Måling TCR-pMHC Binding Published: October 30, 2015 doi: 10.3791/53157

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Markus Axmann¹, Gerhard J. Schütz¹, Johannes B. Huppa²

¹Institute for Applied Physics - Biophysics, Vienna University of Technology, ²Institute for Hygiene and Applied Immunology, Medical University of Vienna

Introduction

En mer grunnleggende forståelse av hvordan T-celler gjenkjenner antigener krever ser på riktig sted, det vil si innenfor den immunologiske synapse dannet mellom T-cellen og APC. Her blir molekylære bindingskinetikken ikke bare bestemt av de iboende biokjemiske egenskaper av interaksjonspartnere som er involvert, men avhenger i stor grad av celleparametere, som inkluderer cellekrefter, membran arkitektur og laterale interaksjonene mellom membranproteiner samt synapse-spesifikke geometriske begrensninger ^3. Biokjemiske fremgangsmåter er begrenset oppløsningsevne som de nødvendiggjør avbrudd av minst en av de synaptiske membraner som er involvert. Av denne grunn er et FRET-basert avbildning metode ble utviklet for å overvåke bindingen av TCR til antigeniske pMHCs ^2. Her T-celler er innredet med en rekombinant og site-spesifikt merket TCRβ-reaktivt enkelt kjede antistoffragment (SCF _V) og konfrontert med plan ar glass-støttet lipidbilag (SLBs), som rommer MHC klasse II molekyler lastet med en fluoresceinmerket antigen peptid, samtidig stimulerende molekyler og adhesjonsproteiner. Synaptic binding mellom dye-merket TCR og dye-merket pMHC resultater i slite, som kan overvåkes på en bulk og enkelt molekyl nivå av Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) mikroskopi.

I denne artikkelen er det forklart i detalj hvordan du kan utnytte SLBs for analyse av T-celle synapser, bekrefte sin integritet gjennom en funksjonell T-celle kalsium-flux analysen, oppførsel FRET målinger i bulk og med enkelt molekyl følsomhet, og analysere de innsamlede data. Anbefalingene tilbys for å produsere riktig dannet proteiner som kreves for dobbeltlag funksjon. For mer spesifikk informasjon om bilagsdannelse og oppsett av en egnet TIRF mikroskop henvises det til en ekstra offentlighet Jove publikasjon publisert rygg mot rygg ^fire.

telt "> Nature of SLBs

Functionalizable SLBs kan lett genereres fra unilamellære vesikler (SUV) som inneholder de to lipider 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-gylcero-3-fosfokolin (kort: POPC, 90-99%) og 1,2-dioleoyl- sn - glycero-3 - {[N (5-amino-1-karboksypentyl) iminodieddiksyre] succinyl} (kort: DGS NTA-Ni, 1-10%). SUVer spredt på rene glassplater for å danne en sammenhengende plan dobbeltlag ^fire. DGS-NTA-Ni tjener til å forankre polyhistidin-merkede proteiner via polyhistidin-mediert kompleksdannelse med det syntetiske NTA-Ni-inneholdende hodegruppe (figur 1A). For stabil assosiasjon en typisk erstatter den native transmembrandomenet og den cytoplasmiske hale av bindingsproteinet, ICAM-1 og kostimulerende molekyl B7-1 med en kode som inneholder tolv histidiner (ICAM-1-12H, B7-1 -12H) (figur 1 B) . Peptid-lastet klasse II molekyl IE ^k inneholder to-membran-embedded (α og β) polypeptidkjedes. De trans / cytoplasmatiske domener av begge kjedene må være erstattet med en kode som inneholder seks histidiner hver (IE ^k α _{6H 6H} β eller IE ^k -2x6H). Som et alternativ kan utvide α-kjede med tolv histidiner og forlater det ekstracellulære domene av den β-kjeden ukodet (som gir opphav til IE ^k α _12H β _0H eller IE ^k -12H) gir opphav til tilfredsstillende resultater (figur 1B).

Stedsspesifikk merking av pMHCs

Det er viktig å merke pMHC stoichiometrically og site-spesifikt for å kunne konvertere målt FRET avkastning til meningsfulle likevekts bindende konstanter. Dette kan oppnås ved kjemisk merking av et syntetisk peptid som er lastet inn i den peptid-bindende kløft av rekombinant histidin-merket MHC klasse II-molekyler ^2,5. Peptidet omfatter alle rester av T-celle-epitop som well som en kort C-terminal linker (GGS) etterfulgt av cystein (f.eks i møll cytokrom c (MCC) peptid ANERADLIAYLKQATK- GGSC, den linker er markert med fet skrift). Dette cystein blir brukt for å merke peptidet støkiometrisk med bruk av maleimid-fargestoff-derivater. På dette punktet ekstra omsorg bør være viet til å verifisere kvantitativ dye-kobling til cystein holdige peptid. HPLC-rensing av peptid-dye Adduktet er anbefalt og har å bli etterfulgt av elektrosprayionisering massespektroskopi. Ikke registrert masser svarende til det peptidet edukt (uten fargestoff) reflekterer ufullstendig merking. Hvis dette er sant, bør HPLC-renset peptid underkastes etterfølgende runder av fargestoffmerking til merking anses kvantitativt. Legg merke til at MALDI-TOF massespektroskopi må unngås, da denne metoden innebærer laserstråling for prøve ionisering. Denne behandlingen desintegrerer vedlagte sensitive fluoroforene før peptid massen blir lest ut og dermed underrepre senterer grader av dye-konjugering.

Indirekte ennå stedsspesifikk merking av celle-bundet TCR med bruk av monovalente enkeltkjede _{Fv-fragmenter}

Det er fortsatt utfordrende å feste fargestoffer til celleoverflaten assosierte proteiner av levende celler i en stedsspesifikk måte. For å overvinne dette hinderet for overflate utsatt TCR, har en mono enkelt kjede versjon (SCF _V) fra genene av TCRβ -reactive monoklonalt antistoff H57-197 ^to blitt konstruert. Krystallstrukturen av dette antistoff i kompleks med TCR gjør det mulig å rasjonelt å utforme en versjon, hvor en serinrest i umiddelbar nærhet til den C-terminale ende av MHC tilknyttede peptid (hvor den tilsvarende FRET partner fargestoff er festet til) er substituert for et cysteinrest. Denne mutant cystein da tjener som en akseptor for fargestoff konjugasjon (figur 2).

Metoder for å registrere FRET

nt "> Bulk FRET verdier er best egnet til å bekrefte forholdet mellom valgte inter-dye avstander og FRET effektivitet målt i denne TCR-pMHC bindende system ^to. I tillegg bulk FRET målinger avslører kvalitative og kvantitative forskjeller i synaptiske TCR-pMHC slektskap ( se nedenfor og protokoll pkt 3.2). Ulike metoder for å kvantifisere FRET effektivitet har blitt introdusert i litteraturen ^6. I denne artikkelen FRET registreres via

(a) donor gjenoppretting etter akseptor bleking, og via

(b) sensitivisert FRET akseptor utslipp.

Den første metoden (a) krever bruk av et FRET-akseptor som lett kan photobleached, og en donor, som er ganske fotostabile. I tillegg er det viktig å sikre at photobleached akseptor er ikke lenger i stand til å slukke donor fluorescens. Som det samme deteksjonskanal (donor) anvendes for kvantifisering, faktorer ingen korreksjon end ingen kromatiske avvik må vurderes, noe som gjør denne metoden enkel og pålitelig. Imidlertid kan kvantitative målinger ikke gjentas på samme prøven spot og endringer i FRET kan ikke tas opp over tid. For å unngå effekter forårsaket av molekylær diffusjon eller cellulær motilitet et fast bleketrinn bør være rettet for, noe som minimaliserer den tid som går mellom den første FRET donor (før akseptor bleking) og den andre FRET donor bildeopptak (etter FRET akseptor bleking). Det er anbefalt å anvende en kraftig laserlyskilde av FRET akseptor eksitasjonsbølgelengden for å minimere belysning og bleketider.

I motsetning til dette, på tilnærmingen av sensitivisert FRET emisjonsmåling (b) FRET donor er spent og utslipp av den FRET akseptor er observert i FRET akseptor kanalen. Endringer i FRET akseptor signal kan tas opp over tid, men utslipp av FRET donor inn i den rød-skiftet akseptor kanal (termed bleedthrough) og FRET akseptor cross-eksitasjon via donor eksitasjon må være nøyaktig bestemt og trekkes fra den registrerte FRET akseptor kanal. For dette de tilsvarende FRET donor og gnage akseptor bildene må romlig justert.

Påvisning av enkelt molekyl (sm) FRET hendelser

Med bruk av lasere som eksitasjon kilde, et følsomt kamera og støydempet TIRF mikros fluorescensen av enkelt fluoroforer lett kan spores over tid. Lignende er sant for påvisning av inter smFRET hendelser. Imidlertid kan komplikasjoner være forårsaket av FRET donor bleedthrough og tverr magnetisering av FRET akseptor, og dermed stor forsiktighet ved justering fluoroforen tettheter i smFRET eksperiment for å bli tatt.

I protokollen nedenfor (protokoll seksjon 4) ble TCR valgt som FRET donor i høy overflod og pMHC som FRET akseptor i lav overflod. Å dempe FRET donor bleedthrough tilstrekkelig, dekorere 10-30% av TCR med fluorescerende SCF _V og 90-70% av TCR med ikke-fluorescerende SCF _V. Her gnage akseptor kanalen ble valgt som eneste molekyl kanal fordi det er konfokalt med enkelt molekyl FRET kanal. Dette bidrar til å justere smFRET hendelser med enkelt molekyl FRET-akseptorer, som er grunnlaget for smFRET validering.

Utpakking synaptiske off-priser gjennom smFRET målinger

Bleking av både FRET donor og FRET akseptor må gjøres rede for når utpakking av halveringstiden for interaksjoner fra enkelt molekyl FRET spor. Antallet observer FRET-signaler ved begynnelsen av sitt utseende som enkelt donor-akseptor paret N (0) reduseres over tid ved begge uforpliktende av reseptor-ligand-kompleks og fotobleking. Antallet overlevende komplekser på et gitt tidspunkt N (t) kan matematisk uttrykkes som følger:

I bleking uttrykket exp (-t / τ _blekemiddel) tiden t er beskrevet av produktet av antall observasjoner n og belysningstiden t _ill på grunn av den ikke-kontinuerlige, diskret observasjon modus (dvs. bleking forekommer bare under belysningen ). Innenfor den kinetiske uttrykket exp- (t / τ _av) tiden t er produktet av antallet observasjoner n og _{tidsforsinkelsen} t for en enkelt observasjon FRET (dvs. det skjer kinetisk uforpliktende kontinuerlig). Ligning 1 kan uttrykkes som:

Begrepet τ _bleike / τ _syk describes antall observasjoner til bleking finner sted, og er definert som forventningsverdien <n _bleke> av sin eksponensielle funksjon. Likning 2 kan forenkles som følger:

Forventningsverdien <n (t _lag)> av det antall rammer N (t) med observer FRET-hendelser etter tiden t er direkte bestemt fra forsøket. Det avhenger av innstillbar tid mellom observasjoner (t _hylse) valgt i eksperimentet og de ​​ukjente verdier for τ _{av (den} inverse av off-rate k _off), og <n _bleker>, forventningsverdien av antall observasjoner før bleking skjer .

Således beregning av forventningsverdien <n (t _lag)> i minst to verdier av t <n _bleke> og ź _av.

Utpakking synaptiske 2D-K _D verdier gjennom FRET baserte målinger

Måling TCR et belegg, dvs. forholdet mellom bundet TCR og total TCR, er sentralt for bestemmelse av synaptiske _{2D-K-D-verdier.} I henhold til ligning 4 dette begrepet er direkte proporsjonal med den målte gnage utbytte så lenge TCR tjener som FRET givere og pMHCs som FRET akseptorer.

med a = TCR belegg, C = omregningsfaktor

C er en konstant, som avhenger av systemet og FRET fluoroforene brukt. Det kan bestemmes eksperimentelt, som vist nedenfor. en kan omdannes til et 2D-K _D i henhold til ligning 5 nårinitial densitet på TCR ligander før tilsetning av T-celler til dobbeltlaget er kjent. Dette er på grunn av den høye mobilitet av SLB-tilknyttede proteiner og også fordi SLBs gi en nesten uuttømmelig reservoar av ligander ^2.

med [pMHC _initial] = initial densitet på pMHC før tilsetning av T-celler

Med ligninger 4 og 5 kan man nå enkelt finne den synaptiske 2D-K _D mellom TCR og pMHC. Dette er mest pålitelig gjort med FRET målinger basert på donor gjenoppretting etter akseptor bleking (se protokoll avsnitt 3.1).

Men for å måle C-forholdet mellom intensiteten I _FRET FRET (korrigert for bakgrunn, FRET bleedthrough donor og akseptor FRET kryss-eksitasjon) og TCR et belegg skal bestemmes. For dette, entrenger å vite forholdet R mellom gjennomsnittlig fluorescens intensitet av enkelt TCR-forbundet FRET giver fluoroforene (f.eks Cy3 eller AF555) sm jeg _{FRET donor} og gjennomsnittlig intensitet enkelt molekyl FRET hendelser sm jeg _gnage. R er avhengig av FRET system, for emisjonsfiltre og kamera som brukes for fluorescensdeteksjon.

TCR belegget en kan deretter bli direkte bestemt i henhold til ligning 6.

med R = sm jeg _{FRET donor} / sm jeg _FRET

R ble bestemt som 1,45 for H57 scFv- Cy3 / pMHC-Cy5 system fører til:

a = bulk jeg _FRET / bulk jeg _TCR-Cy3 • 1,45

Forholdet mellom TCR belegg en og FRET utbytte, kan bestemmes ved FRET donor gjenopprettey etter akseptor bleking. For dette begge parametere er plottet mot hverandre for et antall TCR microclusters som vist i figur 4A sikret helningen av den lineære tilpasning angir omregningsfaktoren C (fra ligning 4).

Som vist i figur 4A, utgjør C for (a) H57 SCF _{V -} Cy3 / pMHC-Cy5 FRET system og (b) den påførte mikroskop systemkonfigurasjon til 1,995. TCR belegget en lett kan utledes som følger:

TCR belegg a = FRET gi • 1,995

Protocol

1. Protein Produksjon

1,1. Bilag-resident proteiner: B7-1, ICAM-1, pMHC (f.eks IE ^{k /} peptid)

1. B7-1 -12H, ICAM-1-12H
   1. Express B7-1-12H og ICAM-1-12H konstruksjoner i store mengder som utskilles native proteiner ved hjelp av et baculovirus uttrykk system.
   2. Rense proteiner fra kultursupernatanter via Ni-NTA affinitetskromatografi, etterfulgt av MonoQ anionbytterkromatografi og S200 størrelseseksklusjonskromatografi.
   3. Merke én porsjon av det rensede protein med amin reaktive fargestoffer som NHS succinimidyl-ester preparater av Alexa Fluor 488 (eller FITC), Alexa Fluor 555 (eller Cy3), Alexa Fluor 647 (eller Cy5).
   4. Etter S200 størrelseseksklusjonskromatografi bestemme graden merking av monomere proteiner i henhold til den fargestoff-produsentens spesifikasjoner ved å sammenligne protein absorpsjon ved 280 nm og fargestoffet absorpsjon ved 488 nm (Alexa Fluor 488, FITC), 555 eller 552 nm(Alexa Fluor 555 eller Cy3) eller 647 nm (Alexa Fluor 647 eller Cy5).
      Merk: Dette forhold vil senere bli nødvendig for å bestemme proteintettheten på SLB fra bulk fluorescenssignal av fargestoff-merket protein.
   5. Lagre de umerkede og fluoroforen-merkede proteiner ved -20 ° C i PBS pluss 50% glycerol.
2. pMHC (her: IE ^k -2x6H eller IE ^k -12H)
   1. Refolde MHC klasse II fra inklusjonslegemer uttrykt i E. coli i nærvær av en mye billigere UV-spaltbare peptid-erstatning, som senere kan kvantitativt utveksles med en fluorofor-konjugert peptid valg ^{5, 7.}
   2. Rens refoldet pMHC komplekser ved hjelp av standardteknikker (Ni-NTA-affinitetskromatografi, MonoQ anionbytterkromatografi, S200-gel-filtrering).
   3. Utveksle UV spaltbare peptid med fluorescerende peptid ^{5, 7.}
   4. Rens monomerisk fluorescerende pMHC komplekser finally av S200 gelfiltrering. Et representativt kromatogram er vist i figur 3.
   5. Kontroller kvantitativ peptid lasting av spektrofotometri.
   6. Oppbevar proteiner ved -20 ° C i PBS / 50% glyserol.

1,2. Generering av enkeltkjede antistoffragmenter (SCF _V s), innføring av cysteiner for stedsspesifikk merking

1. Refolde SCF _V s fra inklusjonslegemer uttrykt i E. coli. Her er en protokoll utviklet av Tsumoto og kolleger ⁸ er fulgt i hvilken inklusjonslegemer først foldes ut i 6 M guanidinium-klorid, fullstendig redusert og deretter refoldet i løpet av en uke ved gradvis å nedsette konsentrasjonen av det protein utfolding guanidinhydroklorid.
2. Konsentrer brettet skikkelig SCF _V av molekylære filterenheter med en molekylær cutoff på 10 KDa.
3. Rens konsentratet ved S200 gelfiltrering.
4. Merke monomerisk SCF fosfin (TCEP) med Alexa Fluor 647 umiddelbart etter rensing. Utføre merking reaksjonen best ved et molart forhold av protein: fargestoff på ikke mer enn 1: 2 ved romtemperatur i lengre enn 2 timer.
   Merk: TCEP er en fosfor- basert reduksjonsmiddel og ikke reagerer med maleimider på disse konsentrasjonene ^9. Det kan således være tilstede under merkingsreaksjonen for å holde det uparede sulfhydrylgruppen redusert inntil det reagerer med fargestoff-maleimid-derivat.
5. Rens merket monomerisk SCF _V endelig via S75 gelfiltrering. Et representativt kromatogram er vist i figur 3.
6. Bestem fargestoff: protein ratio spektrofotometrisk.
7. Oppbevar proteiner ved -20 ° C i PBS / 50% glyserol.

2. Kalsium Flux Målinger

1. Ta en frisk hetteglass som inneholder 50 mikrogram fura-2-AM og oppløse den i 50 mL vann fritt DMSO.
2. Spinne ned 10 ⁶ T-celler i en 5 ml rundbunnet polypropylen rør i 2 minutter ved 250-400 g.
3. Resuspender T-celler i 200 ul bildemateriale som inneholder Hanks Balanced Salt Solution pluss kalsium / magnesium og 1% ovalbumin ved RT, tilsett 1 pl av fura-2-AM stamoppløsning (1: 200 fortynning), blanding av cellesuspensjonen og inkuberes ved RT i 30 min.
4. Vask T-celler gang i bildebehandling buffer. For dette, fylle røret med cellene med avbildnings buffer ved romtemperatur og pelletere cellene som beskrevet i trinn 2. Fjern supernatant og resuspender cellepelleten i 200 ul buffer avbildning (dvs. ved en endelig celletetthet på 5 x 10 ⁶ celler ml ^-1). Celler kan brukes umiddelbart for kalsiummålinger eller lagret på is i opp til 3 timer.
5. Plasser cellene på en funksjon SLB i bildebuffer (37 ° C). Så snart T-cellene begynner å kontakte SLB, erverve følgende sett med bilder hver 15 til 30 sek for 30 min:
   excitation ved 340 +/- 5 nm, deteksjon emisjon på 510 +/- 40 nm
   eksitasjon ved 380 +/- 5 nm, deteksjon emisjon på 510 +/- 40 nm
   DIC (valgfritt)
   Merk: Respektive eksponeringstider avhenger av intensiteten av eksitasjonslyset kilden. Tilfredsstillende resultater oppnås når bildeelementintensitetene av 340 nm (380 nm) kanal utgjør omtrent en fjerdedel (en halvdel) av den maksimalt mulige intensitetsverdi. Husk at Fura-2-verdier opphisset ved 340 nm vil øke og de spent på 380 nm vil redusere ved T-celle aktivering.
6. 20-25 min inn i kjøringen, tilsett 50-100 ul av forvarmet anti-pMHC blokkerende antistoff ved en endelig konsentrasjon på 20-50 ug ml ^-1. Antistoffet metter alle pMHCs og som følge av T-celler som vil opphøre å gjenkjenne antigen og stoppe fluksing kalsium. Fortsett opp bilder for ytterligere 5 - 10 min. Å skaffe seg grunnlinjen for den intracellulære kalsiumkonsentrasjonen, noe som tilsvarer den ikke-aktivert tilstand av T-cellene < / li>
7. Bestemme den gjennomsnittlige bakgrunnsfluorescens signal ved 340 nm og 380 nm eksitasjon innenfor et område av interesse av minst 1000 bildeelementer, som ikke inneholder noen celle. Bakgrunn-trekke alle målte Fura-2 bilder opphisset ved 340 nm og 380 nm og beregne 340 nm / 380 nm intensitetsforhold i enkeltceller eller en gruppe av celler. Normalisere intensitetsforhold ved å dividere alle forhold ved forholdet mellom de fem siste tidsrammer (dvs., med komplett antistoff-blokade av pMHC).
8. Plot normalisert Fura-2 forhold mot tiden. Merk: Når celler og bilagene er i god stand, Fura-2 340 nm / 380 nm intensitetsforhold vedta verdier vanligvis mellom 2 og 5, 15-45 sek etter at cellene har tatt kontakt med bilaget. Forholdstall deretter falle til en verdi mellom 1,6 og 2, hvor de holder konstant i minst 20 min eller lenger. Verdier skal falle til en først etter tilsetning av anti-pMHC antistoffer. Et typisk eksempel er vist i figur 5.

"> 3. Bulk FRET Målinger

3,1. TCR innredning med H57scF _V

1. Spinne ned 10 ⁶ T-celler i en 5 ml rundbunnet polypropylen rør i 2 minutter ved 250-400 g.
2. Dekanter media, flick cellepelleten forsiktig og tilsett 0,3 mL av SCF _V (konsentrasjonen ~ 1 mg / ml) til cellesuspensjonen. For bulk FRET målinger ansetter bare dye-merket scFv. For enkelt molekyl FRET målinger bruke en blanding av umerket scFv (5 til 9 deler, inneholder ingen uparet cystein) og dye-merket scFv (en del, inneholder ett uparet dye-coupled cystein).
3. Cellene inkuberes på is i 15 minutter og vaske cellene to ganger gjennom suksessiv sentrifugering ved bruk av is-kald buffer avbildning.
   Merk: Celler kan lagres på is uten vesentlig tap av bundet SCF _{V (t 1/2 av} dissosiasjon SCF _V ved 0 ° C ~ 4 t ^2). Renheten av primære T-celler avledet fra TCR-transgene (og eventuelt også Rag-En halv mangelfull mus) og stimulert in vitro er høyere enn 98% fra T-celler er de eneste celler som prolifererer (opp til 7 celledel) som respons på peptidet, som er tilsatt for stimulering av T-cellekultur. B-celler som gjennomgår apoptose og ikke lenger er i live etter 7-10 dager med dyrking. Noen dendrittiske celler overlever likevel lett kan diskrimineres ikke bare på grunn av sin distinkte morfologi, men også fordi de ikke binde H57 anti-TCR beta scFv fragment.

3,2. FRET måling via donor bedring etter akseptor bleking

Merk: Husk at halveringstiden av TCR-H57 SCF _V komplekser utgjør 4 timer på is, til 50 minutter ved 22,5 ° C og 6,8 minutter ved 37 ° C (og til omtrent 4 timer på is) ^2. Så lenge H57 SCF _V fungerer som FRET donor, målt FRET avkastning er ingen følsomme for H57 SCF _V dissosiasjon imidlertid signal til støyforhold økermed økt H57 dissosiasjon.

1. Forberede en SLB inneholder AF647 / Cy5 merkede pMHCs samt umerket ICAM-1 og B7 ifølge Axmann et al. ^4.
2. Utveksle PBS på bilde kammer med bilde medium inneholdende Hanks Balanced Salt Solution pluss kalsium / magnesium og 1% ovalbumin. For dette pipette 400 mL av bildebehandling buffer i brønnen, bland forsiktig og fjerne 400 mL fra brønnen. Gjenta denne prosedyren 3-4 ganger. Ikke utsett SLB til luft til enhver tid.
3. Plasser bildekammeret på mikroskopet scenen og justere fokus inntil fluorescerende (AF647, Cy5) SLB kommer i fri sikt.
4. Sett opp TIRF belysning ved å oversette den fokuserte strålen parallelt med den optiske akse til periferien av objektiv s fokalplanet via flytting av periskopet sin translatoriske stadium.
5. Å finjustere eksitasjon laserstråler i TIRF modus, legg T-celler dekorert med AF555 / Cy3 merket SCF _V
6. Tilegne seg følgende seks bilder i angitt rekkefølge og i rask rekkefølge (figur 6):
   (i1, valgfritt) hvitt lys, for å ta et bilde av cellen,
   (i2, tilleggsutstyr) 647 nm eksitasjon (low power) for å ta et bilde av FRET akseptor (pMHC) før den bleike puls,
   (i3) 514 nm eksitasjon (low power) for å ta et bilde av FRET donor (TCR) før den bleike puls,
   (i4) 647 nm eksitasjon (høy effekt) til foto bleike gnage akseptor, /> (I5) 514 nm eksitasjon (lav styrke) for å ta et bilde av den FRET donor (TCR) etter blekemiddel puls,
   (i6) 647 nm eksitasjon (low power) for å verifisere komplett FRET akseptor bleking.
7. Hold den tid som har gått mellom bilder (i3) og (i5) så korte som mulig for å være i stand til å korrelere bilder for senere analyse. Hold FRET donor bleking på et minimum ved anvendelse av eksitasjon ved det lavest mulige nivå kraft, som fortsatt gjør det mulig for riktig avbildning av T-cellene.
8. Velg en region av interesse (ROI), for eksempel, en hel synapse eller en enkeltperson TCR microcluster, bestemme sin middels intensitet i (i3) (= _{I (3))} og i (i5) (= _{I (5)).} For bakgrunn subtraksjon, plukke en ROI av samme dimensjon utenfor belysning plass i (3) eller (5) og bestemme dens gjennomsnittlig intensitet _{(I (bakgrunn)).} For å bestemme FRET utbyttet utføre følgende operasjon:
   g "/> (ligning 7)
   Merk: Det bør bemerkes at i forhold til det absolutte FRET-nivå, kan det være nødvendig å korrigere for donor bleking mellom bilder (i5) og (i3).

3,3. FRET måling via lysfølsomt utslipp

1. Utfør romlig donor og akseptor kanal innretting med bruk av flerfargede kuler, som fluorescerer i alle utslippskanaler. Den romlige skift mellom begge kanalene på grunn av kromatisk aberrasjon kan bestemmes av super-posisjonering individuelle perler og har til å bli brukt for korrigering av en av de to kanalene for alle påfølgende to-farge image-par ^10.
2. Fastslå graden av donor bleedthrough med bruk av en SLB inneholder FRET donor fluorophore alene. Det er også mulig å bruke FRET-donor-merkede T-celler på et lipidbilag med umerket pMHC. Bakgrunnen er først bestemmes utenfor opplyste synsfelt og deretter trekkes fra begge kanaler. På denne måten gjennomsnittlig ba BAKGRUNN korrigert intensiteter av to tilsvarende ROIs (jeg _{donor kanal} og jeg _{ACCEPTOR kanal)} blir bestemt. Beregn bleedthrough koeffisient (BTC) som følger:
   (ligning 8)
   Merk: Dette CS er en konstant for en bestemt farge og filter set-kombinasjonen.
3. Beregn FRET donor bleedthrough bildet som følger:
   (ligning 9)
4. Bestemme akseptor kryss-eksitasjon ved å eksitere en SLB som inneholder FRET akseptor fluoroforen alene (for eksempel, IE ^{k /} MCC-Alexa Fluor 647) først med FRET donor eksitasjonslys (f.eks., 514 nm) og deretter med akseptoren eksitasjonslys (for eksempel 647 nm). Bruk bakgrunnskorrigert bilder innenfor FRET akseptor kanal for å beregne kryss eksitasjon koeffisient (CEC) som følger:
   ftp_upload / 53157 / 53157eq10.jpg "/> (ligning 10)
5. Som CEC avhenger av laserintensitet som brukes for eksitasjon donor, bestemme det på hver måling dag. Bruk den resulterende CEC å beregne bilde utelukkende generert gjennom kryss-eksitasjon.
   (ligning 11)
6. Beregn FRET bilde korrigert for bleedthrough og cross-eksitasjon som følger:
   (ligning 12)
   Note: Absolutt FRET signal (men ikke den relative FRET utbytte) er følsom for dissosiasjon av H57 SCF _V fra T-celle-membranbundet TCR. For å unngå for stort tap av den TCR-FRET probe, tar sikte på å utføre målinger ved 37 ° C i løpet av de første 2 min etter tilsetningen av T-celler i bilaget. Målinger med kvantitative (≥ 95%) TCR merking er bare mulig ved eller under 22,5 ° C i løpet av de første 3 min ettertilsetning av T-celler til bilaget.

4. Enkelt Molecule FRET Målinger

1. Justere kraften i begge lasere for å gi opphav til en intensitet på 1-5 kW / um ² ved prøven. For mer informasjon, vennligst se Axmann et al. ^4.
2. Etikett T-celler som er beskrevet ovenfor med en blanding av umerket SCF _V (5-9 deler) og Cy3 / AF555-merket SCF _{V (1} del). Merk: Denne måten bare en brøkdel av TCR er merket med FRET-donor. Dette reduserer antall påvisbare interaksjoner, men støyen fra donor bleedthrough er også redusert betraktelig (med ca 5 ^{1/2 til 10} 1/2), som er kritisk når løse individuell enkelt molekyl FRET hendelser.
   Merk: dissosiasjon av H57 scFv sonden fra den TCR påvirker ikke målingene, slik det forekommer i en meget større tidsområde (minutter til timer) enn dissosiasjon av TCR fra SLB-bundet pMHC (sub-andre til andreområde).
3. Plassere en SLB med AF647-merket pMHCs samt ICAM og B7 på mikroskopet scenen og justere fokus slik at bilaget kommer i fri sikt.
4. Valgfritt: Sett inn et slit åpning inn i eksitasjon sti (som vist på Axmann et al ^4.) For å maskere de fleste innen belysning unntatt synapse. På denne måten ublekede IE ^{K /} MCC (C) -Alexa Fluor 647 FRET akseptor molekylene kan bevege seg inn i området av belysning.
5. Legg H57 SCF _V dekorerte T-celler til bilaget (med bildebehandling buffer), og vente til synapser vises i synsfeltet.
6. Ta i rask rekkefølge en sekvens av 10 til 20 bildesett med to-fargegjenkjenning:
   i1) eksitasjon 514 nm
   i2) eksitasjon 647 nm
7. Eksponere bildene for 1 til 5 ms og skaffe så et sett med bilder.
8. For å vurdere identiteten enkelt molekyl FRET hendelser, gjelder det samme korreksjon angående donor bleedthrough og akseptor kryss excitasjon. Videre enkelt molekyl FRET hendelser må justere med enkelt akseptor molekyler og skal komme og forsvinne i ett trinn (se også figur 7).
9. Off-rate besluttsomhet
   1. Rekord spor av enkelt molekyl FRET hendelser for flere oppkjøp tidsrammer.
      Merk: I dette eksemplet (i kursiv) off-rate mellom 5c.c7 TCR og IE ^{k /} K3 er målt ved 25 ° C med fire forskjellige forsinkelse (42 msek, 490 ms, 1007 ms, 1989 ms).
   2. Liste FRET spor i henhold til deres sporlengder som vist i tabell 1.
   3. Konverter tabell 1 i en invers kumulativ desintegrasjonsfunksjon (tabell 2) som vist (fargede tall er tatt fra tabell 1).
   4. For å normalisere den resulterende desintegrasjonsfunksjonen, dividere antallet spor av tabell 2 med summen av alle spor i den aktuelle gruppe. Plotte normaliserte verdier for antall tidsrammer. Ved å utelate den siste tidsperiode, som inneholder en null, kan henfall lesesily utstyrt med en enkelt eksponentiell funksjon (figur 8A).
   5. Som vist i figur 8B, plotte forventningsverdien <n (t _lag)>, det vil si den negative inverse av eksponenten av desintegrasjonsfunksjonen er bestemt ovenfor mot forsinkelsestiden t _lag som anvendes (i dette eksemplet: x = t _lag = 0,042 s og y = <n (t _lag)> = 1 / 0,662 = 1,511, x = 0,49 s og y = 1 / 0,902 = 1,101, x = 1,007 s og y = 1 / 1.131 = 0,884, x = 1.989 s og y = 1 / 1,591 = 0,629).
   6. Fit τ _{av og} <n _bleke> basert på ligningen 3. Dette kan gjøres ved hjelp av en ikke-lineær montering funksjon av en vitenskapelig dataanalyse program som Origin.
      Merk: Den beste passform vist i dette eksemplet gir en τ _{ut av} 2,12 +/- 0,23 s og en <n _bleke> 1,53 +/- 0,06 sek.
   7. Beregn half livet av samspillet t _{1/2 av} med t _{1/2 av} = τ _{av •} ln (2) (i dette eksempelet: 1.47 s).
10. 2D-K _D besluttsomhet
    1. Bestem omregningsfaktor C for FRET fargestoff paret anvendes sammen med bruk av ligning 6 og som er beskrevet ovenfor (figur 4A).
    2. Bestem gnage avkastning for individuelle TCR microclusters eller hele synapser (Tall 3B og 5).
    3. Ved hjelp av ligning 4 konvertere alle individuelle FRET avkastning til TCR occupancies (Figur 4C).
    4. Gjelder ligning 11 for å konvertere alle TCR occupancies inn 2D-K _D s. Som angitt nedenfor, er inhomogen synaptisk binding. En meningsfylt mål for synaptisk K _D s er median (angitt i rødt) av alle målte microclusters (Figur 4D).
11. Beregning av 2D-k _på s
    1. Beregn _k på med massevirkningsloven med k _på = k _off / K _D og den eksperimentelt bestemte k _off og K _D verdier.
       Merk: synaptic k _off for forsøket er vist i figur 4 (IE ^{k /} MCC samspill med 5c.c7 TCR ved 25 ° C) er 0,41 s ^-1. Derav K _D plottet (Figur 4D) kan omdannes til ak _på tomten som vist i figur 4E.

Representative Results

Registreringen av intracellulært kalsium via fura-2 kalsium fargestoff, så vel som den etterfølgende cellulære analyser for å bekrefte den stimulerende potens og dermed funksjonaliteten SLBs er vist i figur 4. Som det fremgår, kalsiumnivået stiger i T-celler (uttrykt som normalisert Fura-2 340 nm / 380 nm forholdet med baseline være 1) umiddelbart så snart de bosette seg på de stimulerende SLBs. Kalsiumnivåene returnerer til utgangsnivåer kort tid etter tilsetning av et antistoff som blokkerer pMHCs fra TCR inngrep og som ender T-celleaktivering.

Figur 6 viser et typisk eksperiment med FRET donor-akseptor restitusjon etter bleking, som anvendes for å måle FRET utbytter, og som tjener til å beregne 2D-K _D-verdiene (vist i figur 4). Vær oppmerksom på økningen i FRET donor intensitet, noe som representerer TCR merket via AF555, etter rask og fullstendig ablasjon av FRET encceptor arter (her: AF647 forbundet med pMHCs). Også tydelig den sterke reduksjon i FRET kanal, dvs. den FRET-akseptor kanalen under FRET donor eksitasjon, etter FRET akseptor bleking. Den knapt synlige resterende signal tilsvarer å slite donor bleedthrough. FRET avkastning innenfor enkelte TCR microclusters eller hele synapser er beregnet basert på de angitte målte intensitetsverdier (Figur 6B).

Figur 7 viser en bane og tid bortfall av et enkelt molekyl FRET hendelse synlig i to tidsrammer. Som beskrevet ovenfor i innledningen slik oppførsel er forårsaket av nedbrytning av både synaptisk TCR-bindende pMHC og fotobleking. For å skille mellom disse to bidrag, de eksperimentelle oppkjøpet tidsrammer må varieres i varighet: mens fotobleking forblir en konstant, forårsaket endringer i FRET tilfelle bane lengde er bare av bindingskinetikk. En kvantifisering av tracelengths, w jør danner grunnlag for beregning av priser og off-bleking er vist i figur 7, er gitt i tabellene 1 til 3.

Fastsettelse av 2D-K _D s krever registrering av bulk FRET avkastning for FRET giver merket TCR. Med bruk av den eksperimentelt utledede konstant C (figur 4), kan en FRET utbytte målt for en TCR microcluster eller en hel synapse omdannes til TCR belegget en, det vil si, forholdet mellom pMHC-engasjert og totale TCR (figur 4C) . Med kjente pMHC tettheter som er tilstede på SLB før tilsetning av T-cellen, kan et verdier anvendes for å bestemme synaptiske _{2D-K-D-verdier} (Figur 4D). On-priser kan beregnes med massevirkningsloven (2D-k _på = 2D-k _off / 2D-K _D) fra bestemt synaptiske off-rate og 2D-KD verdier.

1 "src =" / filer / ftp_upload / 53157 / 53157fig1.jpg "/>
Figur 1. Skjematisk oversikt over den plane glass-støttet lipid bilaget (SLB) system. (A) SLBs er sammensatt av POPC (90-99%), og det syntetiske lipid DGS Ni-NTA (1-10%), og det dannes spontant når rene glassflater belastes med små unilamellære vesikler (SUV) som består av de tilsvarende lipider. (B) en gang er dannet, kan slike SLBs funksjonaliseres med oppløselige polyhistidin-merket ekstracellulære deler avledet fra pMHCs, kostimulerende B7-1 proteiner og ICAM-1 adhesjonsproteiner, for å tjene som APCer for T-celler. For mer informasjon om klargjøring SLBs referere til Axmann et al. ^4. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figu re 2. Förster Resonance Energy Transfer-baserte analysen for å kvantifisere TCR-pMHC bindende in situ. (A) en sammensatt konstruksjon av en TCR kompleksdannet med en H57 enkeltkjedet fragment i inngrep med en pMHC illustrerer FRET-tilnærming som er beskrevet heri. Legg merke til den korte avstanden på ca 41A skiller de to tilsvarende fluorophores gjennomgår gnage. Akseptorseter for fluoroforen-maleimider som angitt i grønt og rødt. (B) Prinsippet med å detektere TCR-interaksjoner pMHC in situ er illustrert. Bare SCF _V -Dekorert TCR og pMHCs (her IE ^k), som danner spesifikke komplekser, gi opphav til en målbar FRET signal. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

"/>
Figur 3. Kromatogrammer av den endelige gel-filtreringstrinnet gir opphav til monomere SCF _V s og peptid-lastet IE ^k -2x6H molekyler. X-aksen representerer retensjon volum i ml, Y-akser angir absorbansen ved 280 nm i vilkårlige enheter (AU) . (A) H57 SCF _V sete-spesifikt merket med Alexa Fluor 555 maleimidet ble underkastet S75 kromatografi for å separere ikke-omsatt farvestoff fra proteinet (trinn 1.2.5). Fraksjoner som tilsvarer oppbevaring intervallet 14 to15 ml (stiplede linjer) representerer merket monomerisk H57 SCF _V. (B) IE ^k -2x6H molekyler kompleks med UV-spaltbare ANP-plass holder peptid hadde vært UV-bestrålt, inkuberes med site-spesifikt Alex 647 maleimid-merket peptid og til slutt underkastet S200 kromatografi for å skille protein fra fritt peptid (trinn 1.1.2.4). Intervallet mellom de stiplede linjene inneholder riktig foldet og monomere pMHCs. (A, B) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4. Bestemme 2D-K _D s og 2D-k _på s. (A) Korrelasjonen mellom FRET utbyttet som bestemmes av donor restitusjon etter akseptor bleking og TCR belegg ble målt eksperimentelt. TCR belegg kan bestemmes for individuelle TCR microclusters som forklart i punkt 4.2. En lineær tilpasning av dataene er vist ved hjelp av linjen, er lik forholdet mellom C TCR skråningen av hvilkebelegg og gnage yield. C er en konstant spesifikt for FRET systemet og fluoroforene (her Cy3 og Cy5) er ansatt. I dette eksempelet ga det 1,988. (B) FRET utbyttedata ble bestemt for individuelle TCR microclusters (N = 187, temperatur = 24 ° C) gjennom donor utvinning av akseptor bleking. Tallene nedenfor histogram Linjene angir øvre grense i intervallet. (C) Konvertering av data vist i (B) ved å multiplisere målt FRET avlinger med konstanten C bestemmes i (A). Tallene nedenfor viser linjene øvre grense i intervallet. (D) Histogram (semi-logaritmisk, basen = 4) viser fordelingen av 2D-K _D s målt for individuelle TCR microclusters. Median 2D-K _D er angitt i blått. Tallene nedenfor viser linjene øvre grense i intervallet. (E) Histogrammet vist i (D) ble konvertert intoa 2D-k _på -histogram (semi-logaritmisk, basen = 4) ansette den synaptiske k _{off for} 24 ° C (0,41 s ^-1). Den bestemmes median 2D-k _på verdien vises i blått. Data ble opprinnelig publisert i Huppa et al. ^{2 og} visualiseres her i et nytt format. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5. Funksjonell validering av SLBs ansatt for T-celle stimulering og bildebehandling. (A) TCR-transgene T-celleblaster lastet med Fura-2 ble konfrontert med stimulerende SLB husing antigene pMHCs, ICAM-1 og B-7. Cellular Fura-2 utslipp spent på 340 nm og 380 nm samt DIC bildene ble tatt opp. Som angitt, forholdet verdier av utslippsintensitet eksitert ved 340 og 380 nm er vist i det høyre panelet. Tilsetning av pMHC blokkerende antistoffer 14 min inn i forsøkskjøring resulterte i en reduksjon i den intracellulære kalsiumnivåer sammenlignbare med den i hvilende T-celler. (B) En typisk tidsmessige profil av gjennomsnittlig Fura-2-forhold i T-celler i kontakt stimulerende SLBs er kjennetegnet ved en en innledende økning i intracellulært kalsium, som er to til fire ganger høyere sammenlignet med den ikke-aktiverte T-celler eller T-celler som er berøvet antigen etter antistoff-mediert blokade. Grønne sirkler angir tidspunkter illustrert i (A). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6. Bulk FRET avkastning målt gjennom FRET donor gjenoppretting etter FRET akseptor bleking. et al ^4). Linjen er vist i den venstre DIC bilde indikerer grense av T-celle-synapse. Legg merke til tap i intensitet innen FRET akseptor kanalen samt er økningen i intensitet i FRET donor kanalen etter FRET akseptor bleke (trinn 4). (B) FRET effektivitet kan kvantifiseres som angitt for individuelle synaptiske områder eller for hele synapser. For inspeksjon, er bilder før og etter FRET akseptor bleking vist med bruk av to oppslagstabeller (LUTS, grønne og fysikk). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7. enkelt molekyl FRET hendelser oppstår og forsvinner insingle trinn og er helt i tråd med et enkelt FRET akseptor fluorophore. Tiden er bortfallet av den enkelt molekyl FRET vises hendelsen. Bilder ble anskaffet ved hjelp av en back-opplyst EMCCD kamera. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 8. Fastsettelse τ _{av =} 1 / k _off fra målte smFRET baner. (A) De normaliserte kumulative summer av observer FRET signaler (avledet fra H57 SCF _V -AF555 dekorerte 5c.c7 TCR transgen T-celleblaster gjenkjenne IE <sup> k / K3-AF647 ved 24 ° C) i fire forskjellige tidsforsinkelser (42 ms, 490 ms, 1007 ms, 1989 ms) ble plottet som en funksjon av det totale antallet av observasjoner. Mono-eksponentiell tilpasse funksjoner gir opphav til tilsvarende negativ inverse av forventningsverdiene <n (t _lag)>. (B) forventningsverdier ble plottet mot forsinkelser t _lag og monteres med ligningen <n (t _lag)> = τ _off / {(ź _off / <n _bleke>) + t _etterslep} å gi τ _{av og} <n _bleke>. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Måle protein-protein interaksjoner in situ er svært ønskelig, spesielt når du arbeider med lave affinitetsinteraksjoner som TCR-pMHC bindende ^11. Dette er fordi den på-hastighet, så vel som stabiliteten av slike interaksjoner er betydelig påvirket av de spesielle omstendigheter under hvilke bindingen finner sted. Minimal-invasive FRET-baserte bilde tilnærminger er dermed i prinsippet passer perfekt for slike oppgaver, men innebærer en rekke hindringer som må først overvinnes. Støy generert av cellulær autofluorescens begrenser følsomheten av målingene og bør derfor holdes på et minimum. TIRF mikros tjener dette behovet meget godt ^12, men krever at funksjonalisering av glass-slides, helst i form av et plant glass-støttet lipidbilag dekorert med proteiner av valg ^13-15. En annen fordel med en delvis reconstitutive tilnærmingen er at rekombinante bilag-resident FRET partnere kan være mye mmalm lett merkes i en kvantitativ, stedsspesifikk og rasjonell måte med mindre og lysere fluoroforene enn det ville være mulig med celleoverflate uttrykte proteiner. TCR er merket med rekombinant SCF _V s, som ikke påvirke T-celle-gjenkjenning, som ble testet tidligere ^to. Videre er proteinsammensetningen i SLB, for eksempel tettheten av pMHCs og valget av aksessoriske faktorer kan justeres til sine spesifikke behov. Vi har tidligere utført eksperimenter med varierende tettheter av stimulerende pMHCs, men har ikke påvist signifikante forskjeller i 2D-k _off og 2D-K _D ^2.

Så langt her erkjennelsen av MHC klasse II molekyler har blitt behandlet bare, hovedsakelig på grunn av naturen av deres peptid binding kløft, som er åpen i begge ender og dermed plass til større peptider inkludert en linker for fluorophore vedlegg. I noen tilfeller slik tilnærming kan også arbeide for merking MHC CLAss Jeg molekyler ¹⁶ men stor forsiktighet bør tas for å kontrollere deres bruk i eksperimenter. Sensitiviteten av T-celler mot antigener, som kan måles via T-celle-proliferasjonsanalyser, samt pMHC-TCR-bindende kinetikk som målt in vitro ved hjelp av overflate-plasmonresonans bør ikke påvirkes av tilsetningen av linkeren og fluoroforen til peptidet. Alternativt kan MHC klasse I molekyler seg selv være merket på en sete-spesifikk måte med innføringen av en uparet cystein i sekvensen til den tunge kjeden (upubliserte observasjoner).

Med bruk av egnede molekylære prober enhver synaptiske protein-protein interaksjon kan i prinsippet bli undersøkt på en måte som er beskrevet heri. Slike sonder, f.eks, bør SCF _V s eller Designet Ankyrin Gjenta Proteins (DARPins) ^17, være mono og bør binde sine mål stabilt uten å påvirke samspillet av interesse. Of course, strukturelle informasjonsn er svært ønskelig for rasjonell utforming proben, men ikke absolutt nødvendig. Ved etablering av et nytt par FRET partnere, anbefales det å registrere og analysere FRET i bulk først. Nettsteder av etiketten vedlegg kan varieres mye å maksimere FRET signal og også for å verifisere at målt FRET utbytter variere basert på inter-dye avstand. Når systemet er optimalisert, enkelt molekyl FRET signaler kan bli registrert ved å begrense merking av den høye overflod FRET partner til 10-30% og bleking av lav overflod FRET partner til enkle molekyler er løses på området belysning.

Sist men ikke minst det bør bemerkes at SLBs tilnærmet noen, men ikke alle deler av en fysiologisk plasmamembranen. Egenskaper som membranen krumning og fleksibilitet, domene compartmentalization, cytoskeletal omordninger og celle motilitet, så vel som en høy variasjon av overflateuttrykt membran proteiner er ikke representert ved SLBs men kan påvirke than behandler under etterforskning. Mye arbeid må investeres å etablere avbildningsmodaliteter som tillater overvåking av protein-protein interaksjoner med enkelt molekyl oppløsning i fysiologiske synapser, som er utilgjengelige for TIRF avbildning.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
LB-media	Fisher Scientific	10000713	bacterial expression
Sf900 II	Life Technologies	10227402	insect cell media for baculo virus production
Insect-XPRESS with L-glutamine (Lonza)	Fisher Scientific	10564038	insect cell media for baculo virus expression
Sf9 cells	Life Technologies	11496-015	cells for virus production and expansion
High Five Cells	Life Technologies	B855-02	cells for potein expression
LB-media	Fisher Scientific	10000713	bacterial expression
Centramate System	Pall		protein concentartion from large volumes
Centramate cassette 10kDa cutoff	Pall	OS010T12	protein concentartion from large volumes
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units	EMD Millipore	UFC900308	protein concentartion
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units	EMD Millipore	UFC800308	protein concentartion
Amicon Stirred Ultrafiltration Cell Model 200 mL	EMD Millipore	5123	protein concentartion
Äkta pure 25L	GE Healthcare	29-0182-24	protein purification
Superdex 200 10/300 GL	GE Healthcare	17-5175-01	protein purification
Superdex 75 10/300 GL	GE Healthcare	17-5174-01	protein purification
Mono Q 5/50GL	GE Healthcare	17-5166-01	protein purification
Ni Sepharose 6 Fast Flow	GE Healthcare	17-5318-01	protein purification
Tricorn 10/20 column	GE Healthcare	28-4064-13	protein purification
Gilson HPLC system	Gilson		purificationof fluorochrome-coupled peptides
Pursuit XRs C18, 5 µm particle size, 21.2*250mm column size	Agilent	A6000250X212	purificationof fluorochrome-coupled peptides
Pursuit XRs C18, 5 µm particle size, 21.2*50 mm column size	Agilent	A6000050G212	purificationof fluorochrome-coupled peptides
Tricorn 10/20 column	GE Healthcare	28-4064-13	protein purification
Gilson HPLC system	Gilson		purificationof fluorochrome-coupled peptides
Pursuit XRs C18, 5 µm particle size, 21.2*250mm column size	Agilent	A6000250X212	purificationof fluorochrome-coupled peptides
Pursuit XRs C18, 5 µm particle size, 21.2*50 mm column size	Agilent	A6000050G212	purificationof fluorochrome-coupled peptides
Cy3 maleimide	GE Healthcare	PA23031	site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines
Cy5 maleimide	GE Healthcare	PA25031	site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines
Alexa Fluor 555 C2 Maleimide	Life Technologies	A-20346	site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines
Alexa Fluor 647 C2 Maleimide	Life Technologies	A-20347	site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines
Fura-2, AM, cell permeant	Life Technologies	F-1221	calcium-sensitive dye for cell labeling
dimethyl sulfoxide	Sigma Aldrich	151874	for dissolving fura-2 am
Hank's Balanced Salt Solution plus calcium/magnesium	Fisher Scientific	10225362	imaging buffer
PBS	Life Technologies	14190-136
Bovine Serum Albumin lyophilized powder	Sigma Aldrich	A2153	supplement for imaging buffer
14-4-4S antibody	affimetrix eBioscience	14-5980-81	blocking antibody for H2-I-Ek (recognized by the 5c.c7, 2B4 and AND TCR)
5 ml polypropylene round-bottom tube	Becton Dickinson	FALCON 352063
0.22 μm Ultrafree-MC centrifugal filter unit	EMD Millipore	UFC30GV0S
Syringe filter 0.2µm	Millipore	GVWP04700
TetraSpeck Microspheres, 0.1 µm, fluorescent blue/green/orange/dark red	Life technologies	T-7279
Microscope for fura-2-based calcium measurements	LEICA	DMI4000B
Microscope for (single molecule) FRET measurements	LEICA/ZEISS/NIKON/OLYMPUS	for details please refer to parallel JoVE contribution by Axmann et al.
planar supported lipid bilayers		for details please refer to parallel JoVE contribution by Axmann et al.
RPMI 1640, with L-Glutamine	Life Technologies	11554416	T-cell media
non-essential amino acid 100X	Hyclone	SH30238.01	T-cell media supplement
penicillin/streptomycin/L-glutamine 100x	Life Technologies	12000226	T-cell media supplement
2-mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M6250	T-cell media supplement
mouse interleukin-2 recombinant protein	BPS Bioscience	90185-B	T-cell media supplement
Research Grade Fetal Bovine Serum	Hyclone	SV30160.03	T-cell media supplement
Origin (analysis program)	OrigenLab	http://www.originlab.com/	non-linear fitting of two parameters (tauoff, [ntlag])