Protokoll für die Isolierung von primären humanen Hepatozyten und entsprechende Hauptpopulationen von Nicht-parenchymale Leberzellen

Abstract

Neben parenchymal Hepatozyten besteht die Leber von nicht-Parenchymzellen (NPC) nämlich Kupffer-Zellen (KC), Leber-Endothelzellen (LEC) und hepatischen Sternzellen (HSC). Zweidimensionale (2D) Kultur von primären humanen Hepatozyten (PHH) gilt bis heute als "Goldstandard" betrachtet für in vitro - Untersuchung von Arzneimittelmetabolismus und Hepatotoxizität. Es ist bekannt, dass die 2D-Monokulturen von PHH von Entdifferenzierung und Funktionsverlust leidet. Kürzlich wurde gezeigt, dass hepatische NPC eine zentrale Rolle in der Leber (patho-) Physiologie spielen und die Wartung von PHH Funktionen. Die aktuelle Forschung konzentriert sich auf die Rekonstruktion von in - vivo - Gewebearchitektur von 3D- und Co-Kultur - Modelle , die Grenzen von 2D - Monokulturen zu überwinden. Vorveröffentlichten wir ein Verfahren menschlichen Leberzellen zu isolieren und untersucht um die Eignung dieser Zellen für ihre Verwendung in Zellkulturen in Experimental Biology and Medicine ^1. Auf Basis des breiten Interesses an dieser tedas Ziel dieses Artikels chnique war ein detaillierteres Protokoll für den Leberzellisolierungsverfahren einschließlich eines Video zu schaffen, das eine einfache Reproduktion dieser Technik ermöglicht.

Menschliche Leberzellen wurden aus menschlichen Lebergewebeproben von chirurgischen Eingriffen einem zweistufigen EGTA / Kollagenase P Perfusionstechnik isoliert. PHH wurden aus dem NPC durch eine anfängliche Zentrifugation bei 50 x g abgetrennt. Dichtegradientenzentrifugation Schritte wurden zur Entfernung von abgestorbenen Zellen verwendet. Einzelne Leberzellpopulationen wurden aus dem angereicherten NPC-Fraktion unter Verwendung von spezifischen Zelleigenschaften und Zellsortierverfahren isoliert. Neben der PHH Isolation konnten wir KC, LEC und HSC für die weitere Kultivierung zu trennen.

Zusammengenommen können die präsentierten Protokoll die Isolierung von PHH und NPC in hoher Qualität und Quantität von einem Spender Gewebeprobe. Der Zugriff auf gereinigte Leberzellpopulationen könnte die Schaffung von in vivo wie menschliche li erlaubenver-Modelle.

Introduction

Menschliche Lebergewebe ist sehr komplex und besteht aus zwei verschiedenen Zelleinheiten, Parenchymzellen und nicht-parenchymale Zellen (NPC). Parenchymale Leberzellen umfassen Hepatozyten und Cholangiozyten. Hepatozyten repräsentieren 60 bis 70% der gesamten Leberzellen und machen die meisten der metabolischen Leberfunktionen, zB Gallensäure und Komplementfaktor Synthese, Biotransformation und Energiestoffwechsel ^2,3.

Je kleiner NPC Fraktion bildet 30-40% der gesamten Leberzellen. NPC umfassen verschiedene Zellpopulationen, nämlich Kupffer-Zellen (KC), Leber-Endothelzellen (LEC) und die hepatischen Sternzellen (HSC). Diese heterogene Zellfraktion spielt eine zentrale Rolle in physiologischen Prozessen der Leber. Ferner nehmen NPC akute Leberschäden bei der Vermittlung, zB arzneimittelinduzierte Leberschädigung (DILI) sowie bei chronischen Leberverletzungen, wie Zirrhose ^4.

In den letzten Jahren hUman Leberzellen haben sich mehr und mehr wesentlich in Forschung und Entwicklung von Drogentests, Arzneimittelentwicklung und Identifizierung von neuen biochemischen Wege bei Lebererkrankungen werden. Für in - vitro - Tests PHH Monokulturen sind immer noch als der "Goldstandard" ⁵ betrachtet. Die Hauptbeschränkung der gegenwärtigen homotypische Leber Modelle Dedifferenzierung , und Funktionsverlust der Hepatozyten innerhalb weniger Tage ^4. Die Einrichtung von 3-dimensionalen (3D) Kulturverfahren hat gezeigt , dass diese Einschränkungen ^4,6 ausgeglichen werden können. Aber auch moderne 3D - Kulturtechniken sind nicht in der Lage , alle hepatotoxischer Modi der Aktionen ⁷ angezeigt werden soll . Fehlende NPC Populationen in den bestehenden in vitro - Modelle werden als möglicher Grund für diese Diskrepanz auf die in vivo Situation diskutiert. Es hat sich gezeigt, dass die Zell-Zell Kommunikation eine zentrale Rolle zwischen den verschiedenen Leberzellpopulationen gezeigt in physiologischen Homöostase spielt, sondern auch in pathophysiologic verarbeitet ^8. Deshalb ist die wissenschaftliche Aufmerksamkeit konzentriert sich mehr und mehr auf NPC und ihre Zell-Zell-Interaktionen. Ihre gezielte Einsatz in Co-Kultur und Tissue Engineering Systeme könnte eine Lösung für die hohe Nachfrage von in - vitro - Leber - Modelle ^8,9 sein , die so nahe an die in - vivo - Situation wie möglich.

Derzeit ist die größte Herausforderung ist die Entwicklung eines standardisierten humanen Leber Co-Kultur-Modell, das klar definierte Abschnitte von PHH und NPC enthält. In der Folge Isolationstechniken für die sehr heterogene Leberzellen benötigt werden und diejenigen müssen optimiert werden, um reine Zellpopulationen zu gewinnen. Während standardisierte Protokolle für die Isolierung PHH ¹⁰ vorhanden ist , ist die standardisierte Isolierung menschlicher NPC noch in der Entwicklung. Die meisten veröffentlichten NPC Isolation Protokolle basieren auf Experimenten mit nicht-menschlichen Zellen ^11,12. Nur wenige Publikationen beschreiben die Isolierung Prozess der menschlichen NPC und die meisten decken nurVerfahren zur Isolierung von einem Zelltyp ^11-16. Die wichtigsten Zelleigenschaften, die für die Zellseparation genutzt wurden, sind Größe, Dichte, Bindungsverhalten und der Expression von Oberflächenproteinen. Auf der Grundlage dieser Eigenschaften entwickelten wir ein vereinfachtes Protokoll PHH, KC, LEC und HSC zu isolieren, die zuvor ¹ in Experimental Biology and Medicine veröffentlicht wurde. Aufgrund des breiten Interesses an dieser Technik war es das Ziel dieses Artikels ein detaillierteres Protokoll für die Leberzellisolierungsverfahren, um ein Video mit, die die Technik leichter reproduzieren können. Das Protokoll enthält auch Qualitätskontrollverfahren zur Ermittlung der Ausbeute und Lebensfähigkeit sowie zur Identifikation und Reinheits Auswertung unter Verwendung von spezifischen Immunfärbungen.

Protocol

Anmerkung: Alle Zellen von resezierten nicht-tumorösen menschlichen Lebergewebe isoliert wurden, die nach partieller Leberresektion mit primären oder sekundären Lebertumoren geblieben. Universitätsmedizin Berlin - Einverständniserklärung der Patienten wurde nach den ethischen Richtlinien der Charité erhalten.

1. Herstellung von Materialien und Lösungen

1. Sterilisieren alle Instrumente und die Materialien im Voraus eine bakterielle Kontamination während des Isolationsprozesses zu vermeiden.
2. Herstellung der Lösungen für die Perfusion der Leber Gewebeprobe erforderlich, den Isolationsprozess der Hepatozyten und nicht-parenchymalen Leberzellen und die Kultivierung von primären humanen Leberzellen gemäß den Tabellen 1 und 2, mit Ausnahme der Digestion-Lösung , die frisch zubereitet Vor dem Benutzen. Alle Lösungen können bei 4 ° C gelagert werden, und es wird empfohlen, sie innerhalb von 4 Wochen nach der Herstellung zu verwenden.
3. SterilisierenAlle Lösungen, die eine 0,22 um Flaschenaufsatz-Filter.

2. Herstellung von Perfusionsausrüstung

1. Stellen Sie die Ausrüstung für die Perfusion und die Verdauung der Leber Gewebeprobe, wie in 1A gezeigt.
2. Stellen Sie die Wasserbadtemperatur auf 39 ° C optimal Kollagenase P-Aktivität während der Perfusion und die Verdauung zu gewährleisten.

3. Perfusion und Verdauung der Leber Gewebeprobe (1,5 h)

1. Wählen Sie eine Gewebeprobe mit einem intakten Glisson-Kapsel aus dem Lebergewebe reseziert. Wenn die Gewebeprobe schneiden, versuchen, eine kleine Schnittfläche mit gut sichtbaren Gefäße zu erhalten. Vermeiden Sie warme Ischämie mal durch den Transport und die Handhabung der Lebergewebeprobe auf Eis, bis die Perfusion.
2. Nehmen Sie das Gewebegewicht unter sterilen Bedingungen und legen Sie die Lebergewebeprobe in einer Petrischale im laminaren Luftstrom. Säubern Sie die Oberfläche der Gewebeprobe mit einer sterilen Kompresse aus reRest Blut und bündig ich die Kanüle Set mit 1x Perfusions-Lösung, um sicherzustellen, dass alle Kanüle durchlässig waren.
3. Verwenden Sie Gewebekleber die Oliven der Kanülen in einigen größeren Blutgefäße zu reparieren. Je nach der Größe der Lebergewebeprobe und die Anzahl der Gefäße auf der Oberfläche, mit einem Kanülensatz mit 3 bis 8 Kanülen. Testen Sie die Perfusion und prüfen Sie auf Leckagen. Schließen Sie alle Blutgefäße, die ich klar 1x Perfusions-Lösung auslaufen, mit Gewebekleber.
4. Legen Sie die Kanüle eingeführt Lebergewebeprobe in den Büchner - Trichter auf dem perforierten Filterscheibe (1A).
5. Stellen Sie die Strömungsgeschwindigkeit der peristaltischen Pumpe zwischen 7,5 ml / min und 14,6 ml / min auf der Anzahl der Kanülen Abhängigkeit verwendet und auf den Widerstand des Lebergewebes. Anpassen der Durchflussrate jedes Mal um sicherzustellen, dass ein Strom, aber langsame Perfusion ist. Perfuse das Gewebe, bis das gesamte Blut gespült wird, aber mindestens 20 min. Beobachten Sie das Gewebe heller in Gebieten mit guter perfusiauf.
   Anmerkung: In einigen Fällen kann es erforderlich sein, eine der Kanülen festzuklemmen mit Kunststoffklammern oder um den Innendruck eines Bereichs zu erhöhen, indem sanft mit einem Spatel gegen die Leberkapsel drückt, die Perfusion zu optimieren. Eine komplette Farbwechsel zu einem hellgelben bis leicht bräunliche Farbe zeigt eine gute Perfusion.
6. Ändern , um die Perfusionsflüssigkeit zur Digestion-Lösung , die Kollagenase P (Tabelle 1).
7. Ordnen Sie das Setup (Abbildung 1A) für die Verdauung Schritt. Deshalb eine kreisförmige Strömung des Verdaus-Lösung durchzuführen gemäß 1B für bis zu 15 min.
   Hinweis: Es ist wichtig, die Durchblutung sofort zu stoppen, wenn die Lebergewebeprobe ausreichend verdaut wird. Eine gute Verdauung kann beobachtet werden, wenn das Gewebe zeigt keine Anzeichen einer Elastizität durch Aufrechterhaltung der Kapsel Deformationen beurteilt als, wenn sie mit einem Spatel eingeschoben wird.

4. Isolierung von Hepatozyten (1 h)

1. TUrne die peristaltische Pumpe ab und legen Sie die Lebergewebeprobe in einer Glasschale. Spülen Sie die Außenseite der Gewebeprobe mit eiskaltem Stopp-Lösung (Tabelle 1). Entfernen Sie die Kanülen aus der Leber Gewebeprobe. Verwenden eines Skalpells die Leber Gewebeprobe zu öffnen, indem sie in der Mitte des Bereichs, wo die Einschneiden Kanülen angebracht wurden. Halten Sie darauf, dass die Glisson's Kapsel intakt bleibt.
2. Spülen Sie die Innenseite der Gewebeprobe und dann decken die gesamte Gewebeprobe mit eiskaltem Stopp-Lösung. Schütteln, um das Gewebe sanft um die Zellen zu lösen aus dem Gewebe.
3. Sammeln Sie die Zellsuspension und filtern sie durch einen Blick Trichter (Plastiktrichter mit Gazekompresse ausgekleidet) in 50 ml Plastikröhrchen. Noch ein Stop-Lösung zur Leber Gewebeprobe, bis ein Endvolumen von 500 ml verbraucht wird.
4. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 50 · g, 5 min, 4 ° C. Sammeln Sie den Überstand für eine spätere nicht Parenchymzelle Isolation. Waschen des Zellpellets mit PBS (2A).
5. Zentrifugieren der Zellsuspension wieder bei 50 · g, 5 min, 4 ° C. Sammeln Sie den Überstand und resuspendiere das Pellet in Hepatocyte Incubation Medium (Tabelle 2, 2B).
6. Bestimmung der Zellzahl und Lebensfähigkeit in der resultierenden Zellsuspension unter Verwendung von Trypan-Blau-Färbung. Zählen Sie die lebenden und toten Zellen in einer Neubauer-Zählkammer. Berechnen Sie die Zellzahl, die Lebensfähigkeit und den Ertrag von PHH unter die Formeln.
   
   Ausbeute (gezählten Zellen) = gezählten Zellen x Verdünnungsfaktor x Volumen der Zellsuspension (ml) x 10.000
   
   Ausbeute (Hepatozyten / (g Lebergewebeprobe)) = (Ausbeute (Hepatozyten / (ml Medium)) x Volumen der Zellsuspension (ml)) / (Gewicht der Lebergewebeprobe (g))
   
   Lebensfähigkeit (%) = 100% x (Anzahl der lebenden Zellen) / (Gesamtzellzahl)

5. Reinigung von Hepatozyten (1 h)

Hinweis: Diese Reinigungsstufe wird empfohlen, wenn die Lebensfähigkeitist niedriger als 70%.

1. Führen Sie alle Schritte auf dem Eis. Bereiten Sie eine 25% Dichtegradienten durch Mischen von 5 ml Dichtegradient-Lösung und 15 ml PBS für Dichtegradientenzentrifugation.
2. Setzen Sie ein Maximum von 50 Mio Zellen insgesamt aus der Hepatozyten - reichen Zellsuspension vorsichtig und langsam auf dem 25% Dichtegradienten Schicht , um sicherzustellen , dass eine klare Trennung der beiden Schichten erreicht (Abbildung 2C). Setzen Sie die Rohre sorgfältig in die Zentrifuge und Zentrifuge bei 1250 · g, 20 min, 4 ° C ohne Bremse (2D).
3. Saugen Sie das restliche Zellsuspension und die toten Zellen in der Zwischenphase. Je nach Fettgehalt könnte man auch die Dichtegradient-Lösung anzusaugen.
   Hinweis: PHH mit niedrigem Fettgehalt ein dichtes Pellet-Form und der Dichtegradient vollständig abgesaugt werden. PHH mit hohem Fettgehalt ein diffuser Pellet und eine Menge an lebenden Zellen bilden sich in der Dichtegradientenlösung über dem Pellet verbleiben.
4. Re-suspend die Hepatozyten-Pellets mit PBS und Zentrifuge wieder bei 50 · g, 5 min, 4 ° C. Pool, die Pellets, waschen wieder mit PBS und erneut zu suspendieren gereinigte PHH in Hepatozyten Inkubationsmedium. Führen Zellzählung als 4.6 in Schritt beschrieben.

6. Der Anbau von Hepatozyten

1. Vorbereitung der Zellkulturschalen für die Aussaat von PHH, indem sie mit einer extrazellulären Matrix Beschichtung, beispielsweise Rattenschwanz-Kollagen (Kollagen-Typ I). Bereiten Sie die Rattenschwanz - Kollagen nach dem Protokoll von Rajan etabliert et al. ¹⁷
2. Verdünnen Sie die Rattenschwanz-Kollagen-Stammlösung 1: 200 in PBS. Transfer 100 ul / cm ² Rattenschwanz Kollagen - Lösung in den Kulturschalen, wobei darauf geachtet , dass die gesamte Oberfläche bedeckt ist. Inkubieren der Zellkultur Kunststoffe für 20 min bei Raumtemperatur. Saugen Sie das restliche Rattenschwanz-Kollagen-Lösung.
3. Seed 15 x 10 ⁴ Hepatozyten / cm ² in Hepatozyten Inkubationsmedium auf Kultur dishes mit Rattenschwanz Kollagen beschichtet. Kultivieren der Zellen in einem befeuchteten Inkubator bei 37ºC, 5% CO ₂ für mindestens 4 Stunden. Nach 4 Stunden wurden die Hepatozyten eingehalten und das Medium verändert werden kann.
4. Führen Untersuchungen je nach Versuchsaufbau. Eine Kultivierungszeit von 48 h wird empfohlen, damit die Zellen aus dem Isolationsprozess zu erholen.

7. Isolierung von Nicht-parenchymale Leberzellen (1,5-2 h)

1. Zentrifuge der gesammelte Überstand (Schritt 4.5 und 4.6) bei 72 × g, 5 min, 4 ° C, um die verbleibenden Erythrozyten und Hepatozyten zu beseitigen. Pool der Überstände und Zentrifuge sie zweimal zwei Zellpellets zu gewinnen: 300 · g, 5 min, 4 ° C für die Sedimentation von HSC, LEC und zum Teil KC und 650 · g, 7 Minuten, 4 ° C für die Sedimentation des verbleibenden KC.
2. Pool beide Pellets und resuspendieren sie in HBSS. Bereiten Sie eine 25% und eine Dichte von 50% Gradienten durch Mischen von Dichtegradient-Lösung und PBS für Dichtegradienten Zentri- fugalkrugation (25% Dichtegradient - Lösung: 5 ml Dichtegradient - Lösung und 15 ml PBS, 50% Dichtegradient - Lösung: 10 ml Dichtegradient - Lösung und 10 ml PBS, siehe Abbildung 2). Legen Sie die 25% Dichtegradientenlösung vorsichtig auf der Oberseite der 50% Dichtegradientenlösung Schicht.
3. Setzen Sie den NPC Suspension vorsichtig und langsam auf dem 25% Dichtegradientenlösung Schicht in einer Weise, dass eine klare Trennung der beiden Schichten erreicht wird.
4. Centrifuge die Zellsuspension auf dem Dichtegradienten bei 1.800 × g, 20 min, 4 ° C ohne Bremse (Abbildung 2.2).
5. Aspirat tote Zellen und Zellbruchstücke aus der obersten Schicht. Der NPC werden in der Interphase zwischen 25% und 50% Dichtegradienten Schicht (2) angeordnet ist . Sammeln NPC, waschen Sie sie mit HBSS und Zentrifuge der Zellsuspension die oben beschriebene Doppel Zentrifugationsschritt Anwendung (Schritt 7.2.).

8. Die Trennung von Kupffer-Zellen (AdherenceTrennungsschritt) (1 h)

1. Durchführen einer Zellzahl für die KC in der Fraktion NPC wie in Schritt 4.6 beschrieben. (Bei Auftreten von KC in Suspension siehe 3B). Zentrifuge der NPC - Fraktion mit der oben beschriebenen Doppel Zentrifugationsschritt (Schritt 7.2) und resuspendieren die NPC in Kupffer Zellaussaat - Medium (Tabelle 2).
2. Samen der KC enthaltenden Fraktion auf Kunststoff - Zellkulturgefäßen bei einer Dichte von 5 x 10 ⁵ KC / cm ^2. Inkubieren der KC Kulturen für 20 min in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C, 5% CO _2. Primäre KC innerhalb einer kurzen Zeitdauer (Figur 2.3) auf Zellkultur - Kunststoff anhaften.
3. Die überstehende Flüssigkeit nicht eingehalten NPC enthält, die hauptsächlich aus LEC und HSC. Pool der Überstände für eine spätere Trennung von LEC (siehe Abschnitt 9) und HSC (siehe Abschnitt 10). Waschen Sie die anhaftende KC mit HBSS und kultivieren sie in Kupffer Zellkulturmedium (Tabelle 2) bei 37 ° C, 5% CO₂ in einem befeuchteten Inkubator.

9. Trennung von Endothelial Cells (1,5 h)

1. Zentrifugieren der Überstand gesammelt (Schritt 8.5.) Bei 300 xg, 5 min, 4 ° C. Waschen Sie das Pellet mit PBS. Nach Zentrifugation bei 300 xg, 5 min, 4 ° C erneut suspendieren der Zellen in Sternzellen / Endothelial Zellseparationsmedium und einer Zellzahl für alle verbleibenden Zellen durchführen, wie in Schritt 4.6 beschrieben.
2. Re-suspend 1 x 10 ⁷ Mio Zellen in 1 ml Sternzellen / Endothelial Zellseparationsmedium, 20 ul hinzufügen Blocking Solution aus der MACS-KIT und 20 ul der CD31 - Mikrokorn für Immunmarkierung und Inkubation der erhaltenen Suspension für 15 min bei 4 ° C Temperatur (Abbildung 2.4).
3. Separate LEC von HSC wie im Herstellerprotokoll für die magnetisch aktivierten Zellsortiersystem MACS (Abbildung 2.5) beschrieben. Eluieren magnetisch gehalten CD31-positive LEC und suspendieren sie in Sternförmige Cell / Endothelial Zellkulturmedium (Tabelle 2).
4. Führen Zelle für LEC Zählen, wie in Schritt 4.6 beschrieben. Seed LEC in einer Dichte von 1,25 x 10 ⁵ Zellen / cm ² in Zellkulturgefäße , beschichtet mit Rattenschwanz - Kollagen (siehe Schritt 6.1). Kultivieren der Zellen bei 37 ° C, 5% CO ₂ in einem befeuchteten Inkubator.

10. Die Trennung von Sternzellen (0,5 Stunden)

1. Unbeschriftet HSC passieren die Trennsäule während des MACS Verfahren. Sammeln Sie die HSC - Fraktion (siehe Schritt 9.5, Abbildung 2.5). Führen Zellzählung als 4.6 in Schritt beschrieben.
2. Seed HSC mit einer Dichte von 5 x 10 ⁴ Zellen / cm ² in Zellkulturgefäße , beschichtet mit Rattenschwanz - Kollagen (siehe Schritt 6.1) in Sternzellen / Endothelial Zellkulturmedium (Tabelle 2) und kultivieren sie bei 37 ° C, 5% CO ₂ in einem befeuchteten Inkubator.

Tabelle 1: Perfusion und Isolationslösung.

Tabelle 2: Kultur und Isolation Medien.

Representative Results

Die Trennung in eine parenchymalen und nicht-parenchymalen Fraktion Gradientenzentrifugation als Clean-up-Verfahren unter Verwendung von Dichte mit der Verwendung von Adhärenz kombinierten Eigenschaften und MACS führt zu erfolgreichen PHH und NPC Isolation. PHH und NPC befindet sich in der hohen Qualität und Quantität isoliert werden. Abbildung 1 zeigt die repräsentative Einrichtung der Ausrüstung für die Leberperfusion und Verdauung. 10% FCS wurde der Kollagenase P gegeben, die Perfusions - Lösung II proteolytischen Aktivität von Proteasen zu verringern und Kollagenase P-Aktivität im Gegenzug zu stabilisieren. In der Folge längere Verdauungszeiten für NPC Isolation erforderlich ist, kann ohne negative Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit von PHH angewendet werden.

Abb . 1: Perfusion und Verdauung Setup Der erste Perfusionsschritt wird in orde durchgeführtr Restblut zu entfernen, um das Gewebe erwärmen und entfernen Ca ²⁺ unter Verwendung von 1x Perfusionen Lösung I (PI) (A) Zell-Zell-Verbindungen zu lösen. Rezirkulation von verdauungs Solution (DG) ist für die Verdauung von Lebergewebe während der Perfusion Schritt II (B) durchgeführt.

Abbildung 2:. Vereinfachte schematische Darstellung des kompletten PHH und NPC Isolationsprozess Geändert von Pfeiffer et al ^1, 2014 mit Genehmigung für Experimentelle Biologie und Medizin.. Zuerst wird die Lebergewebeprobe durchströmt und durch einen zweistufigen EGTA / Kollagenase P Perfusionstechnik (A) verdaut. Die gewonnene Zellsuspension wird zunächst bei 50 · g zentrifugiert, 5 min, 4ºC (B), die größere PHH-Fraktion abzutrennen (Pellet) von dem kleineren NPC-Fraktion (supernatant). Im Falle einer PHH Lebensfähigkeit unter 70%, kann die lebensfähige PHH Fraktion durch eine Dichtegradienten-Zentrifugation bei 1250 xg, 20 min, 4 ° C (C) , was ein Absetzen der PHH am Boden des Röhrchens, während tote angereichert Zellen / Zellbruchstücke werden auf der Oberseite der Dichtegradient Schicht (D) befindet. Gesammelte Überstände der anfänglichen Zentrifugation (1) unter Verwendung von zwei Stufen zentrifugiert: 1) 300 · g, 5 min, 4 ° C und 2) 650 · g, 7 min, 4 ° C. Nach der ersten Zentrifugation KC werden teilweise in der Überstand entfernt. In diesem Zusammenhang ist die zweite Isolationsschritt notwendig. Die gewonnenen Zellpellets werden gesammelt und resuspendiert in HBSS. Anschließend werden die Zellsuspension auf einer zweilagigen (25% / 50%) Dichtegradienten sorgfältig geschichtet. Die geschichteten Dichtegradienten Röhrchen werden bei 1800 xg zentrifugiert, 20 min, 4 ° C (2). Toten Zellen auf der Oberseite der 25% Dichtegradienten Schicht werden verworfen. NPC zwischen der Zwischenphase von 25% und die 50% d liegtichte Gradientenschicht werden gesammelt und vereinigt. Die NPC-Fraktion wird ausgesät auf unbeschichteten Zellkultur Kunststoffen. Unter Verwendung eines 20 min Inkubationszeit (Adhärenz Trennungsschritt) KC getrennt von anderen Leberzellpopulationen (3). LEC und HSC werden mithilfe des MACS-Kit getrennt. Daher die gesammelten Restleberzellen in dem Überstand werden bei 300 xg zentrifugiert, 5 min, 4 ° C, und mit CD31-konjugierten MicroBeads markiertem (4). Nur CD31-negativ HSC die MACS-Trennsäule (5) passieren. CD31-positive LEC-Stick auf die Säule. Schließlich wird die Spalte der Magnetvorrichtung entfernt wird und der CD31-positiven LEC werden aus der Säule eluiert (5). Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Die isolierte PHH ergab eine Ausbeute von 14,2 x 10 ⁶ ± 6,6 x 10 ⁶ lebensfähigen PHH / g Lebergewebe und eine Rentabilität von 760,6 ± 4,2% (Tabelle 3 ^1). Mikroskopisch sichtbaren Merkmale waren eine typische große zytoplasmatische Volumen in Kombination mit Lipidtröpfchen und zwischen einem und vier Kerne (3A). Die Zellgröße schwankt zwischen 20 bis 30 um in Suspension.

KC waren die häufigste Zelltyp in der NPC-Fraktion. Wir isolierten etwa 1,9 x 10 ⁶ ± 0,2 x 10 ⁶ lebensfähigen KC / g Lebergewebe mit einer Lebensfähigkeit von 92,8 ± 3,5% (Tabelle 3 ^1). KC sind sehr kleine Zellen (etwa 5 & mgr; m) mit einem geringen Cytoplasmas / Kern - Verhältnis und typische Mikrovilli auf der Oberfläche (3B).

Schließlich haben wir den MACS-Trenntechnik CD31-positive LEC aus dem verbleibenden CD31-negativen HSC zu trennen. Die Ausbeute an LEC war etwa 2,7 x 10 ⁵ ± 0,1 x 10 ⁵ lebensfähige LEC / g Liver Gewebe und die erreichte Lebensfähigkeit betrug 95,6 ± 2,8% (Tabelle 3 ^1). Identifizierungskriterien sind die mehreren Granula und eine Größe von etwa 10 um in der Zellsuspension (3C) sowie die charakteristische spindelförmige Gestalt nach einer kurzen Kultivierungszeit (Figur 3G).

Die Isolierungsverfahren ergab eine Ausbeute HSC etwa 4,7 x 10 ⁵ ± 0,2 x 10 ⁵ lebensfähige HSC / g Leber (N = 8) mit einer Lebensfähigkeit von 89,6 ± 3,8% (Tabelle 3 ^1). Mikroskopisch identifizierbaren Eigenschaften waren eine Größe von etwa 20 um und eine typische granulierten Aussehen mit einer variierenden Menge an Lipidtröpfchen (Abbildung 3D).

Tabelle 3: Ausbeuten, Lebensfähigkeit und Reinheit der isolierten PHH und NPC. Es wurden drei verschiedenen Spendern bewertet. Die Daten werden als Mittelwert ± SD angegeben. Diese Tabelle wurde vor in Pfeiffer et al. ^1, 2014 und wird mit Genehmigung von Experimental Biology and Medicine nachgedruckt.

Zur Identifizierung und Bestimmung der Zellkulturreinheit wurde jeder isolierte Zellfraktion mit Antikörpern gegen Zelltyp-spezifische Antigene behandelt. Die Zellen wurden mit fluoreszierenden Sekundärantikörper und untersucht durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie behandelt. Die Reinheit wurde durch Zählen positive fluoreszierenden gefärbten Zellen in Bezug auf die Gesamtzellzahl visualisiert von Hoechst-Färbung bestimmt.

Nach 24 Stunden der Kultivierung PHH zeigte eine charakteristische polygonale Form und oft Polyploidie (Abbildung 3E). PHH waren positiv für CK 18 (3I) und einer Reinheit von 92,3 ± 3,2% zeigte ,(Tabelle 3 ¹⁾ ist .

KC innerhalb von 20 min auf Zellkultur-Kunststoffoberflächen haftet. Nach einer Inkubationszeit von 24 h kleine runde Zellen mit einem prominenten Kern runden Zelle beobachtet (Abbildung 3F). Das Oberflächenprotein CD68 wurde verwendet KC (3J) zu identifizieren. Die Reinheit der CD68 - positiven Zellen belief sich auf 81,0 ± 5,4% (Tabelle 3 ^1).

Trotz der MACS Trennung unter Verwendung von CD31 Kennzeichnung während der NPC Trennung war es noch möglich, isoliert LEC mit CD31 zu färben. Deshalb ist die isoliert und kultiviert LEC wurden zur Identifizierung und Bestimmung der Reinheit mit CD31 gefärbt. Zusätzlich zeigte LEC Immunreaktivität für die mesenchymalen Zellmarker Vimentin (Abbildung 3 K). Wir haben beobachtet , etwa 81,0 ± 1,7% der positiven gefärbten Zellen (Tabelle 3 ^1). HSC mit ihren typischen prominenten Lipidtröpfchen (3H) wurden für GFAP (Abbildung 3 l) durch Immunofluoreszenzfärbung markiert. HSC Reinheit betrug 93,0 ± 1,7% (Tabelle 3 ^1).

Jede Zellfraktion wurde mit anderen NPC Marker gegengefärbt. Alle Zell Fraktionen enthielten eine kleine Anzahl von anderen Leber spezifischen Zelltypen, aber für den Hepatozyten-Marker CK18 und CK19 Cholangiozyten Marker negativ waren.

. Abbildung 3: Morphologie menschlicher parenchymalen und nicht-parenchymalen Leberzellen in Suspension und nach Adhärenz Die linke Spalte (A - D) zeigt die verschiedenen isolierten Zellpopulationen Leber direkt nach dem Isolationsverfahrenin der Phasenkontrastmikroskopie Ansicht: PHH (A), KC (B), LEC (C) und HSC (D). Die mittlere Spalte (E - H) präsentiert Bilder von isolierten und kultivierten PHH (E), KC (F), LEC (G) und HSC (H) nach 24 Stunden der Kultivierung (Phasenkontrastmikroskopie). Immunofluoreszenz-basierten Charakterisierung der verschiedenen Zellfraktionen wird in der letzten Spalte gezeigt: PHH positive Signale für die Hepatozyten - Marker CK18 zeigte (I, 24 Stunden nach der Isolierung), KC positiv waren für den Marker CD68 (J, 24 h nach der Isolierung), LEC zeigten positive Signale für Vimentin (K, 72 Stunden nach der Isolierung) und HSC waren positiv für GFAP (L, 72 Stunden nach der Isolierung). Die Zellkerne wurden mit Hoechst gefärbt; Vergrößerung: 400X. Geändert von Pfeiffer et al. ^1, 2014 mit freundlicher Genehmigung von Expertellen Biologie und Medizin. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

Die veröffentlichten Protokoll beschreibt eine Technik zur Isolierung reiner PHH und NPC, nämlich KC, HSC und LEC, gleichzeitig in hoher Qualität und Reinheit aus der gleichen Probe von menschlichem Lebergewebe. Die Mehrzahl der Publikationen mit Leberzellisolationen Umgang decken nur eine dieser Zellpopulationen ^18-20 und Isolierungsverfahren mit menschlichem Gewebe durchgeführt sind selten (rezensiert von Damm et al.) ^21. Anpassung von Methoden mit tierischem Gewebe etabliert (zB Rattenleber) für die menschliche Leber zeigte mehrere Unterschiede in der Zelleigenschaften zwischen tierischen und menschlichen Zellpopulationen. Die Einrichtung einer Isolationsmethode Leberzelle, die verschiedenen Leberzellpopulationen abdeckt ergab, dass die parenchymalen und nicht-parenchymale Kombination Zellisolierung ist ein entscheidender Schritt auf Grund der Differenz bei der Verdauung Zeit für optimale Ergebnisse erforderlich. Mit Blick auf diese Herausforderung haben wir eine Leberzellisolierung Protokoll verschiedene Techniken kombiniert und angepasst diese zu unserem PHH Isolierungsprotokoll ^10.

Durch Zugabe von 10% FKS auf die Kollagenase P enthaltende Lösung II konnten wir die proteolytische Aktivität von Proteasen zu verringern. Diese Modifikation erlaubt längere Verdauungszeiten, notwendig für die Gewinnung hohe Zahl von NPC. In der Folge konnten wir PHH sowie NPC von guter Qualität und in hoher Menge zu isolieren. Erfolgreiche Leberzellisolierung hängt stark von der ursprünglichen Gewebequalität. Die Spenderdaten und Anamnese kann die Zelle Qualität und Quantität beeinflussen. Aus unserer Erfahrung gibt es keine Korrelation mit spenderspezifische Faktoren und auch sehr erfahrene Mitarbeiter kann den nicht erfolgreichen Zellisolierung konfrontiert werden. Da die Qualität des Spendergewebes ein kritischer Punkt ist, werden alle externen Quellen, die die Gewebequalität beeinträchtigen können, müssen minimiert werden.

Kritischsten Faktoren sind warme Ischämie Zeiten nach dem chirurgischen Eingriff und kalten Ischämie Zeiten während des Transports des Gewebes to das Labor. Zusätzlich sollten alle Quellen für bakterielle Infektionen vermieden werden. Es ist zu beachten , dass manchmal das Organ selbst bakterielle Verunreinigung enthalten kann, beispielsweise im Falle von Gallenwegserkrankungen. Kritische Schritte innerhalb des Isolationsverfahren decken die Perfusion Zeiten und Dichtegradientenzentrifugation Schritten. Der erste Perfusionsschritt sollte 20-30 Minuten dauern. Kürzere Zeiten Perfusion unvollständigen Abtrennung von Zell-Zell-Kontakte führen kann im Auftreten von Zellclustern in der gewonnenen Zellsuspension resultiert. Eine verlängerte erste Perfusion reduziert Lebensfähigkeit Zelle und induziert Zell - Stress durch Ca ²⁺ Erschöpfung.

Der zweite Perfusionsschritt für die enzymatische Verdauung Gewebe durchgeführt erfordert eine gewisse Erfahrung, um die optimale Verdauung Grad zu bestimmen, für die Entscheidung zu treffen über die Proteolyse-Reaktion zur richtigen Zeitpunkt zu stoppen. Kurze Aufschlusszeiten führen zu geringen Ausbeuten und längere Verdauungszeiten Stress und Zellschäden zu Zelle.Aus unserer Erfahrung zwischen unverdauten Gewebe und geschädigtem Gewebe während des Aufschlusses der Zeitrahmen liegt oft in einem Fenster von 1-3 min. Eine unvollständige Perfusion kann durch Verschieben der Druck innerhalb des Gewebes in einen anderen Bereich mit Klemmen zum Abklemmen Kanülen entgegengewirkt werden. Außerdem weichen Druck mit einem Spatel in Richtung der Gewebeprobe führt zu einer Änderung der Gewebeperfusion. Das Gewebe wird komprimiert und der Innendruck zunimmt. Anschließend werden die Blutgefäße auch komprimiert und deren Radius abnimmt. Mit einer Abnahme des Radius, zieht der Widerstand zunimmt (Hagen-Poiseuille Gesetz), und die Perfusionslösung den Weg des geringsten Widerstandes und durchblutet anderen Bereichen. Gemäß Baccarani und Mitarbeiter beobachteten wir , dass fibrotischen oder Zirrhose und Gewebe benötigt eine längere Verdauung Zeitraum ²² führt Zellviabilitäten zu senken. Aus diesem Grund empfehlen wir Gewebe von Patienten mit Leberfibrose oder Zirrhose zu vermeiden.

Die Herstellung undHandhabung der Dichte sowie Ernte Zellen aus den Steigungen Steigungen (siehe Schritt 5 und 7) ebenfalls wichtige Schritte abdecken. Die unterschiedlichen Dichtegradienten Schichten und die Zellsuspension haben für die Erstellung von scharfen Grenzschichten in einem langsamen und sorgfältigen Art und Weise übertragen werden. Außerdem besteht immer die Gefahr des Gradienten während der Handhabung zu beschädigen, insbesondere, während die Zellen zu ernten. Während der NPC Trennung ist die Einhaltung Trennschritt entscheidend für die spätere Ausbeute und Reinheit aller NPC-Fraktionen. Um die Zellzahl von nicht eingehalten NPC erhöhen und die Reinheit des KC ein zusätzlicher Waschschritt kann hilfreich sein. Die Waschlösung aus diesem Schritt wird für die weitere NPC-Trennung mit den Überständen gesammelt. Um eine Verunreinigung durch Bakterien zu vermeiden, Pilze oder Viren strengen aseptischen Bedingungen müssen ²³ sichergestellt werden.

In Abhängigkeit der erforderlichen Zellpopulationen kann das Protokoll durch Überspringen spezifische Schritte geändert und angepasst werden. Zum Beispiel, wenn nur KCerforderlich, die Doppel Zentrifugationsschritt für NPC Sedimentation mit dem zweiten Zentrifugationsschritt und die Schritte für HSC und LEC Trennung fallen gelassen werden kann reduziert werden. Durchblutungszeiten und g-Kraft für die Zentrifugation auch in Abhängigkeit von Gewebe- und Zellqualität variiert werden kann. Fibrotische Gewebe erfordert Verdauzeiten verlängert, daher gibt es eine Notwendigkeit, sorgfältig die Gewebeelastizität steuern. Die Ansammlung von Fetttröpfchen in Fett Hepatozyten verringert die Zelldichte und damit ändert sich die Sedimentation Eigenschaften. Nach unseren Beobachtungen kann es sinnvoll sein, um die g-Kraft während PHH Isolation je nach Lipidgehalt der PHH, wenn hohe PHH Mengen erforderlich sind, anzupassen. Es muss darauf hingewiesen werden, dass Änderungen des ursprünglichen Zentrifugationsschritt sich negativ auf die NPC Isolation in Bezug auf Qualität und Quantität beeinflussen. Bisher empfehlen wir g-Kräfte zwischen 50 · g (Hepatozyten mit niedrigem Fettgehalt) und 150 · g (Hepatozyten mit hohem Fettgehalt). Zusätzlich Fett Hepatocytes dazu neigen, eine weniger kompakte Zellpellets nach Dichtegradientenzentrifugation und die weitere Zellernte bilden muss geändert werden, wie in Schritt 5.5 beschrieben.

Zur Beschleunigung können die Isolierungsverfahren einige Schritte gleichzeitig durchgeführt werden. Beispielsweise in parallel mit der Reinigung der isolierten Hepatozyten kann eine zweite Person mit dem NPC Isolation beginnen. Zusätzlich kann der Dichtegradient Lösungen im Voraus vorbereitet werden. Wenn es mehr als zwei Personen sind noch mehr Schritte können gleichzeitig durchgeführt werden.

Im Vergleich zu anderen humanen Leberzellisolierung Protokolle zeigen unsere Ergebnisse , ähnliche oder höhere Zellausbeuten und Bewohnbarkeit als ¹ zuvor in Experimental Biology and Medicine veröffentlicht. Für KC Isolation Alabraba und Mitarbeiter zeigten Isolation Ergebnisse mit einer Ausbeute von 2,3 x 10 ⁶ lebensfähigen Lebergewebe KC / g mit einer Lebensfähigkeit von etwa 98% ¹³ kombiniert, die vergleichbarunsere KC Ergebnisse (Zellzahl: 1,9 x 10 ⁶ lebensfähigen KC / g Lebergewebe, Lebensfähigkeit etwa 93%). Die Mehrheit der veröffentlichten LEC Isolation Daten beschreiben Isolationen von ganzen Organen ^15,24. Gerlach und Mitarbeitern sowie Lalor und Mitarbeiter isolierten Zellzahlen zwischen 10 ³ und 10 ⁶ Zellen / organ ^15,24. Diese Daten können nicht direkt miteinander verglichen werden Isolationen aus Gewebeproben zu Zelle. Jedoch unser Protokoll haben wir gezeigt Ausbeuten für LEC von 2,7 x 10 ⁵ lebensfähige LEC / g Lebergewebe, die bei weitem größer sind , wenn sie auf eine ganze Organ hochgerechnet. HSC wurden mit einer Ausbeute von etwa 4,7 x 10 ⁵ lebensfähigen HSC / g Lebergewebe und Lebensfähigkeit etwa 90% isoliert. Bestehende Ergebnisse veröffentlicht von Friedman und Kollegen zeigten die Hälfte niedrigere Zellausbeuten (2,3 x 10 ⁵ HSC / g Leber), aber eine ähnliche Reinheit (91%) ^14. In Bezug auf unser Protokoll können niedrige Zellausbeuten durch schlechte Durchblutung und Verdauung durch geringe oder gar keine Zirkulation von 1x Perfusions-Solutio verursacht werdenn I und verdauungs Lösung innerhalb des Gewebes. Zusätzlich Gasblasen im Gewebe können die intra-Gewebe Zirkulation von 1x Perfusions-Lösung I und Verdauung-Lösung stören. In diesen Fällen kann die Perfusion durch Erhöhung der Perfusionsdruck und die Beseitigung von Gasblasen durch Einklemmen einzelnen Kanülen und / oder mit einem Spatel zum Schieben gegen die Gewebeprobe verbessert werden. Eine schlechte Lebensfähigkeit ist in den meisten Fällen eine Folge von Zellstress. Längerer Ischämie Zeiten, Schäden durch Ca ²⁺ Verarmungs und Proteolyse von Membranproteinen verknüpft sind Beschädigung Zelle sichtbar blebs der Zellmembran. Aus unseren Beobachtungen eine sehr empfindliche diese Zellen Stress zu scheren und in den meisten Fällen während des Isolationsverfahrens sterben. Zusammengefasst erfordert erfolgreiche Isolierung und Trennung von parenchymalen und nicht-parenchymalen Leberzellen, dass kritische Schritte in die richtige Zeitrahmen durchgeführt werden, werden Pipettierschritte durchgeführt sorgfältig und im Allgemeinen die Zeit für die Zellisolierung und Trennung should werden so kurz wie möglich ²¹ gehalten. Ein Nachteil des beschriebenen Protokolls ist , dass die Isolationsbedingungen (zB Durchblutungszeiten) nicht vollständig standardisiert werden können, haben aber individuell auf die Gewebequalität angepasst werden. Zusätzlich in Abhängigkeit der Qualität des Gewebes und die Verdaureaktion Ergebnis die Ausbeute und die Reinheit der gewonnenen Zellpopulationen kann variieren.

Wir veröffentlichten vor kurzem eine Studie den Einfluss von Kultivierungsbedingungen kombiniert mit funktionellen Charakterisierung jeder NPC Zelltyp nach dieser Methode ¹ getrennt zu demonstrieren. Die Möglichkeit , zu isolieren und zu trennen verschiedenen Zellpopulationen der Leber ermöglicht die Erstellung von innovativen humanen Leberzell Co-Kulturen und Tissue-Engineering in vitro Leber - Modelle. Es ist bekannt , daß PHH Kultivierung in 2D mono-Kulturen führt zur Dedifferenzierung und Verlust der typischen Zellfunktionen ^7. Aus diesem Grund ist es notwendig , die in vivo Gewebe archi nachzuahmentektur in in - vitro - Leber - Modelle. Kostadinova und Mitarbeiter (2013 ^8,9) sowie Messner und Mitarbeiter (2013 ^8,9) erfolgreich funktionelle Kokultur Lebermodellen für die Erkennung von hepatotoxischen Wirkungen festgestellt. Allerdings wurden NPC nicht charakterisiert und spezifische Funktionen wurden in diesen Systemen nicht untersucht.

Daher sind weitere Forschung sollte innerhalb von Co-Kulturen auf die langfristige Überleben der NPC, ihre spezifischen Eigenschaften und Wechselwirkungen auf Untersuchungen konzentrieren. Für solche Studien, könnte es auch von Interesse sein, ein Protokoll für die Isolierung von Cholangiozyten zu etablieren. Realisierung von funktionellen in vitro Co-Kulturen einschließlich aller Zelltypen in der nativen Leber enthalten ist, könnte ein weiterer Schritt in die Richtung von in vivo wie menschliche Leber - Modelle sein.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
General Equipment
PIPETBOY	Eppendorf
pipettes	Eppendorf
microscope	Carl Zeiss
microscope	Olympus
CO2-incubator	Binder
Lamin Air	Heraeus
Centrifuge Varifuge 3.0R	Heraeus
Urine Beaker	Sarstedt	2041101
perfusor syringe 50 ml	B.Braun	12F0482022
Bottle Top Filter	Nalgene	1058787
Falcon 50 ml Polypropylene Conical Tube	BD Biosciences	352070
Falcon 15 ml Polypropylene Conical Tube	BD Biosciences	352096
Tissue Culture plate	BD Biosciences	533047	24 well
serological pipettes	BD Biosciences	357525, 357551, 357543	25 ml, 10 ml, 5 ml
pipette tips	SARSTEDT	0220/2278014, 0005/2242011, 0817/2222011	100 µl, 200 µl, 1,000 µl
Name	Company	Catalog Number	Comments
Isolation Equipment
water bath	Lauda
peristaltic pump	Carl Roth
circulation thermostat	Lauda
pH meter	Schott
fine scales	Sartorius
stand
Büchner funnel	Haldenwanger
plastic funnel
silicone tube
cannulae with olive tips
glass dish
forceps
scalpel	Feather	12068760
Neubauer counting chamber	Optic Labor
cell lifter	Costar
Surgical Drape	Charité Universitätsmedizin Berlin	A2013027
compress	Fuhrmann	40013331
sterile surgical gloves	Gammex PF	1203441104
Tissue glue	B. Braun	1050052
glass bottle	VWR
Collagenase P	Roche	13349524
Percoll Separating Solution	Biochrom	L6145	Density 1.124 g/ml
Hank’s BSS	PAA	H00911-3938
Dulbecco’s PBS	PAA	H15 - 002	without Mg/Ca
Ampuwa	Plastipur	13CKP151
Albumin	Sigma-Aldrich	A7906
NaCl	Merck	1,064,041,000
KCl	Merck	49,361,000
Hepes Pufferan	Roth	133196836
EDTA	Sigma	E-5134
Name	Company	Catalog Number	Comments
Media Equipment
DMEM	PAA	E15-005	Low Glucose (1 g/L) (without L-Glutamine)
HEPES Buffer Solution 1 M	GIBCO	1135546
L-Glutamine	GIBCO	25030-024	200 mM
MEM NEAA	GIBCO	11140-035
penicillin/streptomycin	GIBCO	15140-122
RPMI 1640	PAA	E15 - 039	without L-Glutamine
Sodium Pyruvate	GIBCO	1137663	100 mM
Trypan Blue Solution	Sigma-Aldrich	T8154	0.4%
William’s E	GIBCO	32551-020
with GlutaMAX™
EGTA	Sigma-Aldrich	03780-50G
Fortecortin	Merck	49367	8 mg/2 ml
Human-Insulin	Lilly	HI0210	100 I.E./ml
N-Acetyl cysteine	Sigma-Aldrich	A9165-5G
Fetal calf serum (FCS)	PAA	A15-101
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment for Immunostainings
CD 68	R&D Systems, USA		monoclonal
CK 19	Santa Cruz	D2309	polyclonal
CK18	Santa Cruz	K2105	monoclonal
Vimentin	Santa Cruz		monoclonal
GFAP	Sigma Aldrich		monoclonal
Triton X-100	Sigma Aldrich	23.472-9
Goat anti-Mouse IgG1-PE	Santa Cruz	C0712
Goat anti-rabbit IgG-FITC	Santa Cruz	L0412
Methanol	J.T.Baker	1104509006
Formaldehyde 4%	Herbeta Arzneimittel	200-001-8
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A7906-100G