Abstract
paren-kimal hepatositlerden yanında, karaciğer dışı parankimal hücreler (NPC), yani Kupffer hücreleri (KC), karaciğer endotel hücreleri (LEC) ve hepatik yıldız şeklinde hücreler (HSC) oluşur. Birincil insan hepatosit (PHH) iki boyutlu (2D) kültürü hala ilaç metabolizması ve hepatotoksisite in vitro test için "altın standart" olarak kabul edilmektedir. Bu PHH 2D monokültür, farklılaşmadan ve fonksiyon kaybına uğrar çok iyi bilinmektedir. Son zamanlarda karaciğer NPC karaciğer (pato-) fizyoloji merkezi bir rol ve PHH fonksiyonları bakım oynadığı gösterilmiştir. Mevcut araştırma 2D monokültürlere sınırlamaları aşmak için 3B ve ko-kültür modellerinde in vivo doku mimarisinin yeniden odaklanır. Daha önce insan karaciğer hücreleri izole etmek için bir yöntem yayınlanmıştır ve Deneysel Biyoloji ve Tıp 1 hücre kültürlerinde kullanımları için bu hücrelerin uygunluğunu incelenmiştir. Bu te geniş ilgi dayalıBu yazının amacı chnique bu tekniğin kolay bir üreme sağlayacak bir videoda da dahil olmak üzere karaciğer hücre izolasyon işlemi için daha ayrıntılı bir protokol sağlamak oldu.
Insan karaciğer hücreleri, iki aşamalı bir EGTA / kolajenaz P perfüzyon tekniği ile cerrahi müdahalelerin insan karaciğer doku örneklerinden izole edilmiştir. PHH 50 x g bir ilk santrifüj ile NPC ayrılmıştır. Yoğunluk gradyan santrifüj adımları ölü hücrelerin çıkarılması için kullanılmıştır. Bağımsız karaciğer hücre popülasyonları özel hücre özellikleri ve hücre sıralama prosedürleri kullanarak zenginleştirilmiş NPC fraksiyondan izole edilmiştir. PHH izolasyon yanında biz daha fazla ekimi için KC, LEC ve HSC ayırmak için başardık.
Birlikte ele alındığında, sunulan protokol bir donör doku örneğinden yüksek kalite ve miktar PHH ve NPC izolasyonu sağlar. Saflaştırılmış karaciğer hücre popülasyonlarının erişim insan li gibi in vivo oluşturulmasına izin verebilirver modelleri.
Introduction
İnsan karaciğer dokusu son derece karmaşık ve iki farklı hücre varlıklar, parankimal hücreler ve non-parankimal hücreler (NPC) oluşur. Parenkimal karaciğer hücreleri hepatositleri ve cholangiocytes bulunmaktadır. Hepatositler toplam karaciğer hücrelerinin 60 70% temsil eden ve metabolik karaciğer fonksiyonlarının çoğu için hesap, örneğin, safra asidi ve faktör sentezi, metabolizma ve enerji metabolizmasını 2,3 tamamlayacak.
Daha küçük NPC fraksiyonu toplam karaciğer hücrelerinin% 30-40 oluşturmaktadır. NPC farklı hücre popülasyonlarının, yani Kupffer hücreleri (KC), karaciğer endotel hücrelerini (LEC) ve hepatik stellat hücreler (HSC) içerir. Bu heterojen hücre fraksiyonu karaciğer fizyolojik süreçlerde önemli bir rol oynar. Buna ek olarak, NPC örneğin ilaç kaynaklı karaciğer hasarı (Dili) ve kronik karaciğer yaralanması, siroz 4 gibi akut karaciğer hasarı, aracılık katılabilir.
Son yıllarda, Human karaciğer hücreleri karaciğer hastalıklarında daha önemli araştırma ve ilaç testleri, ilaç geliştirme ve yeni bir biyokimyasal yolların belirlenmesi gelişiminde olmuştur. İn vitro testler için PHH monokültürleri, hala "altın standart" olarak kabul edilmektedir 5. Mevcut homotipik karaciğer modellerinde ana sınırlama birkaç gün 4 içinde farksızlaşma ve hepatositler fonksiyon kaybıdır. 3 boyutlu (3D) kültür teknikleri saptanması, bu sınırlama 4,6 telafi edilebilir olduğunu göstermiştir. Ancak, hatta modern 3D kültür teknikleri eylemlerin 7'nin tüm hepatotoksik modlarını görüntülemek mümkün değildir. Mevcut in vitro modellerde eksik NPC popülasyonları in vivo duruma Bu farklılığın olası bir nedeni olarak tartışılmıştır. Aynı zamanda pathophy farklı karaciğer hücre popülasyonları arasında hücre-hücre iletişim fizyolojik homeostazında önemli bir rol oynadığı gösterilmiştirsiologic 8 işler. Bu nedenle bilimsel ilgi NPC ve hücre-hücre etkileşimleri üzerinde daha fazla duruluyor. Ko-kültür ve doku mühendisliği sistemlerindeki maksatlı kullanım mümkün olduğunca in vivo duruma kadar yakın, in vitro karaciğer modellerinin 8,9 yüksek talep için bir çözüm olabilir.
Şu anda temel zorluk PHH ve NPC açıkça tanımlanmış bölümlerini içeren standart bir insan karaciğeri ko-kültür modeli, geliştirilmesidir. Sonuç olarak, çok heterojen karaciğer hücreleri için izolasyon teknikleri gerekli ve bu saf hücre popülasyonlarının kazanmak için optimize edilmiş olması vardır. PHH izolasyonu için standart protokoller 10 varken, insan NPC standartlaştırılmış izolasyon hala geliştirilme aşamasındadır. En yayınlanan NPC izolasyon protokolleri olmayan insan hücreleri 11,12 ile deneylere dayanmaktadır. Sadece birkaç yayınlar insan NPC izolasyon işlemini açıklar ve çoğu sadece kapakTek bir hücrenin izole edilmesi için yöntemler 11-16 yazın. Hücre ayrılması için kullanıldı edilmiştir en önemli hücre özelliklerinin boyutu, yoğunluğu, bağlanma davranışı ve yüzey proteinleri ifadesidir. Bu özellikleri temelinde biz Deneysel Biyoloji ve Tıp 1 daha önce yayımlanan PHH, KC, LEC ve HSC, izole etmek basitleştirilmiş bir protokol geliştirmiştir. Çünkü bu teknikle geniş ilgi, bu makalenin amacı daha kolay tekniği üreten sağlayacak bir videoda da dahil olmak üzere karaciğer hücre izolasyon işlemi için daha ayrıntılı bir protokol sağlamak oldu. Protokol de verim ve canlılığının değerlendirilmesi için ve belirli immunostainings kullanılarak kimlik ve saflık değerlendirmesi için bir kalite kontrol yöntemleri içerir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: Tüm hücreler birincil ya da ikincil karaciğer tümörlerinde parsiyel karaciğer rezeksiyonu sonra kalan rezeke olmayan tümörlü insan karaciğer dokusu, izole edilmiştir. Universitätsmedizin Berlin - hastaların aydınlatılmış onam Charité etik kurallarına göre elde edilmiştir.
Malzemelerin ve Çözümleri 1. Hazırlık
- izolasyon işlemi sırasında bakteri kontaminasyonu önlemek için önceden tüm enstrümanları ve malzemeleri sterilize edin.
- Taze hazırlanmış Sindirime Çözüm hariç olmak üzere, karaciğer doku numunesi, hepatositler ve non-parenkimal karaciğer hücrelerinin izolasyonu işlemi ve Tablo 1 ve 2'ye göre birincil insan karaciğer hücreleri yetiştirme perfüzyon için gerekli çözümler hazırlanması kullanımdan önce. Bütün çözeltiler 4 ° C 'de muhafaza edilebilir ve hazırlandıktan sonra 4 hafta içinde kullanılması önerilmektedir.
- sterilize etmek0.22 mikron şişe üst filtre kullanarak tüm çözümleri.
Perfüzyon Ekipman 2. Hazırlık
- Şekil 1A gösterildiği gibi karaciğer doku örneğinin perfüzyon ve sindirim için donatım ayarlayın.
- perfüzyon ve sindirim sırasında optimum kollajenaz P aktivitesini sağlamak için 39 ° C'ye kadar su banyosu sıcaklığını ayarlayın.
Karaciğer Doku Örneği 3. perfüzyon ve Sindirim (1.5 saat)
- rezeke karaciğer dokusundan dokunulmamış Glisson kapsülü bir doku numunesi seçin. Doku örneği keserken, iyi görünür damarlar ile küçük bir kesme yüzeyi elde etmek için deneyin. taşınması ve perfüzyon kadar buz üzerinde karaciğer doku örneği ele alarak sıcak iskemi süreleri kaçının.
- steril koşullar altında, doku ağırlığı alın ve laminer hava akışının bir Petri kabındaki karaciğer doku numuneyi. yeniden steril bir kompres ile doku örneğinin yüzeyini temizleyinkan isti ve tüm kanül geçirgen olmasını sağlamak için 1x Perfüzyon-Çözüm kullanıyorum kanül seti yıkayın.
- Bazı büyük kan damarlarında kanüller zeytin düzeltmek için doku yapıştırıcısı kullanın. Karaciğer doku numunesi uzunluğuna ve yüzeyde damarların sayısına bağlı olarak, 3 ila 8 kanüllü ayarlanmış bir kanül kullanın. perfüzyon test ve sızıntı olup olmadığını kontrol edin. doku yapıştırıcısı ile net 1x Perfüzyon-Çözüm I sızıntısı tüm yakın kan damarları.
- Kendi delikli bir filtre diski (Şekil 1a) Buchner hunisi içine kanüle karaciğer doku numunesi yerleştirin.
- 7.5 ml / dak ve ikinci kanül sayısına ve karaciğer dokusunda direncine bağlı olarak 14.6 ml / dk peristaltik pompa akış hızını ayarlayın. bir akım ama yavaş perfüzyon orada olduğundan emin olmak için akış hızı her zaman ayarlayın. tam kan dışarı atılırlar ama en azından 20 dk kadar doku serpmek. İyi perfusi olan alanlarda daha parlak hale doku gözlemlemeküzerinde.
Not: Bazı durumlarda, plastik parçaları ile kanüller bir kelepçe gerekli olabilir ya da perfüzyon optimize etmek için, karaciğer kapsülünün karşı bir spatula ile hafifçe iterek bir alan iç basıncı artırmak için. açık kahverengimsi renkte açık sarı için tam bir renk değişikliği iyi perfüzyon gösterir. - Kollajenaz P (Tablo 1) içeren Sindirim-Çözüm perfüzyon sıvısını değiştirin.
- Sindirim adımı için kurulum (Şekil 1A) yeniden düzenleyin. Bu nedenle, en fazla 15 dakika süreyle Şekil 1B uyarınca Sindirime Çözüm dairesel bir akış yapar.
Not: karaciğer doku numunesi yeterince sindirilir zaman hemen perfüzyon durdurmak için kritik öneme sahiptir. İyi bir sindirim bir spatula ile itildiğinde, kapsül deformasyonların bakımı ile değerlendirilen doku elastikiyeti belirtisi gösterdiğinde, görülebilir.
Hepatositlerin 4. izolasyonu (1 saat)
- Trahatsız peristaltik pompa urn bir cam tabak içinde karaciğer doku numuneyi. Buz Stop çözeltisi (Tablo 1), doku numunesi dışında yıkayın. karaciğer doku örneğinden kanüller çıkarın. kanüller bağlanmıştır alanının ortasında incising, karaciğer doku örneği açmak için bir neşter kullanın. Glisson's kapsül sağlam kalır dikkat tutun.
- doku örneğinin içini durulayın ve sonra buz soğuk Dur-Çözüm ile tüm doku örneği kapsamaktadır. doku dışarı hücreleri serbest bırakmak için hafifçe doku sallayın.
- hücre süspansiyonu toplamak ve 50 ml plastik tüplere bir bakış hunisi (gazlı kompres ile kaplı plastik huni) aracılığıyla filtre. 500 ml'lik bir nihai hacim tüketilene kadar, karaciğer doku numunesi daha Stop çözeltisi ilave edilir.
- 50 x g'de, 5 dakika, 4 ° C 'de bir hücre süspansiyonu santrifüj. Daha sonra olmayan parankimal hücre izolasyonu için süpernatant toplayın. PBS (Şekil 2 hücre pelletini yıkayınA).
- 50 x g'de, 5 dakika, 4 ° C sıcaklıkta tekrar hücre süspansiyonu santrifüj. Süpernatant toplayın ve Hepatosit Kuluçka ortamı pelet (Tablo 2, Şekil 2B) yeniden askıya.
- Tripan mavi boya ile elde edilen hücre süspansiyonu, hücre sayısı ve canlılığı belirler. Bir Neubauer sayım odasında canlı ve ölü hücreleri saymak. Aşağıdaki formüller kullanılarak PHH hücre sayısı, canlılığı ve verim hesaplayın.
hücre süspansiyonu (ml) verimi (hücreler sayılır) = sayılan hücre x seyreltme faktörü x hacim 10.000 x
Verim (hepatositler / (g karaciğer doku örneği)) = (hücre süspansiyonu (mi) verimi (hepatositler / (ml ortamı)) x hacim) / (karaciğer doku numunesinin ağırlığı (g))
canlılığı (%) =% 100 x (canlı hücre sayısı) / (toplam hücre sayısı)
Hepatositlerin 5. saflaştırma (1 saat)
Not: canlılığı, bu saflaştırma aşaması önerilir% 70 daha düşüktür.
- Buz üzerinde tüm adımları uygulayın. 5 mi yoğunluk gradyan çözeltisi ve yoğunluk dereceli santrifüj 15 ml PBS karıştırılarak% 25 yoğunluk gradient hazırlayın.
- Her iki tabakada arasında net bir ayrım (Şekil 2C) elde edilmesini sağlamak için% 25 yoğunluk gradyan tabakanın üzerine dikkatli bir şekilde yavaş yavaş, hepatosit zengin hücre süspansiyonu üzerinden toplam 50 Milyon hücre fazla koyun. 1250 xg, 20 dakika, frensiz 4 ° C (Şekil 2B) de santrifüj ve santrifüj içine dikkatlice tüpleri koyun.
- Kalan hücre süspansiyonu ve interfaz ölü hücreleri aspire. yağ içeriği biri bağlı da yoğunluk gradyan-çözüm aspire olabilir.
Not: PHH düşük lipit içerikli yoğun pelet ve yoğunluk gradyan tamamen aspire edilebilir oluştururlar. yüksek lipit içerikli PHH pelet yukarıdaki yoğunluk gradyan çözeltisi içinde kalabilir, daha yaygın pelet ve canlı hücrelerin bir sürü oluşturur. - 50 xg, 5 dakika, 4 ° C'de tekrar PBS ve santrifüj ile hepatosit pelet yeniden askıya. pelet Havuz, PBS ile tekrar yıkayın ve Hepatosit Kuluçka ortamında saflaştırılmış PHH yeniden askıya. Adım 4.6 açıklandığı gibi hücre sayımını yapın.
Hepatositlerin 6. Yetiştirme
- Örnek fare kuyruk kolajeni (kolajen tip I), bir hücre-dışı matris ile kaplanarak PhH tohumlanmasından hücre kültür kaplarına hazırlayın. Rajan ve arkadaşları tarafından kurulan protokole göre sıçan kuyruğu kollajen hazırlayın. 17
- sıçan kuyruğu kollajen stok solüsyonu 1 seyreltilir: 200 PBS içinde. Tüm yüzeyi kaplı kültür kaplarına transferi 100 ul / cm 2 sıçan kuyruğu kollajen çözüm, dikkat çekici. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca hücre kültürü plastik inkübe edin. Kalan sıçan kuyruğu kollajen çözüm aspire.
- Kültür dishe ilgili Hepatosit inkübasyon ortamı içinde tohum 15 x 10 4 hepatositler / cm2fare kuyruk kolajeni ile kaplanmış s. En az 4 saat süreyle 37 ° C'de,% 5 CO2 nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde hücrelerin kültive edilmesi. 4 saat sonra hepatositler yapıştırılır ve orta değiştirilebilir.
- deney düzeneği bağlı soruşturmaları gerçekleştirin. 48 saat bir kültür süresi hücreleri izolasyon sürecinden kurtarmak için izin önerilir.
Sigara parankimal karaciğer hücrelerinin 7. izolasyonu (1.5-2 saat)
- Santrifüj 72 x g'de, 5 dakika, 4 ° C 'de toplanan süpernatan (aşama 4,5 4.6) geri kalan eritrosit ve hepatositleri elemek için kullanılan. süpernatantlar havuzu ve iki hücre pelletleri elde etmek için iki kez santrifüj: 300 xg, 5 dk, HSC, LEC ve kısmen KC 650 xg, 7 dakika, kalan KC çökmesi için 4 ° C sedimantasyon 4 ° C.
- Havuz topakları hem HBSS onları yeniden askıya. % 25 ve yoğunluk gradyan Santrifüj için karıştırma yoğunluk gradyan çözeltisi ve PBS tarafından% 50 yoğunlukta renk geçişlerini hazırlayınugation (% 25 yoğunluk gradyan çözeltisi: 5 mi yoğunluk gradyan çözeltisi ve 15 ml PBS,% 50 yoğunluk gradyan çözeltisi: 10 mi yoğunluk gradyan çözeltisi ve 10 ml PBS, bakınız Şekil 2). % 50 yoğunluk gradyan çözeltisi tabakanın üzerine dikkatli bir şekilde% 25 yoğunluk gradyan çözeltisi yerleştirin.
- Her iki tabakada arasında net bir ayrım elde edilir şekilde% 25 yoğunluk gradyan çözeltisi tabakanın üzerine dikkatli bir şekilde yavaş yavaş NPC süspansiyon koyun.
- Santrifüj 1800 xg, 20 dakika, frensiz 4 ° C (Şekil 2.2) yoğunluk gradyanı üzerinde hücre süspansiyonu.
- Aspire ölü hücreler ve üst tabakadan hücre enkaz. NPC% 25 ve% 50 yoğunluk gradyan tabaka (Şekil 2) arasında arayüz içinde yer almaktadır. HBSS ve santrifüj ile yukarıda açıklanan çift santrifüj adımı uygulayarak hücre süspansiyonu yıkayın, NPC toplayın (adım 7.2.).
Kupffer hücrelerinin 8. Ayırma (bağlılıkAyırma Aşaması) (1 saat)
- Adım 4.6 açıklandığı gibi NPC fraksiyonu KC için bir hücre sayımı gerçekleştirin. (Süspansiyon KC'nin görünüm için Şekil 3B). Santrifüj, yukarıda tarif edilen çift santrifüj leme, aşama (aşama 7.2) NPC Kupffer hücre ekim ortamı (Tablo 2) yeniden askıya NPC fraksiyonu.
- 5 x 10 5 KC / cm2 'lik bir yoğunlukta plastik hücre kültür kaplarına KC içeren fraksiyonu tohumu. 37 ° C'de nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 20 dakika için KC kültürleri inkübe,% 5 CO2. İlköğretim KC kısa bir süre (Şekil 2.3) içinde hücre kültürü plastik üzerine yapışır.
- başta LEC ve HSC oluşan değil yapıştırılır NPC içeren süpernatant toplayın. LEC sonraki ayrılması için süpernatantlar Havuz (bölüm 9) ve HSC (bakınız bölüm 10). HBSS ile yapışık KC yıkayın ve 37 ° C'de,% 5 CO de Kupffer hücre kültür aracı maddesi (Tablo 2) 'de onları yetiştirmekNemli bir kuluçka makinesi içinde 2.
Endotel Hücreleri 9. Ayırma (1.5 saat)
- Santrifüj 300 x g'de 5 dakika, 4 ° C 'de toplanan süpernatan (aşama 8,5).. PBS ile pelet yıkayın. 300 x g'de 5 dakika, 4 ° C Stellat hücre / endotel hücre ayırma ortamı hücrelerin yeniden askıya ve adım 4.6 de tarif edildiği gibi geri kalan hücreler için bir hücre sayımı gerçekleştirmek santrifüjlemeden sonra.
- Immunolabeling için Mac-kitinden bloke etme çözeltisi 20 ul ve CD31 Micro Beads 20 ul, 1 ml Stellat hücre / endotel hücre ayırma ortamı içinde, 1 x 10 7 Mio hücrelerin yeniden askıya ve 4 ° C'de 15 dakika için sonuçtaki süspansiyon inkübe ° C sıcaklık (Şekil 2.4).
- Manyetik aktif hücre sıralama sistemi MACS (Şekil 2.5) için imalatçının protokol açıklandığı gibi HSC ayırın LEC. manyetik muhafaza CD31-pozitif LEC Zehir ve Stellate C askıyaell / endotel hücre kültür ortamı (Tablo 2).
- Adım 4.6 açıklandığı gibi LEC için sayma hücre gerçekleştirin. 1.25 x 10 5 hücre fare kuyruk kolajeni ile kaplanmış hücre kültürü damarlarda / cm2 yoğunluğunda Tohum LEC (adım 6.1). Nemli bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C'de,% 5 CO2 de hücrelerin kültive edilmesi.
Stellat Hücreleri 10. Ayırma (0.5 saat)
- Etiketsiz HSC MACS işlemi sırasında ayırma sütunu geçmektedir. HSC fraksiyonu (Şekil 2.5 adım 9.5) toplayın. Adım 4.6 açıklandığı gibi hücre sayımını yapın.
- Fare kuyruk kolajeni ile kaplanmış hücre kültür kaplarında 5 x 10 4 hücre / cm2'lik bir yoğunlukla tohum HSC Stellat hücre / endotel hücre kültür ortamında (Tablo 2) (aşama 6.1) ve 37 ° C'de,% 5 onları yetiştirmek nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde CO2.
Tablo 1: Perfüzyon ve izolasyon çözümü.
Tablo 2: Kültür ve izolasyon ortamı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
yapışma özellikleri ve MACS kullanımı ile birlikte temizlik prosedürü olarak yoğunluk gradyan santrifüj kullanarak bir parankimal ve non-parankimal fraksiyonu içine ayrılık, başarılı PHH ve NPC izolasyona yol açar. PHH ve NPC yüksek kalite ve miktarda izole edilebilir. 1 karaciğer perfüzyon ve sindirim için ekipman temsilcisi kurulumunu göstermektedir. proteazlar proteolitik aktivitesini azaltmak ve karşılığında kolajenaz p aktivitesinin dengelenmesi için Solüsyon II -% 10 FCS ihtiva eden Perfüzyon kolajenaz P ilave edildi. NPC izolasyonu için gerekli sonucu uzun sindirim zamanlarda PHH canlılığı üzerindeki olumsuz etkisi olmadan uygulanabilir.
Şekil 1:. Perfüzyon ve sindirim kurulumu ilk perfüzyon adım orde yapılırr kalan kanı çıkarmak doku ısınmak ve 1x Perfüzyonları Çözüm I (PI) (A) kullanılarak hücre-hücre bağlantıları eritmek için Ca 2 + kaldırın. Sindirim-Çözüm (DG) ve devridaim perfüzyon aşamasında II (B) karaciğer dokusunun sindirim için yapılır.
Şekil 2:.. Tam PHH ve NPC izolasyon sürecinin basitleştirilmiş şematik gösterimi Deneysel Biyoloji ve Tıp izniyle Pfeiffer ve ark 1, 2014 Modifiye. İlk olarak, karaciğer doku örneği perfüze edilmiş ve bir iki aşamalı EGTA / kolajenaz P perfüzyon tekniği (A) ile sindirilmiştir. Elde edilen hücre süspansiyonu, 50 x g'de, 5 dakika, 4 ° C, (B) daha küçük bir NPC fraksiyondan daha PHH-fraksiyonu (pelet) ayrılması için (yüzerleri başlangıçta santrifüjleniratant). % 70 altında bir PHH canlılığı halinde uygulanabilir PHH fraksiyonu ölü ise, tüpün alt kısmında PhH çökelme ile sonuçlanır 1.250 x g'de, 20 dakika, 4 ° C (C), bir yoğunluk gradyan santrifüj ile zenginleştirilebilir / hücre enkaz hücreleri yoğunluk gradyan tabakasında (D) üst kısmında yer almaktadır. 1) 300 xg 5 dakika, 4 ° C ve 2) 650 xg, 7 dakika, 4 ° C: Initial santrifüj (1) arasında toplanan süpernatanlar, iki adımları kullanarak santrifüjlenir. İlk santrifüjden sonra KC, kısmen yüzer yer almaktadır. Bu bağlamda, ikinci yalıtım adım gereklidir. elde edilen hücre topakları toplanır ve HBSS içinde tekrar süspansiyon haline getirildi. Daha sonra, hücre süspansiyonu, dikkatli bir şekilde, iki katlı (% 25 /% 50) yoğunluk gradyanı üstünde katmanlı. tabakalı yoğunluk gradyan tüpler 1,800 x g'de, 20 dakika, 4 ° C 'de santrifüj edilir (2). % 25 yoğunluk gradyan tabakanın üzerine ölü hücreler atılır. NPC% 25 interfaz ve% 50 d arasında yer alanensity gradyan tabaka toplandı ve bir araya getirilmiştir. NPC fraksiyonu kaplanmamış hücre kültürü plastik üzerine ekilir. 20 dakika inkübasyon süresi kullanılarak (aderans ayırma aşaması) KC diğer karaciğer hücre popülasyonlarının ayrılır (3). LEC HSC MACS-kit kullanılarak ayrılır. Bu nedenle, süpernatan toplanır diğer karaciğer hücreleri, 300 x g'de 5 dakika, 4 ° C'de santrifüje tabi tutulur ve CD31-konjüge mikro, (4) ile etiketlenir. Sadece CD31-negatif HSC MACS ayırma kolonu (5) geçmektedir. sütun CD31-pozitif LEC sopa. Nihayet sütun manyetik cihaz ve CD31-pozitif LEC kaldırılır kolon (5) dışarı akıtılır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
İzole PHH 14.2 x 10 6 ± 6.6 x 10 6 canlı PHH / g karaciğer dokusu verim ve canlılığı gösterdi yaklaşık 76.6 ± 4.2% (Tablo 3 1). Mikroskopik olarak görülebilen özellikleri Tipik bir büyük sitoplazmik lipid damlacıkları ile kombinasyon halinde hacim ve bir ile dört çekirdek, (Şekil 3A) idi. hücre boyutu, süspansiyon içinde um 30-20 arasında değişmektedir.
KC NPC fraksiyonunda en yaygın hücre tipi idi. Yaklaşık 1.9 izole x 10 6 ± 0.2 x 10 92.8 ± 3.5% (Tablo 3 1) bir canlılığı ile 6 canlı KC / g karaciğer dokusu. KC yüzeyi (Şekil 3B) düşük bir sitoplazma / çekirdek oranı ve tipik mikrovilluslar çok küçük hücreler (yaklaşık 5 mikron) bulunmaktadır.
Sonunda kalan CD31-negatif HSC gelen CD31-pozitif LEC ayırmak için MACS ayırma tekniği kullanılır. LEC verimi yaklaşık 2.7 x 10 5 ± 0,1 x 10 5 canlı LEC / g liv olduER dokusu ve elde canlılığı 95.6 ± 2.8% (Tablo 3 1). Kimlik Çoğul granulae ve kısa bir kültivasyon zaman (Şekil 3G) yaklaşık 10 mikron hücre süspansiyonu (Şekil 3C) ve karakteristik mili şeklinde bir boyutu vardır.
İzolasyon işlemi 89,6 ±% 3,8 (Tablo 3 1) 'in bir canlılığı yaklaşık 4.7 X 10 5 ± 0.2 x 10 5 uygulanabilir HSC / g karaciğer (n = 8), HSC verimle elde edilmiştir. Mikroskopik olarak tanımlanabilir özellikleri yaklaşık 20 um'lik bir boyutu ve lipid damlacıkları (Şekil 3D) arasında değişen bir miktarda, tipik bir granül görünümü edildi.
Tablo 3: Verim, canlılık ve izole PHH ve N saflığıPC. Üç farklı bağışçılar değerlendirildi. Veriler ortalama ± SD olarak verilmiştir. Bu tablo Pfeiffer ve ark., 1 2014 yılında daha önce yayınlanan ve Deneysel Biyoloji ve Tıp izniyle edilir.
kimlik ve hücre kültür saflığı belirlenmesi için her bir izole edilmiş hücre fraksiyonu, hücre tipi özel antijenlere karşı antikorlar ile muamele edilmiştir. Hücreler, ışıltılı ikincil antikorlar ile muamele edilmiş ve mikroskobik inceleme ile incelendi. saflık Hoechst lekelemesi ile göz önüne toplam hücre sayısı ile ilgili olarak olumlu bir floresan boyanan hücrelerin sayılması ile tespit edildi.
Kültür PHH 24 saat karakteristik poligon şekilli ve genellikle poliploidi (Şekil 3E) gösterdi. PHH CK 18 (Şekil 3H) için pozitif ve 92.3 ± 3.2% bir saflık gösterdi(Tablo 3 1).
KC hücre kültürü plastik yüzeylerde 20 dakika içinde yapıştırılır. Önemli bir yuvarlak hücre çekirdeğinde ile 24 saat küçük yuvarlak hücrelerin bir inkübasyon süresi gözlendi sonra (Şekil 3F). Yüzey proteini CD68 KC (Şekil 3J) tespit etmek için kullanıldı. CD68 pozitif hücrelerin saflık 81.0 ± 5.4% (Tablo 3 1) olarak gerçekleşti.
NPC ayrılması sırasında CD31 etiketleme kullanarak MACS ayırma rağmen CD31 ile izole LEC leke hala mümkün oldu. Bu nedenle izole edilmiş ve kültür LEC tanımlanması ve saflık belirlenmesi için CD31 ile lekelenmiştir. Ayrıca LEC mezenkimal hücre belirteci vimentin (Şekil 3K) için immünreaktivite gösterdi. Yaklaşık pozitif boyanan hücreler (Tablo 3 1) ve 81.0 ± 1.7% gözlendi. Onların tipik belirgin lipid damlacıkları ile HSC (Şekil 3H) GFAP (Şekil 3L) için immünofloresan boyama ile işaretlenmiştir. HSC saflıkta 93.0 ± 1.7% (Tablo 3 1).
Her hücre fraksiyonu diğer NPC belirteçleri ile karşıt. Tüm hücre fraksiyonları, diğer karaciğere özgü hücre tipleri çok az sayıda bulunan, ancak hepatosit işaretleyici CK18 ve cholangiocyte markör CK19 için negatifti.
. Şekil 3: İnsan parenkimal ve süspansiyon içinde ve yapışma sonrasında olmayan parankimal karaciğer hücrelerinin morfolojisi sol kolonu (A - D), izolasyon işleminden sonra doğrudan farklı bir izole edilmiş karaciğer hücresi popülasyonlarınınFaz kontrast mikroskopisi görünümünde: PhH (A), KC (B) LEC (C) ve HSC (D). Ortadaki sütun (E - H) kültür (faz kontrast mikroskopisi) ve 24 saat sonra izole edilmiş ve kültür PhH (E), KC (F) LEC (G) ve HSC (H) görüntüler sunar. Farklı hücre fraksiyonlarının İmmünofloresan tabanlı karakterizasyonu son sütunda gösterilmiştir: PHH hepatosit işaretleyici CK18 için olumlu sinyaller (I, izolasyon sonra 24 saat), KC işaretleyici CD68 pozitif olduğunu göstermiştir (J, 24 saat izolasyondan sonra), LEC vimentin (K, 72 saat izolasyondan sonra) için olumlu sinyaller gösterdi ve HSC GFAP (L izolasyondan sonra, 72 saat) pozitif bulunmuştur. Hücre çekirdekleri Hoechst ile boyandı; büyütme: 400X. Exper izniyle Pfeiffer ve ark., 1 2014 modifiyeimental Biyoloji ve Tıp. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
yayınlanan protokol aynı zamanda insan karaciğer dokusunda aynı örnekten yüksek kalitede ve saflıkta, saf PHH ve NPC, yani KC, HSC ve LEC izole etmek için bir yöntem açıklanır. Karaciğer hücre izolasyonları ile ilgili yayınlar çoğunluğu sadece insan dokusu ile gerçekleştirildi, bu hücre popülasyonu 18-20 ve izolasyon prosedürlerinin biri 21 (Damm ve ark., Tarafından) nadirdir kapsamaktadır. İnsan karaciğer hayvan dokusu (örneğin, sıçan karaciğer) ile oluşturulan yöntemlerin adaptasyon hayvan ve insan hücre popülasyonları arasındaki hücre özelliklerinde çeşitli farklılıklar ortaya çıkardı. Farklı karaciğer hücre popülasyonlarının kapsayan bir karaciğer hücre izolasyon yönteminin kurulması parankimal ve non-parankimal hücre izolasyonu birleştirerek nedeniyle optimize sonuçlar için gerekli olan sindirim zaman farkı önemli bir adım olduğunu ortaya koymuştur. Bu meydan okumayla karşı karşıya farklı teknikleri birleştirerek bir karaciğer hücre izolasyon protokolü geliştirdi ve adapteBizim PHH izolasyon protokolü 10 se.
Çözelti II içeren kolajenaz P,% 10 FCS eklenerek Bu proteazların proteolitik aktivitesini azaltmak mümkün. Bu değişiklik NPC yüksek sayıda kazanmak için gerekli uzun sindirim süreleri, izin verdi. Sonuç olarak biz kaliteli NPC olarak ve yüksek miktarda yanı PHH izole başardık. Başarılı karaciğer hücre izolasyonu ilk doku kalitesine kuvvetlice bağlıdır. Donör verileri ve anamnez hücre kalitesini ve miktarını etkileyebilir. Bizim deneyim donör spesifik faktörler ile bir ilişki yoktur ve aynı zamanda çok deneyimli personel başarısız hücre izolasyonu ile karşı karşıya olabilir. Donör doku kalitesi kritik bir noktadır, çünkü doku kalitesini bozabilir tüm harici kaynakları, en aza indirilmesi gerekir.
En kritik faktörler doku t taşıma sırasında cerrahi müdahale ve soğuk iskemi süreleri sonra sıcak iskemi sürelerilaboratuvar o. Buna ek olarak, bakteriyel enfeksiyonlar için bir kaynaklar kaçınılmalıdır. Bazen organ kendisi safra yolu hastalıkları durumunda, örneğin, bakteriyel kontaminasyonu içerebilir dikkat edilmesi gerekir. izolasyon prosedürü içinde kritik adımlar perfüzyon süreleri ve yoğunluk gradyan santrifüj adımları kapsamaktadır. İlk perfüzyon adımı 20-30 dk sürmelidir. Daha kısa perfüzyon süreleri elde hücre süspansiyonu hücre kümelerinin bir oluşum içinde, elde edilen hücre-hücre temas eksik ayrılma neden olabilir. Uzamış ilk perfüzyon hücre canlılığını azaltır ve bağlı Ca 2+ tükenmesi hücre stresi neden olur.
enzimatik doku sindirim için yapılan ikinci perfüzyon adımı doğru zaman noktasında proteolitik reaksiyonu durdurma hakkında karar almak için en uygun sindirim derecesini belirlemek için biraz tecrübe gerektirir. Kısa sindirim süreleri stres ve hücre hasarını hücre düşük verim ve uzun süreli sindirim süreleri yol açar.Bizim deneyim sindirim sırasında sindirilmemiş doku ve hasarlı doku arasındaki zaman çerçevesi genellikle 1-3 dakikalık bir pencere içinde yatıyor. Eksik perfüzyon kanüller kapalı kısma için kelepçeler kullanarak başka alana doku içinde basınç kaydırarak karşılık olabilir. doku numunesi doğru bir spatula ile ek olarak, yumuşak basınç perfüzyonu bir değişikliğe yol açar. Doku sıkıştırılmış ve iç basınç artar. Daha sonra, kan damarları da sıkıştırılmış ve yarıçapı azalmaktadır. yarıçapı bir azalma ile, direnç artar (Hagen-Poiseuille yasası) ve perfüzyon çözüm en az direnci ve perfuses diğer alanların yol tercih eder. Baccarani ve işçiler uyarınca biz fibrotik veya siroz doku hücre canlılığı 22 azalmasına yol uzun bir sindirim dönemi ihtiyacı olduğunu gözlemledik. Bu nedenle karaciğer fibroz ya da sirozlu hastalarda doku önlemek için önerilir.
hazırlanması vegeçişlerini dışında yoğunluk geçişlerini ele alınması yanı sıra hasat hücreleri (adım 5 ve 7) da kritik adımları kapsamaktadır. Farklı yoğunluk gradyan katmanları ve hücre süspansiyonu keskin arafazların oluşturulması için yavaş ve dikkatli bir şekilde transfer edilmesi gerekiyor. Ayrıca hücrelerin hasat özellikle iken, taşıma sırasında degrade zarar riski her zaman vardır. NPC ayrılması sırasında bağlılık ayırma adımı tüm NPC fraksiyonların sonraki verim ve saflık açısından çok önemlidir. olup yapıştırılır NPC hücre sayısı ve KC saflığını artırmak için ek bir yıkama aşaması yararlı olabilir. Bu adımın çamaşır çözeltisi, bundan başka NPC ayrılması için süpernatantlar ile bir yerde toplanır. Bakterilerin kontaminasyonunu önlemek için, mantarlar veya virüs sıkı aseptik koşullar 23 sağlanmış olması gerekir.
Gerekli hücre popülasyonlarının bağlı olarak protokol belirli adımlar atlayarak değişti ve ayarlanabilir. Örneğin sadece KC iseNPC çökelme için çift santrifüj adımı, ikinci merkezkaçlama aşamasının indirgenebilir ve HSC ve LEC ayrılması için adım bırakılabilir gerekli. santrifüj için perfüzyon süresi ve G-kuvveti doku ve hücre kalitesi bağlı olarak değiştirilebilir. Fibrotik doku dikkatlice doku esnekliğini kontrol etmek için bir gereksinim vardır, sindirim kez uzun süreli gerektirir. yağ hepatositlerde lipid damlaları birikimine hücre yoğunluğu azalır ve bu nedenle sedimentasyon özelliklerini değiştirir. Bizim gözlemlerimize göre yüksek PHH miktarlarda gerekli olan PHH, lipid içeriğine bağlı PHH izolasyonu sırasında g-kuvveti ayarlamak için yararlı olabilir. Bu, ilk santrifüj aşamasının herhangi bir değişiklik, nitelik ve nicelik açısından NPC izolasyon etki olumsuz olacağını belirtmek gerekir. Şimdiye kadar, 50 xg (düşük yağ içerikli hepatositler) ve 150 x (yüksek yağ içeriğine sahip hepatositler) arasındaki g-kuvvetleri öneriyoruz. Ayrıca yağlı hepatocytes yoğunluk gradyanlı santrifüj sonra daha az kompakt bir hücre pelletini ve daha fazla hücre toplama aşamasında 5.5 de tarif edildiği gibi değiştirilmesi gerekir oluşturma eğilimindedir.
bazı adımlar aynı anda yapılabilir izolasyon prosedürü hızlandırmak için. İzole hepatositlerde saflaştırılması paralel olarak, örneğin ikinci bir kişi NPC izolasyon ile başlayabilir. Buna ek olarak, yoğunluk gradyanlı çözümler, önceden hazırlanabilir. ikiden fazla kişi varsa bile daha fazla adım aynı anda yapılabilir.
Deneysel Biyoloji ve Tıp 1 daha önce yayınlanmış diğer insan karaciğer hücre izolasyonu protokollerine karşılaştırıldığında bizim sonuçlarımız benzer veya daha yüksek hücre verim ve canlılığı göstermektedir. KC izolasyonu Alabraba ve arkadaşları, karşılaştırılabilir yaklaşık% 98 13 arasında bir canlılığı ile kombine 2.3 x 10 6 canlı KC / g karaciğer dokusu verimle izole sonuçlar gösterilmiştir içinBizim KC sonuçları (hücre sayısı: 1.9 x 10 6 canlı KC / g karaciğer dokusu, canlılık yaklaşık% 93). Yayınlanan LEC izolasyon verilerinin çoğunluğu bütün organlarının 15,24 den izolasyonlar açıklar. Gerlach ve arkadaşları yanı sıra Lalor ve arkadaşları 10 3 ve 10 6 hücre / organın 15,24 arasında hücre sayıları izole edilmiştir. Bu veriler, doku örneklerinden izolasyonların hücre doğrudan karşılaştırılamaz. Ancak, bizim protokolünü kullanarak biz bir organ üzerinde çıkılarak zaman çok daha büyük göredir 2.7 x 10 5 canlı LEC / g karaciğer dokularının LEC için verimlerini gösterdi. HSC% 90 hakkında yaklaşık 4.7 x 10 5 canlı HSC / g karaciğer dokusu verim ve canlılık ile izole edilmiştir. Friedman ve arkadaşları tarafından yayınlanan Mevcut sonuçlar yarım alt hücre verimleri (2.3 x 10 5 HSC / g karaciğerleri), ancak benzer bir saflığa (% 91) 14 gösterdi. Bizim protokolü ile ilgili olarak, düşük hücre verimi nedeniyle 1x Perfüzyon-Solutio düşük veya hiç dolaşıma kötü perfüzyon ve sindirim neden olabilirn, I ve doku içinde Sindirime çözümü. Ayrıca dokuda gaz kabarcıkları 1x Perfüzyon-Çözüm I ve Sindirim-Çözüm içi doku dolaşımını bozabilir. Bu gibi durumlarda, perfüzyon tek kanüllerin kıskaç ve / veya doku numunesi karşı itmek için bir spatula ile gaz kabarcıklarının perfüzyon basıncı ve eleme arttırarak geliştirilebilir. Kötü bir canlılığı çoğu hücre stres bir sonucudur. Uzun süreli iskemi kez Ca 2 + tükenmesi ve membran proteinlerinin proteoliz ile hasar, hücre zarının kabarcıkların görünür hasar, hücre ile bağlantılıdır. gözlemlerimize kaynaktan çok hassas olan bu hücreler, kesme stresine karşı ve çoğu durumda izolasyon prosedürü sırasında ölen. Özetle, başarılı izolasyon ve parankimal ve non-parankimal karaciğer hücrelerinin ayrılması, pipet adımlar hücre izolasyonu ve ayırma s dikkatli ve genel olarak zaman yapılır kritik adımlar doğru bir zaman dilimi içinde yerine getirilmesini gerektirirhould mümkün 21 olduğunca kısa tutulmalıdır. Açıklanan protokol bir dezavantajı izolasyon koşulları (örn perfüzyon kez) tamamen standardize olamaz, ancak doku kalitesine ayrı ayrı adapte edilmesi olmasıdır. Buna ek olarak, elde edilen hücre popülasyonu verimi ve saflığı, doku kalitesinin ve sindirim sonucu bağlı olarak değişebilir.
Biz son zamanlarda bu yöntemle 1 ile izole her NPC hücre tipi fonksiyonel karakterizasyonu ile birlikte yetiştirme koşullarının etkisini gösteren bir çalışma yayınladı. Olasılığı izole etmek ve karaciğer, ayrı, farklı hücre popülasyonları yenilikçi insan karaciğer hücre ko-kültür ve doku mühendisliği, in vitro karaciğer model oluşturulmasına izin verir. İyi 2B mono- kültürlerinde PHH ekimi farklılaşmanın giderilmesi ve tipik hücre fonksiyonlarının 7 kaybına yol açtığı bilinmektedir. Nedenle, in vivo olarak, doku Archi taklit etmek için gerekli olanIn vitro karaciğer modelleri içinde tecture. Kostadinovai ve arkadaşları, (2013 8,9) hem de Messner ve arkadaşları, (2013 8,9) başarılı bir şekilde hepatotoksik etkilerinin saptanması için fonksiyonel ko-kültür, karaciğer modelini oluşturmuştur. Bununla birlikte, NPC karakterize edilmedi ve özel fonksiyonlar bu sistemlerde araştırılmamıştır.
Bu nedenle daha fazla araştırma ko-kültürler içinde NPC uzun süreli sağkalım üzerine soruşturma, kendine özgü karakteri ve etkileşimleri üzerinde odaklanmalıdır. Bu çalışmalar için, aynı zamanda cholangiocytes izolasyonu için protokol için ilgi çekici olabilir. Yerli karaciğerde bulunan tüm hücre tipleri de dahil olmak üzere fonksiyonel in vitro ko-kültür gerçekleştirilmesi insan karaciğer modeller gibi in vivo yöne doğru bir adım daha olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
0315741: Biz Bu çalışma Eğitim ve Araştırma (BMBF) projesi Sanal Karaciğer Alman Federal Bakanlığı tarafından desteklenen Şekil 1'de oluşturulmasında desteklerinden dolayı Jia Li Liu teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| General Equipment | |||
| PIPETBOY | Eppendorf | ||
| pipettes | Eppendorf | ||
| microscope | Carl Zeiss | ||
| microscope | Olympus | ||
| CO2-incubator | Binder | ||
| Lamin Air | Heraeus | ||
| Centrifuge Varifuge 3.0R | Heraeus | ||
| Urine Beaker | Sarstedt | 2041101 | |
| perfusor syringe 50 ml | B.Braun | 12F0482022 | |
| Bottle Top Filter | Nalgene | 1058787 | |
| Falcon 50 ml Polypropylene Conical Tube | BD Biosciences | 352070 | |
| Falcon 15 ml Polypropylene Conical Tube | BD Biosciences | 352096 | |
| Tissue Culture plate | BD Biosciences | 533047 | 24 well |
| serological pipettes | BD Biosciences | 357525, 357551, 357543 | 25 ml, 10 ml, 5 ml |
| pipette tips | SARSTEDT | 0220/2278014, 0005/2242011, 0817/2222011 | 100 µl, 200 µl, 1,000 µl |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isolation Equipment | |||
| water bath | Lauda | ||
| peristaltic pump | Carl Roth | ||
| circulation thermostat | Lauda | ||
| pH meter | Schott | ||
| fine scales | Sartorius | ||
| stand | |||
| Büchner funnel | Haldenwanger | ||
| plastic funnel | |||
| silicone tube | |||
| cannulae with olive tips | |||
| glass dish | |||
| forceps | |||
| scalpel | Feather | 12068760 | |
| Neubauer counting chamber | Optic Labor | ||
| cell lifter | Costar | ||
| Surgical Drape | Charité Universitätsmedizin Berlin | A2013027 | |
| compress | Fuhrmann | 40013331 | |
| sterile surgical gloves | Gammex PF | 1203441104 | |
| Tissue glue | B. Braun | 1050052 | |
| glass bottle | VWR | ||
| Collagenase P | Roche | 13349524 | |
| Percoll Separating Solution | Biochrom | L6145 | Density 1.124 g/ml |
| Hank’s BSS | PAA | H00911-3938 | |
| Dulbecco’s PBS | PAA | H15 - 002 | without Mg/Ca |
| Ampuwa | Plastipur | 13CKP151 | |
| Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| NaCl | Merck | 1,064,041,000 | |
| KCl | Merck | 49,361,000 | |
| Hepes Pufferan | Roth | 133196836 | |
| EDTA | Sigma | E-5134 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media Equipment | |||
| DMEM | PAA | E15-005 | Low Glucose (1 g/L) (without L-Glutamine) |
| HEPES Buffer Solution 1 M | GIBCO | 1135546 | |
| L-Glutamine | GIBCO | 25030-024 | 200 mM |
| MEM NEAA | GIBCO | 11140-035 | |
| penicillin/streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | PAA | E15 - 039 | without L-Glutamine |
| Sodium Pyruvate | GIBCO | 1137663 | 100 mM |
| Trypan Blue Solution | Sigma-Aldrich | T8154 | 0.4% |
| William’s E | GIBCO | 32551-020 | |
| with GlutaMAX™ | |||
| EGTA | Sigma-Aldrich | 03780-50G | |
| Fortecortin | Merck | 49367 | 8 mg/2 ml |
| Human-Insulin | Lilly | HI0210 | 100 I.E./ml |
| N-Acetyl cysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
| Fetal calf serum (FCS) | PAA | A15-101 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment for Immunostainings | |||
| CD 68 | R&D Systems, USA | monoclonal | |
| CK 19 | Santa Cruz | D2309 | polyclonal |
| CK18 | Santa Cruz | K2105 | monoclonal |
| Vimentin | Santa Cruz | monoclonal | |
| GFAP | Sigma Aldrich | monoclonal | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 23.472-9 | |
| Goat anti-Mouse IgG1-PE | Santa Cruz | C0712 | |
| Goat anti-rabbit IgG-FITC | Santa Cruz | L0412 | |
| Methanol | J.T.Baker | 1104509006 | |
| Formaldehyde 4% | Herbeta Arzneimittel | 200-001-8 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A7906-100G |
References
- Pfeiffer, E., et al. Isolation, characterization, and cultivation of human hepatocytes and non-parenchymal liver cells. Exp Biol Med. , Maywood. (2014).
- Si-Tayeb, K., Lemaigre, F. P., Duncan, S. A.
- Alpini, G., Phillips, J. O., Vroman, B., LaRusso, N. F. Recent advances in the isolation of liver cells. Hepatology. 20 (2), 494-514 (1994).
- Godoy, P., et al. Recent advances in 2D and 3D in vitro systems using primary hepatocytes, alternative hepatocyte sources and non-parenchymal liver cells and their use in investigating mechanisms of hepatotoxicity, cell signaling and ADME. Arch Toxicol. 87 (8), 1315-1530 (2013).
- Gómez-Lechón, M. J., Castell, J. V., Donato, M. T. Hepatocytes--the choice to investigate drug metabolism and toxicity in man: in vitro variability as a reflection of in vivo. Chem Biol Interact. 168 (1), 30-50 (2007).
- Ginai, M., et al. The use of bioreactors as in vitro models in pharmaceutical research. Drug Discov Today. 18 (19-20), 922-935 (2013).
- Schyschka, L., et al. Hepatic 3D cultures but not 2D cultures preserve specific transporter activity for acetaminophen-induced hepatotoxicity. Arch Toxicol. 87 (8), 1581-1593 (2013).
- Kostadinova, R., et al. A long-term three dimensional liver co-culture system for improved prediction of clinically relevant drug-induced hepatotoxicity. Toxicol Appl Pharmacol. 268 (1), 1-16 (2013).
- Messner, S., Agarkova, I., Moritz, W., Kelm, J. M. Multi-cell type human liver microtissues for hepatotoxicity testing. Arch Toxicol. 87 (1), 209-213 (2013).
- Nussler, A. K., Nussler, N. C., Merk, V., Brulport, M., Schormann, W., Yao, P., Hengstler, J. G. The Holy Grail of Hepatocyte Culturing and Therapeutic Use. Strategies in Regenerative Medicine. Santin, M. , Springer. New York. 1-38 (2009).
- Friedman, S. L., Roll, F. J. Isolation and culture of hepatic lipocytes, Kupffer cells, and sinusoidal endothelial cells by density gradient centrifugation with Stractan. Anal Biochem. 161 (1), 207-218 (1987).
- Knook, D. L., Blansjaar, N., Sleyster, E. C. Isolation and characterization of Kupffer and endothelial cells from the rat liver. Exp Cell Res. 109 (2), 317-329 (1977).
- Alabraba, E. B., et al. A new approach to isolation and culture of human Kupffer cells. J Immunol Methods. 326 (1-2), 139-144 (2007).
- Friedman, S. L., et al. Isolated hepatic lipocytes and Kupffer cells from normal human liver: morphological and functional characteristics in primary culture. Hepatology. 15 (2), 234-243 (1992).
- Lalor, P. F., Lai, W. K., Curbishley, S. M., Shetty, S., Adams, D. H. Human hepatic sinusoidal endothelial cells can be distinguished by expression of phenotypic markers related to their specialised functions in vivo. World J Gastroenterol. 12 (34), 5429-5439 (2006).
- Lee, S. M., Schelcher, C., Demmel, M., Hauner, M., Thasler, W. E. Isolation of human hepatocytes by a two-step collagenase perfusion procedure. J Vis Exp. (79), (2013).
- Rajan, N., Habermehl, J., Coté, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat Protoc. 1 (6), 2753-2758 (2006).
- Chang, W., et al. Isolation and culture of hepatic stellate cells from mouse liver. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 46 (4), 291-298 (2014).
- Zeng, W. Q., et al. A new method to isolate and culture rat kupffer cells. PLoS One. 8 (8), e70832 (2013).
- Tokairin, T., et al. A highly specific isolation of rat sinusoidal endothelial cells by the immunomagnetic bead method using SE-1 monoclonal antibody. J Hepatol. 36 (6), 725-733 (2002).
- Damm, G., et al. Human parenchymal and non-parenchymal liver cell isolation, culture and characterization. Hepatology International. 7, 915-958 (2013).
- Baccarani, U., et al. Isolation of human hepatocytes from livers rejected for liver transplantation on a national basis: results of a 2-year experience. Liver Transpl. 9 (5), 506-512 (2003).
- Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q., Liu, M. Isolation and primary culture of rat hepatic cells. J Vis Exp. (64), (2012).
- Gerlach, J. C., et al. Large-scale isolation of sinusoidal endothelial cells from pig and human liver. J Surg Res. 100 (1), 39-45 (2001).
