Abstract
Inervasyonu organ ve dokuların gelişimi, homeostasis ve rejenerasyonda önemli bir rol oynar. Ancak bu olayları altta yatan mekanizmalar henüz tam olarak anlaşılamamıştır. Özellikle, diş gelişimi ve rejenerasyon innervasyonunun rolü ihmal edilmektedir.
In vivo çalışmalar birçok değişik hayvan modellerinin geliştirilmesi ve onarım işlemleri sırasında diş dokularının innervasyon desen hakkında önemli bilgiler vermiştir. Ancak, bu yaklaşımların pek çok sinir lifleri ve hedef organ ve doku arasındaki etkileşimin moleküler temelini vurgulamak için optimal değildir.
Eş-kültür araştırılması ve kontrollü ve yalıtılmış bir ortamda sinir lifleri ve dişlerin arasındaki etkileşimleri işlemek için değerli bir yöntem teşkil etmektedir. Son yıllarda, aynı kültür ortamı kullanılarak geleneksel eş-kültürleri çok kısa süreler için yapılmıştır (örneğin, iki gün)duyusal sinir lifleri üzerinde ağız ve diş dokularının gelişiminin çekici veya itici etkisini araştırmaktır. Ancak, kültür süresinin uzatma diş morfolojilerinden ve hücrelerdeki farklılaşmanın üzerindeki innervasyonunun etkilerini araştırmak için gereklidir.
Microfluidics sistemleri, uygun bir kültür ortamı nöronların ve farklı hücre tipleri arasında ko-kültürler izin verir. Son zamanlarda, trigeminal gangliyon (TG) ve diş uzun bir süre hayatta mümkün olduğunu göstermiştir birlikte kültüre edildiğinde, mikroakışkan cihazlarda, ve bu koşullar altında da in vivo olarak gösterir, aynı innervasyon deseni korumak.
Bu temelde, biz izole etmek ve bir mikroakışkan ko-kültürü sistemi kullanmaktadır.Bu protokolde trigeminal ganglion ve diş mikropları gelişmekte ko-kültür basit ve esnek bir yol için ortak kültür ganglionlar / sinirler ve hedef doku ve açıklar anlatan rolleri incelemek için Bir Contr tür etkileşimler üzerinde özel moleküllerolled ve izole bir ortam.
Introduction
Inervasyonu organ ve dokularda 1,2 geliştirilmesi, homeostasis ve rejenerasyonda önemli bir rol oynar. 5 - Ayrıca, innervasyon kök hücre proliferasyonu, mobilizasyon ve farklılaşma 3 düzenlenmesinde rol oynar. Gerçekten de, orofasyal kompleks dokularda gerçekleştirilen son çalışmalar parasempatik sinir tükürük geliştirilmesi ve rejenerasyonu 6,7 bezleri içinde epitel progenitör hücrelerin fonksiyonu için gerekli olduğunu göstermiştir. 11 - Aynı şekilde, innervasyon damak 8 gelişimi ve korunması için gerekli olduğu gösterilmiştir. Bu nedenle, bu gibi dişler gibi diğer önemli orofasyal organ ve dokuların gelişimi innervasyon yapılmamış ihmal rolünü analiz etmek önemlidir.
Yetişkin dişi zengin innervasyon rağmen, ve buna karşılık vücut develo tüm diğer organ ve dokularaping dişler erken doğum aşamalarında innerve başlanacak. Dişler ağız ektoderm ve kranial nöral krest kökenli mezenşimin arasındaki sıralı ve karşılıklı etkileşimleri sonucunda gelişir. Bu etkileşimler, epitel türevli ameloblast ve mine ve dentine sırasıyla 12 oluşumundan sorumlu olan mezenşimin türetilmiş odontoblast yol açar. 15 - Üstün servikal ganglionlar gelen trigeminal ganglia ve sempatik sinirler duyu sinirleri yetişkin dişleri 13 innerve. Embriyogenez sırasında sinir lifleri gelişmekte diş mikrop karşı trigeminal ganglion projeden kaynaklanan ve giderek onları çevreleyen ama diş papilla mezenşimin 13 içine nüfuz etmez. Sinir lifleri odontoblast farklılaşma ve dentin matriks birikimi 16 ile ilişkili daha ileri gelişim aşamalarında diş pulpa mezenşimi girin. Diş hamuru innervasyon completed yakında ağız boşluğunda 13 diş patlaması sonucu. 19 - Çeşitli semaphorins ve nörotrofinler Odontogenez 16 sırasında innervasyon düzenlenmesinde rol oynadığını Önceki çalışmalar ortaya koymuştur. Daha önceki çalışmalarda açıkça innervasyon balıkların 20 diş oluşumu için bir ön koşul olduğunu göstermiştir. Daha yeni çalışmalar sonik kirpi (sus) 21 salgılanması yoluyla duyusal sinirler tarafından düzenlenir fare kesici diş mezenşimin kök hücrelerin bu homeostasisi göstermiştir. 24 - Bununla birlikte, diş başlatma, geliştirme ve yenilenme içinde innervasyon rolü hala memelilerde 22 derece tartışmalıdır.
In vivo çalışmalarda bir bolluk, çeşitli hayvan modellerinde 13,25,26 geliştirme ve onarım işlemleri sırasında diş dokularının innervasyon desen hakkında önemli bilgiler vermiştir. Bununla birlikte, bu en APPROağrıları sinir lifleri ve hedef organ ve doku arasındaki etkileşimin moleküler temelini vurgulamak için optimal değildir. 29 - Co-kültürler araştırılması ve kontrollü ve yalıtılmış bir ortamda 26 sinir lifleri ve dişlerin arasındaki etkileşimleri işlemek için değerli bir yöntem teşkil etmektedir. Aynı zamanda, eş-kültürleme çeşitli teknik ayarlamalar tabidir. 32 - Örneğin, sinirler ve spesifik diş dokularının (örneğin, diş hamuru, diş folikül, diş epiteli) için çoğu zaman 30 uzun süreler için doku hayatta garanti etmek amacıyla farklı bir kültür ortamı gerektirir.
29 - Son yıllarda, aynı kültür ortamı kullanılarak geleneksel eş-kültürler duyusal sinir lifleri 27 ağız ve diş dokularının gelişiminin çekici veya itici etkilerini araştırmak için çok kısa bir süre (örneğin, iki gün) için yapılmıştır.Ancak, kültür süresinin uzatma diş morfolojilerinden ve hücrelerdeki farklılaşmanın üzerindeki innervasyonunun etkilerini araştırmak ve hedef organlarda içinde dallanma sinir liflerinin dinamiklerini incelemek için gereklidir. Bu nedenle, bitişik olmayan ko-kültürler nöronal-diş dokuları etkileşimler çalışmalar yapmak daha uygun olacaktır.
Microfluidics sistemleri, uygun bir kültür ortamı nöronların ve farklı hücre tipleri arasında ko-kültürler izin verir. Hedef doku 33 içeren bölmeye doğru mikrokanallar boyunca nöral hücre kütlelerinden aksonlarının gelişimini izin verirken, bu cihazlarda, diş dokuları ve nöronlar farklı bölümlerinde ayrılır. Mikroakışkan cihaz zaten kanser ve neovaskülarizasyon 35 hücre etkileşimleri nöronlar ve mikroglia 34,35 arasındaki etkileşimleri hem de hücre incelemek için kullanılmıştır. Ayrıca, bu sistemler Dors'a arasındaki etkileşimi incelemek için kullanılmıştıral kök gangliyon ve osteoblastlar 36.
Biz son zamanlarda trigeminal gangliyon (TG) ve diş uzun süre hayatta kalmak için mümkün olduğunu göstermiştir zaman birlikte kültüre mikroakışkan cihazlar 37. Ayrıca, biz farklı gelişim aşamalarında dişler bu in vitro koşullarda bunlar, in vivo 37 göstermek trigeminal inervasyon aynı itici ya da çekici efektler korumak olduğunu göstermiştir. Bu protokol, basit, güçlü ve esnek bir şekilde birlikte kültür ganglionlar / sinirler ve hedef doku ve kontrollü ve yalıtılmış bir ortamda bu tür etkileşimler ile ilgili özel moleküllerin rollerini incelemek için hakkında bilgi sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm fareler İsviçre Hayvan Refahı Kanunu ve Kanton Veteriner ofisi, Zürih düzenlemelere uygun olarak uygun muhafaza ve ele alınmıştır.
Diseksiyon Malzeme, Kültür Medya, mikroakışkan Cihazlar 1. Hazırlık
- Otoklav mikro diseksiyon forseps ve makas (121 ° C, sterilizasyon süresi: 20 dk) ve steril bir kapta saklayın.
- 37 ° C'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde 24 saat süre ile, 1 M HCI onları kuluçka cam lamelleri (24 mm x 24 mm) sterilize edin. Etanol% 99 ile steril distile H 2 O, onlara üç kez üç kez yıkayın. Kuru daha sonra 37 ° C'de ya da steril bir akış hunisi altına lamelleri. Son olarak, otoklav veya sterilizasyon tamamlamak için UV ışığı (30 dakika) lamelleri maruz kalmaktadır. Lameller sonra etanol% 70 saklanabilir.
- Steril forseps kullanarak dikkatlice paketinden AXIS Akson İzolasyon Aygıtlar çıkarın ve steril bir Petri kabı koyun. Steril bir biyopsi yumruk kullanarak (ø: 1mm) kültür odaları yazışmalarda numune başına bir delik kültüre edilmesi (Şekil 1) oluşturun.
NOT: uygulanan basınç tarafından zarar olabileceği gibi, mikro oluklarda çok yakın yumruk yapmayın. - Etanol% 70 bunları yükselmekte tarafından AXIS Akson İzolasyon Cihazları sterilize edin. Tamamen steril bir akış kaputu altında kuru ardından EKSEN Akson İzolasyon Cihazları ve lamelleri. Geçmeden önce 3 saat, en az bekleyin.
NOT: Eksik kurutma mikroakışkan cihazların arızalı mecliste neden olacaktır. - 6-kuyu plaka içindeki bir 35 mm Petri kabı içine veya iyi olarak her bir lamel yerleştirin.
- Izolasyon cihazı ve cam lamel arasında tam yapışma sağlamak için bükülmüş uçları ile forseps ile yavaşça ama sıkıca lamel ve basın üzerine AXIS Akson İzolasyon Cihazı yerleştirin.
- Her bir kültür odası içinde, bir pipet, poli-D-lisin, 150 ul (steril 0.1 mg / ml, H 2 damıtılmışO). Kültür odaları tüm havayı çıkarmak için, 5 dakika vakum altında mikroakışkan cihazlar yerleştirin.
- Hala hava odaları, yeniden pipet olan odalarına poli-D-lisin solüsyonu görülebilir gerekebilir.
- 37 ° C 'de, poli-D-lizin O / N cihazları inkübe edin.
- Steril distile H 2 O ile bölmeleri üç defa yıkamak
- 150 (PBS içinde, Sigma-Aldrich, 5 ug / ml ya da serum barındırmayan ortam) il, laminin çözelti ile odaları doldurun ve 37 ° C 'de O / N inkübe edin.
- Şöyle oluşan trigeminal ganglion kültürleri 37 için 50 ml hazırlayın: 48 mi, Neuro temelli vasat, 1 mi B-27 / ml penisilin / streptomisin, 2 mM L-glutamin, 5 ng / ml sinir büyüme faktörü 100 U (NGF) , 12:25 sitosin arabinosid.
- 40 mi DMEM-F12, 10 ml cenin sığır serumu (FBS, nihai konsantrasyon:% 20), aşağıdaki gibi oluşan, diş mikrop kültürlerinden 37 için 50 ml hazırlayın, 100 U / ml penisilin / streptomisin, 2 mM L-glutamin, 150 ug / ml askorbik asit.
2. Fare Embriyo Üretimi ve Diseksiyon
- (Vajinal fişi: geliştirme 0.5, E0.5 embriyonik gün) vajinal fiş göre embriyonik yaşını belirlemek ve morfolojik kriterlere aracılığıyla onaylayın. Bu protokol için, genellikle E14.5-E17.5 fare embriyoları kullanmak.
- Diseksiyon alanı ve etanol% 70 ile stereoskop temizleyin.
- Servikal dislokasyon yoluyla hamile anne Kurban. Bir ızgara üzerine birinci ve ikinci parmak ile fare boyun engelleyin ve kararı kuyruğu ile çekin.
- Alt karın çevresindeki deri teşrih ve makas kullanılarak karın açın. Rahim bulun: Gebeliğin böyle geç evrelerinde, rahim bol karın boşluğuna doldurun.
- Buz üzerinde PBS ile dolu bir tüp içinde rahim ve yeri parçalara ayır. Zaman buz üzerinde doku birçok saat boyunca bırakılabilir. Kurumsal kurallarına göre anne cesedi atın <li> rahim embriyolar inceleyin ve onların extraembryonic dokulardan onları serbest. Buz üzerinde PBS embriyolar yerleştirin.
- Makas kullanarak embriyolar decapitate ve mikro diseksiyon makas (Şekil 2A) kullanarak baş geri kalanından alt çene ayırın. Trigeminal ganglionlar zarar vermeden, tam alt çene çıkarın; İkinci alt çene yakın lokalize olarak, onların kaza sonucu hasar mümkündür. Buz üzerinde alt çene ve soğuk PBS başın kalan, koruyun.
- TG incelemek için, başını alıp önce soğuk PBS ile dolu bir diseksiyon cam Petri kabı üzerine yerleştirin. Forseps kullanarak, deri ve kafatası çıkarın. Daha sonra telencephalon ve telencephalon ve asansör altındaki forseps koyarak beyincik çıkarın; telencephalon ve beyincik maruz kafatası alt bırakarak, birlikte çevirmek olacaktır.
- (Şekil 2B'de gösterildiği gibi) trigeminal ganglionları yerelleştirilmesine. Forseps kullanıntrigeminal sinirler TG ayırmak için. Bıçaklar olarak diseksiyonu iğneler kullanılarak trigeminal projeksiyonlar kalıntılarını ortadan kaldırın. Soğuk PBS ile dolu bir Petri kabındaki disseke TG koyun ve buz üzerinde saklayın.
- Soğuk PBS ile dolu önceden diseksiyon cam Petri kabı üzerine, kafatasından ayrılan alt çene, koyun, embriyonik dişleri incelemek için. Bıçaklar olarak diseksiyonu iğneler kullanarak, dil ve çene etrafındaki cilt kaldırmak. Çene orta hat boyunca keserek sol ve sağ hemi-çeneleri ayırın. Şekil 1C gösterildiği gibi diş mikrop kolaylıkla görebilir. Diseksiyon iğneler kullanarak diş mikropları yalıtmak ve olmayan diş dokularının fazlalığı kaldırın. Soğuk PBS ile dolu bir Petri kabındaki disseke diş mikropları yerleştirin ve buz üzerinde saklayın.
3. mikroakışkan Co-kültürler
- Diseksiyon sonra, mikroakışkan cihazlardan laminin çıkarın. Saygımdan 200 ul odaları doldurunmedyayı ettik.
- Forseps ile (Şekil 1D) delme tarafından oluşturulan deliklere hafifçe disseke TG ve diş mikropları aktarın. Diş mikrop yüzer yok emin olun ve onlar lamelleri temas edene kadar onlar lavabo söyledi.
- Kültür, 37 ° C'de inkübatör içinde örnekleri,% 5 CO2.
- Kültür ortamı, her 48 saat değiştirin. Tamamen odaları boşaltmak etmeyin ve kültür odalarına doğrudan pipetle yok. Odaları içindeki hava kabarcıklarının oluşmasına neden olur bölmelerin tam boşalması; odasına doğrudan pipetleme aksonal hasarla sonuçlanır. Kuyuların dış tarafına doğru pipet işaret orta kaldırmak, bu sorunları önlemek için; Benzer şekilde, odalarına karşısında yer kuyuların yanında taze orta pipetle.
- Kültür döneminde, eş-kültürleri kolayca time-lapse mikroskobu ile görüntülenebilir. Eş-kültür 10 gün boyunca muhafaza edilebilir.
- Kültür perio sonrad odasının başına bir kuyuya PBS 150 ul pipetle ve PBS odaları aracılığıyla üç kez akış sağlayarak odaları yıkayın.
- PBS çıkarın ve odanın başına bir kuyudaki paraformaldehit 150 ul (PBS)% 4 pipetleme örnekleri düzeltmek; 15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir.
- 3.6 de tarif edildiği gibi PBS ile iki kez odaları yıkayın.
- Daha fazla analiz ile devam edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu sonuçlar, izole trigeminal ganglion izole diş mikrop gelişimi mikroakışkan cihazın diğer bölmeye uzun bir süre boyunca devam olduğu, ek olarak, mikro-akışkan cihazın bir bölmeye büyür ve olduğunu göstermektedir. Farklı kültür ortamı iki bölme kullanılır ve iki bölme arasında microgrooves geliştirilmesi diş mikrop doğru trigeminal ganglion gelen akson uzantısı sağlar. Şekil 3, bir fare, bir ko-kültür, immünofloresan 37 üzerinden nörofilament bir görselleştirme temsil eder tarif edilen mikroakışkan ko-kültür sistemindeki embriyonik trigeminal gangliyon ve fare embriyonik kesici. Fare kesici dişler in vivo gelişimi sırasında innerve değildir;. Tutarlı, trigeminal ganglion gelen aksonlar 10 kadar gün boyunca kültür gelişen diş tohumu ile yürürlükten kaldırılmıştır Şekil 3A, bu aksonal odasının bir bakış göstermektedir ko-kültür sistemi. Şekil 3B ve 3C gösterisi aksonal odaları ve mikro-bahçeleri içinde neurites ilerici büyütme. Diş mikroplar (veya herhangi bir ko-kültürler organlar ve dokular) histolojik boyamalar veya gen ekspresyon analizi için işlenmiştir kolayca mikroakışkan cihazlar kaldırılır ve ayrı olarak, örneğin analiz edilebilir.
Şekil monte mikroakışkan ko-kültür cihazı, yukarıda (A) 1. Ziyaret; . (B) kısmen yan kültür odaları (cc) kırmızı (eosin) vurgulanmıştır ve mavi (toluidin mavisi) vardır; (mg) microgrooves Kültür oda arasında beyaz bir çizgi olarak görülebilir. Ganglia ve ko-kültürlenmiştir organ / doku cihazı açılmış delikler (Ph) ile uygun bir kültür odasına yerleştirilir. Ortamı, oyuklara (MW) ile ilave edildi ve çıkarılır. "Https://www.jove.com/files/ftp_upload/53114/53114fig1large.jpg" target = "_ blank"> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. (A) fare embriyo kafasının Yanal görünümü (geliştirme E14.5 embriyonik gün). Siyah çizgi alt çene hem trigeminal ganglion ve diş mikropların bütünlüğünü korumak amacıyla kesilmelidir nerede gösterir. Alt çene, kafatası ve telencephalon çıkarılmasından sonra (B) fare embriyo kafası (E14.5). Siyah oklar trigeminal ganglionlar (TG) gösterir. Dil çıkarılmasından sonra (C), fare embriyosu (E14.5) alt çenesine. (:; FM kesici: İlk azı dişleri Inc) Siyah oklar farklı diş mikropların lokalizasyonu göstermektedir. (D), mikroakışkan ko-kültür cihazın şematik gösterimi.p_upload / 53114 / 53114fig3large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Trigeminal ganglion ve vahşi tip E15.5 fare embriyoları kesici diş tohumu Şekil 3. Co-kültür. Akson odasının (A) genel bakış (nörofilaman, DAPI). Ölçek çubuğu: 300 mikron. (B) akson odasına büyüyen mikro oluklarda ve neurites yüksek büyütme (nörofilament, DAPI, floresan ve aydınlık görüntülerin süperpozisyon). Ölçek çubuğu: 150 mikron. (C) mikro oluklarda (nörofilaman) içinde akson büyümesini gösteren yüksek büyütme. Ölçek çubuğu:. 75 mikron bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Diş innervasyon in vitro çalışmalar mi, trigeminal ganglionların diş dokuları veya hücreleri 26,28,29 geleneksel ko-kültürler dayandırılmıştır. Bu çalışmalar çoğunlukla duyusal aksonlar 38 bu hücrelerin veya dokuların çekici etkisini araştırmak amacıyla yapılmıştır. Alanda önemli ilerlemeler getirerek rağmen, çeşitli teknik sorunlar dile getirildi. Diş mikroplar kültür 37 birkaç gün sonra dejenere başlar. Bu gözlemlere dayanarak, aynı kültür koşullarında büyüyen nöronlar ve diş bu iki doku arasındaki çapraz konuşma dahil olan moleküllerin bir nihai analiz bozar. Optimal kültür koşulları, trigeminal ganglionların ve dental doku fizyolojik molekül profil korumak için gereklidir.
Microfluidics sistemleri optimize ortam 34,36 nöronları ve çeşitli hücre tipleri kültürü birlikte bugüne kadar kullanılmıştır. Bu Mikroakiskan sistemi daha inanç temsil edebilirNöral hücre gövdeleri, aksonal terminalleri ve hedef dokular arasında genel anlamda farklı hücresel ve moleküler mikroçevrelerde maruz tam olarak in vivo durumu. Daha yakın zamanlarda, mikroflüidik cihazlar, tüm arka kök gangliyon ve osteoblastlar 36 kültür birlikte kullanılmıştır. Biz son zamanlarda trigeminal ganglion ve diş mikroakışkan cihazlar 37 zaman birlikte kültürlü uzun süre hayatta kalmak için mümkün olduğunu göstermiştir. Ayrıca, biz farklı gelişim aşamalarında dişler bu in vitro koşullarda bunlar, in vivo 37 sergilenen trigeminal inervasyon aynı itici ya da çekici efektler korumak olduğunu göstermiştir.
açıklanan protokol trigeminal ganglion ve diş mikropların mikrodiseksiyon özellikle uygulama ve el becerisi gerektirir. Trigeminal ganglion kolayca diseksiyonu sırasında yırtılır. Bu nedenle, biz diseksiyon iğneleri yerine diseksiyon güç kullanımını önermekps, sırayla ganglionlar çevreleyen dokuyu çıkarmak için. Çevredeki mezenkimal dokuların ayıran ise diş epitel zarar görmesini önlemek amacıyla, diş mikropları diseksiyon Benzer şekilde, özellikle dikkatli olunmalıdır. Aşırı titreşim kültür lamel trigeminal ganglion yapışma bozabilir Dahası, ko-kültür ilk gününde, özellikle bakımı, kuluçka ele alınmalıdır. Ko-kültür periyodu boyunca, ortam maddesi ayrılmış ve kültürüne odaları karşı tarafında, kuyu içine pipet ile eklenir. Kültür odaları yakınında hevesli ve pipetleme ortam aksonal hasarla sonuçlanır.
Açıklanan protokol birçok oluşum safhasındaki organ ve embriyonik ve doğum sonrası doku ve hücre tipleri innervasyon incelemek için modifiye edilebilir. Mikroakiskan sistemleri nöronlar ve büyüyen tee arasındaki etkileşimlerin çalışma için uzun kültür dönemleri izin uygun bir platform temsil edebilecekinci. Ayrıca, diş bölmeden nöronal ayrılması spesifik protein lokalizasyonu ve miktar tayini 33,37 etkilerinin analizini izin verir. Engelleme antikorlar ya da rekombinant proteinler de nöronal diş dokusu üzerindeki etkilerini analiz etmek için Mikroakiskan cihazları, ayrı bölmelere ilave edilebilir. Örneğin, NGF ile, trigeminal ganglionların tedavisi hayatta kalma destekler ve nöronal gelişimini sağlar. Ancak, bu çalışma dışsal NGF diş kaynaklı sinyaller nöronal çekim ya da itme sadece sorumlu diş mikrop bölmesinden gelen yoktur. Benzer şekilde, diğer rekombinant moleküller, antikorlar ya da ilaçların kontrollü şartlar sistemi işlemek için kullanılabilir.
Sunulan protokol ana kısıtlamalar ticari mikroakışkan cihazların nispeten yüksek maliyeti ve esas olarak 2D-set eş-kültür sistemine kadar içinde bulunur. Aslında, bütün organların olmasına rağmen, kültürd organlar ve aksonlar hem cam lamel üzerinde 2D-yapışık kültür koşullarında büyümek; sistemin uyarlanması innervasyon bölgesinin üç boyutlu bir, gerçekçi bir temsilini elde etmek için gerekli olacaktır.
Sonuç olarak, mikroakışkan cihazlar organları geliştirmek veya yenileyici olarak innervasyonunun rolünü araştırmak için en uygun ve optimum kültür koşulları nöronal ve hedef dokular arasındaki etkileşimlerin çalışma izin verir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AXIS Axon Isolation Devices | Millipore | AX15010-TC | Microchannels of different lenght are available |
| Laminin | Sigma Aldrich | L2020 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| B27 | Gibco | 17504 | |
| Recombinant Mouse beta-NGF | R&D Systems | 1156-NG-100 | Human and Rat beta-NGF (R&D Systems) are equivalent |
| DMEM-F12 | Gibco | 11320-033 |
References
- Pagella, P., Jiménez-Rojo, L., Mitsiadis, T. A. Roles of innervation in developing and regenerating orofacial tissues. Cellular and molecular life sciences : CMLS. 71, 2241-2251 (2014).
- Kumar, A., Brockes, J. P. Nerve dependence in tissue, organ, and appendage regeneration. Trends in neurosciences. 35 (11), 691-699 (2012).
- Brownell, I., Guevara, E., Bai, C. B., Loomis, C. A., Joyner, A. L. Nerve-derived sonic hedgehog defines a niche for hair follicle stem cells capable of becoming epidermal stem cells. Cell stem cell. 8 (5), 552-565 (2011).
- Katayama, Y., Battista, M., et al. Signals from the sympathetic nervous system regulate hematopoietic stem cell egress from bone marrow. Cell. 124 (2), 407-421 (2006).
- Fitch, S. R., Kimber, G. M., et al. Signaling from the sympathetic nervous system regulates hematopoietic stem cell emergence during embryogenesis. Cell stem cell. 11 (4), 554-566 (2012).
- Knox, S. M., Lombaert, I. M. a, Reed, X., Vitale-Cross, L., Gutkind, J. S., Hoffman, M. P. Parasympathetic innervation maintains epithelial progenitor cells during salivary organogenesis. Science(New York, N.Y.). 329 (5999), 1645-1647 (2010).
- Knox, S. M., Lombaert, I. M. A., et al. Parasympathetic stimulation improves epithelial organ regeneration. Nature communications. 4, 1494 (2013).
- Oakley, B., Witt, M. Building sensory receptors on the tongue. Journal of neurocytology. 33 (6), 631-646 (2004).
- Oakley, B., Brandemihl, A., Cooper, D., Lau, D., Lawton, A., Zhang, C. The morphogenesis of mouse vallate gustatory epithelium and taste buds requires BDNF-dependent taste neurons. Brain research. Developmental brain research. 105 (1), 85-96 (1998).
- Sun, H., Oakley, B. Development of anterior gustatory epithelia in the palate and tongue requires epidermal growth factor receptor. Developmental biology. 242 (1), 31-43 (2002).
- Mistretta, C. M., Goosens, K. a, Farinas, I., Reichardt, L. F. Alterations in size, number, and morphology of gustatory papillae and taste buds in BDNF null mutant mice demonstrate neural dependence of developing taste organs. The Journal of comparative neurology. 409 (1), 13-24 (1999).
- Mitsiadis, T. a, Graf, D. Cell fate determination during tooth development and regeneration. Birth defects research. Part C, Embryo today reviews. 87 (3), 199-211 (2009).
- Mohamed, S. S., Atkinson, M. E. A histological study of the innervation of developing mouse teeth. Journal of anatomy. 136 (Pt 4), 735-749 (1983).
- Luukko, K. Immunohistochemical localization of nerve fibres during development of embryonic rat molar using peripherin and protein gene product 9.5 antibodies. Archives of oral biology. 42 (3), 189-195 (1997).
- Johnsen, D. Innervation of teeth: qualitative, quantitative, and developmental assessment. Journal of dental research. 64, 555-563 (1985).
- Mitsiadis, T. a, Dicou, E., Joffre, A., Magloire, H. Immunohistochemical localization of nerve growth factor (NGF) and NGF receptor (NGF-R) in the developing first molar tooth of the rat. Differentiation; research in biological diversity. 49 (1), 47-61 (1992).
- Mitsiadis, T. a, Luukko, K.
- Moe, K., Sijaona, A., Shrestha, A., Kettunen, P., Taniguchi, M., Luukko, K. Semaphorin 3A controls timing and patterning of the dental pulp innervation. Differentiation; research in biological diversity. 84 (5), 371-379 (2012).
- Kettunen, P., Løes, S., et al. Coordination of trigeminal axon navigation and patterning with tooth organ formation: epithelial-mesenchymal interactions and epithelial Wnt4 and Tgfbeta1 regulate semaphorin 3a expression in the dental mesenchyme. Development (Cambridge, England). 132 (2), 323-334 (2005).
- Tuisku, F., Hildebrand, C. Evidence for a neural influence on tooth germ generation in a polyphyodont species. Developmental biology. 165, 1-9 (1994).
- Zhao, H., Feng, J., et al. Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor. Cell stem cell. 14 (2), 160-173 (2014).
- Kettunen, P., Kvinnsland, H., Luukko, K. Mouse rudimentary diastema tooth primordia are devoid of peripheral nerve fibers. Anatomy and embryology. 205 (3), 187-191 (2002).
- Lumsend, A., Buchanan, J. An experimental study of timing and topography of early tooth development in the mouse embryo. Archives of oral biology. , 301-311 (1986).
- Kollar, E., Lumsend, A. Tooth morphogenesis: the role of the innervation during induction and pattern formation. Journal de Biologia Buccale. 7 (1), 49-60 (1979).
- Luukko, K., Kettunen, P. Coordination of tooth morphogenesis and neuronal development through tissue interactions: lessons from mouse models. Experimental cell research. 325 (2), 72-77 (2014).
- Lillesaar, C., Eriksson, C., Johansson, C. S., Fried, K., Hildebrand, C. Tooth pulp tissue promotes neurite outgrowth from rat trigeminal ganglia in vitro. Journal of neurocytology. 28 (8), 663-670 (1999).
- Lumsend, A., Davies, A. M. Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system. Nature. 323 (9), 538-539 (1986).
- Lillesaar, C., Fried, K. Neurites from trigeminal ganglion explants grown in vitro are repelled or attracted by tooth-related tissues depending on developmental stage. Neuroscience. 125 (1), 149-161 (2004).
- Lillesaar, C., Eriksson, C., Fried, K. Rat tooth pulp cells elicit neurite growth from trigeminal neurones and express mRNAs for neurotrophic factors in vitro. Neuroscience letters. 308 (3), 161-164 (2001).
- Petrinovic, M. M., Duncan, C. S., et al. Neuronal Nogo-A regulates neurite fasciculation, branching and extension in the developing nervous system. Development(Cambridge, England). 137 (15), 2539-2550 (2010).
- Otsu, K., Fujiwara, N., Harada, H.
- Mitsiadis, T. a, Drouin, J. Deletion of the Pitx1 genomic locus affects mandibular tooth morphogenesis and expression of the Barx1 and Tbx1 genes. Developmental biology. 313 (2), 887-896 (2008).
- Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nature protocols. 1 (4), 2128-2136 (2006).
- Hosmane, S., Tegenge, M. A., et al. Toll/interleukin-1 receptor domain-containing adapter inducing interferon-β mediates microglial phagocytosis of degenerating axons. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 32 (22), 7745-7757 (2012).
- Delamarche, E., Tonna, N., Lovchik, R. D., Bianco, F., Matteoli, M. Pharmacology on microfluidics: multimodal analysis for studying celll-cell interaction. Current opinion in pharmacology. 13 (5), 821-828 (2013).
- Neto, E., Alves, C. J., et al. Sensory neurons and osteoblasts: close partners in a microfluidic environment. Integrative Biology. , (2014).
- Pagella, P., Neto, E., Jiménez-Rojo, L., Lamghari, M., Mitsiadis, T. A. Microfluidics co-culture systems for studying tooth innervation. Frontiers in physiology. 5 (August), (2014).
- Connor, R., Tessier-Lavigne, M. Identification of maxillary factor, a maxillary process-derived chemoattractant for developing trigeminal sensory axons. Neuron. 24, 165-178 (1999).
