Abstract
Ao lado de hepatócitos do parênquima, o fígado é composto de células não-parenquimatosas (NPC), como as células de Kupffer (KC), células endoteliais do fígado (LEC) e células estreladas hepáticas (HSC). Bidimensional (2D) de cultura de hepatócitos humanos primários (PHH) ainda é considerado como o "padrão de ouro" para testes in vitro do metabolismo do fármaco e hepatotoxicidade. É bem conhecido que a monocultura 2D da PHH sofre de desdiferenciação e perda de função. Recentemente, foi mostrado que NPC hepática desempenham um papel central no fígado (pato-) fisiologia e a manutenção das funções PHH. A investigação actual centra-se na reconstrução de tecidos in vivo pela arquitectura 3d- e co-cultura de modelos para ultrapassar as limitações de monoculturas 2D. Anteriormente, publicou um método para isolar células do fígado humano e investigado o uso destas células para a sua utilização em culturas de células em Biologia Experimental e Medicina 1. Com base no amplo interesse neste technique o objetivo deste artigo foi o de fornecer um protocolo mais detalhado para o processo de isolamento das células do fígado, incluindo um vídeo, o que permitirá uma fácil reprodução desta técnica.
células de fígado humano foram isoladas a partir de amostras de tecido de fígado humanas de intervenções cirúrgicas por uma técnica de perfusão P EGTA / colagenase em dois passos. PHH foram separadas a partir do APN por uma centrifugação inicial a 50 x g. Densidade passos de centrifugação de gradiente foram usadas para a remoção de células mortas. populações de células de fígado individuais foram isolados a partir da fracção enriquecida NPC usando as propriedades de células específicas e os procedimentos de separação de células. Ao lado do isolamento PHH fomos capazes de separar KC, LEC e HSC para posterior cultivo.
Tomados em conjunto, o protocolo apresentado permite o isolamento de PHH e NPC em alta qualidade e a quantidade de amostra de tecido de um dador. O acesso a populações de células do fígado purificados poderia permitir a criação de in vivo como li humanamodelos Ver.
Introduction
tecido de fígado humano é altamente complexo e consiste em duas entidades diferentes de células, células parenquimatosas e células não-parenquimatosas (NPC). células parenquimatosas do fígado incluem hepatócitos e cholangiocytes. Hepatócitos representam 60 a 70% das células do fígado totais e representam a maioria das funções metabólicas no fígado, por exemplo, ácidos biliares e complementar a síntese de factor de, biotransformação e metabolismo energético 2,3.
A fracção mais pequena NPC constitui 30-40% do total de células de fígado. NPC incluem diferentes populações de células, ou seja, células de Kupffer (KC), células endoteliais do fígado (LEC) e as células estreladas hepáticas (HSC). Esta fracção de células heterogénea desempenha um papel central em processos fisiológicos do fígado. Além disso, NPC participar na mediação de lesão hepática aguda, por exemplo, lesão hepática induzida por drogas (DILI), assim como em lesões hepáticas crónicas, tais como a cirrose 4.
Nos últimos anos, hcélulas do fígado uman tornaram-se cada vez mais essencial na pesquisa e desenvolvimento de testes de drogas, o desenvolvimento de drogas e identificação de novos caminhos bioquímicos em doenças do fígado. Para os testes in vitro monoculturas PHH ainda são considerados como o "padrão ouro" 5. A principal limitação dos modelos actuais homotípicas fígado é desdiferenciação e perda de função dos hepatócitos em poucos dias 4. O estabelecimento de 3-dimensionais (3D técnicas de cultura) mostrou que estas limitações podem ser compensadas 4,6. No entanto, mesmo modernas técnicas de cultura 3D não são capazes de exibir todos os modos hepatotóxicos de ações 7. Faltando populações NPC em modelos in vitro existentes são discutidos como uma possível razão para esta discrepância com a situação in vivo. Tem sido demonstrado que a comunicação célula-célula entre as diferentes populações de células de fígado desempenha um papel central na homeostase fisiológica, mas também em pathophysiologic processa 8. Portanto, a atenção científica se concentra cada vez mais em NPC e suas interações célula-célula. Seu uso proposital em sistemas de engenharia de tecidos co-cultura e poderia ser uma solução para a elevada procura de modelos in vitro do fígado 8,9, que são o mais próximo possível da situação in vivo quanto possível.
Atualmente, o principal desafio é o desenvolvimento de um modelo de co-cultura fígado humano padronizado, que contém partes claramente definidas de PHH e NPC. Em consequência, as técnicas de isolamento para as células do fígado muito heterogéneos são necessários e aqueles tem que ser optimizado para obter populações de células puras. Enquanto protocolos padronizados para isolamento PHH existem 10, o isolamento padronizado de NPC humano ainda está em desenvolvimento. Protocolos de isolamento mais NPC publicados são baseadas em experiências com células não-humanos 11,12. Apenas algumas publicações descrevem o processo de isolamento do NPC humana e mais cobrem apenasmétodos para o isolamento de um único tipo de célula 11-16. As características mais importantes de células que foram aproveitadas para a separação de células são de tamanho, densidade, o comportamento de fixação, e a expressão de proteínas de superfície. Na base destas características foi desenvolvido um protocolo simplificado para isolar PHH, KC, LEC e HSC, o qual foi publicado anteriormente em Experimental Biology and Medicine 1. Por causa do grande interesse nesta técnica, o objectivo deste artigo foi o de fornecer um protocolo mais detalhado para o processo de isolamento de células de fígado incluindo um vídeo, o que permitirá reproduzir a técnica mais facilmente. O protocolo também inclui métodos de controlo de qualidade para avaliação do rendimento e a viabilidade, bem como para a identificação e a pureza avaliação utilizando colorações imunológicas específicas.
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Protocol
Nota: Todas as células foram isoladas a partir de tecido do fígado ressecado não-tumoral humana, que permaneceu após a ressecção parcial do fígado com tumores hepáticos primários ou secundários. O consentimento informado dos pacientes foi obtido de acordo com as diretrizes éticas da Charité - Universitätsmedizin Berlim.
1. Preparação de Materiais e Soluções
- Esterilizar todos os instrumentos e os materiais com antecedência, para evitar a contaminação bacteriana durante o processo de isolamento.
- Preparar as soluções necessárias para a perfusão da amostra de tecido do fígado, o processo de isolamento de hepatócitos e células do fígado não-parenquimatosas e o cultivo de células de fígado humanas primárias de acordo com as Tabelas 1 e 2, com excepção da digestão-solução que é preparada imediatamente antes da utilização. Todas as soluções podem ser armazenadas a 4 ° C e é recomendado para usá-los dentro de 4 semanas após a preparação.
- Esterilizartodas as soluções que utilizam um filtro top 0,22 garrafa.
2. Preparação da perfusão Equipamento
- Defina-se a equipamento para a perfusão e a digestão da amostra de tecido do fígado, como mostrado na Figura 1A.
- Ajustar a temperatura do banho de água a 39 ° C para assegurar a actividade óptima P colagenase durante a perfusão e digestão.
3. perfusão e digestão da amostra de tecido do fígado (1,5 h)
- Seleccionar uma amostra de tecido com uma cápsula de Glisson intacta a partir do tecido ressecado fígado. Ao cortar a amostra de tecido, tentar obter uma superfície de corte pequena com boas vasos visíveis. Evitar tempos de isquemia quente pelo transporte e manuseio da amostra de tecido do fígado em gelo até perfusão.
- Aqui o peso de tecido sob condições estéreis e colocar a amostra de tecido do fígado em uma placa de Petri no fluxo de ar laminar. Limpar a superfície da amostra de tecido com uma compressa estéril de remaining sangue e liberar o conjunto cânula usando 1x Perfusão-Solution I para garantir que todos cânula eram permeáveis.
- Use cola de tecido para fixar as azeitonas das cânulas em alguns vasos sanguíneos maiores. Dependendo do tamanho da amostra de tecido do fígado e o número de vasos na superfície, utilizar uma cânula de definir com 3 a 8 cânulas. Teste a perfusão e verificar se há vazamentos. Fechar todos os vasos sanguíneos, que vazam clara 1x Perfusão-Solution I, com cola de tecido.
- Colocar a amostra de tecido do fígado canulada para o funil de Buchner sobre o seu disco de filtro perfurado (Figura 1A).
- Definir a taxa de fluxo da bomba peristáltica entre 7,5 ml / min e 14,6 ml / min, dependendo do número de cânulas e utilizados na resistência do tecido do fígado. Ajustar o caudal de cada vez para garantir que há uma corrente de perfusão mas lento. Perfundir o tecido até que o sangue total é lavada para fora, mas, pelo menos, 20 min. Observe o tecido se tornar mais brilhante em áreas com boas perfusiem.
Nota: Em alguns casos, pode ser necessário para fixar uma das cânulas com grampos plásticos ou para aumentar a pressão interior de uma área, empurrando suavemente com uma espátula contra a cápsula do fígado, para optimizar a perfusão. A mudança de cor completa para uma luz amarela para cor acastanhada luz indica uma boa perfusão. - Mudar o fluido de perfusão à digestão-solução contendo colagenase P (Tabela 1).
- Reorganizar a configuração (Figura 1A) para a etapa de digestão. Portanto, realizar um fluxo circular da digestão-Solução de acordo com a Figura 1B para até 15 minutos.
Nota: É crítico para parar imediatamente a perfusão, quando a amostra de tecido de fígado digerido é suficientemente. Uma boa digestão pode ser observado, quando o tecido não mostra sinal de elasticidade tal como avaliada por manutenção de deformações da cápsula, quando é empurrado com uma espátula.
4. Isolamento de hepatócitos (1 h)
- Turna bomba peristáltica fora e colocar a amostra de tecido do fígado num prato de vidro. Lavar o exterior da amostra de tecido com gelo frio Stop Solution (Tabela 1). Retirar as cânulas da amostra de tecido do fígado. Usar um bisturi para abrir a amostra de tecido do fígado, por incisão no meio da área onde as cânulas foram ligados. Manter cuidado para que a cápsula Glisson's permanece intacta.
- Lavar o interior da amostra de tecido e, em seguida cobrir toda a amostra de tecido com gelo frio Stop Solution. Agitar suavemente o tecido para libertar as células para fora do tecido.
- Recolha a suspensão de células e filtrá-la através de um funil olhar (funil de plástico forrado com compressa de gaze) em tubos de 50 ml de plástico. Adicionar mais Stop-Solução para a amostra de tecido do fígado, até um volume final de 500 ml é consumido.
- Centrifugar a suspensão de células a 50 xg, 5 min, 4 ° C. Recolhe-se o sobrenadante para o isolamento de células não-parenquimatosas mais tarde. Lava-se a pelete de células com PBS (Figura 2A).
- Centrifugar novamente a suspensão de células a 50 xg, 5 min, 4 ° C. Recolhe-se o sobrenadante e ressuspender o sedimento em meio de incubação de hepatócitos (Tabela 2, Figura 2B).
- Determinar o número de células e a viabilidade na suspensão de células resultante utilizando coloração com azul de tripano. Contar as células vivas e mortas em uma câmara de contagem Neubauer. Calcule o número de células, viabilidade e produtividade de PHH usando as fórmulas abaixo.
rendimento (células contadas) = células contadas x factor de diluição x volume de suspensão de células (ml) x 10.000
rendimento (hepatócitos / (g de fígado amostra de tecido)) = (rendimento (hepatócitos / (meios ml)) x volume de suspensão de células (ml)) / (peso da amostra de tecido do fígado (g))
viabilidade (%) = 100% x (número de células vivas) / (número total de células)
5. Purificação de hepatócitos (1 h)
Nota: Este passo de purificação é recomendado, se a viabilidadeé inferior a 70%.
- Execute todas as etapas no gelo. Preparar um gradiente de densidade de 25% por mistura de 5 ml de solução de gradiente de densidade e 15 ml de PBS por centrifugação em gradiente de densidade.
- Coloque um máximo de 50 células Mio total de suspensão de células de hepatócitos rico cuidadosamente e lentamente na parte superior da camada de gradiente de densidade de 25% para assegurar que uma clara separação de ambas as camadas é conseguida (Figura 2C). Colocar os tubos cuidadosamente para a centrífuga e centrifugar a 1250 x g, 20 min, 4 ° C sem travagem (Figura 2D).
- Aspirar a suspensão de células remanescente e as células mortas na interfase. Dependendo do um teor de matéria gorda também pode aspirar o gradiente de densidade-solução.
Nota: PHH, com baixo teor de lípido formar um sedimento denso e o gradiente de densidade pode ser completamente aspirados. PHH com elevado teor de lípidos formam um sedimento mais difusa e uma grande quantidade de células viáveis podem permanecer na solução de gradiente de densidade acima do sedimento. - Re-suspender as pelotas de hepatócitos com PBS e centrifugar novamente a 50 x g, 5 min, 4 ° C. Reúnem-se os aglomerados, lavar novamente com PBS e re-suspender purificada PHH em meio Hepatócito incubação. Efectuar a contagem das células, como descrito no passo 4.6.
6. A cultura de hepatócitos
- Prepare os pratos de cultura de células para a semeadura do PHH revestindo-os com uma matriz extracelular, por exemplo, colagénio de cauda de rato (colagénio do tipo I). Prepare o colagénio da cauda de rato de acordo com o protocolo estabelecido por Rajan et al. 17
- Dilui-se a solução de colagénio da cauda de rato a 1: 200 em PBS. Transferência / cm solução de 100 ul 2 rat colagénio de cauda nas placas de cultura, tomando cuidado para que toda a superfície é coberta. Incubar os plásticos de cultura de células durante 20 minutos à temperatura ambiente. Aspirar a restante solução de colagénio de cauda de rato.
- Semente de 15 x 10 4 hepatócitos / cm 2 em meio de incubação em Hepatócito dishe culturas revestidos com colagénio de cauda de rato. Cultivar as células numa incubadora humidificada a 37 ° C, 5% de CO 2 durante pelo menos 4 h. Após 4 h os hepatócitos aderiram e a forma pode ser alterada.
- Realizar pesquisas, dependendo da configuração experimental. Um tempo de cultura de 48 horas é recomendado para permitir que as células para recuperar do processo de isolamento.
7. O isolamento das células do fígado não-parenquimatosas (1,5-2 h)
- Centrifugar o sobrenadante recolhido (passo 4,5 e 4,6) a 72 x g, 5 min, 4 ° C para eliminar os eritrócitos e hepatócitos remanescentes. Reúnem-se os sobrenadantes e centrifuga-se duas vezes para obter dois sedimentos celulares: 300 xg, 5 min, 4 ° C durante a sedimentação de HSC, LEC e, em parte, KC e 650 xg, 7 min, 4 ° C durante a sedimentação do restante KC.
- Piscina ambos os pellets e re-suspendê-las em HBSS. Prepare um 25% e um gradiente de densidade de 50% de mistura de solução de gradiente de densidade e PBS para Centrif gradiente de densidadeugation (25% de solução de gradiente de densidade: 5 ml de solução de gradiente de densidade e 15 ml de PBS, solução de gradiente de densidade de 50%: solução de gradiente de densidade de 10 ml e 10 ml de PBS, ver Figura 2). Coloque a solução com gradiente de densidade de 25% cuidadosamente no topo da camada de solução de gradiente de densidade de 50%.
- Coloque a suspensão NPC cuidadosamente e lentamente na parte superior da camada de solução de gradiente de densidade de 25% de uma forma que é conseguida uma clara separação das duas camadas.
- Centrifugar a suspensão de células em gradiente de densidade a 1800 xg, 20 min, 4 ° C sem travagem (Figura 2.2).
- Aspirar as células mortas e detritos celulares a partir da camada superior. A APN estão localizadas na interface entre a camada de gradiente de densidade de 25% e 50% (Figura 2). Recolhe NPC, lavá-las com HBSS e centrifugar a suspensão de células a aplicação do passo de centrifugação acima descrito dupla (passo 7.2.).
8. Separação de células de Kupffer (AderênciaSeparação Passo) (1 h)
- Executar uma contagem de células para o KC na fracção NPC tal como descrito na etapa 4.6. (Para aparecimento de KC em suspensão ver Figura 3B). Centrifugar a fracção NPC com o passo de centrifugação dupla acima descrito (passo 7.2) e re-suspender o NPC na Kupffer celular meio de sementeira (Tabela 2).
- Semente da fracção contendo KC em vasos de cultura de células de plástico a uma densidade de 5 x 10 5 KC / cm 2. Incubam-se as culturas KC durante 20 min numa incubadora humidificada a 37 ° C, 5% de CO 2. KC primária aderir em plásticos de cultura de células dentro de um curto período de tempo (Figura 2.3).
- Recolher o sobrenadante contendo não aderiu NPC, que consiste principalmente de LEC e HSC. Reúnem-se os sobrenadantes para a separação posterior do LEC (ver secção 9) e HSC (ver secção 10). Lava-se a KC aderente com HBSS e cultivar-los em Kupffer meio de cultura celular (Tabela 2), a 37 ° C, 5% de CO2, num incubador humidificado.
9. Separação de Células Endoteliais (1,5 h)
- Centrifugar o sobrenadante recolhido (passo 8.5.) A 300 xg, 5 min, 4 ° C. Lava-se a pelete com PBS. Após centrifugação a 300 xg, 5 min, 4 ° C, re-suspender as células em Stellate celular / meio de separação celular endotelial e executar uma contagem de células para todas as células restantes como descrito no passo 4.6.
- Re-suspender a 1 x 10 7 células Mio em 1 ml Stellate Celulares / meio de separação celular endotelial, adicionar 20 ul de solução bloqueadora do MACS-Kit e 20 ul da CD31 micro esferas de imunomarcação e incubar a suspensão resultante durante 15 min a 4 ° C de temperatura (Figura 2.4).
- LEC independente de HSC, tal como descrito no protocolo MANUFACTURER'S para o sistema de separação de células activadas magneticamente MACS (Figura 2.5). Eluir LEC CD31-positivo magneticamente retida e suspendê-las em C StellateEll / meio de cultura de células endoteliais (Tabela 2).
- Efectuar a contagem de células para LEC tal como descrito na etapa 4.6. LEC semente em uma densidade de 1,25 x 10 5 células / cm2 em vasos de cultura de células revestidas com colagénio de cauda de rato (ver passo 6.1). Cultivar as células a 37 ° C, 5% de CO2 num incubador humidificado.
10. Separação de células estreladas (0,5 h)
- Unlabeled HSC passar a coluna de separação durante o procedimento MACS. Recolher a fracção HSC (veja o passo 9.5, Figura 2.5). Efectuar a contagem das células, como descrito no passo 4.6.
- HSC de sementes com uma densidade de 5 x 10 4 células / cm2 em vasos de cultura de células revestidas com colagénio de cauda de rato (ver passo 6.1) em Stellate celular / meio de cultura de células endoteliais (Tabela 2) e cultivam-los a 37 ° C, 5% CO2 numa incubadora humidif içada.
Tabela 1: perfusão e solução de isolamento.
Tabela 2: Cultura e isolamento de meios de comunicação.
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Representative Results
A separação em uma fracção parenquimal e não-parenquimatosas, utilizando gradiente de densidade de centrifugação como um procedimento de limpeza combinada com a utilização de propriedades de aderência e MACS leva a PHH bem sucedida e isolamento NPC. PHH e NPC pode ser isolado em alta qualidade e de quantidade. A Figura 1 mostra a configuração representativa do equipamento para a perfusão do fígado e digestão. 10% de FCS foi adicionado à colagenase P contendo Perfusion - Solução II para reduzir a actividade proteolítica de proteases e para estabilizar a actividade da colagenase P em retorno. Em consequência mais períodos de digestão necessárias para o isolamento NPC pode ser aplicado sem um impacto negativo sobre a viabilidade da PHH.
Figura 1:. Perfusão e configuração digestão O primeiro passo de perfusão é levado a cabo na order para remover o sangue residual, aquecer o tecido e remover Ca 2+ para dissolver célula-célula-conexões usando perfusões 1x Solução I (PI) (A). A recirculação da digestão-Solução (DG) é realizada por digestão do tecido do fígado durante o passo de perfusão II (B).
Figura 2:. Simplificado representação esquemática do processo completo isolamento PHH e NPC Modificado de Pfeiffer et al 1, 2014, com permissão de Biologia Experimental e Medicina.. Em primeiro lugar, a amostra de tecido de fígado é perfundido e digerido por uma técnica de P perfusão de duas etapas de EGTA / colagenase (A). A suspensão de células obtida é centrifugada inicialmente a 50 x g, 5 min, 4 ° C (B), para separar a maior fracção PHH-(pelete) a partir da NPC-fracção menor (supernatant). No caso de uma viabilidade PHH abaixo de 70%, a fracção PHH viável pode ser enriquecida por uma centrifugação em gradiente de densidade a 1250 xg, 20 min, 4 ° C (C) resultando na resolução do PHH na parte inferior do tubo, ao mesmo tempo morto células detritos / célula estão localizados na parte superior da camada de gradiente de densidade (D). Os sobrenadantes recolhidos da centrifugação inicial (1) são centrifugadas através de dois passos: 1) 300 xg, 5 min, 4 ° C e 2) 650 x g, 7 min, 4 ° C. Depois da primeira centrifugação KC são parcialmente localizado no sobrenadante. Neste contexto, o segundo passo de isolamento é necessário. Os sedimentos de células obtidas são reunidas e re-suspensas em HBSS. Subsequentemente, a suspensão de células são cuidadosamente em camadas no topo de um gradiente de densidade de duas camadas (25% / 50%). Os tubos de gradiente de densidade em camadas são centrifugados a 1800 xg, 20 min, 4 ° C (2). As células mortas no topo da camada de gradiente de densidade de 25% são rejeitados. NPC localizado entre a interfase do 25% e o 50% dcamada de gradiente ensity são coletados e reunidos. A fracção NPC é semeada em plásticos de cultura de células não revestidas. Utilizando um tempo de incubação de 20 min (passo de separação aderência) KC são separadas de outras populações de células hepáticas (3). LEC e HSC são separados usando o MACS-kit. Por conseguinte, as restantes células de fígado recolhidas do sobrenadante são centrifugadas a 300 xg, 5 min, 4 ° C, e são rotulados com MicroBeads CD31 conjugado (4). Apenas CD31-negativas HSC passar a coluna MACS separação (5). CD31 positivo vara LEC para a coluna. Finalmente, a coluna é removida do dispositivo magnético ea LEC CD31-positivas são eluídas da coluna (5). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A PHH isolado mostrou um rendimento de 14,2 x 10 6 ± 6,6 x 10 6 tecido hepático viável PHH / g e uma viabilidade de cerca de 760,6 ± 4,2% (Tabela 3 1). Microscopicamente características visíveis foram um grande volume típico citoplasmática em combinação com gotículas de lípidos e entre um e quatro núcleos, (Figura 3A). O tamanho das células varia entre 20 a 30 um em suspensão.
KC foram o tipo celular mais comum na fracção NPC. Isolamos aproximadamente 1,9 x 10 6 ± 0,2 x 10 6 / g de tecido de fígado viável KC com uma viabilidade de 92,8 ± 3,5% (Tabela 3 1). KC são células muito pequenas (cerca de 5 um) com um citoplasma / núcleo baixo e microvilosidades típico na superfície (Figura 3B).
Finalmente foi utilizada a técnica MACS separação para separar LEC CD31 positivo do restante HSC CD31-negativas. O rendimento do LCE foi de aproximadamente 2,7 x 10 5 0,1 x 10 ± 5 viável LEC / g Livtecido er e a viabilidade foi alcançado 95,6 ± 2,8% (Tabela 3 1). Critérios de identificação são os granulae múltipla e um tamanho de cerca de 10 um em suspensão de células (Figura 3C), bem como a forma de fuso característica depois de um curto tempo de cultura (Figura 3G).
O processo de isolamento resultou num rendimento HSC cerca de 4,7 x 10 5 0,2 x 10 ± 5 viável HSC / g de fígado (N = 8) com uma viabilidade de 89,6 ± 3,8% (Tabela 3 1). Microscopicamente características identificáveis tinham um tamanho de cerca de 20 um e uma aparência granulada típico com uma quantidade variável de gotículas de lípidos (Figura 3D).
Tabela 3: Os rendimentos, viabilidade e pureza da PHH isolada e NPC. Foram avaliados três dadores diferentes. Os dados são apresentados como média ± DP. Esta tabela foi publicado antes em Pfeiffer et al. 1, 2014, e é reproduzido com permissão de Biologia Experimental e Medicina.
Para a identificação e determinação de pureza de cultura celular, a cada fracção de células isolada foi tratada com anticorpos contra antigénios específicos do tipo de célula. As células foram tratadas com anticorpos secundários fluorescentes e investigadas por microscopia de imunofluorescência. A pureza foi determinada pela contagem de células marcadas fluorescentes positivas em relação ao número total de células visualizadas por coloração Hoechst.
Após 24 h de cultivo PHH mostrou uma forma poligonal característica e muitas vezes polyploidy (Figura 3E). PHH foram positivos para CK 18 (Figura 3I) e mostrou uma pureza de 92,3 ± 3,2%(Tabela 3 1).
KC adere dentro de 20 min em superfícies de plástico de cultura de células. Depois foram observados um tempo de incubação de pequenas células redondas 24 hr com um núcleo da célula redonda proeminente (Figura 3F). A proteína de superfície de CD68 foi utilizada para identificar KC (Figura 3J). A pureza das células CD68 positivas ascendeu a 81,0 ± 5,4% (Tabela 3 1).
Apesar da separação MACS usando rotulagem CD31 durante a separação NPC ainda era possível para manchar isolado LEC com CD31. Portanto, o LEC isoladas e cultivadas foram coradas com CD31 para a identificação e determinação de pureza. Além disso LEC mostraram imunorreactividade para o marcador de células mesenquimais vimentina (Figura 3K). Observou-se cerca de 81,0 ± 1,7% de células coradas positivas (Tabela 3 1). HSC com as suas gotículas lipídicas típicos proeminentes (Figura 3H) foram marcados por imunofluorescência para GFAP (Figura 3 L). HSC pureza foi de 93,0 ± 1,7% (Tabela 3 1).
Cada fracção celular foi contrastado com outros marcadores de NPC. Todas as fracções de células continha uma pequena quantidade de outros tipos de células específicas do fígado, mas foram negativos para o marcador de hepatócitos CK18 e a CK19 cholangiocyte marcador.
. Figura 3: Morfologia do parênquima do fígado humano e células não-parenquimatosas em suspensão e após aderência a coluna da esquerda (A - D) mostra as diferentes populações de células isoladas de fígado, directamente após o processo de isolamentoem fase de vista microscopia de contraste: PHH (A), KC (B), LEC (C), e HSC (D). A coluna do meio (E - H) apresenta imagens de isolada e cultivada PHH (E), KC (F), LEC (G) e HSC (H) após 24 h de cultivo (microscopia de contraste de fase). Caracterização à base de imunofluorescência das diferentes fracções de células é mostrada na última coluna: PHH mostrou sinais positivos para o CK18 hepatócitos marcador (I, 24 horas após o isolamento), KC foram positivos para o CD68 marcador (J, 24 horas após o isolamento), LEC mostrou sinais positivos para vimentina (K, 72 horas após o isolamento) e HSC foram positivas para GFAP (L, 72 horas depois do isolamento). os núcleos das células foram coradas com Hoechst; Ampliação: 400x. Modificado de Pfeiffer et al. 1, 2014, com permissão do ExperBiologia imental e Medicina. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O protocolo publicado descreve uma técnica para isolar pura PHH e NPC, nomeadamente KC, HSC e LEC, ao mesmo tempo de alta qualidade e pureza a partir de uma mesma amostra de tecido de fígado humano. A maioria das publicações que tratam de isolamentos de células hepáticas cobrir apenas uma dessas populações de células 18-20 e procedimentos de isolamento realizados com o tecido humano são raros (revisado por Damm et al.) 21. Adaptação de métodos estabelecidos com tecido animal (por exemplo, do fígado do rato) para o fígado humano revelou várias diferenças nas propriedades de células entre as populações de células humanas e animais. O estabelecimento de um método de isolamento de células de fígado que abrange as diferentes populações de células de fígado revelou que combinando o isolamento de células do parênquima e não parenquimatoso é um passo crítico devido à diferença no tempo de digestão necessária para resultados optimizados. Frente a este desafio, desenvolvemos um protocolo de isolamento de células do fígado que combina diferentes técnicas e adaptou ose para o nosso protocolo de isolamento PHH 10.
Por adição de 10% de FCS para a colagenase P contendo a solução II que foram capazes de reduzir a actividade proteolítica de proteases. Esta modificação permitiu períodos de digestão mais longos, necessários para a obtenção de um elevado número de NPC. Em consequência, fomos capazes de isolar PHH, bem como NPC de boa qualidade e em grande quantidade. isolamento de células de fígado bem sucedido depende fortemente da qualidade do tecido inicial. Os dados dos doadores e anamnese pode influenciar a qualidade e quantidade de células. Pela nossa experiência não há nenhuma correlação com fatores específicos dos doadores e também uma equipe muito experiente pode ser enfrentado para o isolamento de células sem êxito. Uma vez que a qualidade do tecido do dador é um ponto crítico, todas as fontes externas, o que pode prejudicar a qualidade do tecido, tem de ser minimizado.
A maioria dos fatores críticos são tempos de isquemia quente após a intervenção cirúrgica e os tempos de isquemia fria durante o transporte do tecido tO laboratório. Além disso quaisquer fontes de infecções bacterianas deve ser evitada. Tem de ser notado que, por vezes, o próprio órgão pode conter contaminação bacteriana, por exemplo, no caso de doenças do tracto biliar. passos críticos no procedimento de isolamento cobrir os tempos de perfusão e os passos de centrifugação de gradiente de densidade. O primeiro passo de perfusão deve durar 20-30 min. Os tempos de perfusão mais curtos podem levar ao descolamento incompleto de contactos célula-célula, resultando na ocorrência de agrupamentos de células em suspensão de células obtida. Uma primeira perfusão prolongada reduz a viabilidade das células e induz o stress celular, devido à depleção de Ca2 +.
O segundo passo de perfusão realizada por digestão enzimática dos tecidos requer alguma experiência para determinar o grau de digestão óptima para a tomada de decisão sobre a paragem da reacção proteolítica no ponto de tempo certo. tempos de digestão curtas levar a rendimentos baixos e tempos de digestão prolongada ao stress celular e danos às células.A partir de nossa experiência, o período de tempo entre o tecido não digerido e tecido danificado durante a digestão, muitas vezes está dentro de uma janela de 1-3 min. Uma perfusão incompleta pode ser combatida, deslocando a pressão dentro do tecido para outra área usando braçadeiras para beliscar fora cânulas. Além disso pressão suave com uma espátula para a amostra de tecido conduz a uma alteração na perfusão do tecido. O tecido é comprimida e a pressão interna aumenta. Subsequentemente, os vasos sanguíneos também são comprimidos e o seu raio decresce. Com a diminuição do raio, a resistência aumenta (lei de Hagen-Poiseuille) e a solução de perfusão prefere o caminho de menor resistência e perfunde outras áreas. De acordo com Baccarani e colegas de trabalho observou-se que o tecido fibrótico ou cirrótico necessita de um período de digestão mais longo que conduz à diminuição viabilidades celulares 22. Por este motivo, recomendamos evitar tecido de pacientes com fibrose do fígado ou cirrose.
A preparação emanipulação dos gradientes de densidade, bem como células de colheita para fora dos gradientes (ver passo 5 e 7) também cobrir passos críticos. As camadas de gradiente de densidade diferentes e a suspensão de células têm de ser transferidos de uma forma lenta e cuidadosa para criação de interfases afiadas. Além disso, há sempre o risco de danificar o gradiente durante a manipulação, especialmente durante a colheita das células. Durante a separação NPC o passo de separação a adesão é importante para os rendimentos mais tarde e pureza de todas as fracções de NPC. Para aumentar o número de células de APN não aderiram e a pureza da KC um passo de lavagem adicional pode ser útil. A solução de lavagem do presente passo é reunido com os sobrenadantes para uma separação adicional NPC. Para evitar a contaminação por bactérias, fungos ou vírus rigorosas condições assépticas tem que ser assegurada 23.
Em dependência das populações de células necessárias ao protocolo pode ser alterado e ajustado por saltar passos específicos. Por exemplo, se única KC sãorequerido o passo de centrifugação para NPC dupla sedimentação pode ser reduzida para o segundo passo de centrifugação e os passos de separação e HSC LEC pode ser descartado. Os tempos de perfusão e força-g para a centrifugação podem também ser variada na dependência de tecido e a qualidade celular. tecido fibrótico requer períodos de digestão prolongada, por conseguinte, há uma necessidade de controlar cuidadosamente a elasticidade do tecido. A acumulação de gotículas lipídicas em hepatócitos gordos diminui a densidade de células e, portanto, altera as propriedades de sedimentação. De acordo com as nossas observações, pode ser útil para ajustar a força-g durante o isolamento PHH, dependendo do teor de lípidos da PHH, quando elevadas quantidades de PHH são necessários. Tem de ser notado que todas as alterações do passo de centrifugação inicial irá influenciar negativamente o isolamento NPC em termos de qualidade e quantidade. Até agora, recomendamos forças-g entre 50 xg (hepatócitos com baixo teor de gordura) e 150 xg (hepatócitos com alto teor de gordura). HEPA Além disso fattytocytes tendem para formar um sedimento celular menos compacta após centrifugação em gradiente de densidade e uma maior colheita de células tem de ser alterada, como descrito na etapa 5.5.
Para acelerar o processo de isolamento alguns passos pode ser feito simultaneamente. Por exemplo, em paralelo com a purificação dos hepatócitos isolados de uma segunda pessoa pode começar com o isolamento NPC. Além disso, as soluções de gradiente de densidade pode ser preparado antecipadamente. Se houver mais do que duas pessoas, mesmo mais passos podem ser realizados ao mesmo tempo.
Em comparação com outros protocolos de isolamento de células do fígado humanas nossos resultados mostram rendimentos celulares semelhantes ou mais elevadas e viabilidades como publicado anteriormente em Experimental Biology and Medicine 1. Para KC isolamento Alabraba e colaboradores demonstraram resultados do isolamento com um rendimento de 2,3 x 10 6 / g de tecido de fígado viável KC combinada com uma viabilidade de cerca de 98% de 13, que são comparáveis aosnosso (número de células: 1,9 x 10 6 tecido do fígado viável KC / g, viabilidade cerca de 93%) KC resultados. A maioria dos dados de isolamento LEC publicados descrevem isolamentos de órgãos inteiros 15,24. Gerlach e colegas de trabalho, bem como Lalor e colaboradores isolado números celulares entre 10 3 e 10 6 células / órgãos 15,24. Estes dados não podem ser comparados directamente para a célula isolamentos a partir de amostras de tecido. No entanto, usando o nosso protocolo que apresentaram rendimentos para LEC de 2,7 x 10 5 tecidos do fígado viáveis LEC / g, que são de longe maiores quando extrapolados em um órgão inteiro. HSC foram isolados com um rendimento de cerca de 4,7 x 10 5 / g de fígado tecidos viáveis HSC e viabilidade cerca de 90%. Os resultados existentes publicados por Friedman e colaboradores mostraram metade inferior rendimentos celulares (2,3 x 10 5 HSC / g fígados), mas uma pureza semelhante (91%) 14. Em relação ao nosso protocolo, os rendimentos celulares de baixo pode ser causado por má perfusão e digestão devido à baixa ou nenhuma circulação de 1x Perfusão-SolutioN-I e digestão solução dentro do tecido. Além disso bolhas de gás no tecido pode perturbar a circulação intra-tecido de 1x Solução de perfusão-I e digestão-solução. Nestes casos, a perfusão pode ser melhorada pelo aumento da pressão de perfusão e a eliminação de bolhas de gás por aperto cânulas individuais e / ou utilizando uma espátula para empurrar contra a amostra de tecido. Um mau viabilidade é na maioria dos casos, uma conseqüência do estresse celular. Tempos de isquemia prolongada, os danos de Ca2 + e depleção de proteólise de proteínas de membrana estão ligadas ao dano celular, visível por vesículas da membrana celular. De nossas observações estas células muito sensíveis à tensão de cisalhamento e na maioria dos casos morrer durante o procedimento de isolamento. Em resumo, o isolamento bem sucedido e separação das células do parênquima hepático e não-parenquimatosas, que requer passos críticos são realizadas no intervalo de tempo certo, passos de pipetagem são realizados com cuidado e, em geral, o tempo para o isolamento de células e separação should ser mantido o mais curto possível 21. Uma desvantagem do protocolo descrito é que as condições de isolamento (por exemplo, tempos de perfusão) não pode ser completamente padronizado, mas têm de ser adaptados individualmente para a qualidade do tecido. Além disso, o rendimento e a pureza das populações de células obtidas podem variar na dependência da qualidade do tecido e o resultado da digestão.
Recentemente, publicou um estudo que demonstra a influência das condições de cultura combinados com a caracterização funcional de cada tipo de célula NPC isolado por este método 1. A possibilidade de isolar populações de células diferentes e separados do fígado permite a criação de co-culturas de células de fígado humano inovadoras e modelos da engenharia de tecidos in vitro de fígado. É bem sabido que o cultivo PHH em 2D mono-culturas leva à desdiferenciação e perda de funções celulares típicas 7. Por esta razão é necessário imitar o tecido in vivo arquitecture dentro de modelos in vitro do fígado. Kostadinova e colaboradores (2013) 8,9, bem como Messner e colaboradores (2013) 8,9 estabelecida com sucesso modelos de co-cultura do fígado funcionais para a detecção de efeitos hepatotóxicos. No entanto, NPC não foram caracterizadas e as funções específicas não foram investigados nestes sistemas.
Portanto mais pesquisas devem se concentrar em investigações sobre a sobrevivência a longo prazo da NPC, as suas características específicas e interações dentro co-culturas. Para esses estudos, pode ser também de interesse de estabelecer um protocolo para o isolamento de cholangiocytes. Realização da funcionais in vitro de co-culturas, incluindo todos os tipos de células contidas no fígado nativo pode ser um passo em frente na direcção da in vivo, como modelos de fígado humano.
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Acknowledgments
Nós gostaríamos de agradecer Jia Li Liu pelo seu apoio na criação da figura 1. Este estudo foi apoiado pelo Ministério Federal Alemão de Educação e Projecto de Investigação (BMBF) Fígado Virtual: 0.315.741.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| General Equipment | |||
| PIPETBOY | Eppendorf | ||
| pipettes | Eppendorf | ||
| microscope | Carl Zeiss | ||
| microscope | Olympus | ||
| CO2-incubator | Binder | ||
| Lamin Air | Heraeus | ||
| Centrifuge Varifuge 3.0R | Heraeus | ||
| Urine Beaker | Sarstedt | 2041101 | |
| perfusor syringe 50 ml | B.Braun | 12F0482022 | |
| Bottle Top Filter | Nalgene | 1058787 | |
| Falcon 50 ml Polypropylene Conical Tube | BD Biosciences | 352070 | |
| Falcon 15 ml Polypropylene Conical Tube | BD Biosciences | 352096 | |
| Tissue Culture plate | BD Biosciences | 533047 | 24 well |
| serological pipettes | BD Biosciences | 357525, 357551, 357543 | 25 ml, 10 ml, 5 ml |
| pipette tips | SARSTEDT | 0220/2278014, 0005/2242011, 0817/2222011 | 100 µl, 200 µl, 1,000 µl |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isolation Equipment | |||
| water bath | Lauda | ||
| peristaltic pump | Carl Roth | ||
| circulation thermostat | Lauda | ||
| pH meter | Schott | ||
| fine scales | Sartorius | ||
| stand | |||
| Büchner funnel | Haldenwanger | ||
| plastic funnel | |||
| silicone tube | |||
| cannulae with olive tips | |||
| glass dish | |||
| forceps | |||
| scalpel | Feather | 12068760 | |
| Neubauer counting chamber | Optic Labor | ||
| cell lifter | Costar | ||
| Surgical Drape | Charité Universitätsmedizin Berlin | A2013027 | |
| compress | Fuhrmann | 40013331 | |
| sterile surgical gloves | Gammex PF | 1203441104 | |
| Tissue glue | B. Braun | 1050052 | |
| glass bottle | VWR | ||
| Collagenase P | Roche | 13349524 | |
| Percoll Separating Solution | Biochrom | L6145 | Density 1.124 g/ml |
| Hank’s BSS | PAA | H00911-3938 | |
| Dulbecco’s PBS | PAA | H15 - 002 | without Mg/Ca |
| Ampuwa | Plastipur | 13CKP151 | |
| Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| NaCl | Merck | 1,064,041,000 | |
| KCl | Merck | 49,361,000 | |
| Hepes Pufferan | Roth | 133196836 | |
| EDTA | Sigma | E-5134 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media Equipment | |||
| DMEM | PAA | E15-005 | Low Glucose (1 g/L) (without L-Glutamine) |
| HEPES Buffer Solution 1 M | GIBCO | 1135546 | |
| L-Glutamine | GIBCO | 25030-024 | 200 mM |
| MEM NEAA | GIBCO | 11140-035 | |
| penicillin/streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | PAA | E15 - 039 | without L-Glutamine |
| Sodium Pyruvate | GIBCO | 1137663 | 100 mM |
| Trypan Blue Solution | Sigma-Aldrich | T8154 | 0.4% |
| William’s E | GIBCO | 32551-020 | |
| with GlutaMAX™ | |||
| EGTA | Sigma-Aldrich | 03780-50G | |
| Fortecortin | Merck | 49367 | 8 mg/2 ml |
| Human-Insulin | Lilly | HI0210 | 100 I.E./ml |
| N-Acetyl cysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
| Fetal calf serum (FCS) | PAA | A15-101 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment for Immunostainings | |||
| CD 68 | R&D Systems, USA | monoclonal | |
| CK 19 | Santa Cruz | D2309 | polyclonal |
| CK18 | Santa Cruz | K2105 | monoclonal |
| Vimentin | Santa Cruz | monoclonal | |
| GFAP | Sigma Aldrich | monoclonal | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 23.472-9 | |
| Goat anti-Mouse IgG1-PE | Santa Cruz | C0712 | |
| Goat anti-rabbit IgG-FITC | Santa Cruz | L0412 | |
| Methanol | J.T.Baker | 1104509006 | |
| Formaldehyde 4% | Herbeta Arzneimittel | 200-001-8 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A7906-100G |
References
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