Mesure de TCR-pMHC Reliure Published: October 30, 2015 doi: 10.3791/53157

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Markus Axmann¹, Gerhard J. Schütz¹, Johannes B. Huppa²

¹Institute for Applied Physics - Biophysics, Vienna University of Technology, ²Institute for Hygiene and Applied Immunology, Medical University of Vienna

Introduction

Une compréhension plus fondamentale de la façon dont les cellules T reconnaissent les antigènes, il faut regarder au bon endroit, qui est, au sein de la synapse immunologique formé entre la cellule T et l'APC. Ici, la cinétique de liaison moléculaires ne sont pas seulement déterminées par les propriétés biochimiques intrinsèques des partenaires d'interaction en cause, mais dépend dans une large mesure, de paramètres cellulaires qui comprennent des forces cellulaires, l'architecture de la membrane et des interactions latérales entre protéines membranaires ainsi que les contraintes géométriques spécifiques synapse ^3. Approches biochimiques sont limités en puissance de résolution car ils nécessitent l'interruption d'au moins une des membranes synaptiques concernées. Pour cette raison, une méthode d'imagerie basée FRET a été développé pour surveiller la liaison du TCR à pMHCs antigéniques ^2. Voici cellules T sont décorées avec un recombinant et site spécifiquement étiquetés TCRβ-réactive chaîne unique fragment d'anticorps (SCF _V) et confrontés avec le plan ar bicouches lipidiques verre soutenu (SLBS), qui abritent des molécules du CMH de classe II chargées avec un peptide antigénique marqué par fluorescence, les molécules de co-stimulation et des protéines d'adhésion. Synaptic liaison entre les résultats pMHC marqués par un colorant TCR et marqué par un colorant dans FRET, qui peuvent être surveillés sur un vrac et le niveau de la molécule unique par fluorescence à réflexion interne totale (FRBR) microscopie.

Dans cet article, il est expliqué en détail comment utiliser SLBS pour doser synapses des cellules T, vérifier leur intégrité à travers un dosage de calcium-flux T-cellule fonctionnelle, la conduite de FRET mesures en vrac et à la sensibilité de la molécule unique, et d'analyser les données acquises. Recommandations sont offerts à la production de protéines correctement conformés requises pour bicouche fonctionnalisation. Pour des informations plus spécifiques concernant la formation de bicouche et la configuration d'un microscope de la FRBR appropriée s'il vous plaît se référer à un accès public publication JoVE supplémentaire publiée dos à dos ^4.

tente "> Nature de SLBS

SLBS fonctionnalisables peuvent être facilement générés à partir de vésicules unilamellaires (SUV) contenant les deux lipides-2-oléoyl-sn-gylcero-3-phosphocholine 1-palmitoyl (courte: POPC, 90-99%) et 1,2 sn-dioleoyl- - glycéro-3 - {[N (5-amino-1-carboxypentyl) iminodiacétique acide] succinyl} (courte: DGS NTA-Ni, 1-10%). VUS étalées sur des lames de verre propres pour former une bicouche plane contiguë ^4. DGS-NTA-Ni sert à ancrer les protéines à marquage polyhistidine via la formation de complexe-polyhistidine médiée par la synthèse NTA-Ni contenant un groupe de tête (figure 1A). Pour association stable, on le remplace généralement le domaine transmembranaire natif et la queue cytoplasmique de la protéine d'adhésion ICAM-1 et la molécule de co-stimulation B7-1 avec une étiquette contenant douze histidines (ICAM-1-12H, -12H B7-1) (figure 1B) . Le peptide-molécule de classe II chargé IE ^k contient deux chaînes de polypeptide membranaire incorporé (α et β)s. Les transmembranaires / domaines cytoplasmiques de deux chaînes doivent être remplacés avec une étiquette contenant six histidines chaque (IE ^k α β _{6H 6H} ou IE ^k -2x6H). En variante, l'extension de la chaîne α-douze histidines et en laissant le domaine extracellulaire de la chaîne β-non marqué (donnant lieu à des α ^k IE _{0H 12H} β ou IE -12H ^k) donne lieu à des résultats satisfaisants (figure 1B).

Étiquetage des pMHCs spécifique au site

Il est important de marquer le pMHC stoechiométriquement et spécifique au site afin d'être en mesure de convertir mesurées FRET rendements dans des constantes de liaison d'équilibre significatives. Ceci peut être réalisé par marquage chimique d'un peptide synthétique qui est chargé dans la fente de l'histidine recombinante étiquetée du CMH de classe II de ^2,5 molécules de liaison peptidique. Le peptide comprend tous les résidus de l'épitope de cellule T comme well comme un C-terminal de liaison courte (GGS), suivie par la cystéine (par exemple dans la teigne du cytochrome c (MCC) peptide ANERADLIAYLKQATK- GGSC, le linker est marquée en gras). Cette cystéine est utilisé pour marquer le peptide stoechiométriquement avec l'utilisation de dérivés de maléimide colorant. À ce stade soin supplémentaire devrait être consacrée à la vérification quantitative colorant couplage au peptide contenant de la cystéine. HPLC-purification du produit d'addition de peptide-colorant est recommandé et doit être suivie par spectroscopie de masse à ionisation électrospray. Toute masses enregistrées correspondant au produit de départ de peptide (sans colorant) reflètent l'étiquetage incomplet. Si cela est vrai, le peptide purifié par HPLC doit être soumis à des cycles de colorant étiquetage consécutifs jusqu'à ce que l'étiquetage est considéré quantitative. A noter que la spectroscopie de masse MALDI-TOF doit être évitée car ce procédé implique un rayonnement laser pour l'ionisation échantillon. Ce traitement se désintègre les fluorophores sensibles attachés avant la messe de peptide est lue et donc underrepre sente degrés de colorant conjugaison.

Marquage indirect instant spécifique de site de cellules TCR lié à l'utilisation de fragments monovalents à chaîne unique _Fv

Il est encore difficile de fixer des colorants à la cellule des protéines des cellules vivantes surface associée d'une manière spécifique au site. Pour surmonter cet obstacle pour les TCR de surface exposé, une version monovalent à chaîne unique (scFv _V) à partir des gènes de l'anticorps monoclonal TCRβ -reactive H57-197 ² a été construit. La structure cristalline de cet anticorps dans un complexe avec le TCR permet de concevoir rationnellement une version, dans lequel un résidu de serine à proximité immédiate de l'extrémité C-terminale du peptide associé au CMH (lorsque le partenaire colorant FRET correspondant est attaché) est remplacé par un résidu cystéine. Ce mutant cysteine ​​sert alors d'accepteur de colorant pour la conjugaison (figure 2).

Méthodologies d'enregistrer FRET

nt "> Les valeurs de FRET en vrac sont les mieux adaptés à vérifier la relation entre les distances inter-colorants choisis et FRET efficacité mesurés dans cette TCR-pMHC système ^{de liaison 2.} En outre, les mesures de FRET en vrac révèlent des différences qualitatives et quantitatives dans synaptiques affinités TCR-pMHC ( voir ci-dessous et la section de protocole 3.2). Différentes approches pour quantifier l'efficacité de FRET ont été introduites dans la littérature ^6. Dans cet article FRET est enregistrée via

(a) la récupération de donneur après accepteur blanchiment, et via

(b) sensibilisé FRET accepteur émission.

Le premier procédé (a) nécessite l'utilisation d'un accepteur de FRET qui peut être facilement décolorées, et d'un donneur, qui est plutôt photostable. En outre, il est important de veiller à ce que l'accepteur décolorées est plus capable d'éteindre la fluorescence du donneur. Comme le même canal de détection (donneur) est utilisée pour la quantification, un pas de facteurs de correctiond aucun aberrations chromatiques doivent être considérées, ce qui rend cette simple méthodologie et fiable. Cependant, les mesures quantitatives ne peuvent pas être répétées au même endroit de l'échantillon et les changements de FRET ne peuvent pas être enregistrées au fil du temps. Pour éviter les effets causés par la diffusion moléculaire ou la motilité cellulaire une étape de blanchiment rapide doit être recherché, ce qui minimise le temps qui passe entre le premier donneur de FRET (avant accepteur blanchiment) et la seconde image acquisition FRET donneur (après FRET accepteur blanchiment). Il est recommandé d'utiliser une source de lumière laser puissant du FRET accepteur d'onde d'excitation afin de minimiser éclairage et de blanchiment fois.

En revanche, dans l'approche de la mesure de FRET de l'émission sensibilisée (b) le donneur FRET est excité et l'émission de l'accepteur de FRET est observé dans le canal d'accepteur FRET. Changements dans signal d'accepteur FRET peuvent être enregistrées au fil du temps, mais émission du donneur FRET dans le canal accepteur décalée vers le rouge (termed bleedthrough) et accepteur FRET croix-excitation via donateurs excitation doit être déterminé et soustrait du canal accepteur FRET correctement enregistrée. Pour cela, les images d'accepteur FRET FRET donneur correspondant et doivent être alignés spatialement.

Détection de molécule unique (sm) FRET événements

Avec l'utilisation des lasers en tant que source d'excitation, et une caméra sensible microscopie TIRF de bruit atténué la fluorescence de fluorophores simples peuvent être facilement tracé au fil du temps. Similaire est vrai pour la détection d'événements de smFRET intermoléculaires. Toutefois, des complications peuvent être causés par FRET bleedthrough des bailleurs de fonds et de contre-excitation de l'accepteur de FRET, et donc le plus grand soin doit être pris lors de l'ajustement des densités de fluorophores dans l'expérience smFRET.

Dans le protocole ci-dessous (section 4 du protocole) du TCR a été choisi comme donneur de FRET en haute abondance et pMHC comme accepteur FRET en faible abondance. Pour atténuer FRET donateurs bleedthrough suffisamment, décorer 10-30% des TCR avec fluorescente scF _{V et} 90-70% des TCR avec des non-fluorescente scF _V. Voici le canal accepteur FRET a été choisi comme canal de la molécule unique, car il est confocale avec le seule molécule FRET canal. Cela permet d'aligner événements smFRET avec une seule molécule FRET accepteurs, qui est la base de la validation smFRET.

Extraction hors-taux synaptiques par des mesures smFRET

Photoblanchiment des deux FRET donneur et accepteur FRET doivent être pris en compte lors de l'extraction de la demi-vie des interactions de molécule unique FRET traces. Le nombre de FRET signaux observables au début de leur apparition en tant que seule paire donneur-accepteur N (0) est réduite au fil du temps à la fois par la déliaison du photoblanchiment complexe et récepteur-ligand. Le nombre de survivants complexes à un moment donné N (t) peut être exprimée mathématiquement comme suit:

Dans le terme exp de photoblanchiment (-t / τ _{de blanchiment),} le temps t est décrit par le produit du nombre d'observations n et l'illumination temps t _mauvais à cause du mode d'observation non continue, discrets (par exemple, la décoloration ne se produit que pendant l'illumination ). Dans le EXP- cinétique à long terme (t / τ _off) le temps t est le produit du nombre d'observations n et t le _{temps de retard} pour une seule observation de FRET (c.-à-déliaison cinétique se produit en continu). L'équation 1 peut être exprimée comme:

Le terme τ _{eau de Javel} / τ des _maladescribes le nombre d'observations jusqu'au blanchissement se produit et est défini comme la valeur moyenne <n _blanchir> de sa fonction exponentielle. L'équation 2 peut être simplifiée comme suit:

La valeur moyenne <n (t _lag)> du nombre d'images N (t) avec FRET événements observables après l'instant t est déterminé directement à partir de l'expérience. Il dépend du temps réglable entre les observations (T _lag) choisis dans l'expérience et les valeurs inconnues pour τ _off (l'inverse de la vitesse de dissociation k _{off) et} <n _blanchir>, la valeur moyenne du nombre d'observations avant le blanchiment se produit .

Ainsi, le calcul de la valeur moyenne <n (t _{de latence)>} pendant au moins deux valeurs de t <n _blanchir> et T pour _off.

L'extraction de valeurs synaptiques 2D-K _D par des mesures sur la base de FRET-

Mesure TCR occupation d'un, à savoir le rapport entre le TCR et TCR consolidés totaux, est essentiel pour la détermination des valeurs synaptiques 2D-K _D. Selon l'équation 4 ce terme est directement proportionnelle à la mesure FRET céder tant que TCR sert donateurs et pMHCs comme accepteurs FRET FRET.

avec une occupation = TCR, C = facteur de conversion

C est une constante qui dépend du système de FRET et les fluorophores utilisés. Il peut être déterminé expérimentalement, comme indiqué ci-dessous. un peut être converti en un 2D-K _D conformément à l'équation 5 lorsque ledensité initiale de ligands de TCR avant l'addition des cellules T à la bicouche est connue. Ceci est dû à la forte mobilité des protéines SLB-jointes et aussi parce que SLBS fournir un réservoir presque inépuisable de ligands ^2.

avec _[initial pMHC] = densité initiale de pMHC avant l'addition des cellules T

Avec équations 4 et 5, on peut maintenant facilement déterminer la synaptique 2D-K _{D entre} TCR et pMHC. Ceci est le plus fiable fait avec des mesures de FRET à base de récupération de donneur après accepteur blanchiment (voir la section de protocole 3.1).

Cependant, pour mesurer C la relation entre l'intensité de FRET je _FRET (corrigé pour le fond, FRET bleedthrough donneur et accepteur FRET croix-excitation) et TCR occupation A doit être déterminée. Pour cela, unea besoin de connaître le rapport R entre l'intensité de fluorescence moyenne de fluorophores simples TCR-associés FRET donateurs (par exemple Cy3 ou AF555) sm je _{donneur de FRET} et l'intensité moyenne de la molécule unique FRET événements sm i _FRET. R dépend du système de FRET en question, les filtres d'émission et de la caméra utilisée pour la détection de fluorescence.

Le TCR OCCUPATION un peut alors être directement déterminé selon l'équation 6.

avec R = sm je _{donneur de FRET} / sm je _FRET

R a été déterminée comme 1,45 pour le système H57 scFv Cy3 / Cy5-pMHC conduit à:

a = vrac je _FRET / vrac je _TCR-cy3 • 1,45

La relation entre le taux d'occupation des TCR a et le rendement de FRET peut être déterminée par FRET donneur récupérery accepteur après blanchiment. Pour ces deux paramètres sont tracés les uns contre les autres pour un certain nombre de TCR microamas comme représenté sur la figure 4A .La pente de la régression linéaire indique le facteur de conversion C (à partir de l'équation 4).

Comme le montre la figure 4A, C représente pour (a) le scFv _V H57 - Cy3 / Cy5-pMHC système FRET et (b) la configuration du système de microscope appliqué à 1,995. Le TCR occupation d'un peut être facilement déduit comme suit:

Occupation du TCR a = FRET céder • 1.995

Protocol

1. Production de Protéines

1.1. Bicouches-résident protéines: B7-1, ICAM-1, pMHC (par exemple, IE ^k / peptide)

1. -12H B7-1, ICAM-1-12H
   1. B7-1-12H Express et constructions d'ICAM-1-12H en grandes quantités sécrétées natives que des protéines en utilisant un système d'expression de baculovirus.
   2. Purifier des protéines à partir des surnageants de culture par Chromatographie d'affinité Ni-NTA, puis par Chromatographie d'échange d'anions MonoQ et Chromatographie d'exclusion de taille S200.
   3. Attribuer une aliquote de la protéine purifiée avec des colorants réagissant avec les amines tels que NHS-ester de succinimidyle préparations de Alexa Fluor 488 (ou FITC), Alexa Fluor 555 (ou Cy3), Alexa Fluor 647 (ou Cy5).
   4. Après chromatographie d'exclusion de taille S200 déterminer le degré de protéines monomériques selon les caractéristiques du colorant produit étiquetage en comparant l'absorption de protéine à 280 nm et l'absorption de colorant à 488 nm (Alexa Fluor 488, FITC), 555 ou 552 nm(Alexa Fluor 555 ou Cy3) ou 647 nm (Alexa Fluor 647 ou Cy5).
      Remarque: Ce ratio sera nécessaire par la suite pour déterminer la densité de la protéine sur SLB à partir du signal de fluorescence plus grande partie de la protéine marqué par un colorant.
   5. Stocker les protéines non marquées et marqué par un fluorophore à -20 ° C dans du PBS plus 50% de glycerol.
2. pMHC (ici: IE ^k -2x6H ou IE ^k -12H)
   1. Replier le CMH de classe II à partir de corps d'inclusion exprimés dans E. coli en présence d'un substitut du peptide clivable beaucoup moins cher aux UV, qui peut être ensuite quantitativement échangé avec un peptide conjugué à un fluorophore de choix ^{5, 7.}
   2. Purifier complexes pMHC repliée par des techniques classiques (chromatographie Ni-NTA-affinité, chromatographie d'échange d'anions MonoQ, S200 filtration sur gel).
   3. Échanger les UV peptide clivable avec le peptide fluorescent ^{5, 7.}
   4. Purifier fluorescent monomère pMHC complexes fnfin par filtration sur gel S200. Un chromatogramme représentatif est montré sur la figure 3.
   5. Vérifiez quantitative peptide chargement par spectrophotométrie.
   6. Protéines de conserver à -20 ° C dans du PBS / glycérol à 50%.

1.2. Génération de fragments de chaîne unique d'anticorps (SCF _V s), l'introduction de cysteines pour l'étiquetage spécifique au site

1. Replier scF _V s des corps d'inclusion exprimées dans E. coli. Voici un protocole conçu par Tsumoto et ses collègues ⁸ est suivi dans lequel les corps d'inclusion sont d'abord déroulée dans 6 M de chlorure de guanidinium, entièrement réduite et ensuite replié dans le cours d'une semaine par progressivement la diminution de la concentration du chlorure de guanidinium protéine-déploiement.
2. Concentrez-vous correctement plié scF _V en utilisant les unités de filtration moléculaire avec une coupure moléculaire de 10 kDa.
3. On purifie le concentré par filtration sur gel S200.
4. Étiqueter monomère scF phosphine (TCEP) avec Alexa Fluor 647 immédiatement après purification. Effectuer la réaction de marquage au mieux un rapport molaire protéine: colorant de pas plus de 1: 2 à température ambiante pendant pas plus de 2 heures.
   Remarque: le TCEP est un agent de réduction à base de phosphore et ne réagit pas avec des maléimides à ces concentrations ^9. Il peut donc être présent pendant la réaction de marquage afin de maintenir le groupe sulfhydryle non apparié réduit jusqu'à ce qu'il réagit avec le dérivé de colorant maléimide.
5. Purifier monomère scFv marqué _V enfin par gel filtration S75. Un chromatogramme représentatif est montré sur la figure 3.
6. Déterminer la teinture: rapport de protéine par spectrophotométrie.
7. Protéines de conserver à -20 ° C dans du PBS / glycérol à 50%.

2. Mesures calcium Flux

1. Prenez un flacon frais contenant 50 pg Fura-2-AM et dissoudre dans 50 pi de DMSO sans eau.
2. Isoler 10 ⁶ cellules T dans un tube à fond rond de 5 ml polypropylène pendant 2 min à 250-400 g.
3. Resuspendre les cellules T dans le milieu de l'imagerie de 200 pi contenant solution saline équilibrée de Hank plus calcium / magnésium et 1% d'ovalbumine à la température ambiante, ajouter 1 pl du-AM Fura-2 solution stock (dilution 1: 200), mélanger la suspension de cellules et incuber à température ambiante pendant 30 min.
4. Laver les cellules T une fois dans du tampon d'image. Pour cela, remplir le tube contenant les cellules avec du tampon de formation d'image à la température ambiante et culotter les cellules comme décrit dans l'étape 2. Enlever le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 200 de tampon de formation d'image ul (par exemple, à une densité cellulaire finale de 5 x 10 ⁶ cellules ml ^-1). Les cellules peuvent être utilisées immédiatement pour les mesures de calcium ou stockés sur de la glace pendant jusqu'à 3 heures.
5. La place des cellules sur une SLB fonctionnalisés dans un tampon d'imagerie (37 ° C). Dès que les cellules T commencer à contacter le SLB, d'acquérir l'ensemble des images ci-dessous toutes les 15 à 30 secondes pendant 30 min:
   excitation à 340 +/- 5 nm, la détection de l'émission à 510 +/- 40 nm
   excitation à 380 +/- 5 nm, la détection de l'émission à 510 +/- 40 nm
   DIC (facultatif)
   Remarque: Les durées d'exposition respectives dépendent de l'intensité de la source de lumière d'excitation. Des résultats satisfaisants sont obtenus lorsque les intensités des pixels de 340 nm (380 nm) de quantité de canal à environ un quart (la moitié) de la valeur maximum possible d'intensité. Gardez à l'esprit que les valeurs Fura-2 excités à 340 nm vont augmenter et ceux excité à 380 nm vont diminuer lors de l'activation des cellules T.
6. 20-25 min dans la course, ajouter 50-100 ul de l'anticorps anti-pMHC préchauffé blocage à une concentration finale de 20-50 pg ml ^-1. L'anticorps sature tous pMHCs et comme une conséquence des cellules T va cesser de reconnaître l'antigène et arrêter fluxant calcium. Continuer l'enregistrement d'images pour un autre 5 - 10 min. D'acquérir la ligne de base de la concentration de calcium intracellulaire, ce qui correspond à l'état non-activé des cellules T < / li>
7. Déterminer le signal moyen de fluorescence de fond à 340 nm et 380 nm excitation dans une région d'intérêt d'au moins 1000 pixels, qui ne contient pas de cellule. Background-soustraire tous Fura-2 images mesurées excités à 340 nm et 380 nm et 340 nm calculer / 380 rapports d'intensité nm des cellules individuelles ou un groupe de cellules. Normaliser rapports d'intensité en divisant tous les rapports à travers le rapport entre les cinq trames dernière fois (à savoir, avec toutes les anticorps blocage du pMHC).
8. Terrain normalisée Fura-2 ratios contre le temps. Remarque: Lorsque les cellules et bicouches sont en bon état, des ratios d'intensité nm Fura-2 340 nm / 380 adopter des valeurs généralement entre 2 et 5, 15-45 sec après que les cellules ont pris contact avec la bicouche. Ratios tombent alors à une valeur entre 1,6 et 2 où ils restent constants pendant au moins 20 minutes ou plus. Les valeurs devraient tomber à 1 qu'après l'addition d'anticorps anti-pMHC. Un exemple typique est représenté sur la Figure 5.

"> 3. Vrac FRET Mesures

3.1. TCR avec la décoration H57scF _V

1. Isoler 10 ⁶ cellules T dans un tube à fond rond de 5 ml polypropylène pendant 2 min à 250-400 g.
2. Décanter les médias, feuilletez le culot cellulaire en douceur et ajouter 0,3 pi de SCF _V (concentration ~ 1 mg / ml) à la suspension cellulaire. Pour en vrac FRET mesures emploient seulement marqué par un colorant scFv. Pour seule molécule FRET mesures utilisent un mélange de non marqué scFv (5 à 9 parties, ne contient pas de cystéine non apparié) et marqué par un colorant scFv (1 partie, contient un résidu cystéine de colorant couplé non apparié).
3. Incuber les cellules sur de la glace pendant 15 minutes et laver les cellules deux fois par centrifugation successives en utilisant un tampon d'imagerie glacée.
   Note: Les cellules peuvent être stockées sur la glace sans perte significative de borne scF _V (t _1/2 de SCF _V dissociation à 0 ° C ~ 4 h ^2). La pureté des cellules T primaires dérivées de TCR-transgéniques (et éventuellement aussi chiffonniers1/2 souris déficientes) et stimulées in vitro est supérieure à 98% car les lymphocytes T sont les seules cellules qui prolifèrent (jusqu'à 7 divisions cellulaires) en réponse au peptide, qui a été ajouté à la culture à la stimulation des lymphocytes T. Cellules B subissent une apoptose et ne sont plus en vie après 7-10 jours de culture. Quelques cellules dendritiques survivent encore peuvent être facilement discriminées non seulement en raison de leur morphologie distincte mais aussi parce qu'ils ne se lient pas l'anti-TCR beta fragment scFV H57.

3.2. FRET mesure par la reprise des donateurs après accepteur blanchiment

Remarque: Gardez à l'esprit que la demi-vie des complexes _V TCR-H57 SCF élève à 4 h sur de la glace, à 50 min à 22,5 ° C et à 6,8 min à 37 ° C (et à environ 4 h sur de la glace) ^2. Tant que le scFv H57 _V sert de donneur de FRET, les rendements de FRET mesurées ne sont pas sensibles à H57 scFv _V dissociation, cependant, le rapport signal à bruit augmenteà une augmentation de la dissociation de H57.

1. Préparer un SLB contenant AF647 / pMHCs Cy5 ainsi que non marquée ICAM-1 et B7 selon Axmann et al. ^4.
2. Remplacer le PBS de la chambre de formation d'image avec un milieu de formation d'image contenant une solution plus calcium / magnésium et 1% d'ovalbumine saline équilibrée de Hank. Pour cette pipette 400 pi de tampon d'imagerie dans le puits, mélanger soigneusement et retirez 400 pl du puits. Répétez cette procédure 3-4 fois. Ne pas exposer le SLB à l'air à tout moment.
3. Placer la chambre de l'imagerie sur la platine du microscope et de la mise au point jusqu'à ce que le fluorescent (AF647, Cy5) SLB est en vue claire.
4. Mettre en place éclairage TIRF en traduisant le faisceau focalisé parallèle à l'axe optique à la périphérie du plan focal de l'objectif par l'intermédiaire de l'étage de translation en mouvement de la périscope.
5. Pour affiner les faisceaux laser d'excitation en mode FRBR, ajouter les cellules T décorées avec AF555 / Cy3 marqué scF _V
6. Acquérir les six images suivantes dans l'ordre indiqué et en succession rapide (figure 6):
   (i1, en option) de la lumière blanche, pour prendre une image de la cellule,
   (i2, en option) 647 nm excitation (basse consommation) pour prendre une photo de l'accepteur de FRET (pMHC) avant l'impulsion de l'eau de Javel,
   (i3) 514 nm excitation (de faible puissance) de prendre une image du donneur FRET (TCR) avant l'impulsion de l'eau de Javel,
   (i4) 647 nm excitation (haute puissance) à la photo-eau de Javel l'accepteur de FRET, /> (I5) 514 nm excitation (basse consommation) pour prendre une image du donneur FRET (TCR) suivant l'impulsion de l'eau de Javel,
   (i6) 647 nm excitation (basse consommation) pour vérifier complète blanchiment d'accepteur FRET.
7. Conserver le temps écoulé entre les images (i3) et (i5) aussi court que possible afin de pouvoir corréler les images pour une analyse ultérieure. Gardez donneur de FRET blanchiment au minimum en employant l'excitation au niveau de puissance le plus bas possible, ce qui permet encore pour l'imagerie appropriée des T-cellules.
8. Choisissez une région d'intérêt (ROI), par exemple, toute une synapse ou un Microcluster de TCR individuelle, de déterminer son intensité moyenne (i3) (= _{I (3))} et (i5) (= _{I (5)).} Pour la soustraction de fond, choisissez un retour sur investissement de la même dimension à l'extérieur du point d'illumination à (3) ou (5) et de déterminer son intensité moyenne _{(I (arrière-plan)).} Pour déterminer le rendement de FRET effectuer l'opération suivante:
   g "/> (équation 7)
   Remarque: Il est à noter que par rapport au niveau de FRET absolue, il peut être nécessaire de corriger pour le blanchiment donneur entre images (i5) et (i3).

3.3. FRET mesure par émission sensibilisée

1. Effectuer donneur et l'alignement spatial du canal d'accepteur avec l'utilisation de billes multicolores, qui sont fluorescents dans tous les canaux d'émission. Le décalage spatial entre les deux canaux en raison de l'aberration chromatique peut être déterminée par des billes individuelles super positionnement et doit être appliquée pour la correction de l'un des deux canaux pour tous les 2 couleurs ¹⁰ paires d'images suivantes.
2. Déterminer le degré de donneur bleedthrough avec l'utilisation d'un SLB contenant le fluorophore donneur de FRET seul. Il est également possible d'utiliser des cellules T FRET donneur marqués sur une bicouche lipidique avec pMHC non marqué. Contexte est d'abord déterminé en dehors du champ de vue éclairé et ensuite soustraite de deux canaux. De cette façon, le ba moyenne intensités de ckground corrigée de deux ROI correspondant _{(canal des bailleurs de fonds} I et I _{accepteur canal)} sont déterminés. Calculer le coefficient bleedthrough (BTC) comme suit:
   (équation 8)
   Note: Ce BTC est une constante pour un certain colorant et jeu de filtres-combinaison.
3. Calculer l'image FRET bleedthrough des bailleurs de fonds comme suit:
   (équation 9)
4. Déterminer accepteur contre-excitation en excitant un SLB contenant le fluorophore accepteur de FRET seul (par exemple, IE ^{k /} MCC-Alexa Fluor 647) d'abord avec FRET donneur excitation lumineuse (par ex., 514 nm) et ensuite avec accepteur d'excitation lumineuse (par exemple, 647 nm). Utiliser les images de fond soustrait l'intérieur du canal d'accepteur FRET pour calculer le coefficient contre-excitation (CCE) comme suit:
   ftp_upload / 53157 / 53157eq10.jpg "/> (équation 10)
5. Comme le CEC dépend de l'intensité du laser utilisé pour l'excitation donneur, déterminer sur chaque jour de mesure. Utilisez la CCE résultant de calculer l'image uniquement généré par cross-excitation.
   (équation 11)
6. Calculer l'image FRET corrigé pour bleedthrough et cross-excitation comme suit:
   (équation 12)
   Note: signal de FRET absolu (mais pas le rendement relatif de FRET) est sensible à la dissociation de l'H57 scFv _V de membrane de cellules T TCR lié. Pour éviter une perte excessive de la sonde FRET TCR, le but d'effectuer des mesures à 37 ° C dans les 2 premières minutes après l'addition des cellules T à la bicouche. Mesures avec quantitative (≥ 95%) l'étiquetage des TCR ne sont possibles à ou en dessous de 22,5 ° C dans les 3 premières minutes aprèsaddition des cellules T à la bicouche.

4. Les mesures molécule unique FRET

1. Ajuster la puissance de deux lasers pour donner lieu à une intensité de 5.1 kW / um ² à l'échantillon. Pour plus d'informations s'il vous plaît se référer à Axmann et al. ^4.
2. T-cellules d'étiquetage décrites ci-dessus avec un mélange de non marqué scF _V (5-9 pièces) et Cy3 / AF555 marqué scF _V (partie 1). Remarque: De cette façon, seulement une fraction de TCR est marqué avec le FRET donneur. Cela réduit le nombre d'interactions détectables, mais le bruit généré par les donateurs bleedthrough est également diminué de manière significative (de l'ordre de 5 à ¹⁰ 1/2 ^1/2), ce qui est essentiel lors de la résolution individuelle seule molécule FRET événements.
   Remarque: La dissociation de la sonde H57 scFV du TCR ne modifie pas les mesures, comme cela se produit dans un éventail beaucoup plus large de temps (minutes à quelques heures) que la dissociation du TCR du SLB lié pMHC (sous-seconde en secondegamme).
3. Placer une SLB avec pMHCs de AF647 marqué ainsi que ICAM et B7 sur la platine du microscope et de la mise au point de sorte que la bicouche est en vue claire.
4. Facultatif: Insérer une ouverture de fente dans la voie d'excitation (comme représenté sur la Axmann ⁴ et coll.) Pour masquer la majeure partie du champ d'illumination à l'exception de la synapse. De cette façon, écrus IE ^{k /} MCC (C) -Alexa Fluor 647 FRET molécules accepteurs peuvent se déplacer dans la zone d'éclairage.
5. Ajouter les cellules T décorées H57 scF _V à la bicouche (avec un tampon d'imagerie), et attendre que les synapses apparaissent dans le champ de vision.
6. Prenez en succession rapide d'une séquence de 10 à 20 ensembles d'image en utilisant la détection de 2 couleurs:
   i1) 514 nm excitation
   i2) 647 nm excitation
7. Exposer des images de 1 à 5 ms et d'acquérir un ensemble d'images.
8. Pour évaluer l'identité de molécule unique FRET événements, appliquer la même correction concernant bleedthrough de donneur et accepteur croix-excitetion. En outre, seule molécule FRET événements ont pour aligner avec les molécules d'accepteurs simples et devraient apparaître et disparaître en une seule étape (voir également la figure 7).
9. Off-taux détermination
   1. Traces record de molécule unique FRET événements pour plusieurs délais d'acquisition.
      Remarque: Dans cet exemple (en italique), la vitesse de dissociation entre le 5c.c7 TCR et IE ^k / K3 est mesurée à 25 ° C avec quatre moments différents de retard (42 ms, 490 ms, 1007 ms, 1989 ms).
   2. Liste FRET retrace en fonction de leurs longueurs de trace, comme indiqué dans le tableau 1.
   3. Convertir le tableau 1 dans une fonction de décroissance cumulative inverse (tableau 2) comme indiqué (numéros colorés sont prises à partir du tableau 1).
   4. Pour normaliser la fonction de décroissance résultant, diviser le nombre de traces du tableau 2 par la somme de toutes les traces dans ce groupe particulier. Tracer les valeurs normalisées par rapport au nombre de trames temporelles. Lorsque omettant le dernier laps de temps, qui contient un zéro, les caries peuvent être luesily équipé d'une fonction exponentielle simple (figure 8A).
   5. Comme le montre la figure 8B, tracer la valeur moyenne <n (t _{de latence)>,} à savoir, l'inverse négatif de l'exposant de la fonction de décroissance déterminé ci-dessus contre le t _{décalage dans le temps} de retard employée (dans cet exemple: x = t _lag = 0,042 s et y = <n (t _lag)> = 1 / 0,662 = 1,511, x = 0,49 s et y = 1 / 0.902 = 1.101, x = 1.007 s et y = 1 / 1,131 = 0,884, x = 1.989 s et y = 1 / 1,591 = 0,629).
   6. Fit τ _off et <n _blanchir> basé sur l'équation 3. Cela peut être fait en utilisant une fonction de montage non linéaire d'un programme d'analyse des données scientifiques comme origine.
      Remarque: Le meilleur ajustement montré dans cet exemple donne un τ _off de 2,12 +/- 0,23 s et un <n _blanchir> de 1,53 +/- 0,06 sec.
   7. Calculer le half la vie de l'interaction t _{1/2 off} avec _1/2 t _{off =} τ _off • ln (2) (dans cet exemple: 1,47 s).
10. Détermination 2D-K _D
    1. Déterminer le facteur de conversion C pour la paire de FRET colorant utilisé avec l'utilisation de l'équation 6 et comme indiqué plus haut (figure 4A).
    2. Déterminer les rendements de FRET pour TCR microamas individuels ou synapses entières (figures 3B et 5).
    3. En utilisant l'équation 4 convertir tous les rendements de FRET individuels dans les occupations TCR (figure 4C).
    4. Appliquer l'équation 11 pour convertir tous les usages TCR en 2D-K _D s. Comme il est indiqué ci-dessous, la liaison synaptique est inhomogène. Une mesure significative pour synaptique K _D s est la médiane (indiquée en rouge) de tous les microamas mesurée (figure 4D).
11. Calcul de la 2D-k _sur s
    1. Calculer k _avec la loi d'action de masse avec k = _k off _sur / K _{D et le} k déterminée expérimentalement _off et les valeurs K _D.
       Remarque: Le k synaptique _off pour l'expérience le montre la figure 4 (IE ^k / MCC interagir avec 5c.c7 TCR à 25 ° C) est de 0,41 ^s -1. D'où la parcelle K _D (Figure 4D) peut être converti en ak _{sur terrain} comme dans la figure 4E.

Representative Results

L'enregistrement du calcium intracellulaire via le colorant de calcium fura-2, ainsi que l'analyse cellulaire ultérieure pour vérifier l'activité de stimulation et donc la fonctionnalité de SLBS sont représentés sur la figure 4. Comme devient évident, les taux de calcium augmente dans les lymphocytes T (exprimée en normalisée Fura-2 340nm / 380nm rapport aux valeurs de base étant 1) immédiatement dès qu'ils installent sur les SLBS stimulatrices. Les taux de calcium retournent aux niveaux de référence peu de temps après l'addition d'un anticorps qui bloque pMHCs engagement du TCR et qui se termine activation des lymphocytes T.

La figure 6 représente une expérience typique impliquant FRET donneur de récupération après accepteur blanchiment, qui est utilisé pour mesurer les rendements de FRET et qui sert à calculer les valeurs 2D-K _{D (représentée} sur la figure 4). S'il vous plaît noter l'augmentation de l'intensité des donateurs FRET, qui représente TCR marqué par AF555, après l'ablation rapide et complète de l'un FRETespèces cceptor (ici: AF647 associé à pMHCs). De plus évident est la réduction solide dans le canal de FRET, à savoir le canal accepteur FRET FRET donneur sous excitation, après accepteur FRET blanchiment. Le signal restant à peine visible correspond à donneur de FRET bleedthrough. Rendements FRET dans TCR microamas individuels ou synapses entières sont calculés sur la base des valeurs indiquées d'intensité mesurées (figure 6B).

La figure 7 illustre une trajectoire et laps de temps d'une seule molécule événement FRET visible dans deux cadres temporels. Comme indiqué ci-dessus dans l'introduction de tels comportements est causée à la fois par la décomposition des synaptique TCR-pMHC contraignant et photoblanchiment. Pour la distinction entre ces deux contributions, les expérimentaux délais d'acquisition doivent être varié dans la durée: tout photoblanchiment reste une constante, les changements dans FRET longueur événement de trajectoire ne sont causées par la cinétique de liaison. Une quantification de tracelengths, w UEL constitue la base pour le calcul des taux et des effluents de blanchiment représentés sur la figure 7, sont fournis dans les tableaux 1 à 3.

Détermination de la 2D-K _D s nécessite l'enregistrement de gros rendements pour FRET FRET donateurs TCR étiquetés. Avec l'utilisation de la constante C expérimentalement déduite (figure 4), avec un rendement de FRET mesuré pour une Microcluster de TCR ou toute une synapse peut être converti en le TCR occupation a, à savoir, le rapport de TCR pMHC-activité et totales (Figure 4C) . Avec des densités pMHC connus présents sur le SLB avant l'addition de la cellule T, une des valeurs peuvent être appliquées pour déterminer les valeurs K synaptiques _{2D-D (Figure} 4D). Sur les taux peuvent être calculés avec la loi d'action de masse _(2D-K = _2D-k off / 2D-K _D) de la synaptique déterminée hors taux et les valeurs 2D-KD.

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Figure 1. Représentation schématique du système plane de verre supportée bicouche lipidique (SLB). (A) sont composés de SLBS POPC (90-99%) et le lipide synthétique DGS Ni-NTA (1-10%) et forment spontanément lorsque les surfaces de verre propres sont chargés de petites vésicules unilamellaires (SUV) constitué par les lipides correspondants. (B) Une fois formé, ces SLBS peuvent être fonctionnalisés avec des parties solubles dans l'polyhistidine marqués extracellulaires dérivées de co-stimulation B7-1, pMHCs protéines ICAM-1 et des protéines d'adhésion, pour servir de CPA pour les cellules T. Pour plus d'informations sur la préparation SLBS référer à Axmann et al. ^4. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figu re 2. Förster Resonance Energy basée sur le transfert de dosage pour quantifier la liaison TCR-pMHC in situ. (A) une structure composite d'un TCR complexé avec un fragment à chaîne unique H57 engager un pMHC illustre l'approche FRET décrit ici. Notez la courte distance d'environ 41a séparant les deux fluorophores correspondants subissant FRET. Sites accepteurs de fluorophores-maléimides sont indiqués en vert et rouge. (B) Le principe de la détection des interactions TCR-pMHC in situ est illustré. Seulement scF _V -decorated TCR et pMHCs (ici IE ^k), qui forment des complexes spécifiques, donner lieu à un signal de FRET mesurable. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 3. Les chromatogrammes de la dernière montée étape de filtration sur gel donnant de monomères scFv _V s et un peptide chargé IE ^k -2x6H molécules. Axes X représentent volume de rétention en ml axes Y indiquent l'absorbance à 280 nm en unités arbitraires (AU) . (A) H57 _V scFv spécifique de site marqué avec Alexa Fluor 555 maléimide a été soumis à une Chromatographie pour séparer S75 colorant qui n'a pas réagi à partir de la protéine (étape 1.2.5). Les fractions correspondant à l'intervalle de rétention 14 to15 ml (lignes pointillées) représentent étiquetés monomère H57 scF _V. (B), à savoir ^k molécules d'-2x6H complexés avec l'ANP espace titulaire peptide clivable-UV avait été irradiée aux rayons UV, incubées avec site spécifiquement Alex 647 maléimide peptide marqué et finalement soumis à une chromatographie pour séparer le S200 protéine de peptide libre (étape 1.1.2.4). L'intervalle entre les lignes pointillées contient correctement pliés et pMHCs monomères. (A, B) S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4. Déterminer 2D-K _D s et 2D-k _{sur l'art.} (A) La corrélation entre le rendement de FRET tel que déterminé par la reprise de donneur après accepteur blanchiment et l'occupation TCR a été mesurée expérimentalement. Occupation TCR peut être déterminée pour TCR microamas individuels comme expliqué dans la section 4.2. Un ajustement linéaire des données est indiqué par la ligne, dont la pente est égale au rapport entre C TCRoccupation et le rendement de FRET. C est une constante spécifique pour le système de FRET et les fluorophores (ici Cy3 et Cy5) employés. Dans cet exemple, il a abouti à 1.988. (B) FRET données de rendement ont été déterminées pour TCR microamas individuels (N = 187, la température = 24 ° C) grâce à la récupération des bailleurs de fonds d'accepteur blanchiment. Numéros ci-dessous barres de l'histogramme indiquent la limite supérieure dans l'intervalle. (C) Conversion des données présentées dans (B) en multipliant mesurée FRET rendements avec la constante C déterminée (A). Les nombres ci-dessous barres indiquent la limite supérieure dans l'intervalle. (D) de l'histogramme (semi-logarithmique, base = 4) représentant la distribution de 2D-K _D s, mesurée à microamas TCR individuels. La médiane 2D-K _D est indiqué en bleu. Les nombres ci-dessous barres indiquent la limite supérieure dans l'intervalle. (E) L'histogramme représenté en (D) a été converti intoa 2D-k _sur -histogram (semi-logarithmique, base = 4) employant le k synaptique _off pour 24 ° C (0,41 ^s -1). La 2D-k médian déterminé _{sur la valeur} est indiquée en bleu. Les données ont été initialement publiés dans Huppa et al. ^{2 et} sont visualisés ici dans un nouveau format. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5. validation fonctionnelle de SLBS employé pour la stimulation des cellules T et d'imagerie. (A) TCR transgéniques blastes de cellules T chargées de fura-2 ont été confrontés à de stimulation SLB hébergeant pMHCs antigéniques, ICAM-1 et B-7. Cellular Fura-2 émissions excité à 340 nm et 380 nm ainsi que des images DIC ont été enregistrées. Comme indiqué, les valeurs du rapport des intensités d'émission excités à 340 et 380 nm sont présentés dans le panneau de droite. Ajout de pMHC anticorps bloquant 14 min dans l'essai expérimental a entraîné une diminution des niveaux de calcium intracellulaires comparable à celle des cellules T au repos. (B) Un profil temporel typique de ratios de Fura-2 moyennes dans les cellules T en contact SLBS stimulation est caractérisé par une augmentation initiale dans un calcium intracellulaire qui est 2 à 4 fois plus élevée par rapport à celle des cellules T non activées ou des cellules T antigène après privées de blocage médiée par des anticorps. Les cercles verts indiquent les points de temps illustrés dans (A). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6. Bulk FRET rendements telle que mesurée par FRET récupération de donneur après FRET accepteur blanchiment. et al ^4). La ligne figurant dans l'image DIC de gauche indique la limite de la synapse des cellules T. Notez la perte d'intensité dans le canal de l'accepteur de FRET est ainsi l'augmentation de l'intensité dans le canal FRET donneur après FRET accepteur blanchiment (étape 4). (B) FRET efficacité peuvent être quantifiés comme indiqué pour les régions synaptiques individuels ou synapses entières. Pour l'inspection, les images avant et après FRET accepteur blanchiment sont présentés avec l'utilisation de deux tables de consultation (LUT, vert et physique). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 7. molécule unique FRET événements apparaissent et disparaissent étapes insingle et sont parfaitement alignés avec un seul fluorophore accepteur de FRET. Le laps de temps de la molécule unique événement FRET est représenté. Les images ont été acquises à l'aide d'une caméra EMCCD rétro-éclairé. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 8. Détermination τ _{off =} 1 / _k off de trajectoires de smFRET mesurées. (A) Les sommes cumulées normalisées de signaux de FRET observables (dérivés de H57 scF _V -AF555 décorées 5c.c7 TCR explosions cellules T transgénique reconnaissant IE <sup> k / K3-AF647 à 24 ° C) pendant quatre décalages de temps différentes (42 ms, 490 ms, 1007 ms, 1989 ms) ont été tracées en fonction du nombre total d'observations. Fonctions d'ajustement mono-exponentielle donnent lieu à correspondante l'inverse négative des valeurs moyennes <N (t _lag)>. (B) valeurs moyennes ont été tracées contre les retards t _{lag et} équipés en utilisant l'équation <n (t _lag)> = τ _{off /} {(T pour _{off /} <n _blanchir>) + t _lag} pour obtenir τ _off et <n _blanchir>. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Mesure interactions protéine-protéine in situ est très souhaitable en particulier lorsque le traitement avec des interactions de faible affinité tels que TCR-pMHC de liaison ^11. Ceci parce que le taux ainsi que sur la stabilité de ces interactions sont fortement influencés par les circonstances particulières dans lesquelles la liaison a lieu. Des approches d'imagerie à base de FRET mini-invasives sont donc en principe parfaitement adapté pour de telles tâches, mais impliquent un certain nombre d'obstacles qui doivent d'abord être surmontés. Le bruit généré par autofluorescence cellulaire limite la sensibilité des mesures et doit donc être maintenu à un minimum. Microscopie FRBR sert ce besoin très bien ¹² mais nécessite la fonctionnalisation de verre-diapositives, idéalement sous la forme d'un plan de verre soutenue bicouche lipidique décorée avec des protéines de choix ^13-15. Un autre avantage d'une approche en partie reconstitutive est que les partenaires de FRET bicouches-résident recombinants peuvent être beaucoup mle minerai facilement marqué dans un, spécifique au site de manière rationnelle et quantitative avec des fluorophores plus petits et plus lumineux que ce qui serait possible avec des protéines exprimées à la surface des cellules. TCR sont étiquetés avec SCF recombinant _V s, qui ne sont pas d'influence sur la reconnaissance des cellules T, comme cela a été précédemment testé ^deux. En outre, la composition protéique de la SLB, par exemple la densité de pMHCs et le choix des éléments accessoires peut être ajustée à ses besoins spécifiques. Nous avons déjà réalisé des expériences avec des densités de pMHCs stimulateurs varier, mais avons pas détecté de différences significatives en _2D-k off et 2D-K _D ^2.

Jusqu'à présent, ici la reconnaissance des molécules du CMH de classe II a été traitée avec seulement, principalement en raison de la nature de leur fente de liaison peptidique, qui est ouvert aux deux extrémités et reçoit donc des peptides plus grands, y compris un agent de liaison pour la fixation de fluorophore. Dans certains cas, cette approche pourrait également travailler pour l'étiquetage CMH class je molécules ^16, mais une grande prudence devraient être prises pour vérifier leur utilisation dans des expériences. La sensibilité des cellules T à l'égard des antigènes, qui peuvent être mesurés par des tests de prolifération des cellules T, ainsi que la cinétique de liaison pMHC-TCR telle que mesurée in vitro par résonance plasmonique de surface ne doit pas être affectée par l'addition de l'agent de liaison et un fluorophore à le peptide. Alternativement, CMH de classe I se molécules peuvent être étiqueté d'une manière spécifique au site avec l'introduction d'une cystéine non apparié dans la séquence de la chaîne lourde (observations non publiées).

Avec l'utilisation de sondes moléculaires appropriés toute interaction protéine-protéine synaptique peut en principe être étudié de façon que décrit ici. Ces sondes, par exemple, le SCF _V s ou des protéines Conçu Ankyrin de répétition (DARPins) ^17, devraient être monovalent et doivent lier leur cible de manière stable sans affecter l'interaction d'intérêt. Bien sûr, informatio structurellen est hautement souhaitable pour la conception de la sonde rationnelle mais pas absolument nécessaire. Lors de l'établissement d'une nouvelle paire de partenaires de FRET, il est recommandé d'enregistrer et d'analyser FRET en vrac premier. Les sites d'attachement de l'étiquette peuvent varier considérablement à maximiser le signal de FRET et aussi pour vérifier que les rendements mesurés FRET diffèrent en fonction de la distance inter-colorant. Une fois que le système est optimisé, seule molécule FRET signaux peuvent être enregistrés en limitant l'étiquetage de la forte abondance FRET partenaire à 10-30% et de blanchiment de la faible abondance FRET partenaire jusqu'à molécules simples peuvent être résolus dans le domaine de l'éclairage.

Last but not least, il convient de noter que SLBS rapprochant certains, mais pas tous les aspects d'une membrane plasmique physiologique. Des qualités telles que la courbure de la membrane et la flexibilité, domaine cloisonnement, réarrangements du cytosquelette et la motilité cellulaire ainsi que d'une grande variété de protéines membranaires exprimées en surface ne sont pas représentés par SLBS mais pourraient influencer til traiter sous enquête. Beaucoup d'efforts devront être investis pour établir des modalités d'imagerie qui permettent la surveillance interactions protéine-protéine avec une résolution de la molécule unique dans les synapses physiologiques, qui sont inaccessibles à l'imagerie de la FRBR.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
LB-media	Fisher Scientific	10000713	bacterial expression
Sf900 II	Life Technologies	10227402	insect cell media for baculo virus production
Insect-XPRESS with L-glutamine (Lonza)	Fisher Scientific	10564038	insect cell media for baculo virus expression
Sf9 cells	Life Technologies	11496-015	cells for virus production and expansion
High Five Cells	Life Technologies	B855-02	cells for potein expression
LB-media	Fisher Scientific	10000713	bacterial expression
Centramate System	Pall		protein concentartion from large volumes
Centramate cassette 10kDa cutoff	Pall	OS010T12	protein concentartion from large volumes
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units	EMD Millipore	UFC900308	protein concentartion
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units	EMD Millipore	UFC800308	protein concentartion
Amicon Stirred Ultrafiltration Cell Model 200 mL	EMD Millipore	5123	protein concentartion
Äkta pure 25L	GE Healthcare	29-0182-24	protein purification
Superdex 200 10/300 GL	GE Healthcare	17-5175-01	protein purification
Superdex 75 10/300 GL	GE Healthcare	17-5174-01	protein purification
Mono Q 5/50GL	GE Healthcare	17-5166-01	protein purification
Ni Sepharose 6 Fast Flow	GE Healthcare	17-5318-01	protein purification
Tricorn 10/20 column	GE Healthcare	28-4064-13	protein purification
Gilson HPLC system	Gilson		purificationof fluorochrome-coupled peptides
Pursuit XRs C18, 5 µm particle size, 21.2*250mm column size	Agilent	A6000250X212	purificationof fluorochrome-coupled peptides
Pursuit XRs C18, 5 µm particle size, 21.2*50 mm column size	Agilent	A6000050G212	purificationof fluorochrome-coupled peptides
Tricorn 10/20 column	GE Healthcare	28-4064-13	protein purification
Gilson HPLC system	Gilson		purificationof fluorochrome-coupled peptides
Pursuit XRs C18, 5 µm particle size, 21.2*250mm column size	Agilent	A6000250X212	purificationof fluorochrome-coupled peptides
Pursuit XRs C18, 5 µm particle size, 21.2*50 mm column size	Agilent	A6000050G212	purificationof fluorochrome-coupled peptides
Cy3 maleimide	GE Healthcare	PA23031	site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines
Cy5 maleimide	GE Healthcare	PA25031	site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines
Alexa Fluor 555 C2 Maleimide	Life Technologies	A-20346	site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines
Alexa Fluor 647 C2 Maleimide	Life Technologies	A-20347	site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines
Fura-2, AM, cell permeant	Life Technologies	F-1221	calcium-sensitive dye for cell labeling
dimethyl sulfoxide	Sigma Aldrich	151874	for dissolving fura-2 am
Hank's Balanced Salt Solution plus calcium/magnesium	Fisher Scientific	10225362	imaging buffer
PBS	Life Technologies	14190-136
Bovine Serum Albumin lyophilized powder	Sigma Aldrich	A2153	supplement for imaging buffer
14-4-4S antibody	affimetrix eBioscience	14-5980-81	blocking antibody for H2-I-Ek (recognized by the 5c.c7, 2B4 and AND TCR)
5 ml polypropylene round-bottom tube	Becton Dickinson	FALCON 352063
0.22 μm Ultrafree-MC centrifugal filter unit	EMD Millipore	UFC30GV0S
Syringe filter 0.2µm	Millipore	GVWP04700
TetraSpeck Microspheres, 0.1 µm, fluorescent blue/green/orange/dark red	Life technologies	T-7279
Microscope for fura-2-based calcium measurements	LEICA	DMI4000B
Microscope for (single molecule) FRET measurements	LEICA/ZEISS/NIKON/OLYMPUS	for details please refer to parallel JoVE contribution by Axmann et al.
planar supported lipid bilayers		for details please refer to parallel JoVE contribution by Axmann et al.
RPMI 1640, with L-Glutamine	Life Technologies	11554416	T-cell media
non-essential amino acid 100X	Hyclone	SH30238.01	T-cell media supplement
penicillin/streptomycin/L-glutamine 100x	Life Technologies	12000226	T-cell media supplement
2-mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M6250	T-cell media supplement
mouse interleukin-2 recombinant protein	BPS Bioscience	90185-B	T-cell media supplement
Research Grade Fetal Bovine Serum	Hyclone	SV30160.03	T-cell media supplement
Origin (analysis program)	OrigenLab	http://www.originlab.com/	non-linear fitting of two parameters (tauoff, [ntlag])