Lauda | ||
| peristaltic pump | Carl Roth | ||
| circulation thermostat | Lauda | ||
| pH meter | Schott | ||
| fine scales | Sartorius | ||
| stand | |||
| Büchner funnel | Haldenwanger | ||
| plastic funnel | |||
| silicone tube | |||
| cannulae with olive tips | |||
| glass dish | |||
| forceps | |||
| scalpel | Feather | 12068760 | |
| Neubauer counting chamber | Optic Labor | ||
| cell lifter | Costar | ||
| Surgical Drape | Charité Universitätsmedizin Berlin | A2013027 | |
| compress | Fuhrmann | 40013331 | |
| sterile surgical gloves | Gammex PF | 1203441104 | |
| Tissue glue | B. Braun | 1050052 | |
| glass bottle | VWR | ||
| Collagenase P | Roche | 13349524 | |
| Percoll Separating Solution | Biochrom | L6145 | Density 1.124 g/ml |
| Hank’s BSS | PAA | H00911-3938 | |
| Dulbecco’s PBS | PAA | H15 - 002 | without Mg/Ca |
| Ampuwa | Plastipur | 13CKP151 | |
| Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| NaCl | Merck | 1,064,041,000 | |
| KCl | Merck | 49,361,000 | |
| Hepes Pufferan | Roth | 133196836 | |
| EDTA | Sigma | E-5134 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media Equipment | |||
| DMEM | PAA | E15-005 | Low Glucose (1 g/L) (without L-Glutamine) |
| HEPES Buffer Solution 1 M | GIBCO | 1135546 | |
| L-Glutamine | GIBCO | 25030-024 | 200 mM |
| MEM NEAA | GIBCO | 11140-035 | |
| penicillin/streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | PAA | E15 - 039 | without L-Glutamine |
| Sodium Pyruvate | GIBCO | 1137663 | 100 mM |
| Trypan Blue Solution | Sigma-Aldrich | T8154 | 0.4% |
| William’s E | GIBCO | 32551-020 | |
| with GlutaMAX™ | |||
| EGTA | Sigma-Aldrich | 03780-50G | |
| Fortecortin | Merck | 49367 | 8 mg/2 ml |
| Human-Insulin | Lilly | HI0210 | 100 I.E./ml |
| N-Acetyl cysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
| Fetal calf serum (FCS) | PAA | A15-101 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment for Immunostainings | |||
| CD 68 | R&D Systems, USA | monoclonal | |
| CK 19 | Santa Cruz | D2309 | polyclonal |
| CK18 | Santa Cruz | K2105 | monoclonal |
| Vimentin | Santa Cruz | monoclonal | |
| GFAP | Sigma Aldrich | monoclonal | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 23.472-9 | |
| Goat anti-Mouse IgG1-PE | Santa Cruz | C0712 | |
| Goat anti-rabbit IgG-FITC | Santa Cruz | L0412 | |
| Methanol | J.T.Baker | 1104509006 | |
| Formaldehyde 4% | Herbeta Arzneimittel | 200-001-8 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A7906-100G |
References
- Pfeiffer, E., et al. Isolation, characterization, and cultivation of human hepatocytes and non-parenchymal liver cells. Exp Biol Med. , Maywood. (2014).
- Si-Tayeb, K., Lemaigre, F. P., Duncan, S. A.
- Alpini, G., Phillips, J. O., Vroman, B., LaRusso, N. F. Recent advances in the isolation of liver cells. Hepatology. 20 (2), 494-514 (1994).
- Godoy, P., et al. Recent advances in 2D and 3D in vitro systems using primary hepatocytes, alternative hepatocyte sources and non-parenchymal liver cells and their use in investigating mechanisms of hepatotoxicity, cell signaling and ADME. Arch Toxicol. 87 (8), 1315-1530 (2013).
- Gómez-Lechón, M. J., Castell, J. V., Donato, M. T. Hepatocytes--the choice to investigate drug metabolism and toxicity in man: in vitro variability as a reflection of in vivo. Chem Biol Interact. 168 (1), 30-50 (2007).
- Ginai, M., et al. The use of bioreactors as in vitro models in pharmaceutical research. Drug Discov Today. 18 (19-20), 922-935 (2013).
- Schyschka, L., et al. Hepatic 3D cultures but not 2D cultures preserve specific transporter activity for acetaminophen-induced hepatotoxicity. Arch Toxicol. 87 (8), 1581-1593 (2013).
- Kostadinova, R., et al. A long-term three dimensional liver co-culture system for improved prediction of clinically relevant drug-induced hepatotoxicity. Toxicol Appl Pharmacol. 268 (1), 1-16 (2013).
- Messner, S., Agarkova, I., Moritz, W., Kelm, J. M. Multi-cell type human liver microtissues for hepatotoxicity testing. Arch Toxicol. 87 (1), 209-213 (2013).
- Nussler, A. K., Nussler, N. C., Merk, V., Brulport, M., Schormann, W., Yao, P., Hengstler, J. G. The Holy Grail of Hepatocyte Culturing and Therapeutic Use. Strategies in Regenerative Medicine. Santin, M. , Springer. New York. 1-38 (2009).
- Friedman, S. L., Roll, F. J. Isolation and culture of hepatic lipocytes, Kupffer cells, and sinusoidal endothelial cells by density gradient centrifugation with Stractan. Anal Biochem. 161 (1), 207-218 (1987).
- Knook, D. L., Blansjaar, N., Sleyster, E. C. Isolation and characterization of Kupffer and endothelial cells from the rat liver. Exp Cell Res. 109 (2), 317-329 (1977).
- Alabraba, E. B., et al. A new approach to isolation and culture of human Kupffer cells. J Immunol Methods. 326 (1-2), 139-144 (2007).
- Friedman, S. L., et al. Isolated hepatic lipocytes and Kupffer cells from normal human liver: morphological and functional characteristics in primary culture. Hepatology. 15 (2), 234-243 (1992).
- Lalor, P. F., Lai, W. K., Curbishley, S. M., Shetty, S., Adams, D. H. Human hepatic sinusoidal endothelial cells can be distinguished by expression of phenotypic markers related to their specialised functions in vivo. World J Gastroenterol. 12 (34), 5429-5439 (2006).
- Lee, S. M., Schelcher, C., Demmel, M., Hauner, M., Thasler, W. E. Isolation of human hepatocytes by a two-step collagenase perfusion procedure. J Vis Exp. (79), (2013).
- Rajan, N., Habermehl, J., Coté, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat Protoc. 1 (6), 2753-2758 (2006).
- Chang, W., et al. Isolation and culture of hepatic stellate cells from mouse liver. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 46 (4), 291-298 (2014).
- Zeng, W. Q., et al. A new method to isolate and culture rat kupffer cells. PLoS One. 8 (8), e70832 (2013).
- Tokairin, T., et al. A highly specific isolation of rat sinusoidal endothelial cells by the immunomagnetic bead method using SE-1 monoclonal antibody. J Hepatol. 36 (6), 725-733 (2002).
- Damm, G., et al. Human parenchymal and non-parenchymal liver cell isolation, culture and characterization. Hepatology International. 7, 915-958 (2013).
- Baccarani, U., et al. Isolation of human hepatocytes from livers rejected for liver transplantation on a national basis: results of a 2-year experience. Liver Transpl. 9 (5), 506-512 (2003).
- Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q., Liu, M. Isolation and primary culture of rat hepatic cells. J Vis Exp. (64), (2012).
- Gerlach, J. C., et al. Large-scale isolation of sinusoidal endothelial cells from pig and human liver. J Surg Res. 100 (1), 39-45 (2001).
