Abstract
Inervación juega un papel clave en el desarrollo, la homeostasis y la regeneración de órganos y tejidos. Sin embargo, los mecanismos subyacentes a estos fenómenos no son bien entendidos todavía. En particular, se descuida el papel de la inervación en desarrollo de los dientes y la regeneración.
Varios estudios in vivo han proporcionado información importante acerca de los patrones de inervación de los tejidos dentales durante los procesos de desarrollo y reparación de diversos modelos animales. Sin embargo, la mayoría de estos enfoques no son óptimas para resaltar las bases moleculares de las interacciones entre las fibras nerviosas y órganos diana y tejidos.
Co-culturas constituyen un valioso método para investigar y manipular las interacciones entre las fibras nerviosas y los dientes en un ambiente controlado y aislado. En las últimas décadas, se han realizado co-cultivos convencionales utilizando el mismo medio de cultivo durante períodos muy cortos (por ejemplo, dos días)para investigar los efectos de atracción o repulsión de desarrollar tejidos bucales y dentales en las fibras nerviosas sensoriales. Sin embargo, se requiere la extensión del período de cultivo para investigar los efectos de la inervación de la morfogénesis y dientes citodiferenciación.
Sistemas de microfluidos permiten co-cultivos de neuronas y diferentes tipos de células en su medio de cultivo apropiado. Hemos demostrado recientemente que los ganglios del trigémino (TG) y los dientes son capaces de sobrevivir durante un largo período de tiempo cuando se co-cultivaron en dispositivos de microfluidos, y que se mantienen en estas condiciones el mismo patrón de inervación que muestran in vivo.
Sobre esta base, se describe cómo aislar y co-desarrollo de la cultura y de los ganglios del trigémino diente gérmenes en el protocolo de un co-cultivo de microfluidos sistema.Este describe una forma simple y flexible para co-cultura ganglios / nervios y los tejidos diana y para estudiar los papeles de moléculas específicas sobre tales interacciones en un controlled y entorno aislado.
Introduction
Inervación juega un papel clave en el desarrollo, la homeostasis y la regeneración de órganos y tejidos 1,2. Además, la inervación está implicado en la regulación de la proliferación de células madre, la movilización y diferenciación 3 - 5 de. De hecho, estudios recientes realizados en los tejidos del complejo orofacial han demostrado que los nervios parasimpáticos son necesarios para la función de las células progenitoras epiteliales durante el desarrollo y la regeneración de la glándulas salivales 6,7. Del mismo modo, se ha demostrado que la inervación es necesaria para el desarrollo y mantenimiento de las papilas gustativas 8-11. Por lo tanto, es importante analizar los papeles todavía descuidados de la inervación en el desarrollo de otros órganos y tejidos orofaciales importantes tales como dientes.
A pesar de la rica inervación de los dientes adultos, y en contraste con todos los demás órganos y tejidos del cuerpo, Develode ping dientes comienzan a ser inervado en las etapas postnatales tempranas. Los dientes se desarrollan como resultado de las interacciones secuenciales y recíproca entre el ectodermo oral y craneal mesénquima derivadas de la cresta neural. Estas interacciones dan lugar a ameloblastos epiteliales derivadas de mesénquima y odontoblastos derivados que son responsables de la formación del esmalte y la dentina, respectivamente 12. Los nervios sensoriales de los ganglios del trigémino y los nervios simpáticos de los ganglios cervicales superiores inervan los dientes adultos 13-15. Durante la embriogénesis, las fibras nerviosas que emana del proyecto ganglios del trigémino hacia los gérmenes dentales en desarrollo y progresivamente los rodean, pero que no penetran en el mesénquima papila dental 13. Las fibras nerviosas entran en el mesénquima de pasta dental en las etapas de desarrollo más avanzados que se correlacionan con la diferenciación de odontoblastos y la matriz de dentina deposición 16. Inervación pulpa dental es complETED poco después de la erupción del diente en la cavidad oral 13. Estudios anteriores han revelado que varios semaforinas y las neurotrofinas están implicadas en la regulación de la inervación durante odontogenesis 16-19. Estudios anteriores han demostrado claramente que la inervación es un requisito previo para la formación de los dientes en los peces 20. Estudios más recientes han demostrado que la homeostasis de las células madre mesenquimales dental en incisivos ratón está regulada por los nervios sensoriales a través de la secreción de sonic hedgehog (Shh) 21. Sin embargo, el papel de la inervación en diente de iniciación, el desarrollo y la regeneración es todavía muy controvertido en mamíferos 22-24.
Una gran cantidad de estudios in vivo han proporcionado información importante acerca de los patrones de inervación de los tejidos dentales durante los procesos de desarrollo y reparación de diversos modelos animales 13,25,26. Sin embargo, la mayoría de estos APPROdolores no son óptimas para resaltar las bases moleculares de las interacciones entre las fibras nerviosas y órganos diana y tejidos. Co-culturas constituyen un valioso método para investigar y manipular las interacciones entre las fibras nerviosas y los dientes en un ambiente controlado y aislado 26-29. Al mismo tiempo, co-cultivo está sujeto a diversos ajustes técnicos. Por ejemplo, los nervios y los tejidos dentales específicos (por ejemplo, la pulpa dental, folículo dental, epitelio dental) a menudo requieren diferentes medios de cultivo con el fin de garantizar la supervivencia del tejido durante largos períodos de tiempo 30-32.
En las últimas décadas, se han realizado co-cultivos convencionales utilizando el mismo medio de cultivo durante períodos muy cortos (por ejemplo, dos días) para investigar los efectos de atracción o repulsión de desarrollar tejidos bucales y dentales en las fibras nerviosas sensoriales 27-29.Sin embargo, se requiere la extensión del período de cultivo para investigar los efectos de la inervación de la morfogénesis y dientes citodiferenciación, y para estudiar la dinámica de las fibras nerviosas se ramifican en los órganos diana. Por lo tanto, co-cultivos no contiguos serían más adecuados para llevar a cabo estudios sobre neuronales dental tejidos interacciones.
Sistemas de microfluidos permiten co-cultivos de neuronas y diferentes tipos de células en su medio de cultivo apropiado. En estos dispositivos, los tejidos dentales y las neuronas se separan en diferentes compartimentos, mientras que permite el crecimiento de los axones de los cuerpos de las células neuronales a través de microcanales hacia el compartimento que contiene su tejido diana 33. Los dispositivos microfluídicos han sido ya utilizado para estudiar las interacciones entre las neuronas y la microglia 34,35, así como interacciones célula a célula en el cáncer y la neovascularización 35. Además, estos sistemas se han utilizado para estudiar las interacciones entre dorsal ganglios de la raíz y osteoblastos 36.
Hemos demostrado recientemente que los ganglios del trigémino (TG) y los dientes son capaces de sobrevivir por largos períodos de tiempo cuando se co-cultivaron en dispositivos de microfluidos 37. Por otra parte, hemos demostrado que los dientes de las diferentes etapas de desarrollo mantienen en estas condiciones in vitro los mismos efectos repulsivas o atractivas en la inervación del trigémino que muestran in vivo 37. Este protocolo proporciona información acerca de una forma sencilla, potente y flexible para co-cultura ganglios / nervios y los tejidos diana y para estudiar los papeles de moléculas específicas en tales interacciones en un ambiente controlado y aislado.
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Protocol
Todos los ratones fueron mantenidos y manejados de acuerdo a la Ley de Protección de los Animales de Suiza y en cumplimiento de la normativa de la oficina cantonal Veterinaria, Zurich.
1. Preparación de Material de disección, Medios de Cultivo, dispositivos de microfluidos
- Fórceps Autoclave micro-disección y tijeras (121 ° C, tiempo de esterilización: 20 min) y almacenarlos en un recipiente estéril.
- Esterilizar cubreobjetos de vidrio (24 mm x 24 mm) mediante su incubación en HCl 1 M durante 24 h en un agitador orbital a 37 ° C. Lavar tres veces con ellos, H 2 O destilada estéril y tres veces con etanol 99%. Seco entonces los cubreobjetos a 37 ° C o bajo campana de flujo estéril. Por último, en autoclave o exponer los cubreobjetos a la luz UV (30 min) para completar la esterilización. Los cubreobjetos se pueden almacenar entonces en etanol al 70%.
- Retire con cuidado los dispositivos de aislamiento AXIS Axon del paquete usando pinzas estériles y colocarlos en una placa de Petri estéril. Usando un punzón de biopsia estéril (ø: 1 mm) crear un agujero por muestra a ser cultivados (Figura 1) en correspondencia de las cámaras de cultivo.
NOTA: No perfore demasiado cerca de los microsurcos, ya que podrían ser dañados por la presión aplicada. - Esterilizar los dispositivos de aislamiento AXIS Axon sumergiéndola en etanol al 70%. Seque luego Dispositivos de aislamiento AXIS Axon y cubreobjetos completamente bajo una campana de flujo estéril. Espere un mínimo de 3 horas antes de proceder.
NOTA: secado incompleto resultará en el montaje defectuoso de los dispositivos de microfluidos. - Coloque cada cubreobjetos en una placa de Petri de 35 mm o en un pozo dentro de una placa de 6 pocillos.
- Coloque el aislamiento de dispositivos AXIS Axon en el cubreobjetos y presione suavemente pero con firmeza con un fórceps con extremos doblados con el fin de permitir la plena adherencia entre el dispositivo de aislamiento y el cubreobjetos de vidrio.
- En cada cámara de cultivo, pipeta 150 l de poli-D-lisina (0,1 mg / ml en estéril, destilada H 2O). Coloque los dispositivos de microfluidos bajo vacío durante 5 min, a fin de eliminar todo el aire de las cámaras de cultivo.
- Si el aire todavía se puede ver dentro de la cámaras, re-pipeta la solución de poli-D-lisina en las cámaras.
- Incubar los dispositivos con O poli-D-lisina / N a 37 ° C.
- Lávese las cámaras tres veces con estéril, H2O destilada
- Rellene cámaras con 150 l solución laminina trabajo (Sigma-Aldrich, 5 mg / ml, en PBS o medio libre de suero), e incubar O / N a 37 ° C.
- Preparar 50 ml de medio para cultivos de ganglios del trigémino 37, compuesta como sigue: 48 ml Neurobasal medio, 1 ml B-27, 100 U de estreptomicina, 2 mM L-glutamina, 5 ng / ml de factor de penicilina / / ml de crecimiento nervioso (NGF) , arabinósido de citosina 24:25.
- Preparar 50 ml de medio para cultivos germinales diente 37, compuesta como sigue: 40 ml de DMEM-F12, 10 ml de suero fetal bovino (FBS, concentración final: 20%), 100 U / ml de penicilina / estreptomicina, 2 mM L-glutamina, 150 mg / ml de ácido ascórbico.
2. Generación de embriones de ratón y disección
- Determinar la edad embrionaria acuerdo con tapón vaginal (tapón vaginal: día embrionario de desarrollo 0.5, E0.5) y confirmarla mediante criterios morfológicos. Para este protocolo, por lo general usamos embriones de ratón E14.5-E17.5.
- Limpie el área de disección y el estereoscopio con etanol al 70%.
- Sacrificar la madre embarazada a través de la dislocación cervical. Bloquear el cuello del ratón con el primer y segundo dedo sobre una rejilla y tire con la decisión de la cola.
- Diseccionar la piel alrededor del abdomen inferior, y abrir el abdomen con unas tijeras. Busque el útero: durante tales etapas finales del embarazo, el útero abundantemente llenar la cavidad abdominal.
- Diseccionar el útero y colocar en un tubo lleno de PBS en hielo. Cuando en el hielo, el tejido se puede dejar para varias horas. Deseche el cadáver de la madre según las directrices institucionales <li> diseccionar los embriones del útero y liberarlos de sus tejidos extraembrionarias. Coloca los embriones en PBS en hielo.
- Decapitar a los embriones con unas tijeras, y separar la mandíbula inferior del resto de la cabeza con unas tijeras micro-disección (Figura 2). Eliminar precisamente la mandíbula inferior, sin dañar los ganglios del trigémino; como este último se localizan en las proximidades de la mandíbula inferior, su daño accidental es posible. Preservar la mandíbula inferior y el resto de la cabeza en PBS frío, en hielo.
- Para diseccionar TG, toma la cabeza y colocarla en una placa de Petri de vidrio de la disección, previamente llenado con PBS frío. Usando las pinzas, quitar la piel y el cráneo. Retire entonces el telencéfalo y el cerebelo colocando fórceps debajo del telencéfalo y ascensor; el telencéfalo y el cerebelo le dará la vuelta juntos, dejando la parte inferior del cráneo expuesta.
- Localizar los ganglios del trigémino (que se muestra en la Figura 2B). Utilice las pinzaspara separar el TG de los nervios trigémino. Elimine los restos de las proyecciones del trigémino usando las agujas de disección como cuchillos. Coloque el TG diseccionado en una placa de Petri llena de PBS frío y mantenerlos en hielo.
- Para diseccionar dientes embrionarias, colocar la mandíbula inferior, separado previamente del cráneo, en la placa de Petri de vidrio disección, lleno de PBS frío. El uso de agujas de disección como cuchillos, retire la lengua y la piel que rodea la mandíbula. Separar el los hemi-mandíbulas izquierdo y derecho cortando a lo largo de la línea media de la mandíbula. Los gérmenes de los dientes son fácilmente visibles, como se muestra en la Figura 1C. Aislar los gérmenes de dientes utilizando agujas de disección y retirar el exceso de tejidos no dentales. Coloca los gérmenes de dientes disecados en una placa de Petri llena de PBS frío y mantenerlos en hielo.
3. microfluidos Co-culturas
- Después de la disección, laminina eliminar de los dispositivos de microfluidos. Llenar las cámaras con 200 l de la respecticinco medios de comunicación.
- Con unas pinzas, transfiera suavemente los TG y diente gérmenes disecados en los agujeros creados por la perforación (Figura 1D). Asegúrese de que los gérmenes de dientes no flotan y que se hunden hasta que entran en contacto con los cubreobjetos.
- Cultura las muestras en incubadora a 37 ° C, 5% de CO 2.
- Cambie el medio de cultivo cada 48 horas. No vaciar las cámaras por completo, y no pipetear directamente en las cámaras de cultivo. El vaciado completo de las cámaras daría lugar a la formación de burbujas de aire dentro de las cámaras; pipeteado directa en la cámara podría resultar en daño axonal. Para evitar estos problemas, se elimina el medio que señala la pipeta hacia el lado externo de los pozos; Del mismo modo, pipetear el medio fresco en el lado de los pozos situados frente a las cámaras.
- Durante el período de cultivo, co-cultivos pueden ser fácilmente imágenes de microscopía de lapso de tiempo. Co-culturas se pueden mantener por más de 10 días.
- Después de que el perio culturad, lavar las cámaras con la pipeta 150 l de PBS en un pocillo por cámara, y dejando PBS fluya a través de las cámaras de tres veces.
- Retire el PBS y fijar las muestras con la pipeta 150 l de paraformaldehído al 4% (en PBS) en un pozo por cada cámara; incubar a TA durante 15 min.
- Lavar las cámaras dos veces con PBS como se describe en 3.6.
- Continúe con su posterior análisis.
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Representative Results
Estos resultados muestran que los ganglios del trigémino aislados pueden crecer en un compartimiento del dispositivo de microfluidos y, además, que el desarrollo de los gérmenes de los dientes aislados se mantiene durante un largo período de tiempo en el otro compartimento del dispositivo de microfluidos. Diferentes medios de cultivo se utilizan en los dos compartimentos, y los microsurcos entre los dos compartimentos permitir la extensión de axones desde el ganglio del trigémino hacia los gérmenes dentales en desarrollo. La figura 3 representa una visualización de neurofilamentos a través de inmunofluorescencia 37, en un co-cultivo de un ratón ganglio trigeminal embrionaria y el ratón incisivo embrionaria en el sistema de co-cultivo de microfluidos descrito. Incisivos mouse no están inervados durante el desarrollo in vivo;. Consistentemente, los axones desde el ganglio trigémino se derogan por el germen de diente en desarrollo en cultivo durante hasta 10 días Figura 3A muestra una visión general de la cámara axonal en este sistema de co-cultivo. Figura 3B y 3C muestran aumentos progresivos de los axones dentro de las cámaras axonal y los micro-huertos. Gérmenes diente (o cualquier órganos o tejidos co-cultivos) se pueden quitar fácilmente de los dispositivos de microfluidos y analizaron por separado, por ejemplo, procesado para tinciones histológicas o para el análisis de la expresión génica.
Figura 1. Puntos de vista montada dispositivo de co-cultivo de microfluidos (A) desde arriba; . (B) parcialmente lateral Las cámaras de cultivo (cc) se destacan en rojo (eosina) y azul (azul de toluidina); microsurcos (mg) puede ser visto como una línea en blanco entre las cámaras de cultivo. Ganglios y co-cultivadas órganos / tejidos se colocan en la cámara de cultivo apropiado a través de los agujeros perforados (PH) en el dispositivo. Se agregan y quitan Medios a través de los pozos (MW). Objetivo "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53114/53114fig1large.jpg" = "_ blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. (A) Vista lateral de una cabeza de embrión de ratón (día embrionario de desarrollo E14.5). La línea de color negro indica que la mandíbula inferior se debe cortar con el fin de preservar la integridad de ambos ganglios y diente gérmenes trigémino. Cabeza (B) alfombrillas de embriones (E14.5) después de la eliminación de la mandíbula inferior, cráneo y telencéfalo. Las flechas negras indican los ganglios del trigémino (TG). (C) La mandíbula inferior de embrión de ratón (E14.5) después de la eliminación de la lengua. Las flechas negras indican la localización de los diferentes gérmenes de dientes (Inc: incisivos; FM: primeros molares). (D) Representación esquemática del dispositivo de co-cultivo de microfluidos.p_upload / 53114 / 53114fig3large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Co-cultura de ganglio trigémino y el germen del diente incisivo de tipo salvaje embriones E15.5 ratón. (A) Descripción general de la cámara axonal (neurofilamentos, DAPI). Barra de escala: 300 m. (B) Mayor aumento de los microsurcos y neuritas en crecimiento dentro de la cámara axonal (neurofilamentos, DAPI; superposición de imágenes fluorescentes y campo claro). Barra de escala: 150 m. (C) mayor aumento que muestra el crecimiento de los axones dentro de los microsurcos (neurofilamentos). Barra de escala:. 75 micras Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Anterior en estudios in vitro de la inervación de los dientes estaban basados en co-cultivos convencionales de los ganglios del trigémino y los tejidos o células 26,28,29 dentales. Estos estudios se realizaron para investigar principalmente los efectos atractivos de estas células o tejidos en los axones sensoriales 38. Aunque trayendo avances significativos en el campo, se plantearon varias cuestiones técnicas. Gérmenes de dientes empiezan a degenerar después de pocos días de cultivo 37. Basándose en estas observaciones, las neuronas crecen y los dientes en las mismas condiciones de cultivo perjudican cualquier eventual análisis de moléculas implicadas en la charla cruzada entre estos dos tejidos. Se necesitan condiciones de cultivo óptimas para preservar el perfil molecular fisiológica de los ganglios del trigémino y los tejidos dentales.
Sistemas de microfluidos se han utilizado hasta ahora para co-cultivo de neuronas y varios tipos de células en medios optimizados 34,36. Este sistema de microfluidos puede representar más feplenamente la situación in vivo, donde los cuerpos de células neuronales, terminales axonales y tejidos diana están generalmente expuestos a diferentes microambientes celulares y moleculares. Más recientemente, los dispositivos de microfluidos se han utilizado para co-cultivo conjunto ganglios de la raíz dorsal y los osteoblastos 36. Recientemente hemos demostrado que los ganglios del trigémino y los dientes son capaces de sobrevivir por largos períodos de tiempo cuando se co-cultivadas en dispositivos de microfluidos 37. Por otra parte, hemos demostrado que los dientes de diferentes etapas de desarrollo mantienen en estas condiciones in vitro los mismos efectos repulsivas o atractivas en la inervación del trigémino que exhiben in vivo 37.
El protocolo descrito requiere práctica y destreza manual, en particular para la microdisección de los ganglios del trigémino y el diente gérmenes. Ganglios del trigémino se rompen fácilmente durante la disección. Por lo tanto, se sugiere el uso de agujas de disección en lugar de la fuerza de disecciónps, con el fin de eliminar el tejido que rodea los ganglios. Del mismo modo, en particular se debe tener cuidado mientras que la disección de los gérmenes de los dientes, con el fin de evitar dañar el epitelio diente mientras que lo separa de los tejidos mesenquimales circundantes. Por otra parte, durante el primer día de la co-cultura, en particular se debe tener cuidado en el manejo de la incubadora, como una vibración excesiva puede perjudicar la adherencia ganglio trigémino al cubreobjetos cultura. Durante el período de co-cultivo, los medios de comunicación deben ser retirados y añaden por pipeteo en los pocillos, en el lado opuesto a las cámaras de cultivo. Los aspirantes o pipeteo medios de comunicación en la proximidad de las cámaras de cultivo resultaría en daño axonal.
El protocolo descrito puede ser modificado para estudiar la inervación de varios órganos embrionarias y tejidos embrionarios o postnatales y tipos de células. Sistemas de microfluidos podrían representar una plataforma adecuada para permitir períodos de cultivo más largas para el estudio de las interacciones entre las neuronas y en crecimiento camisetaXX. Por otra parte, la separación de la neuronal desde el compartimiento dental permite el análisis de los efectos de la localización de la proteína específica y cuantificación 33,37. Anticuerpos de bloqueo o de proteínas recombinantes también podrían añadirse a los compartimientos separados de los dispositivos de microfluidos para analizar sus efectos sobre los tejidos neuronales y dentales. Por ejemplo, el tratamiento de los ganglios del trigémino con NGF apoya su supervivencia y permite consecuencia neuronal. Sin embargo, en este trabajo exógenos NGF está ausente del compartimento germen del diente, donde las señales de dientes derivados son la única responsable de la atracción o repulsión neuronal. Del mismo modo, otras moléculas, anticuerpos o fármacos recombinantes se pueden utilizar para manipular el sistema en condiciones controladas.
Las principales limitaciones del protocolo presentado residen en el alto costo relativo de los dispositivos de microfluidos comerciales y la esencia 2D-establecido del sistema de co-cultivo. De hecho, aunque órganos enteros pueden ser culturad, ambos órganos y axones crecen en condiciones de cultivo 2D adherentes sobre un cubreobjetos de vidrio; sería necesaria la personalización del sistema con el fin de obtener una representación tridimensional, realista de la inervación.
En conclusión, los dispositivos de microfluidos son óptimas para investigar el papel de la inervación en el desarrollo o la regeneración de órganos y permiten el estudio de las interacciones entre los tejidos neuronales y de destino en condiciones óptimas de cultivo.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AXIS Axon Isolation Devices | Millipore | AX15010-TC | Microchannels of different lenght are available |
| Laminin | Sigma Aldrich | L2020 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| B27 | Gibco | 17504 | |
| Recombinant Mouse beta-NGF | R&D Systems | 1156-NG-100 | Human and Rat beta-NGF (R&D Systems) are equivalent |
| DMEM-F12 | Gibco | 11320-033 |
References
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