Protokoll för isolering av primära humana hepatocyter och Motsvarande Större populationer av icke-parenkymala leverceller

Abstract

Bredvid parenkymala hepatocyter, levern består av icke-parenkymceller (NPC), nämligen Kupffer-celler (KC), lever endotelceller (LEC) och leverstellate celler (HSC). Tvådimensionell (2D) odling av primära humana hepatocyte (PHH) fortfarande anses vara den "gyllene standarden" för in vitro testning av läkemedelsmetabolism och levertoxicitet. Det är väl känt att 2D monokultur av PHH lider dedifferentiering och funktionsförlust. Det har nyligen visat att hepatiska NPC spelar en central roll i levern (patho-) fysiologi och underhåll av PHH funktioner. Aktuell forskning fokuserar på återuppbyggnaden av in vivo vävnad arkitektur med 3D- och co-kultur modeller att övervinna begränsningarna i 2D monokulturer. Tidigare publicerade vi en metod för att isolera humana leverceller och undersökt lämpligheten av dessa celler för deras användning i cellkulturer i experimentell biologi och medicin ^1. Baserat på det breda intresset för denna technique syftet med denna artikel var att ge en mer detaljerad protokoll för leverceller isoleringsprocessen bland annat en video, som kommer att möjliggöra en enkel återgivning av denna teknik.

Humana leverceller isolerades från levervävnadsprover av kirurgiska ingrepp mänskliga av en två-stegs EGTA / kollagenas P perfusion teknik. PHH separerades från NPC av en initial centrifugering vid 50 x g. Densitetsgradient centrifugeringssteg användes för avlägsnande av döda celler. Individuella levercellpopulationer isolerades från den anrikade NPC-fraktionen med användning av specifika egenskaper cell och cellsorteringsprocedurer. Bredvid PHH isolering vi kunde skilja KC, LEC och HSC för ytterligare odling.

Sammantaget gör det presenterade protokollet isoleringen av PHH och NPC i hög kvalitet och kvantitet från en donator vävnadsprov. Tillgången till renade levercellpopulationer kan möjliggöra skapandet av in vivo som mänskliga liver modeller.

Introduction

Human levervävnad är mycket komplexa och består av två olika cell enheter, parenkymala celler och icke-parenkymceller (NPC). Parenkymala leverceller inkluderar hepatocyter och cholangiocytes. Hepatocyter utgör 60 till 70% av det totala antalet leverceller och svarar för huvuddelen av de metaboliska leverfunktioner, t.ex. gallsyror och komplettera faktor syntes, biotransformation och energiomsättning ^2,3.

Den mindre NPC fraktion utgör 30-40% av den totala leverceller. NPC inkludera olika cellpopulationer, nämligen Kupffer-celler (KC), lever endotelceller (LEC) och leverstellate celler (HSC). Detta heterogen cellfraktionen spelar en central roll i fysiologiska processer i levern. Dessutom, NPC delta i mediering av akut leverskada, t ex läkemedelsinducerad leverskada (DILI) såväl som i kroniska leverskador, såsom cirros ^4.

På senare år, hUman leverceller har blivit mer och mer viktigt i forskning och utveckling av drogtestning, läkemedelsutveckling och identifiering av nya biokemiska vägar i leversjukdomar. För in vitro-tester PHH monokulturer fortfarande betraktas som "gold standard" ^5. Den största begränsningen av nuvarande homotypiska lever modeller är dedifferentiering och förlust av funktion av hepatocyter inom några dagar ^4. Inrättandet av 3-dimensionella (3D) odlingstekniker har visat att dessa begränsningar kan kompenseras ^4,6. Även moderna 3D odlingstekniker är dock inte kunna visa alla hepatotoxiska verknings ^7. Saknade NPC befolkningar i de befintliga in vitro modeller diskuteras som en möjlig orsak till denna diskrepans för in vivo situationen. Det har visats att den cell-cell-kommunikation mellan de olika levercellpopulationer spelar en central roll i fysiologisk homeostas utan också i pathophysiologic bearbetar ^8. vetenskaplig uppmärksamhet fokuserar därför mer och mer på NPC och deras cell-cell interaktioner. Deras målmedveten användning i samarbete kultur och vävnadstekniska system skulle kunna vara en lösning för den stora efterfrågan av in vitro lever modeller ^8,9 som är så nära situationen in vivo som möjligt.

För närvarande den största utmaningen är att utveckla ett standardiserat humanlever co-kultur-modellen, som innehåller klart definierade delar av PHH och NPC. Följaktligen är isoleringstekniker för de heterogena leverceller behövs och de som måste optimeras för att få rena cellpopulationer. Även standardiserade protokoll för PHH isolering finns ^10, är den standardiserade isolering av humant NPC fortfarande under utveckling. Mest publicerade NPC isoleringsprotokoll baserade på experiment med icke-mänskliga celler ^11,12. Endast ett fåtal publikationer beskriver isoleringen processen för mänsklig NPC och de flesta täcker endastMetoder för isolering av en enda celltyp ^11-16. De viktigaste cellegenskaper som har tas i bruk för cellseparation är storlek, densitet, fastsättning beteende, och uttrycket av ytproteiner. På grundval av dessa egenskaper har vi utvecklat ett förenklat protokoll för att isolera PHH, KC, LEC och HSC, som tidigare publicerats i experimentell biologi och medicin ^1. På grund av det breda intresset för denna teknik, syftet med denna artikel var att ge en mer detaljerad protokoll för leverceller isoleringsprocessen bland annat en video, som gör det möjligt att reproducera tekniken lättare. Protokollet innehåller också kvalitetskontroll metoder för utvärdering av avkastning och lönsamhet samt för identifiering och renhet utvärdering med specifika immunostainings.

Protocol

Obs: Alla celler isolerades från resekterade icke-tumör human levervävnad, som kvarstod efter partiell leverresektion med primära eller sekundära levertumörer. Informerat samtycke från patienterna erhölls i enlighet med etiska riktlinjer Charité - Universitätsmedizin Berlin.

1. Framställning av material och lösningar

1. Sterilisera alla instrument och material i förväg för att undvika bakteriell kontaminering under isoleringsprocessen.
2. Förbereda de lösningar som krävs för perfusion av provet levervävnad, isoleringsprocessen av hepatocyter och icke-parenkymala leverceller och odling av primära humana leverceller enligt tabellerna 1 och 2, med undantag av Digestion-lösning som är beredd nyligen före användning. Alla lösningar kan lagras vid 4 ° C och det rekommenderas att använda dem inom 4 veckor efter beredning.
3. Steriliseraalla lösningar med hjälp av ett 0,22 | j, m flaska toppfiltret.

2. Framställning av Perfusion Equipment

1. Installera utrustningen för perfusion och digerering av vävnadsprov levern såsom visas i figur 1A.
2. Justera vattenbadets temperatur till 39 ° C för att säkerställa optimal kollagenas P aktivitet under perfusion och matsmältning.

3. Perfusion och Digestion av levervävnaden Prov (1,5 tim)

1. Välj ett vävnadsprov med en intakt Glisson kapsel från opererande levervävnad. När du skär av vävnadsprov, försöka få en liten skäryta med goda synliga fartyg. Undvik varma ischemi gånger genom att transportera och hantera prov levervävnaden på is tills perfusion.
2. Ta vävnadsvikt under sterila betingelser och placera provet levervävnaden i en petriskål i det laminära luftflödet. Rengör ytan av vävnadsprov med en steril kompress från reresterande blod och spola kanylen ställts in med 1x Perfusion-lösning I för att säkerställa att alla kanyl var genomsläppligt.
3. Använd vävnadslim för att fixera oliver av kanyler i några större blodkärl. Beroende på storleken av provet levervävnad och antalet fartyg på ytan, använd en kanyl in med 3 till 8 kanyler. Testa perfusion och kontrollera läckage. Stäng alla blodkärl, som läcker klar 1x Perfusion-lösning I, med vävnadslim.
4. Placera den kanylerade provet levervävnad in i Biichner-tratt på dess perforerade filterskiva (Figur 1A).
5. Ställa in flödeshastigheten hos den peristaltiska pumpen mellan 7,5 ml / min och 14,6 ml / min beroende på antalet kanyler som har använts och på motstånd av levervävnaden. Justera flödet varje gång för att säkerställa att det finns en aktuell men långsam perfusion. BEGJUTA vävnaden tills helblod spolas ut men åtminstone 20 min. Observera vävnaden blir ljusare i områden med goda perfusipå.
   Obs: I vissa fall kan det vara nödvändigt att spänna fast en av kanylerna med klämmor av plast eller för att öka det inre trycket i ett område genom att trycka försiktigt med en spatel mot leverkapseln, för att optimera perfusion. En fullständig färgförändring till en ljusgul till ljust brunaktig färg indikerar en god perfusion.
6. Ändra organgenomströmningsfluiden till Digestion-Lösning innehållande kollagenas P (tabell 1).
7. Ordna installationen (figur 1A) för uppslutningssteget. Därför utföra ett cirkulärt flöde av Digestion-Lösning enligt figur 1B i upp till 15 min.
   Obs: Det är viktigt att stoppa perfusion omedelbart när prov levervävnaden är tillräckligt smälta. En god matsmältning kan observeras, när vävnaden visar inga tecken på elasticitet såsom fastställts genom upprätthållande av kapsel deformationer, när den förs med en spatel.

4. Isolering av hepatocyter (1 tim)

1. Turna den peristaltiska pumpen av och placera provet levervävnaden i en glasskål. Skölj utsidan av vävnadsprov med iskall stopplösning (tabell 1). Ta bort kanyler från prov levervävnad. Använda en skalpell för att öppna vävnadsprov levern, genom öppning i mitten av det område där kanylerna var fästa. Håll noga med att Glisson's kapseln förblir intakt.
2. Skölj insidan av vävnadsprov och sedan täcka hela provet vävnaden med iskall stopplösning. Skaka vävnaden försiktigt för att frigöra cellerna ut ur vävnaden.
3. Samla cellsuspensionen och filtrera den genom en blick tratt (plast tratt fodrad med gasbinda kompress) i 50 ml plaströr. Tillsätt mer Stop-lösning till prov levervävnad tills en slutlig volym av 500 ml förbrukas.
4. Centrifugera cellsuspensionen vid 50 x g, 5 min, 4 ° C. Samla in supernatanten för senare icke-parenkymal cellisolering. Tvätta cellpelleten med PBS (Figur 2A).
5. Centrifugera cellsuspensionen igen vid 50 xg, 5 min, 4 ° C. Samla in supernatanten och återsuspendera pelleten i Hepatocyte inkubationsmediet (tabell 2, figur 2B).
6. Bestäm antalet celler och livskraft i den resulterande cellsuspensionen med hjälp av trypan blå färgning. Räkna levande och döda celler i en Neubauer räknekammare. Beräkna antalet celler, livskraft och utbyte av PHH med hjälp av nedanstående formler.
   
   avkastning (räknade celler) = räknade celler x utspädningsfaktor x volym av cellsuspensionen (ml) x 10000
   
   utbyte (hepatocyter / (g levervävnad prov)) = (utbyte (hepatocyter / (ml media)) x Volymen av cellsuspension (ml)) / (vikt av levervävnadsprov (g))
   
   viabilitet (%) = 100% x (antalet levande celler) / (totalt antal celler)

5. Rening av Hepatocyter (1 tim)

Obs: Detta reningssteg rekommenderas, om lönsamhetenär lägre än 70%.

1. Utför alla steg på is. Bered en 25% densitetsgradient genom att blanda 5 ml densitetsgradientlösningen och 15 ml PBS för densitetsgradientcentrifugering.
2. Sätt högst 50 miljoner celler totalt ur hepatocyte rika cellsuspensionen långsamt och försiktigt på toppen av 25% densitetsgradient lager för att säkerställa att en klar åtskillnad mellan de båda skikten uppnås (figur 2C). Sätta rören försiktigt in i centrifugen och centrifugera vid 1250 xg, 20 min, 4 ° C utan broms (figur 2D).
3. Aspirera återstående cellsuspensionen och de döda celler i interfas. Beroende på fetthalten en kan också aspirera densitetsgradienten-lösning.
   Obs: PHH med låg lipidhalt bildar en tät pellet och densitetsgradienten kan sugas helt. PHH med hög lipidhalt bilda en mer diffus pellet och en massa av livskraftiga celler kan finnas kvar i densitetsgradientlösningen ovanför pelleten.
4. Åter suspendera hepatocyt pellets med PBS och centrifugera igen vid 50 xg, 5 min, 4 ° C. Pool pelletsen, tvätta igen med PBS och återsuspendera renad PHH i Hepatocyte Incubation medium. Utför cellräkning som beskrivs i steg 4,6.

6. Odling av hepatocyter

1. Förbered cellodlingsskålar för sådd av PHH genom att belägga dem med en extracellulär matris, t ex råttsvanskollagen (kollagen typ I). Förbered råttsvanskollagen i enlighet med protokoll som upprättades av Rajan et al. ¹⁷
2. Späd råttsvanskollagen stamlösningen 1: 200 i PBS. Överföring 100 pl / cm ² råttsvanskollagen lösning i odlingsskålarna, noga med att hela ytan är täckt. Inkubera cellodlings plast under 20 min vid rumstemperatur. Aspirera återstående råttsvanskollagen-lösning.
3. Seed 15 x 10 ⁴ hepatocyter / ^cm2 i Hepatocyte inkubationsmediet för kultur dishes belagda med råttsvanskollagen. Odla cellerna i en fuktad inkubator vid 37 ° C, 5% _CO2 under åtminstone 4 h. Efter fyra timmar hepatocyterna har anslutit sig och mediet kan ändras.
4. Utför undersökningar beroende på försöksuppställningen. En odlingstid av 48 h rekommenderas för att tillåta cellerna att återhämta sig från isoleringsprocessen.

7. Isolering av icke-parenkymala leverceller (1,5-2 h)

1. Centrifugera den insamlade supernatanten (steg 4,5 och 4,6) vid 72 xg, 5 min, 4 ° C för att eliminera de återstående erytrocyter och hepatocyter. Pool supernatanterna och centrifugera dem två gånger för att få två cellpellets: 300 xg, 5 min, 4 ° C under sedimentation av HSC, LEC och delvis KC och 650 xg, 7 min, 4 ° C under sedimentering av det kvarvarande KC.
2. Pool både pellets och återsuspendera dem i HBSS. Bered en 25% och en 50% densitetsgradienter genom att blanda densitetsgradientlösningen och PBS under densitetsgradient centrifugeugation (25% densitetsgradient lösning: 5 ml densitetsgradientlösningen och 15 ml PBS, 50% densitetsgradient lösning: 10 ml densitetsgradientlösningen och 10 ml PBS, se figur 2). Placera 25% densitetsgradientlösningen noggrant ovanpå densitetsgradientlösningen skiktet den 50%.
3. Sätt NPC suspensionen långsamt och försiktigt på toppen av densitetsgradient lösning skiktet 25% på ett sätt som en klar åtskillnad mellan de båda skikten uppnås.
4. Centrifugera cellsuspensionen på densitetsgradienten vid 1800 xg, 20 min, 4 ° C utan broms (figur 2,2).
5. Aspirera döda celler och cellavfall från det översta skiktet. NPC är belägna i interfas mellan 25% och 50% densitetsgradient skikt (figur 2). Samla NPC, tvätta dem med HBSS och centrifugera cellsuspensionen tillämpning av ovan beskrivna dubbla centrifugeringssteget (steg 7,2)..

8. Separation av Kupffer-celler (VidhäftningSeparationssteg) (1 timme)

1. Gör en cellräkning för KC i NPC fraktion som beskrivs i steg 4,6. (För uppkomsten av KC i suspension se figur 3B). Centrifugera NPC fraktion med det ovan beskrivna dubbla centrifugeringssteg (steg 7,2) och återsuspendera NPC i Kupffer cellsådd medium (tabell 2).
2. Seed KC innehållande fraktionen på plastcellkulturkärl vid en densitet av 5 x 10 ⁵ KC / cm ^2. Inkubera KC kulturerna under 20 min i en fuktad inkubator vid 37 ° C, 5% _CO2. Primära KC följa på cellodlings plast inom en kort tidsperiod (Figur 2.3).
3. Samla supernatanten innehållande inte följs NPC, som huvudsakligen består av LEC och HSC. Pool supernatanterna för senare separation av LEC (se avsnitt 9) och HSC (se avsnitt 10). Tvätta vidhäftande KC med HBSS och odla dem i Kupffer Cellodlingsmedium (Tabell 2) vid 37 ° C, 5% CO₂ i en fuktad inkubator.

9. Separation av endotelceller (1,5 tim)

1. Centrifugera den insamlade supernatanten (steg 8,5.) Vid 300 xg, 5 min, 4 ° C. Tvätta pelleten med PBS. Efter centrifugering vid 300 xg, 5 min, 4 ° C återsuspendera cellerna i Stellate Cell / Endothelial Cell separationsmedium och utför en cellräkning för alla återstående celler såsom beskrivs i steg 4,6.
2. Återsuspendera 1 x 10 ⁷ Mio-celler i 1 ml Stellate Cell / Endothelial Cell separationsmedium, tillsätt 20 | il blockerande lösningen från MACS-kit och 20 | il av de CD31 Micro Pärlor för immunomärkning och inkubera den resulterande suspensionen under 15 min vid 4 ° C temperatur (figur 2,4).
3. Separat LEC från HSC som beskrivs i tillverkar protokollet för den magnetiskt aktiverad cellsorteringssystem MACS (figur 2,5). Eluera magnetiskt behöll CD31-positiva LEC och suspendera dem i Stellate Cell / Endothelial Cellodlingsmedium (tabell 2).
4. Utför cellräkning för LEC som beskrivs i steg 4,6. Utsäde LEC i en täthet av 1,25 x 10 ⁵ celler / cm ² i cell odlingskärl belagda med råttsvanskollagen (se steg 6.1). Odla cellerna vid 37 ° C, 5% _CO2 i en fuktad inkubator.

10. Separation av stellatceller (0,5 tim)

1. Omärkt HSC passerar separationskolonnen under MACS förfarande. Samla HSC fraktionen (se steg 9,5, figur 2.5). Utför cellräkning som beskrivs i steg 4,6.
2. Seed HSC med en densitet av 5 x 10 ⁴ celler / cm ² i cellkulturkärl belagda med råttsvanskollagen (se steg 6.1) i Stellate Cell / Endothelial Cellodlingsmedium (tabell 2) och odla dem vid 37 ° C, 5% _CO2 i en fuktad inkubator.

Tabell 1: Perfusion och isolering lösning.

Tabell 2: Kultur och isoleringsmedia.

Representative Results

Separationen i en parenkymal och icke-parenkymala fraktionen, med hjälp av densitetsgradientcentrifugering som en sanering förfarande i kombination med användning av vidhäftningsegenskaper och MACS leder till framgångsrik PHH och NPC isolering. PHH och NPC kan isoleras i hög kvalitet och kvantitet. Figur 1 visar representativa installationen av utrustning för levern perfusion och matsmältning. 10% FCS tillsattes till kollagenas P innehållande Perfusion - lösning II för att reducera proteolytisk aktivitet av proteaser och stabilisera kollagenas P-aktivitet i gengäld. I konsekvens längre uppslutningstider som krävs för NPC isolering kan tillämpas utan en negativ inverkan på lönsamheten för PHH.

Figur 1:. Perfusion och matsmältning lation Första perfusion steget genomföres i order för att avlägsna kvarvarande blod, värma upp vävnaden och avlägsna Ca2 ⁺ för att lösa upp cell-cell-anslutningar genom att använda 1x perfusioner Lösning I (PI) (A). Återcirkulation av Digestion-Lösning (GD) utförs för nedbrytning av levervävnaden under perfusionen steg II (B).

Figur 2:. Förenklad schematisk bild av hela PHH och NPC isoleringsprocess Modifierad från Pfeiffer et al ^ett 2014 med tillstånd av experimentell biologi och medicin.. För det första är vävnadsprov levern perfuserades och digererades genom en två-stegs EGTA / kollagenas P perfusion teknik (A). Den fick cellsuspensionen centrifugeras initialt vid 50 xg, 5 min, 4 ° C (B), för att separera den större PHH-fraktion (pellet) från den mindre NPC-fraktion (supernatant). I händelse av en PHH viabilitet under 70%, kan den viabla PHH fraktionen anrikas genom en densitetsgradient centrifugering vid 1250 xg, 20 min, 4 ° C (C) som resulterar i sedimentering av PHH vid botten av röret, medan döda celler / cellrester är belägna på toppen av densitetsgradient skiktet (D). Insamlade supernatanter av den ursprungliga centrifugering (1) centrifugeras med två steg: 1) 300 xg, 5 min, 4 ° C och 2) 650 xg, 7 min, 4 ° C. Efter den första centrifugeringen KC är delvis belägen i den överstående lösningen. I detta sammanhang är nödvändigt det andra isoleringssteget. De fått cellpelletar poolas och re-suspenderades i HBSS. Därefter cellsuspensionen försiktigt skiktas på toppen av en två-skikt (25% / 50%) densitetsgradient. De skiktade densitetsgradient Rören centrifugeras vid 1800 xg, 20 min, 4 ° C (2). Döda celler på toppen av 25% densitetsgradient skiktet kasseras. NPC belägen mellan interfasen av 25% och 50% density gradientskikt uppsamlas och poolas. NPC fraktionen ympas på obelagda cellodlings plast. Med användning av en 20 min inkubation tid (vidhäftning separationssteg) KC är separerade från andra levercellpopulationer (3). LEC och HSC separeras med hjälp av MACS-kit. Därför de uppsamlade återstående leverceller i supernatanten centrifugeras vid 300 xg, 5 min, 4 ° C, och är märkta med CD31-konjugerade mikropärlor (4). Endast CD31-negativa HSC passera MACS separationskolonnen (5). CD31-positiva LEC stick till kolonnen. Slutligen kolonnen bort från magnetanordningen och CD31-positiva LEC elueras ur kolonnen (5). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Den isolerade PHH visade en avkastning på 14,2 x 10 ⁶ ± 6,6 x 10 ⁶ livskraftig PHH / g levervävnad och en lönsamhets ca 760,6 ± 4,2% (tabell 3 ^1). Mikroskopiskt synliga detaljer var en typisk stor cytoplasmisk volym i kombination med fettdroppar och mellan en och fyra kärnor, (figur 3A). Cellstorleken varierar mellan 20 till 30 | im i suspension.

KC var den vanligaste celltypen i NPC fraktionen. Vi isolerade ungefär 1,9 x 10 ⁶ ± 0,2 x 10 ⁶ livskraftig KC / g levervävnad med en livskraft 92,8 ± 3,5% (tabell 3 ^1). KC är mycket små celler (ca 5 ^ m) med en låg cytoplasma / kärna-förhållande och typiska mikrovilli på ytan (figur 3B).

Slutligen vi använde MACS separationsteknik för att separera CD31-positiva LEC från kvarvarande CD31-negativa HSC. Utbytet av LEC var ca 2,7 x 10 ⁵ ± 0,1 x 10 ⁵ livskraftig LEC / g liver vävnad och den uppnådda lönsamheten var 95,6 ± 2,8% (tabell 3 ^1). Identifieringskriterier är den multipla granulat och en storlek på ca 10 | im i cellsuspension (fig 3C) samt den karakteristiska spindelform efter en kort odlingstid (figur 3G).

Isoleringsprocessen resulterade i en HSC utbyte ca 4,7 x 10 ⁵ ± 0,2 x 10 ⁵ viabla HSC / g lever (N = 8) med en livsduglighet av 89,6 ± 3,8% (tabell 3 ^1). Mikroskopiskt identifierbara karakteristika var en storlek av ca 20 | j, m och en typisk granulerat utseende med en varierande mängd av lipiddroppar (Figur 3D).

Tabell 3: Utbyten, livskraft och renhet av isolerade PHH och NPC. Tre olika donatorer utvärderades. Data ges som medelvärde ± SD. Denna tabell publicerades tidigare i Pfeiffer et al. ^1, 2014 och återges med tillstånd från experimentell biologi och medicin.

För identifiering och bestämning av cellodlings renhet, varje isolerad cellfraktionen behandlas med antikroppar mot cell typspecifika antigener. Cellerna behandlades med fluorescerande sekundära antikroppar och undersöktes genom immunofluorescens mikroskopi. Renheten bestämdes genom att räkna positiva fluorescerande färgade celler i förhållande till det totala cellantalet visualiserades genom Hoechst-färgning.

Efter 24 h odling PHH visade en karakteristisk polygonal form och ofta polyploidi (figur 3E). PHH var positiva för CK 18 (figur 3I) och visade en renhet av 92,3 ± 3,2%(Tabell 3 ^1).

KC efterlevs inom 20 minuter på cellodlingsplastytor. Efter en inkubationstid på 24 hr små runda celler med en framstående runda cellkärna observerades (Figur 3F). Ytproteinet CD68 användes för att identifiera KC (figur 3J). Renheten hos CD68-positiva celler uppgick till 81,0 ± 5,4% (tabell 3 ^1).

Trots MACS separation med användning av CD31 märkning under NPC separationen var det fortfarande möjligt att färga isolerade LEC med CD31. den isolerade och odlade LEC var därför färgades med CD31 för identifiering och bestämning av renhet. Dessutom LEC visade immunoreaktivitet för mesenkymala cellmarkör vimentin (figur 3K). Vi observerade ungefär 81,0 ± 1,7% av positiva färgade celler (tabell 3 ^1). HSC med sina typiska framträdande lipiddropparna (figur 3H) präglades av immunofluorescens färgning för GFAP (Figur 3L). HSC renheten var 93,0 ± 1,7% (tabell 3 ^1).

Varje cell fraktionen motfärgades med andra NPC markörer. Alla fraktioner cell innehöll ett litet antal andra lever specifika celltyper, men var negativa för hepatocyte markören CK18 och cholangiocyte markören CK19.

Fig. 3: Morfologi av mänsklig parenkymal och icke-parenkymala leverceller i suspension och efter vidhäftning Den vänstra kolumnen (A - D) visar de olika isolerade levercellpopulationer direkt efter isoleringsprocesseni faskontrastmikroskopi vy: PHH (A), KC (B), LEC (C), och HSC (D). Den mellersta kolumnen (E - H) presenterar bilder av isolerade och odlade PHH (E), KC (F), LEC (G) och HSC (H) efter 24 timmar av odling (faskontrastmikroskopi). Immunofluorescens baserad karakterisering av de olika cellfraktioner visas i den sista kolumnen: PHH visade positiva signaler för hepatocyte markör CK18 (I, 24 timmar efter isolering), KC var positiva för markören CD68 (J, 24 timmar efter isolering), LEC visade positiva signaler för vimentin (K, 72 timmar efter isolering) och HSC var positiva för GFAP (L, 72 timmar efter isolering). Cellkärnor färgades med Hoechst; förstoring: 400X. Modifierad från Pfeiffer et al. ^1, 2014 med tillstånd av Experimental biologi och medicin. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Den publicerade protokoll beskriver en teknik för att isolera ren PHH och NPC, nämligen KC, HSC och LEC, samtidigt med hög kvalitet och renhet från samma prov av human levervävnad. Majoriteten av publikationer som behandlar levercells isoleringar täcker endast en av dessa cellpopulationer ^18-20 och isoleringsåtgärder som vidtas med mänsklig vävnad är sällsynta (granskats av Damm et al.) ^21. Anpassning av metoder som upprättats med djurvävnad (t.ex. råttlever) för människors levern avslöjade flera skillnader i cellegenskaper mellan djur och humana cellpopulationer. Inrättandet av en levercellisolering metod som täcker de olika levercellspopulationer visade att kombinera parenkymal och icke-parenkymala cellisolering är ett kritiskt steg på grund av skillnaden i matsmältningen tid som krävs för optimerade resultat. Inför denna utmaning vi utvecklat en levercellisolering protokoll som kombinerar olika tekniker och anpassatse till vår PHH isolering protokoll ^10.

Genom tillsats av 10% FCS till kollagenas P innehållande lösning II kunde vi reducera den proteolytiska aktiviteten hos proteaser. Denna ändring får längre uppslutningstider, som krävs för att få ett stort antal NPC. Som en följd har vi kunnat isolera PHH liksom NPC av god kvalitet och i stor mängd. Framgångsrik lever cellisolering beror starkt på den initiala vävnadskvalitet. Data och anamnes givare kan påverka cellernas kvalitet och kvantitet. Från vår erfarenhet finns det inget samband med givarspecifika faktorer och även mycket erfaren personal kan ställas inför till misslyckad cellisolering. Eftersom kvaliteten på donatorvävnaden är en kritisk punkt, alla externa källor, vilket kan försämra den vävnadskvalitet, måste minimeras.

Mest kritiska faktorerna är varma ischemi gånger efter det kirurgiska ingreppet och kall ischemi gånger under transporten av vävnads to laboratoriet. Dessutom några källor för bakteriella infektioner bör undvikas. Det bör noteras att ibland orgeln själv kan innehålla bakteriell kontaminering, t.ex., i fall av galla vägssjukdomar. Kritiska steg i isoleringsförfarandet omfatta perfusion gånger och densitetsgradientcentrifugering steg. Den första perfusion steget bör pågå 20-30 min. Kortare perfusion tider kan leda till ofullständig lösgöring av cell-cell-kontakter som resulterar i förekomsten av cellkluster i vunnits cellsuspensionen. En långvarig första perfusion minskar cellviabiliteten och inducerar cell stress på grund av Ca2 ⁺ utarmning.

Den andra perfusion steget för enzymatisk vävnad matsmältningen kräver lite erfarenhet för att bestämma den optimala uppslutningsgraden för att fatta beslut om att stoppa den proteolytiska reaktionen vid rätt tidpunkt. Korta uppslutningstider leder till låga utbyten och längre uppslutningstider för cellstress och cellskador.Från vår erfarenhet tidsramen mellan osmält vävnad och skadad vävnad under uppslutning ofta ligger inom ett fönster på 1-3 minuter. En ofullständig perfusion kan motverkas genom att skifta trycket i vävnaden i ett annat område med hjälp av klämmor för att klämma ut kanyler. Dessutom mjukt tryck med en spatel mot vävnadsprovet leder till en förändring i vävnadsperfusion. Vävnaden är komprimerade och de inre trycket ökar. Därefter blodkärlen också komprimeras och deras radie minskar. Med en minskning i radie, motståndet ökar (Hagen-Poiseuille lag) och perfusion lösning föredrar vägen för minsta motståndets lag och perfuses andra områden. I enlighet med Baccarani och medarbetare observerade vi att fibrotisk eller cirrotisk vävnad behöver längre matsmältning period som leder till lägre celllivsduglighet ^22. Av denna anledning rekommenderar vi att undvika vävnad hos patienter med leverfibros eller cirros.

Beredningen ochhanteringen av densitetsgradienter samt skörd av celler ur de gradienter (se steg 5 och 7) även omfatta kritiska steg. De olika densitetsgradient skikt och cellsuspensionen måste överföras i en långsam och noggrann sätt för att skapa skarpa interphases. Dessutom finns det alltid en risk för att skada gradienten under hanteringen, särskilt medan skörd av cellerna. Under NPC separation följsamhet separationssteget är avgörande för senare utbyten och renhet av alla NPC fraktioner. För att öka cellantalet av att inte vidhäftat NPC och renheten hos KC ett ytterligare tvättsteg kan vara till hjälp. Tvättlösningen i detta steg sammanslås med supernatanterna för vidare NPC separation. För att undvika kontaminering av bakterier, svampar eller virus strikt aseptiska förhållanden måste säkerställas ^23.

I beroende av de erforderliga cellpopulationer kan ändras och justeras protokollet genom att hoppa över specifika steg. Till exempel om bara KC ärkrävs dubbla centrifugeringssteg för NPC sedimentation kan reduceras till andra centrifugeringssteget och stegen för HSC och LEC separation kan släppas. Perfusion gånger och g-kraft för centrifugeringen kan också varieras i beroende av vävnader och celler kvalitet. Fibrotisk vävnad kräver långvarig uppslutningstider, därför finns det ett behov av att noggrant styra vävnads elasticitet. Ansamling av lipiddropparna i fettleverceller minskar celltätheten och därför ändrar sedimenteringsegenskaper. Enligt våra observationer kan det vara lämpligt att justera g-kraft under PHH isolering beroende på innehållet i PHH, när det krävs höga PHH mängder lipid. Det bör noteras att eventuella ändringar av det ursprungliga centrifugeringssteget kommer att negativt påverka NPC isolering när det gäller kvalitet och kvantitet. Hittills rekommenderar vi g-krafter mellan 50 xg (hepatocyter med låg fetthalt) och 150 xg (hepatocyter med hög fetthalt). Dessutom fett hepatocytes tenderar att bilda en mindre kompakt cellpellet efter densitetsgradientcentrifugering och det ytterligare cellskörd måste ändras såsom beskrivs i steg 5,5.

För att snabba upp isoleringsförfarandet vissa steg kan utföras samtidigt. Exempelvis parallellt med rening av de isolerade hepatocyter en andra person kan börja med NPC isolering. Dessutom densitetsgradienten lösningar kan framställas i förväg. Om det finns fler än två personer ännu fler steg kan utföras samtidigt.

I jämförelse med andra mänskliga leverceller isoleringsprotokoll våra resultat visar liknande eller högre cellutbyten och viabilitet som tidigare publicerats i experimentell biologi och medicin ^1. För KC isolering Alabraba och medarbetare demonstrerade isoleringsresultat med ett utbyte av 2,3 x 10 ⁶ viabla KC / g levervävnad kombinerad med en viabilitet av ca 98% ^13, som är jämförbara medvår KC resultat (cellantal: 1,9 x 10 ⁶ viabla KC / g levervävnad, viabilitet ca 93%). Majoriteten av publicerade LEC isolerings uppgifter beskriver isolering från hela organ ^15,24. Gerlach och medarbetare samt Lalor och medarbetare isolerade cellantal mellan 10 ³ och 10 ⁶ celler / organ ^15,24. Dessa data kan inte jämföras direkt till cell isoleringar från vävnadsprover. Men med hjälp av våra protokoll vi visade avkastningen för LEC 2,7 x 10 ⁵ livskraftiga LEC / g levervävnad, som är av mycket större när extrapoleras på ett helt organ. HSC isolerades med ett utbyte av ca 4,7 x 10 ⁵ viabla HSC / g levervävnader och viabilitet ca 90%. Befintliga resultat publicerade av Friedman och medarbetare visade halv lägre cellutbyten (2,3 x 10 ⁵ HSC / g lever), men en motsvarande renhetsgrad (91%) ^14. När det gäller våra protokoll, kan låga cellutbyten orsakas av dålig perfusion och matsmältning på grund av låg eller ingen cirkulation av 1x Perfusion-Solution I och Uppslutning-lösning i vävnaden. Dessutom gasbubblor i vävnaden kan störa intra-vävnads cirkulation av 1x Perfusion-lösning I och Uppslutning-lösning. I dessa fall kan perfusionen förbättras genom ökning av perfusionstryck och eliminering av gasbubblor genom fastspänning enkel kanyler och / eller med användning av en spatel för att trycka mot vävnadsprovet. En dålig lönsamhet är i de flesta fall en följd av cellstress. Långvarig ischemi gånger, skador av Ca2 ⁺ utarmning och proteolys av membranproteiner är kopplade till cellskador, synlig genom blåsor i cellmembranet. Från våra observationer dessa celler en mycket känsliga för skjuvning stress och i de flesta fall dör under isoleringsförfarandet. Sammanfattningsvis kräver framgångsrik isolering och separation av parenkymala och icke-parenkymala leverceller som kritiska steg utförs i rätt tid, pipetteringssteg utförs noggrant och i allmänhet tiden för cellisolering och separation should hållas så kort som möjligt ^21. En nackdel med det beskrivna protokollet är att isoleringsförhållanden (t.ex. perfusion gånger) inte kan vara helt standardiserat, utan måste anpassas individuellt till den vävnadskvalitet. Dessutom kan utbytet och renheten av de vunna cellpopulationer variera i beroende av den vävnadskvalitet och uppslutnings resultatet.

Vi publicerade nyligen en studie som visar påverkan av odlingsförhållanden i kombination med funktionell karakterisering av varje NPC celltyp isolerades med denna metod ^ett. Möjligheten att isolera och separera olika cellpopulationer i levern kan skapa innovativa mänskliga leverceller co-kulturer och vävnadstekniska in vitro levermodeller. Det är väl känt att PHH odling i 2D mono-kulturer leder till dedifferentiering och förlust av typiska cellfunktioner ^7. Av detta skäl är det nödvändigt att efterlikna in vivo vävnads architektur inom in vitro-modeller levern. Kostadinova och medarbetare (2013 ^8,9) samt Messner och medarbetare (2013 ^8,9) framgångsrikt etablerat funktionella co-kultur levermodeller för detektion av hepatotoxiska effekter. Emellertid var NPC inte karaktäriseras och specifika funktioner undersöktes inte i dessa system.

Därför ytterligare forskning bör inriktas på undersökningar på långsiktig överlevnad av NPC, deras specifika egenskaper och interaktioner inom co-kulturer. För sådana studier, kan det också vara av intresse för att etablera ett protokoll för isolering av cholangiocytes. Genomförande av funktionella in vitro samodlingar inklusive alla celltyper som finns i den nativa levern kan vara ett ytterligare steg i riktning mot in vivo som humana levermodeller.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
General Equipment
PIPETBOY	Eppendorf
pipettes	Eppendorf
microscope	Carl Zeiss
microscope	Olympus
CO2-incubator	Binder
Lamin Air	Heraeus
Centrifuge Varifuge 3.0R	Heraeus
Urine Beaker	Sarstedt	2041101
perfusor syringe 50 ml	B.Braun	12F0482022
Bottle Top Filter	Nalgene	1058787
Falcon 50 ml Polypropylene Conical Tube	BD Biosciences	352070
Falcon 15 ml Polypropylene Conical Tube	BD Biosciences	352096
Tissue Culture plate	BD Biosciences	533047	24 well
serological pipettes	BD Biosciences	357525, 357551, 357543	25 ml, 10 ml, 5 ml
pipette tips	SARSTEDT	0220/2278014, 0005/2242011, 0817/2222011	100 µl, 200 µl, 1,000 µl
Name	Company	Catalog Number	Comments
Isolation Equipment
water bath	Lauda
peristaltic pump	Carl Roth
circulation thermostat	Lauda
pH meter	Schott
fine scales	Sartorius
stand
Büchner funnel	Haldenwanger
plastic funnel
silicone tube
cannulae with olive tips
glass dish
forceps
scalpel	Feather	12068760
Neubauer counting chamber	Optic Labor
cell lifter	Costar
Surgical Drape	Charité Universitätsmedizin Berlin	A2013027
compress	Fuhrmann	40013331
sterile surgical gloves	Gammex PF	1203441104
Tissue glue	B. Braun	1050052
glass bottle	VWR
Collagenase P	Roche	13349524
Percoll Separating Solution	Biochrom	L6145	Density 1.124 g/ml
Hank’s BSS	PAA	H00911-3938
Dulbecco’s PBS	PAA	H15 - 002	without Mg/Ca
Ampuwa	Plastipur	13CKP151
Albumin	Sigma-Aldrich	A7906
NaCl	Merck	1,064,041,000
KCl	Merck	49,361,000
Hepes Pufferan	Roth	133196836
EDTA	Sigma	E-5134
Name	Company	Catalog Number	Comments
Media Equipment
DMEM	PAA	E15-005	Low Glucose (1 g/L) (without L-Glutamine)
HEPES Buffer Solution 1 M	GIBCO	1135546
L-Glutamine	GIBCO	25030-024	200 mM
MEM NEAA	GIBCO	11140-035
penicillin/streptomycin	GIBCO	15140-122
RPMI 1640	PAA	E15 - 039	without L-Glutamine
Sodium Pyruvate	GIBCO	1137663	100 mM
Trypan Blue Solution	Sigma-Aldrich	T8154	0.4%
William’s E	GIBCO	32551-020
with GlutaMAX™
EGTA	Sigma-Aldrich	03780-50G
Fortecortin	Merck	49367	8 mg/2 ml
Human-Insulin	Lilly	HI0210	100 I.E./ml
N-Acetyl cysteine	Sigma-Aldrich	A9165-5G
Fetal calf serum (FCS)	PAA	A15-101
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment for Immunostainings
CD 68	R&D Systems, USA		monoclonal
CK 19	Santa Cruz	D2309	polyclonal
CK18	Santa Cruz	K2105	monoclonal
Vimentin	Santa Cruz		monoclonal
GFAP	Sigma Aldrich		monoclonal
Triton X-100	Sigma Aldrich	23.472-9
Goat anti-Mouse IgG1-PE	Santa Cruz	C0712
Goat anti-rabbit IgG-FITC	Santa Cruz	L0412
Methanol	J.T.Baker	1104509006
Formaldehyde 4%	Herbeta Arzneimittel	200-001-8
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A7906-100G