Abstract
Innervation spielt eine Schlüsselrolle in der Entwicklung, Homöostase und Regeneration von Organen und Geweben. Allerdings sind die Mechanismen, die diese Phänomene sind nicht gut noch verstanden. Insbesondere wird die Rolle der Innervation in der Zahnentwicklung und Regeneration vernachlässigt.
Mehrere In-vivo-Studien haben wichtige Informationen über die Muster der Innervation der Zahngewebe während der Entwicklung und Reparaturprozesse von verschiedenen Tiermodellen zur Verfügung gestellt. Allerdings sind die meisten dieser Ansätze nicht optimal, um die molekulare Grundlage der Wechselwirkungen zwischen den Nervenfasern und die Zielorgane und Gewebe zu markieren.
Co-Kulturen stellen eine wertvolle Methode zu untersuchen und zu manipulieren, die Wechselwirkungen zwischen den Nervenfasern und die Zähne in einer kontrollierten und isolierten Umgebung. In den letzten Jahrzehnten haben sich herkömmliche Co-Kulturen unter Verwendung des gleichen Kulturmediums für sehr kurze Zeiträume durchgeführt wurden (beispielsweise zwei Tage)um die anziehende oder abstoßende Wirkung der Entwicklungs Mund- und Zahngewebe an sensorischen Nervenfasern zu untersuchen. Jedoch Verlängerung der Kultivierungsperiode erforderlich, um die Auswirkungen der Innervation auf Zahn Morphogenese und Zelldifferenzierung zu untersuchen.
Mikrofluidik-Systeme ermöglichen Co-Kulturen von Neuronen und verschiedene Zelltypen in ihren geeigneten Kulturmedien. Wir haben kürzlich gezeigt, dass Trigeminalganglien (TG) und die Zähne sind in der Lage, für eine lange Zeit überleben, wenn co-kultiviert in Mikrofluidvorrichtungen, und dass sie zu erhalten in diesen Bedingungen die gleiche Innervationsmuster, dass sie in vivo zeigen.
Auf dieser Basis beschreiben wir, wie zu isolieren und Co-Kultur entwickeln Trigeminalganglien und Zahnkeime in einem mikrofluidischen Co-Kultur system.This Protokoll beschreibt eine einfache und flexible Möglichkeit, Co-Kultur-Ganglien / Nerven und Zielgewebe und die Rollen zu studieren spezifischer Moleküle auf solchen Wechselwirkungen in einem controlled und isolierten Umgebung.
Introduction
Innervation spielt eine Schlüsselrolle in der Entwicklung, Homöostase und Regeneration von Organen und Geweben, 1,2. 5 - Weiterhin ist Innervation bei der Regulation der Stammzellproliferation, Mobilisierung und Differenzierung 3 beteiligt. In der Tat, die jüngsten Studien in Geweben des orofazialen Komplexes realisiert haben gezeigt, dass parasympathischen Nerven sind für epithelialen Vorläuferzellen Funktion notwendig bei der Entwicklung und Regeneration der Speicheldrüsen 6,7. Ebenso hat sich gezeigt, dass Innervation für die Entwicklung und Wartung von Gaumen 8 notwendig - 11. Somit ist es wichtig, die noch vernachlässigt Rollen Innervation bei der Entwicklung anderer wichtiger orofacial Organen und Geweben wie Zähne analysieren.
Trotz der Innervation reichen zweiten Zähne und im Gegensatz zu allen anderen Organen und Geweben des Körpers, developing Zähne beginnen, in den frühesten Stadien der postnatalen innerviert werden. Zähne entwickeln als Folge der sequentiellen und gegenseitige Wechselwirkungen zwischen oralen Ektoderm und Schädel Neuralleiste stammenden Mesenchym. Diese Wechselwirkungen führen zu Epithelzellen abgeleitete Adamantoblasten und Mesenchym abgeleitete Odontoblasten, die für die Bildung von Zahnschmelz und Dentin, die jeweils 12 verantwortlich sind. Sensorischen Nerven vom Trigeminalganglien und sympathischen Nerven aus der oberen Halsganglien innervieren die Erwachsenen die Zähne 13-15. Während der Embryogenese, Nervenfasern aus dem Trigeminalganglien Projekt gegenüber den Entwicklungszahnkeime ausgeht und progressiv umgeben sie aber nicht in die Papille Mesenchym 13 eindringen. Nervenfasern in das Zahnmark Mesenchym in fortgeschrittenen Entwicklungsstadien, die mit odontoblast Differenzierung und Dentin Matrixablagerung 16 zu korrelieren. Pulpa Innervation ist komplETED bald nach dem Zahndurchbruch in der Mundhöhle 13. Frühere Studien haben gezeigt, dass verschiedene Semaphorine und Neurotrophine sind an der Regulation der Innervation bei Odontogenese 16 beteiligt - 19. Frühere Studien haben klar gezeigt, dass Innervation ist eine Voraussetzung für die Zahnbildung bei Fischen 20. Neuere Studien haben gezeigt, daß die Homöostase der Zahn Mesenchym-Stammzellen in Maus-Schneidezähne wird durch sensorische Nerven über Sekretion von Sonic Hedgehog (Shh) 21 reguliert wird. Dennoch ist die Rolle der Innervation in Zahn Initiierung, Entwicklung und Regeneration immer noch sehr umstritten in Säugetieren 22-24.
Eine Vielzahl von in-vivo-Studien haben wichtige Informationen über die Muster der Innervation der Zahngewebe während der Entwicklung und Reparaturprozesse von verschiedenen Tiermodellen 13,25,26 vorgesehen. Jedoch sind die meisten von diesen auf angemesseneSchmerzen nicht optimal sind, um die molekularen Grundlagen der Wechselwirkungen zwischen Nervenfasern und Ziel Organe und Gewebe zu markieren. Co-Kulturen stellen eine wertvolle Methode zu untersuchen und zu manipulieren, die Wechselwirkungen zwischen den Nervenfasern und die Zähne in eine kontrollierte und isolierte Umgebung 26-29. Zugleich ist Kokultivierung unterliegen verschiedenen technischen Anpassungen. Zum Beispiel, Nerven und spezifische Zahngewebe (zB Pulpa, Zahnsäckchen, Zahn Epithel) erfordern oft unterschiedliche Kulturmedien, um Gewebeüberlebenszeit für längere Zeit garantieren 30 - 32.
In den letzten Jahrzehnten haben sich herkömmliche Co-Kulturen mit dem gleichen Kulturmedium für sehr kurze Zeiträume (zB zwei Tage) durchgeführt wurde, um die anziehende oder abstoßende Wirkung der Entwicklungs Mund- und Zahngewebe an sensorischen Nervenfasern 27 zu untersuchen - 29.Jedoch Verlängerung der Kultivierungsperiode erforderlich, um die Auswirkungen der Innervation auf Zahn Morphogenese und Zelldifferenzierung zu untersuchen und die Dynamik von Nervenfasern innerhalb Verzweigungszielorgane zu untersuchen. Deshalb würde nicht zusammenhängende Co-Kulturen besser geeignet, um Studien über neuronale-Zahngewebe Interaktionen durchzuführen.
Mikrofluidik-Systeme ermöglichen Co-Kulturen von Neuronen und verschiedene Zelltypen in ihren geeigneten Kulturmedien. In diesen Vorrichtungen werden Zahngeweben und Neuronen in verschiedenen Kammern getrennt, während gleichzeitig das Wachstum der Axone der neuronalen Zellkörper durch Mikrokanäle in Richtung der Kammer ihre Zielgewebe 33 enthält. Mikrofluidik-Vorrichtungen wurden bereits verwendet, um die Interaktionen zwischen Neuronen und Mikroglia 34,35 sowie von Zelle zu Zelle-Wechselwirkungen bei Krebs und Neovaskularisation 35 zu studieren. Darüber hinaus sind diese Systeme sind verwendet worden, um die Wechselwirkungen zwischen dors studierenal Wurzelganglien und Osteoblasten 36.
Wir haben kürzlich gezeigt, dass trigeminalen Ganglien (TG) und der Zähne in der Lage sind, für längere Zeiträume zu überleben, wenn co-kultiviert in Mikrofluidik-Vorrichtungen 37. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass die Zähne von verschiedenen Entwicklungsstadien zu erhalten in diesen in vitro Bedingungen die gleichen abstoßend oder anziehend Auswirkungen auf Trigeminus innerviert, dass sie in vivo 37 zeigen. Dieses Protokoll enthält Informationen über eine einfache, leistungsfähige und flexible Möglichkeit, Co-Kultur-Ganglien / Nerven und Zielgewebe und die Rollen von spezifischen Molekülen auf solche Wechselwirkungen in einer kontrollierten und isolierten Umgebung zu studieren.
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Protocol
Alle Mäuse wurden nach Schweizer Tierschutzgesetz und in Übereinstimmung mit den Vorschriften des kantonalen Veterinäramt, Zürich gepflegt und behandelt werden.
1. Herstellung von Dissection Material, Kultur, Medien, Mikrofluidiksysteme
- Autoklaven Mikrodissektion Pinzette und Schere (121 ° C, Sterilisationszeit: 20 min) und speichert sie in einem sterilen Behälter.
- Sterilisieren Deckgläser (24 mm x 24 mm) durch Inkubation in 1 M HCl 24 h lang auf einem Rundschüttler bei 37 ° C. Dreimal mit 99% Ethanol waschen sie mit sterilem, destilliertem H 2 O und dreimal. Dry dann die Deckgläser auf 37 ° C oder unter sterilen Flow-Haube. Schließlich Autoklaven oder setzen Sie die Deckgläser mit UV-Licht (30 min), um die Sterilisation zu vervollständigen. Deckgläser kann dann in Ethanol 70% gelagert werden.
- Entfernen Sie vorsichtig die AXIS Axon Isolation Geräte aus der Verpackung mit Hilfe einer sterilen Pinzette und legen Sie sie in eine sterile Petrischale. Mit einem sterilen Biopsie Stempel (ø: 1 mm) schaffen ein Loch pro Probe kultiviert werden (Abbildung 1) in Übereinstimmung mit den Kulturkammern.
HINWEIS: stanzen nicht zu nahe an den Mikrorillen, da sie möglicherweise durch den Druck aufgebracht beschädigt werden. - Sterilisieren Sie die AXIS Axon Isolation Devices durch immerging sie in Ethanol 70%. Dry dann AXIS Axon Isolation Geräte und Deckgläser vollständig unter einer sterilen Flow-Haube. Warten Sie mindestens 3 Stunden, bevor Sie fortfahren.
HINWEIS: unvollständige Trocknung wird in fehlerhaften Montage der mikrofluidischen Bauteilen führen. - Legen Sie jedes Deckglas in eine 35 mm Petrischale oder in einen Brunnen in einem 6-wells Platte.
- Setzen Sie den AXIS Axon Isolation Gerät auf dem Deckglas und drücken Sie vorsichtig, aber fest mit einer Zange mit gebogenen Enden, um die volle Haftung zwischen der Trennvorrichtung und dem Deckglas zu ermöglichen.
- In jeder Kulturkammer, einer Pipette 150 ul Poly-D-Lysin (0,1 mg / ml in sterilem destilliertem H 2O). Legen Sie die mikrofluidischen Vorrichtungen unter Vakuum für 5 Minuten, um die gesamte Luft aus den Kulturkammern zu entfernen.
- Wenn Luft kann noch innerhalb der Kammern, re-Pipette die Poly-D-Lysin-Lösung in die Kammern zu sehen.
- Die Vorrichtungen mit Poly-D-Lysin O / N bei 37 ° C.
- Waschkammern dreimal mit sterilem destilliertem H 2 O.
- Füllen Kammern mit 150 ul Laminin-Arbeitslösung (Sigma-Aldrich, 5 ug / ml in PBS oder Serum-freiem Medium), und Inkubation O / N bei 37 ° C.
- Vorbereitung 50 ml Medium für Trigeminalganglien Kulturen 37, wie folgt zusammen: 48 ml Neurobasalmedium, 1 ml B-27, 100 U / ml Penicillin / Streptomycin, 2 mM L-Glutamin, 5 ng / ml Nervenwachstumsfaktor (NGF) , 12.25 Cytosinarabinosid.
- Bereiten Sie 50 ml Medium für Zahnkeim Kulturen 37, wie folgt zusammen: 40 ml DMEM-F12, 10 ml fötalem Rinderserum (FBS, Endkonzentration: 20%), 100 U / ml Penicillin / Streptomycin, 2 mM L-Glutamin, 150 & mgr; g / ml Ascorbinsäure.
2. Mouse Embryo Erzeugung und Dissection
- Bestimmen Sie embryonalen Alter nach Vaginalpfropf (Vaginalpfropf: embryonalen Tag der Entwicklung 0,5, E0.5) und bestätigen Sie es via morphologischen Kriterien. Für dieses Protokoll verwenden wir in der Regel E14.5-E17.5 Mäuseembryonen.
- Reinigen Sie das Sezierung Bereich und die Stereoskop mit Ethanol 70%.
- Opfer der schwangeren Mutter über Genickbruch. Blockieren Sie den Hals der Maus mit dem ersten und zweiten Finger auf ein Gitter, und ziehen Sie mit der Entscheidung der Schwanz.
- Präparieren Sie die Haut um die Unterbauch, und öffnen Sie den Unterleib mit einer Schere. Suchen Sie die Gebärmutter: während dieser späten Stadien der Schwangerschaft, der Uterus reichlich die Bauchhöhle zu füllen.
- Sezieren die Gebärmutter und in eine Röhre mit PBS auf Eis gefüllt. Wenn auf Eis kann das Gewebe für mehrere Stunden verlassen werden. Entsorgen Sie die Leiche der Mutter gemäß gültiger Richtlinien <li> sezieren die Embryonen aus der Gebärmutter und sie von ihrer extra Gewebe. Legen Sie die Embryonen in PBS auf Eis.
- Enthaupten die Embryonen mit einer Schere, und trennen Sie den Unterkiefer aus dem Rest des Kopfes mit Mikrodissektion Schere (2A). Genau Entfernen Sie die Unterkiefer, ohne Beschädigung der Trigeminalganglien; dieser letzteren in der Nähe des Unterkiefers lokalisiert ist ihre versehentliche Beschädigung möglich. Erhalten Sie den Unterkiefer und den Rest des Kopfes in kaltem PBS, auf Eis.
- Um TG sezieren, nehmen Sie den Kopf und legen Sie sie auf eine Dissektion Glaspetrischale, die zuvor mit kaltem PBS gefüllt. Unter Verwendung der Zange, entfernen Sie die Haut und den Schädel. Entfernen Sie dann das Telencephalon und das Kleinhirn, indem Zange unterhalb des Telencephalon und Aufzug; das Telencephalon und das Kleinhirn zusammen drehen, so dass die Unterseite des Schädels freigelegt.
- Lokalisierung der trigeminalen Ganglien (in 2B gezeigt). Verwenden Sie die Pinzetteum die TG von den Trigeminus trennen. Beseitigen Sie die Reste der Trigeminus-Projektionen mit Hilfe der Dissektion Nadeln wie Messer. Legen Sie die seziert TG in einer Petrischale mit kaltem PBS gefüllt und halten sie auf Eis.
- Embryonale Zähne sezieren, legen Sie den Unterkiefer, die zuvor aus dem Schädel getrennt auf die Dissektion Glaspetrischale mit kaltem PBS gefüllt. Verwendung Dissektion Nadeln wie Messer, entfernen Sie die Zunge und die Haut rund um den Kiefer. Trennen Sie den linken und den rechten Hemi-Backen durch Schneiden entlang der Mittellinie des Kiefers. Die Zahnanlagen sind gut sichtbar, wie in 1C gezeigt. Isolieren Sie die Zahnkeime mit Dissektion Nadeln und entfernen Sie den Überschuss an nicht-Zahngewebe. Legen Sie die seziert Zahnkeime in einer Petrischale mit kaltem PBS gefüllt und halten sie auf Eis.
3. Mikrofluidik-Co-Kulturen
- Nach der Sektion, entfernen Laminin aus den mikrofluidischen Systemen. Füllen der Kammern mit 200 ul der respective Medien.
- Mit einer Pinzette, übertragen vorsichtig seziert die TG und Zahnkeime in die Löcher erzeugt durch Stanzen (1D). Stellen Sie sicher, dass die Zahnkeime nicht schwimmen, und dass sie sinken, bis sie die Deckgläser.
- Kultur die Proben in Brutschrank bei 37 ° C, 5% CO 2.
- Ändern Sie das Kulturmedium alle 48 Stunden. Die Kammern leeren nicht vollständig, und nicht direkt Pipette nicht in die Kulturkammern. Vollständige Entleerung der Kammern würde zur Bildung von Luftblasen in den Kammern führen; direkte Pipettieren in die Kammer würde in axonalen Schäden führen. Um diese Probleme zu vermeiden, entfernen Sie das Medium zeigt die Pipette in Richtung der Außenseite der Vertiefungen; Ähnlich pipettieren frischem Medium auf der Seite der Vertiefungen angeordnet gegenüber den Kammern.
- Während der Kulturzeit kann Co-Kulturen leicht durch Zeitraffer-Mikroskopie abgebildet werden. Co-Kulturen für 10 Tage lang aufrechterhalten werden.
- Nach der Kultur period, waschen Sie die Kammern durch Pipettieren von 150 ul PBS in einem gut pro Kammer und ließ PBS durch die Kammern fließen dreimal.
- Entfernen Sie die PBS und fixieren Sie die Proben durch Pipettieren von 150 ul Para 4% (in PBS) in einer gut per Kammer; Inkubation bei Raumtemperatur für 15 min.
- Zweimaliges Waschen der Kammern mit PBS, wie in 3.6 beschrieben.
- Fahren Sie mit der weiteren Analyse.
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Representative Results
Diese Ergebnisse zeigen, dass isolierte Trigeminalganglien kann in einem Abteil der mikrofluidischen Vorrichtung zu wachsen, und zusätzlich, dass die Entwicklung von den isolierten Zahnanlagen ist für einen langen Zeitraum in der anderen Kammer der mikrofluidischen Vorrichtung aufrechterhalten. Verschiedenen Kulturmedien sind in den zwei Kammern verwendet, und die Mikrorillen zwischen den beiden Kammern zu ermöglichen Verlängerung der Axone vom Ganglion trigeminale gegenüber den Entwicklungszahnanlagen dar. 3 stellt eine Visualisierung von Neurofilament mittels Immunofluoreszenz 37, in einer Co-Kultur der Maus embryonale Ganglion trigeminale und embryonalen Maus-Schneidezahn in der beschriebenen mikrofluidischen Co-Kultursystem. Maus Schneidezähne während der Entwicklung nicht in vivo viert;. Konsistent sind Axone Trigeminalganglions durch die Entwicklungszahnkeim in Kultur für bis zu 10 Tage aufgehoben 3A zeigt einen Überblick über den axonalen Kammer in diese Co-Kultursystem. 3B und 3C zeigen progressive Vergrößerung der Neuriten in den axonalen Kammern und den Mikrohaine. Zahnkeime (oder jeder Kokulturen Organe oder Gewebe) können leicht aus den Mikrofluidvorrichtungen entfernt werden und separat zum Beispiel analysiert werden, für die histologische Färbungen oder zur Genexpressionsanalyse verarbeitet.
Abbildung 1. Ansichten des mikrofluidischen montiert Co-Kultur-Gerät (A) von oben; . (B) teilweise seitliche Die Kulturkammern (cc) sind rot (Eosin) hervorgehoben und Blau (Toluidinblau); Mikronuten (mg) als weiße Linie zwischen den Kulturkammern sichtbar. Ganglien und cokultiviert Organe / Gewebe werden über die gestanzten Löcher (PH) in der Vorrichtung in die entsprechenden Kulturkammer gestellt. Medien werden über die Vertiefungen (mw) hinzugefügt und entfernt werden. "Https://www.jove.com/files/ftp_upload/53114/53114fig1large.jpg" target = "_ blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. (A) Seitenansicht eines Maus-Embryo-Kopf (embryonalen Tag der Entwicklung E14.5). Die schwarze Linie zeigt an, wo der Unterkiefer sollte, um die Integrität der beiden Trigeminalganglien und Zahnkeime erhalten geschnitten werden. (B) Mausembryo Kopf (E14.5) nach Entfernen der Unterkiefer, Schädel und Telencephalon. Schwarze Pfeile zeigen trigeminal Ganglien (TG). (C) Unterkiefer des Mausembryo (E14.5) nach dem Entfernen der Zunge. Schwarze Pfeile zeigen die Lokalisierung der verschiedenen Zahnkeime (Inc: Schneidezahn; FM: ersten Molaren). (D) Schematische Darstellung der mikrofluidischen Co-Kultur-Gerät.p_upload / 53114 / 53114fig3large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Co-Kultur des Ganglion trigeminale und Schneidezahn Keim aus Wildtyp-E15.5 Maus-Embryonen. (A) Übersicht des axonalen Kammer (Neurofilament, DAPI). Maßstab: 300 & mgr; m. (B) Eine stärkere Vergrößerung der Mikrorillen und Neuriten wachsen in den axonalen Kammer (Neurofilament, DAPI; Überlagerung der Fluoreszenz und Hellfeld-Bilder). Maßstab: 150 & mgr; m. (C) die höhere Auflösung, welche das Wachstum von Axonen innerhalb der Mikrorillen (Neurofilament). Maßstab:. 75 um Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Vorherige in vitro-Studien der Zahn Innervation wurden auf herkömmliche Kokulturen Trigeminalganglien und Zahngewebe oder Zellen 26,28,29 basiert. Diese Studien wurden durchgeführt, um in erster Linie untersuchen die attraktive Wirkung dieser Zellen oder Gewebe auf sensorische Axone 38. Zwar bringen bedeutende Fortschritte auf dem Gebiet wurden mehrere technische Fragen aufgeworfen. Zahnkeime beginnen, nach ein paar Tagen der Kultur 37 degenerieren. Basierend auf diesen Beobachtungen wachsenden Neuronen und die Zähne in den gleichen Kulturbedingungen beeinträchtigt ein eventuelles Analyse von Molekülen in der Nebensprechen zwischen diesen beiden Geweben beteiligt. Optimale Kulturbedingungen nötig sind, die physiologische Molekularprofil Trigeminalganglien und Zahngewebe zu bewahren.
Mikrofluidik-Systeme wurden bisher verwendet, um Nervenzellen und verschiedene Zelltypen in Medien optimiert 34,36-Kultur co. Das Mikrofluidik-System kann mehr Vertrauen darstellenvollständig die in vivo Situation, in neuronalen Zellkörpern, axonale Terminals und Zielgewebe im allgemeinen auf verschiedenen zellulären und molekularen Mikroumgebungen ausgesetzt. In jüngerer Mikrofluidik Vorrichtungen wurden verwendet, um Kokultur ganze Dorsalwurzelganglien und Osteoblasten 36. Wir haben kürzlich gezeigt, dass Trigeminalganglien und Zähnen sind in der Lage, für lange Zeiträume in mikrofluidischen Vorrichtungen 37, wenn co-kultiviert überleben. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass die Zähne von verschiedenen Entwicklungsstadien in diesen aufrechtzuerhalten in vitro Bedingungen die gleichen abstoßend oder anziehend Wirkungen auf Trigeminus innerviert, dass sie in vivo 37 ausgestellt.
Die beschriebenen Protokoll erfordert Übung und Fingerfertigkeit, insbesondere für die Mikrodissektion von Trigeminalganglien und Zahnkeime. Trigeminalganglien sind leicht beim Präparieren gerissen. Daher empfehlen wir die Verwendung von Dissektion Nadeln statt Dissektion Kraftps, um die rund um den Ganglien Gewebe zu entfernen. Ebenso sollte besondere Vorsicht beim Sezieren Zahnkeime, um eine Beschädigung der Zahn Epithel, während trennt sie von den umliegenden mesenchymalen Geweben genommen werden. Ferner wird während der ersten Tage der Co-Kultur, besondere Sorgfalt sollte bei der Handhabung der Inkubator genommen werden, da eine übermäßige Vibration kann Ganglion trigeminale Haftung auf dem Deckglas Kultur beeinträchtigen. Während des Cokulturzeit sollte Medien entfernt und durch Pipettieren in die Vertiefungen auf der Seite gegenüber den Kulturkammern werden. Aspiring oder Pipettieren Medien in Nähe der Kulturkammern würden im axonalen Schäden führen.
Das beschriebene Protokoll kann modifiziert werden, um die Innervation mehreren embryonalen Organen und embryonalen oder postnatale Geweben und Zelltypen zu untersuchen. Microfluidics-Systeme könnten eine geeignete Plattform dar, um mehr Kulturzeiten für die Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen Neuronen und wächst tee ermöglichenth. Außerdem Trennung des neuronalen aus dem Dentalraum ermöglicht eine Analyse der Effekte von spezifischen Protein-Lokalisierung und Quantifizierung 33,37. Blockierenden Antikörpern oder rekombinanten Proteinen konnten auch für die getrennten Kammern der Mikrofluidik Vorrichtungen für die Analyse ihrer Wirkung auf neuronale und Zahngewebe hinzugefügt. Beispielsweise die Behandlung von Trigeminalganglien mit NGF unterstützt ihr Überleben und ermöglicht neuronale Auswachsen. Jedoch wird in dieser Arbeit exogenem NGF fehlt im Zahnkeim Faches, zahn abgeleiteten Signale sind für neuronale Anziehung oder Abstoßung der nur verantwortlich. In ähnlicher Weise können andere rekombinante Moleküle, Antikörper oder Arzneimittel verwendet, um das System unter kontrollierten Bedingungen zu manipulieren.
Die wichtigsten Einschränkungen der vorgelegten Protokoll befinden sich in der relativ hohen Kosten der kommerziellen Mikrofluidvorrichtungen und der wesentlichen 2D-Einrichtung des Co-Kultursystem. In der Tat, wenn auch ganze Organe kann Kulturd, die beide Organe und Axone wachsen in 2D-adhärenten Kulturbedingungen auf einem Deckglas; Anpassung des Systems würde, um eine dreidimensionale, realistische Darstellung der Innervation erhalten benötigt.
Abschließend sind mikrofluidischen Bauteilen optimal für die Untersuchung der Rolle der Innervation bei der Entwicklung oder Regeneration von Organen und erlauben die Untersuchung von Interaktionen zwischen neuronalen und Zielgeweben in optimalen Kulturbedingungen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AXIS Axon Isolation Devices | Millipore | AX15010-TC | Microchannels of different lenght are available |
| Laminin | Sigma Aldrich | L2020 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| B27 | Gibco | 17504 | |
| Recombinant Mouse beta-NGF | R&D Systems | 1156-NG-100 | Human and Rat beta-NGF (R&D Systems) are equivalent |
| DMEM-F12 | Gibco | 11320-033 |
References
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