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Bioengineering

TCR-pMHC बंधन मापने Published: October 30, 2015 doi: 10.3791/53157
Automatic Translation
1, 1, 2
1Institute for Applied Physics - Biophysics, Vienna University of Technology, 2Institute for Hygiene and Applied Immunology, Medical University of Vienna

Introduction

टी-कोशिकाओं एंटीजन की पहचान कैसे की एक और अधिक मौलिक समझ टी सेल और एपीसी के बीच का गठन प्रतिरक्षात्मक अन्तर्ग्रथन के भीतर, वह यह है कि सही जगह पर देख रहे हैं की आवश्यकता है। इधर, आणविक बाध्यकारी कैनेटीक्स केवल सेलुलर बलों, झिल्ली वास्तुकला और झिल्ली प्रोटीन के बीच पार्श्व बातचीत के साथ ही अन्तर्ग्रथन विशेष ज्यामितीय बाधाओं शामिल हैं, जो सेलुलर मापदंडों पर काफी हद तक निर्भर करती है लेकिन इसमें शामिल बातचीत के भागीदारों के निहित जैव रासायनिक गुणों द्वारा निर्धारित नहीं कर रहे हैं 3। जैव रासायनिक दृष्टिकोण वे शामिल अन्तर्ग्रथनी झिल्ली का कम से कम एक के विघटन की जरूरत के रूप में सत्ता का समाधान करने में सीमित कर रहे हैं। इस कारण एक झल्लाहट आधारित इमेजिंग कार्यप्रणाली प्रतिजनी pMHCs से 2 TCR के बंधन की निगरानी के लिए विकसित किया गया था। यहाँ टी कोशिकाओं को एक पुनः संयोजक से सजाया जाता है और साइट विशेष TCRβ प्रतिक्रियाशील एकल श्रृंखला एंटीबॉडी टुकड़ा (एससीएफ वी) लेबल और योजना के साथ सामना MHC वर्ग द्वितीय एक fluorescently लेबल प्रतिजनी पेप्टाइड के साथ भरी हुई अणुओं, costimulatory अणुओं और आसंजन प्रोटीन बंदरगाह जो एआर गिलास-समर्थित लिपिड bilayers (SLBs),। Synaptic कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (TIRF) माइक्रोस्कोपी द्वारा एक थोक और एक अणु के स्तर पर नजर रखी जा सकती है, जो झल्लाहट में डाई लेबल TCR और डाई लेबल pMHC परिणाम है, के बीच बंधन।

इस लेख में यह टी-सेल synapses परख करने की क्रिया के लिए SLBs उपयोग एक कार्यात्मक टी सेल कैल्शियम प्रवाह परख के माध्यम से उनकी ईमानदारी को सत्यापित करने के लिए विस्तार से समझाया गया है, आचरण थोक में और एक अणु संवेदनशीलता के साथ माप झल्लाहट, और प्राप्त डेटा का विश्लेषण। अनुशंसाएँ बाईलेयर functionalization के लिए आवश्यक ठीक से पुष्टि प्रोटीन का उत्पादन करने की पेशकश कर रहे हैं। बाईलेयर गठन और एक उपयुक्त TIRF माइक्रोस्कोप 4 वापस करने के लिए वापस प्रकाशित एक अतिरिक्त सार्वजनिक उपयोग जौव प्रकाशन के लिए कृपया देखें की स्थापना के बारे में और अधिक विशिष्ट जानकारी के लिए।

तम्बू "> SLBs की प्रकृति

Functionalizable SLBs आसानी से दो लिपिड 1-palmitoyl-2-oleoyl-एस.एन.-gylcero-3-phosphocholine युक्त unilamellar पुटिकाओं (एसयूवी) से उत्पन्न हो सकता है (कम: POPC, 90-99%) और 1,2-dioleoyl- एस.एन. - ग्लिसरो-3 - {[एन (5-अमीनो-1-carboxypentyl) iminodiacetic एसिड] succinyl} (लघु: डीजीएस NTA-नी, 1-10%)। स्वच्छ गिलास स्लाइड पर फैल एसयूवी एक सन्निहित तलीय बाईलेयर 4 के रूप में। डीजीएस-NTA-नी सिंथेटिक NTA-नी-युक्त सिर समूह (चित्रा 1 ए) के साथ polyhistidine की मध्यस्थता जटिल गठन के माध्यम से polyhistidine टैग प्रोटीन लंगर के लिए कार्य करता है। स्थिर संघ एक के लिए आम तौर पर आसंजन प्रोटीन ICAM -1 और बारह histidines (ICAM-1-12H, B7-1 -12H) युक्त एक टैग के साथ costimulatory अणु B7-1 के देशी transmembrane डोमेन और cytoplasmic पूंछ को बदल देता है (चित्रा 1 बी) । पेप्टाइड से भरी हुई वर्ग द्वितीय अणु आईई कश्मीर दो झिल्ली एम्बेडेड (α और β) पॉलीपेप्टाइड श्रृंखला में शामिलएस। दोनों श्रृंखलाओं के ट्रांसमेम्ब्रेन / साइटोप्लास्मिक डोमेन छह histidines प्रत्येक (आईई कश्मीर α 6H β 6H या IE कश्मीर -2x6H) युक्त एक टैग के साथ प्रतिस्थापित किया जाना है। एक वैकल्पिक, बारह histidines साथ α श्रृंखला का विस्तार और untagged (12H β 0H या IE कश्मीर -12H α आईई कश्मीर को जन्म दे रही है) β श्रृंखला के बाह्य डोमेन छोड़ने के रूप में संतोषजनक परिणाम (चित्रा 1 बी) को जन्म देता है।

PMHCs की साइट विशेष लेबलिंग

यह सार्थक संतुलन बाध्यकारी स्थिरांक में झल्लाहट मापा पैदावार परिवर्तित करने में सक्षम होने के लिए आदेश में stoichiometrically और साइट विशेष pMHC लेबल करने के लिए महत्वपूर्ण है। इस पुनः संयोजक हिस्टिडीन टैग MHC वर्ग द्वितीय अणुओं 2,5 की पेप्टाइड बाध्यकारी फांक में भरी हुई है कि एक सिंथेटिक पेप्टाइड की रासायनिक लेबलिंग के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। पेप्टाइड w के रूप में टी सेल मिलान के सभी अवशेष शामिलपक्ष सिस्टीन द्वारा पीछा किया एक छोटी सी टर्मिनल लिंकर (GGS) के रूप में (जैसे कीट साइटोक्रोम ग (एमसीसी) पेप्टाइड ANERADLIAYLKQATK- GGSC में, लिंकर बोल्ड में चिह्नित किया गया है)। इस सिस्टीन maleimide डाई डेरिवेटिव के उपयोग के साथ stoichiometrically पेप्टाइड लेबल करने के लिए प्रयोग किया जाता है। इस बिंदु पर अतिरिक्त ध्यान सिस्टीन युक्त पेप्टाइड मात्रात्मक डाई युग्मन की पुष्टि करने के लिए समर्पित किया जाना चाहिए। पेप्टाइड डाई अभिवर्तन का एचपीएलसी-शुद्धि की सिफारिश की है और electrospray आयनीकरण जन स्पेक्ट्रोस्कोपी के द्वारा पीछा किया जाना है। (डाई के बिना) पेप्टाइड educt के संगत किसी भी दर्ज की जनता अधूरा लेबलिंग दर्शाते हैं। अगर यह सच है लेबलिंग मात्रात्मक समझा जाता है, जब तक एचपीएलसी शुद्ध पेप्टाइड डाई लेबलिंग की लगातार राउंड के अधीन किया जाना चाहिए। इस विधि नमूना आयनीकरण के लिए लेजर विकिरण शामिल है के रूप में MALDI-TOF मास स्पेक्ट्रोस्कोपी से परहेज किया जाना चाहिए ध्यान दें। पेप्टाइड बड़े पैमाने पर इस प्रकार underrepre बाहर पढ़ने के लिए किया जाता है और इससे पहले इस उपचार जुड़ी संवेदनशील fluorophores विखंडित डाई-विकार के sents डिग्री।

मोनोवैलेन्ट एकल श्रृंखला एफ वी टुकड़े के उपयोग के साथ सेल बाध्य TCRs के अप्रत्यक्ष अभी तक साइट विशेष लेबलिंग

यह अभी भी एक साइट विशेष ढंग से जीवित कोशिकाओं की सतह से जुड़े प्रोटीन सेल रंगों संलग्न करने की चुनौती दे रहा है। सतह उजागर TCRs के लिए इस बाधा को दूर करने के लिए, TCRβ -reactive मोनोक्लोनल एंटीबॉडी H57-197 2 के जीन से एक मोनोवैलेन्ट एकल श्रृंखला संस्करण (एससीएफ वी) का निर्माण किया गया है। TCR के साथ परिसर में इस एंटीबॉडी की क्रिस्टल संरचना तर्क से (इसी झल्लाहट साथी डाई जुड़ा हुआ है जहां) एमएचसी जुड़े पेप्टाइड की सी टर्मिनस के करीब निकटता में एक सेरीन अवशेषों एक के लिए प्रतिस्थापित किया गया है, जिसमें एक संस्करण है, डिजाइन करने के लिए अनुमति देता है सिस्टीन अवशेषों। इस उत्परिवर्ती सिस्टीन तो डाई विकार (चित्रा 2) के लिए एक स्वीकर्ता के रूप में कार्य करता है।

के तरीके में झल्लाहट रिकॉर्ड करने के लिए

NT "> थोक झल्लाहट मूल्यों चुना अंतर-डाई दूरियों के बीच संबंधों को सत्यापित करने के लिए सबसे उपयुक्त हैं और प्रणाली 2 बाध्यकारी इस TCR-pMHC में मापा क्षमता झल्लाहट। इसके अलावा, थोक झल्लाहट माप अन्तर्ग्रथनी TCR-pMHC समानताएं में गुणात्मक और मात्रात्मक मतभेद (पता चलता है ) के नीचे देख सकते हैं और प्रोटोकॉल अनुभाग 3.2। साहित्य 6 में पेश किया गया है झल्लाहट क्षमता बढ़ाता के लिए विभिन्न दृष्टिकोणों। इस लेख झल्लाहट के माध्यम से दर्ज की गई है में

(क) दाता वसूली स्वीकर्ता विरंजन के बाद, और के माध्यम से

(ख) झल्लाहट स्वीकर्ता उत्सर्जन अवगत।

पहली विधि (क) आसानी से photobleached जा सकता है कि एक झल्लाहट स्वीकर्ता, और नहीं बल्कि photostable है, जो एक दाता के उपयोग की आवश्यकता है। इसके अलावा यह photobleached स्वीकर्ता नहीं रह दाता प्रतिदीप्ति शमन करने में सक्षम है कि यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है। एक ही पहचान चैनल (दाता) मात्रा का ठहराव के लिए इस्तेमाल किया जाता है, कोई सुधार एक कारकD नहीं रंगीन aberrations इस पद्धति सरल और विश्वसनीय दान करता है जो विचार किया जाना है। हालांकि, मात्रात्मक मापन एक ही नमूना मौके पर ही दोहराया नहीं जा सकता और झल्लाहट में परिवर्तन समय के साथ दर्ज नहीं किया जा सकता है। (स्वीकर्ता विरंजन से पहले) पहली झल्लाहट दाता और (झल्लाहट स्वीकर्ता विरंजन के बाद) दूसरे झल्लाहट दाता छवि अधिग्रहण के बीच गुजरते समय को कम करता है जो आणविक प्रसार या एक तेजी से विरंजन कदम के लिए उद्देश्य से किया जाना चाहिए सेलुलर गतिशीलता, की वजह से प्रभाव से बचने के लिए। यह रोशनी और विरंजन बार कम करने के क्रम में झल्लाहट स्वीकर्ता उत्तेजना तरंग का एक शक्तिशाली लेजर प्रकाश स्रोत को रोजगार के लिए सलाह देते हैं।

इसके विपरीत, (ख) अवगत झल्लाहट उत्सर्जन माप के दृष्टिकोण में झल्लाहट दाता उत्साहित है और झल्लाहट स्वीकर्ता के उत्सर्जन झल्लाहट स्वीकर्ता चैनल में मनाया जाता है। झल्लाहट स्वीकर्ता संकेत में परिवर्तन लाल स्थानांतरित स्वीकर्ता चैनल में समय है, लेकिन झल्लाहट दाता के उत्सर्जन से अधिक दर्ज किया जा सकता (टीermed bleedthrough) और सही ढंग से निर्धारित होता है और दर्ज की झल्लाहट स्वीकर्ता चैनल से घटाया जाना है दाता उत्तेजना के माध्यम से स्वीकर्ता पार उत्तेजना झल्लाहट। इसके लिए झल्लाहट दाता इसी और झल्लाहट स्वीकर्ता छवियों स्थानिक गठबंधन किया जाना है।

एक अणु का पता लगाने (एस) की घटनाओं झल्लाहट

उत्तेजना स्रोत, एक संवेदनशील कैमरे और शोर-तनु TIRF माइक्रोस्कोपी के रूप में लेज़रों के उपयोग के साथ एकल fluorophores के प्रतिदीप्ति आसानी से समय अधिक का पता लगाया जा सकता है। इसी अंतरआणविक smFRET घटनाओं का पता लगाने के लिए सच है। हालांकि, जटिलताओं झल्लाहट दाता bleedthrough और झल्लाहट स्वीकर्ता के पार उत्तेजना की वजह से है, और इस महान देखभाल smFRET प्रयोग में fluorophore घनत्व जब समायोजन लिया जाना है हो सकता है।

नीचे प्रदान प्रोटोकॉल (प्रोटोकॉल धारा 4) में TCR कम बहुतायत में झल्लाहट स्वीकर्ता के रूप में उच्च बहुतायत और pMHC में झल्लाहट दाता के रूप में चुना गया था। एफआर attenuate करने के लिएपर्याप्त रूप से, फ्लोरोसेंट एससीएफ वी और गैर फ्लोरोसेंट एससीएफ वी के साथ TCRs के 90-70% के साथ TCRs के 10-30% सजाने bleedthrough एट दाता। यह एक अणु के साथ confocal चैनल झल्लाहट है क्योंकि यहाँ झल्लाहट स्वीकर्ता चैनल एक अणु चैनल के रूप में चुना गया था। इस smFRET सत्यापन का आधार है जो झल्लाहट स्वीकार अणु, साथ smFRET घटनाओं के लिए पंक्ति में मदद करता है।

SmFRET माप के माध्यम से अन्तर्ग्रथनी ऑफ दरों निकालने

दोनों की photobleaching दाता झल्लाहट और स्वीकर्ता एक अणु से बातचीत निशान झल्लाहट के आधे जीवन निकालने जब के लिए जिम्मेदार होने की जरूरत झल्लाहट। एकल दाता स्वीकर्ता जोड़ी के रूप में उनकी उपस्थिति एन की शुरुआत में नमूदार झल्लाहट संकेतों की संख्या (0) रिसेप्टर ligand जटिल और photobleaching के दोनों unbinding द्वारा समय पर कम हो जाता है। इस प्रकार के रूप में एक निश्चित समय एन (टी) में परिसरों जीवित रहने की संख्या गणितीय व्यक्त किया जा सकता है:

Photobleaching अवधि EXP (आयकर / τ ब्लीच) में समय टी यानी, विरंजन ही रोशनी के दौरान होता है टिप्पणियों की संख्या n के उत्पाद और (क्योंकि गैर निरंतर, असतत अवलोकन मोड के बीमार रोशनी समय टी द्वारा वर्णित है )। गतिज अवधि exp- (टी / τ बंद) समय टी टिप्पणियों की संख्या n के उत्पाद है और एक भी झल्लाहट अवलोकन (यानी, गतिज unbinding लगातार होता है) के लिए समय टी अंतराल है भीतर। 1 समीकरण के रूप में व्यक्त किया जा सकता है:

2 समीकरण

अवधि τ ब्लीच / τ बीमार desविरंजन होता है और उम्मीद मूल्य <n ब्लीच> के रूप में अपनी घातीय समारोह का परिभाषित किया गया है, जब तक टिप्पणियों की संख्या cribes। इस प्रकार के रूप 2 समीकरण को सरल बनाया जा सकता है:

3 समीकरण

समय टी के बाद नमूदार झल्लाहट घटनाओं के साथ फ्रेम की संख्या एन (टी) की उम्मीद के मूल्य <n (टी अंतराल)> सीधे प्रयोग से निर्धारित होता है। यह प्रयोग में चुना टिप्पणियों (टी अंतराल) और τ बंद (कश्मीर बंद ऑफ दर का उल्टा) के लिए अज्ञात मूल्यों के बीच settable समय पर निर्भर करता है और विरंजन के होने से पहले, टिप्पणियों की संख्या की उम्मीद मूल्य <n ब्लीच> ।

इस प्रकार, टी के कम से कम दो मूल्यों के लिए उम्मीद मूल्य <n (टी अंतराल)> की गणना <n ब्लीच> और बंद τ की प्रयोगात्मक निर्धारण की अनुमति देता।

झल्लाहट आधारित माप के माध्यम से अन्तर्ग्रथनी 2 डी-कश्मीर डी मूल्यों निकालने

TCR अधिभोग यानी एक, बंधे TCRs और कुल TCRs के बीच अनुपात को मापने, अन्तर्ग्रथनी 2 डी-कश्मीर डी मूल्यों को निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है। के रूप में लंबे समय TCRs झल्लाहट दाताओं और pMHCs झल्लाहट स्वीकार के रूप में के रूप में कार्य करता है के रूप उपज झल्लाहट मापा करने के लिए समीकरण 4 के अनुसार इस अवधि सीधे आनुपातिक है।

4 समीकरण

एक = TCR अधिभोग के साथ, सी = रूपांतरण कारक

सी झल्लाहट सिस्टम पर निर्भर करता है और fluorophores के लिए प्रयोग किया जाता है, जो एक स्थिर है। नीचे दिखाया गया के रूप में यह प्रयोगात्मक निर्धारित किया जा सकता है। एक समीकरण 5 के अनुसार एक 2 डी-कश्मीर डी में परिवर्तित किया जा सकता है जबपूर्व के दो परतों का निर्माण करने के लिए टी-कोशिकाओं के अलावा करने के लिए TCR ligands के प्रारंभिक घनत्व में जाना जाता है। इस वजह से SLB संलग्न प्रोटीन की उच्च गतिशीलता की है और यह भी SLBs ligands 2 के एक लगभग अटूट जलाशय प्रदान करते हैं।

5 समीकरण

[pMHC प्रारंभिक] से पहले टी कोशिकाओं के अलावा pMHC की प्रारंभिक घनत्व = के साथ

समीकरणों के साथ 4 और 5 एक अब आसानी से TCR और pMHC बीच synaptic 2 डी-कश्मीर डी निर्धारित कर सकते हैं। यह सबसे मज़बूती स्वीकर्ता विरंजन (प्रोटोकॉल धारा 3.1 देखें) के बाद दाता वसूली के आधार पर झल्लाहट माप के साथ किया जाता है।

हालांकि, सी मैं झल्लाहट झल्लाहट तीव्रता के बीच के रिश्ते को मापने के लिए और TCR अधिभोग एक निर्धारित किया गया है (पृष्ठभूमि के लिए सही, झल्लाहट दाता bleedthrough और स्वीकर्ता पार उत्तेजना झल्लाहट)। इस के लिए, एकमैं दाता झल्लाहट और एक अणु की औसत तीव्रता घटनाओं मैं झल्लाहट एस.एम. झल्लाहट एकल TCR जुड़े झल्लाहट दाता fluorophores (जैसे Cy3 या AF555) एस.एम. की औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता के बीच का अनुपात आर पता करने की जरूरत है। आर प्रतिदीप्ति का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया सवाल, उत्सर्जन फिल्टर और कैमरे में झल्लाहट सिस्टम पर निर्भर करता है।

TCR एक तो सीधे समीकरण 6 के अनुसार निर्धारित किया जा सकता अधिभोग।

समीकरण 6

आर = एस.एम. के साथ मैं मैं झल्लाहट दाता / एसएम झल्लाहट

आर की ओर जाता है H57 scFv- Cy3 / pMHC-Cy5 प्रणाली के लिए 1.45 के रूप में निर्धारित किया गया था:

एक = थोक मैं 1.45 • / थोक मैं TCR-cy3 झल्लाहट

TCR अधिभोग एक और झल्लाहट उपज के बीच के रिश्ते झल्लाहट दाता द्वारा निर्धारित किया जा सकता की वसूलीस्वीकर्ता विरंजन के बाद वाई। रेखीय फिट की चित्रा -4 ए व्याप्ति ढाल के रूप में दिखाया यह दोनों मानकों एक नंबर TCR microclusters के लिए एक दूसरे के खिलाफ साजिश रची है के लिए (समीकरण 4) रूपांतरण कारक सी इंगित करता है।

1.995 के लिए Cy3 / pMHC-Cy5 झल्लाहट प्रणाली और (ख) लागू माइक्रोस्कोप प्रणाली विन्यास - चित्रा -4 ए में प्रदर्शन किया, सी (एक) H57 एससीएफ V के लिए बराबर है। TCR प्रकार के रूप में एक आसानी से deduced किया जा सकता अधिभोग:

TCR अधिभोग एक = 1.995 • उपज झल्लाहट

Protocol

1. प्रोटीन उत्पादन

1 1। Bilayer निवासी प्रोटीन: B7-1, ICAM-1, pMHC (जैसे, आईई कश्मीर / पेप्टाइड)

  1. B7-1 -12H, ICAM-1-12H
    1. एक्सप्रेस B7-1-12H और एक baculovirus अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग कर स्रावित देशी प्रोटीन के रूप में उच्च मात्रा में ICAM-1-12H निर्माणों।
    2. MonoQ आयनों विनिमय क्रोमैटोग्राफी और S200 आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी द्वारा पीछा नी NTA आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी के माध्यम से संस्कृति supernatants से प्रोटीन शुद्ध।
    3. ऐसे एलेक्सा स्त्राव 488 (या FITC), एलेक्सा स्त्राव 555 (या Cy3), एलेक्सा स्त्राव 647 (या Cy5) के एन एच एस succinimidyl एस्टर की तैयारी के रूप में अमाइन प्रतिक्रियाशील रंजक के साथ शुद्ध प्रोटीन की एक विभाज्य लेबल।
    4. S200 आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी के बाद, (एलेक्सा स्त्राव 488, FITC) 488 एनएम पर 555 या 552 एनएम 280 एनएम पर प्रोटीन के अवशोषण और डाई अवशोषण की तुलना द्वारा डाई-निर्माता विनिर्देशों के अनुसार मोनोमेरिक प्रोटीन की लेबलिंग डिग्री का निर्धारण(एलेक्सा स्त्राव 555 या Cy3) या 647 एनएम (एलेक्सा स्त्राव 647 या Cy5)।
      नोट: यह अनुपात बाद में डाई लेबल प्रोटीन के थोक प्रतिदीप्ति संकेत से SLB पर प्रोटीन घनत्व निर्धारित करने के लिए आवश्यक हो जाएगा।
    5. पीबीएस में -20 डिग्री सेल्सियस से अधिक 50% ग्लिसरॉल पर लेबल हटाया गया और fluorophore लेबल प्रोटीन स्टोर।
  2. (यहाँ: आईई कश्मीर -2x6H या IE कश्मीर -12H) pMHC
    1. बाद में मात्रात्मक चुनाव 5, 7 की एक fluorophore संयुग्मित पेप्टाइड के साथ विमर्श किया जा सकता है, जो एक बहुत सस्ती यूवी cleavable पेप्टाइड स्थानापन्न की उपस्थिति में कोलाई में व्यक्त समावेश शरीर से MHC वर्ग द्वितीय refold।
    2. मानक तकनीक (नी NTA आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी, MonoQ आयनों विनिमय क्रोमैटोग्राफी, S200 जेल निस्पंदन) द्वारा refolded pMHC परिसरों शुद्ध।
    3. फ्लोरोसेंट पेप्टाइड 5, 7 के साथ यूवी cleavable पेप्टाइड विनिमय।
    4. PMHC च परिसरों मोनोमेरिक फ्लोरोसेंट शुद्धinally S200 जेल निस्पंदन द्वारा। एक प्रतिनिधि वर्णलेख 3 चित्र में दिखाया गया है।
    5. स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री द्वारा मात्रात्मक पेप्टाइड लोड हो रहा है सत्यापित करें।
    6. पीबीएस / 50% ग्लिसरॉल में -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर प्रोटीन।

1.2। एकल श्रृंखला एंटीबॉडी टुकड़े (एससीएफ वी एस), साइट विशेष लेबलिंग के लिए cysteines की शुरूआत की पीढ़ी

  1. कोलाई में व्यक्त समावेश शरीर से एससीएफ वी एस refold। यहाँ Tsumoto और उनके सहयोगियों 8 द्वारा तैयार एक प्रोटोकॉल का पालन किया जाता है, जिसमें शामिल किए जाने के शव पहले, 6 एम guanidinium क्लोराइड में सामने आया कर रहे हैं पूरी तरह से धीरे-धीरे करके एक सप्ताह के पाठ्यक्रम में कम और फिर refolded प्रोटीन खुलासा guanidinium क्लोराइड की एकाग्रता कम।
  2. 10 केडीए के एक आणविक कटऑफ के साथ आणविक फिल्टर इकाइयों का उपयोग ठीक से मुड़ा हुआ एससीएफ वी ध्यान लगाओ।
  3. S200 जेल निस्पंदन द्वारा ध्यान केंद्रित शुद्ध।
  4. मोनोमेरिक एससीएफ लेबल (TCEP) की उपस्थिति में b> वी। प्रोटीन का एक दाढ़ अनुपात में सबसे अच्छा लेबलिंग प्रतिक्रिया प्रदर्शन: डाई नहीं 1 से अधिक की: आरटी पर 2 2 घंटा से अधिक समय के लिए।
    नोट: TCEP एक phosphorous- आधारित कमी एजेंट है और इन सांद्रता 9 में maleimides साथ प्रतिक्रिया नहीं करता। यह इसलिए यह डाई maleimide व्युत्पन्न के साथ प्रतिक्रिया करता है जब तक कम हो अयुगल sulfhydryl समूह रखने के लिए लेबलिंग प्रतिक्रिया के दौरान उपस्थित हो सकता है।
  5. अंत में S75 के जेल निस्पंदन के माध्यम से मोनोमेरिक एससीएफ वी लेबल शुद्ध। एक प्रतिनिधि वर्णलेख 3 चित्र में दिखाया गया है।
  6. डाई का निर्धारण: प्रोटीन अनुपात spectrophotometrically।
  7. पीबीएस / 50% ग्लिसरॉल में -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर प्रोटीन।

2. कैल्शियम प्रवाह माप

  1. 50 ग्राम Fura-2-पूर्वाह्न युक्त एक ताजा शीशी ले लो और 50 μl पानी से मुक्त DMSO में भंग।
  2. 250-400 ग्राम पर 2 मिनट के लिए एक 5 मिलीलीटर polypropylene दौर नीचे ट्यूब में 10 6 टी कोशिकाओं स्पिन।
  3. : (200 कमजोर पड़ने 1) सेल निलंबन मिश्रण और सेते आरटी पर हांक बैलेंस्ड नमक समाधान प्लस कैल्शियम / मैग्नीशियम और 1% ovalbumin युक्त 200 μl इमेजिंग मध्यम में Resuspend टी कोशिकाओं, Fura-2-AM स्टॉक समाधान के 1 μl जोड़ने 30 मिनट के लिए आरटी पर।
  4. इमेजिंग बफर में एक बार टी-कोशिकाओं को धो लें। इस के लिए, आरटी पर इमेजिंग बफर के साथ कोशिकाओं से युक्त ट्यूब भरने और 5 एक्स 10 6 के अंतिम सेल घनत्व में, तैरनेवाला निकालें और यानी 200 μl इमेजिंग बफर (में सेल गोली resuspend चरण 2 में वर्णित के रूप में गोली कोशिकाओं कोशिकाओं मिलीलीटर -1)। प्रकोष्ठों कैल्शियम मापन के लिए तुरंत इस्तेमाल किया या 3 घंटा अप करने के लिए बर्फ पर रखा जा सकता है।
  5. इमेजिंग बफर में एक क्रियाशील SLB (37 डिग्री सेल्सियस) पर जगह कोशिकाओं। जैसे ही टी-कोशिकाओं SLB से संपर्क शुरू के रूप में, छवियों के निम्नलिखित सेट प्राप्त हर 15 से 30 मिनट के लिए 30 सेकंड के लिए:
    excitat340 +/- 5 एनएम पर आयन, 510 +/- 40 एनएम पर उत्सर्जन का पता लगाने
    380 +/- 5 एनएम पर उत्तेजना, 510 +/- 40 एनएम पर उत्सर्जन का पता लगाने
    डीआईसी (वैकल्पिक)
    नोट: संबंधित जोखिम बार उत्तेजना प्रकाश स्रोत की तीव्रता पर निर्भर करते हैं। संतोषजनक परिणाम प्राप्त कर रहे हैं जब ज़्यादा से ज़्यादा संभव तीव्रता मूल्य के बारे में एक चौथाई (एक) आधा करने के लिए 340 एनएम (380 एनएम) चैनल राशि का पिक्सेल तीव्रता। 340 एनएम पर उत्साहित Fura-2 मूल्यों में वृद्धि होगी और 380 एनएम पर उत्साहित उन टी सेल सक्रियण पर कम हो जाएगा कि मन में रखो।
  6. रन में 20-25 मिनट, 20-50 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर -1 की एक अंतिम एकाग्रता में पूर्व गर्म विरोधी pMHC अवरुद्ध एंटीबॉडी के 50-100 μl जोड़ें। एंटीबॉडी सभी pMHCs संतृप्त और एक परिणाम के रूप में टी कोशिकाओं प्रतिजन को समझते हैं और कैल्शियम fluxing को रोकने के लिए संघर्ष करेंगे। एक और 5 के लिए छवियों रिकॉर्डिंग जारी -। टी कोशिकाओं की गैर सक्रिय राज्य से मेल खाती है, जो intracellular कैल्शियम एकाग्रता के आधारभूत, प्राप्त करने के लिए 10 मिनट < / Li>
  7. 340 एनएम और कोई सेल में शामिल है जो कम से कम 1,000 पिक्सेल की ब्याज की एक क्षेत्र के भीतर 380 एनएम उत्तेजना में औसत पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति संकेत निर्धारित करते हैं। 340 एनएम और 380 एनएम पर उत्साहित सभी मापा Fura-2 छवियों पृष्ठभूमि-घटाना और 340 एनएम / 380 एनएम तीव्रता व्यक्ति की कोशिकाओं के अनुपात या कोशिकाओं के एक समूह की गणना। (PMHC की पूरी एंटीबॉडी नाकाबंदी के साथ, यानी) पांच पिछली बार फ्रेम के अनुपात के माध्यम से सभी अनुपात विभाजित करके तीव्रता अनुपात मानक के अनुसार।
  8. प्लॉट समय के खिलाफ Fura-2 के अनुपात में सामान्यीकृत। नोट: कोशिकाओं और bilayers अच्छी हालत में हैं, Fura -2 340 एनएम / 380 एनएम तीव्रता अनुपात आम तौर पर कोशिकाओं की दोहरी परत के साथ संपर्क किया है 15-45 सेकंड के बाद, 2 और 5 के बीच मूल्यों को अपनाने। अनुपात तो वे कम से कम 20 मिनट या उससे अधिक समय के लिए स्थिर रहने के जहां 1.6 और 2 के बीच एक मूल्य के लिए छोड़ देते हैं। मूल्यों केवल विरोधी pMHC एंटीबॉडी के अलावा के बाद एक के लिए छोड़ देना चाहिए। एक विशिष्ट उदाहरण चित्रा 5 में दिखाया गया है।
"> 3। बल्क माप झल्लाहट

3.1। H57scF वी के साथ TCR सजावट

  1. 250-400 ग्राम पर 2 मिनट के लिए एक 5 मिलीलीटर polypropylene दौर नीचे ट्यूब में 10 6 टी कोशिकाओं स्पिन।
  2. मीडिया, झाड़ू सेल गोली धीरे छानना और सेल निलंबन के लिए एससीएफ वी (एकाग्रता ~ 1 मिलीग्राम / एमएल) के 0.3 μl जोड़ें। थोक के लिए माप केवल scFv लेबल डाई रोजगार झल्लाहट। एक अणु माप लेबल हटाया scFv का एक मिश्रण का उपयोग झल्लाहट के लिए (5-9 भागों, कोई अयुगल सिस्टीन शामिल हैं) और (1 हिस्सा है, एक अयुगल डाई-युग्मित सिस्टीन शामिल हैं) scFv लेबल डाई।
  3. 15 मिनट के लिए बर्फ पर कोशिकाओं को सेते हैं और ठंडा इमेजिंग बफर का उपयोग लगातार centrifugation के माध्यम से कोशिकाओं को दो बार धो लें।
    नोट: कोशिकाओं (0 डिग्री सेल्सियस ~ 4 घंटा 2 में एससीएफ वी हदबंदी की टी 1/2) बाध्य एससीएफ वी के महत्वपूर्ण नुकसान के बिना बर्फ पर संग्रहित किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से भी TCR ट्रांसजेनिक (और से निकाली गई प्राथमिक टी कोशिकाओं की पवित्रता Rag-टी-कोशिकाओं टी सेल संस्कृति को प्रोत्साहन के लिए जोड़ा गया है, जो पेप्टाइड, के जवाब में (7) कोशिका विभाजन के लिए ऊपर proliferating केवल कोशिकाओं रहे हैं के बाद से 1/2 चूहों की कमी) और इन विट्रो में उत्तेजित अधिक से अधिक 98% है। बी कोशिकाओं apoptosis से गुजरना है और अब खेती के 7-10 दिनों के बाद जीवित हैं। कुछ वृक्ष के समान कोशिकाओं अभी तक आसानी से, क्योंकि उनके अलग आकृति विज्ञान की न केवल उनके साथ भेदभाव किया जा सकता जीवित रहते हैं लेकिन यह भी कि वे H57 विरोधी TCR बीटा scFv टुकड़ा बाँध नहीं है।

3.2। स्वीकर्ता विरंजन के बाद दाता वसूली के माध्यम से माप झल्लाहट

नोट: 22.5 डिग्री सेल्सियस पर 50 मिनट के लिए, TCR-H57 एससीएफ वी परिसरों के आधे जीवन बर्फ पर 4 घंटा के बराबर है कि मन में रखो और 37 डिग्री सेल्सियस पर 6.8 मिनट के लिए (और बर्फ पर लगभग 4 घंटे के लिए) 2। जब तक H57 एससीएफ वी कार्य करता है के रूप में झल्लाहट दाता के रूप में मापा जाता है, झल्लाहट पैदावार, हालांकि, शोर अनुपात बढ़ जाती है के लिए संकेत H57 एससीएफ वी हदबंदी के प्रति संवेदनशील नहीं हैंबढ़ी हुई H57 हदबंदी के साथ।

  1. एक SLB युक्त AF647 / Cy5 लेबल pMHCs तैयार करने के साथ ही लेबल हटाया ICAM -1 और बी 7 Axmann एट अल। 4 के अनुसार।
  2. हांक बैलेंस्ड नमक समाधान प्लस कैल्शियम / मैग्नीशियम और 1% ovalbumin युक्त इमेजिंग माध्यम के साथ इमेजिंग कक्ष की पीबीएस विनिमय। कुएं में इमेजिंग बफर के इस pipet के 400 μl के लिए, ध्यान से मिश्रण है और अच्छी तरह से 400 μl को हटा दें। इस प्रक्रिया में 3-4 बार दोहराएँ। किसी भी समय हवा के लिए SLB का खुलासा नहीं करते।
  3. खुर्दबीन मंच पर इमेजिंग कक्ष रखें और फ्लोरोसेंट (AF647, Cy5) SLB स्पष्ट देखने में आता है, जब तक ध्यान समायोजित।
  4. पेरिस्कोप के translational मंच के चलते माध्यम उद्देश्य के फोकल हवाई जहाज़ की परिधि के लिए ऑप्टिकल अक्ष के लिए ध्यान केंद्रित बीम समानांतर अनुवाद करके TIRF रोशनी की स्थापना की।
  5. TIRF मोड में उत्तेजना लेजर बीम को ठीक करने, AF555 के साथ सजाया टी-कोशिकाओं को जोड़ने / Cy3 एससीएफ वी लेबल
  6. संकेत क्रम में और तेजी से उत्तराधिकार (चित्रा 6) में निम्नलिखित छह छवियों का मोल:
    (I1, वैकल्पिक) सफेद प्रकाश, सेल की एक छवि लेने के लिए
    (I2, वैकल्पिक) 647 एनएम उत्तेजना (कम शक्ति), ब्लीच नाड़ी करने से पहले (pMHC) झल्लाहट स्वीकर्ता की एक छवि लेने के लिए
    (I3) 514 एनएम उत्तेजना (कम शक्ति), ब्लीच नाड़ी करने से पहले झल्लाहट दाता की एक छवि (TCR) लेने के लिए
    647 एनएम उत्तेजना (उच्च शक्ति) तस्वीर ब्लीच झल्लाहट स्वीकर्ता (I4), /> (I5) ब्लीच नाड़ी के बाद 514 एनएम उत्तेजना (कम शक्ति) झल्लाहट दाता की एक छवि लेने के लिए (TCR),
    (I6) 647 एनएम उत्तेजना (कम शक्ति) पूरा झल्लाहट स्वीकर्ता विरंजन सत्यापित करने के लिए।
  7. बाद में विश्लेषण के लिए छवियों सहसंबंधी करने में सक्षम होने के लिए आदेश में छवियों (i3) और जितना संभव हो कम (i5) के बीच समय बीत रखें। अभी भी टी-कोशिकाओं के समुचित इमेजिंग के लिए अनुमति देता है जो संभव शक्ति स्तर, पर उत्तेजना को रोजगार से कम से कम झल्लाहट दाता विरंजन रखें।
  8. (I3) में इसकी औसत तीव्रता का निर्धारण, ब्याज (आरओआई), उदाहरण के लिए, एक पूरे अन्तर्ग्रथन या एक व्यक्ति TCR microcluster की एक क्षेत्र उठाओ (= मैं (3)) और (i5) में (= मैं (5))। पृष्ठभूमि घटाव के लिए, में रोशनी स्थान के बाहर ही आयाम का एक रॉय लेने (3) या (5) और इसकी औसत तीव्रता का निर्धारण (मैं (पृष्ठभूमि))। झल्लाहट उपज निम्नलिखित कार्रवाई करने के निर्धारित करें:
    जी "/> (समीकरण 7)
    नोट: यह पूर्ण झल्लाहट स्तर के संबंध में, यह दाता छवियों (i5) के बीच ब्लीचिंग और (i3) के लिए सही करने के लिए आवश्यक हो सकता है कि ध्यान दिया जाना चाहिए।

3.3। अवगत उत्सर्जन के माध्यम से माप झल्लाहट

  1. सभी उत्सर्जन चैनलों में प्रतिदीप्ति जो बहुरंगी मोती, के उपयोग के साथ स्थानिक दाता और स्वीकर्ता चैनल संरेखण प्रदर्शन करते हैं। कारण रंगीन विपथन के लिए दोनों चैनलों के बीच स्थानिक पारी सुपर स्थिति अलग-अलग मोती द्वारा निर्धारित किया जा सकता है और सभी निम्न 2-रंग छवि जोड़े 10 के लिए दो चैनलों में से एक के सुधार के लिए लागू हो गया है।
  2. अकेले झल्लाहट दाता fluorophore युक्त एक SLB के उपयोग के साथ दाता bleedthrough की डिग्री का निर्धारण। यह भी लेबल हटाया pMHC के साथ एक लिपिड bilayer पर झल्लाहट दाता लेबल टी कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए संभव है। पृष्ठभूमि पहली बार देखने के प्रबुद्ध क्षेत्र के बाहर निर्धारित किया है और उसके बाद दोनों चैनलों से घटाया जाता है। इस तरह औसत बीए ckground-सही ROIs इसी दो की तीव्रता (मैं दाता चैनल और मैं चैनल स्वीकर्ता) निर्धारित कर रहे हैं। इस प्रकार के रूप bleedthrough गुणांक (बीटीसी) की गणना:
    समीकरण 8 (समीकरण 8)
    नोट: यह बीटीसी एक निश्चित डाई और फिल्टर सेट संयोजन के लिए एक स्थिर है।
  3. इस प्रकार के रूप झल्लाहट दाता bleedthrough की छवि की गणना:
    समीकरण 9 (समीकरण 9)
  4. (जैसे, आईई कश्मीर / एमसीसी-एलेक्सा स्त्राव 647) पहली झल्लाहट दाता उत्तेजना प्रकाश के साथ (उदाहरण के लिए।, 514 एनएम) और फिर स्वीकर्ता उत्तेजना प्रकाश के साथ (जैसे, 647 अकेले झल्लाहट स्वीकर्ता fluorophore युक्त रोमांचक एक SLB द्वारा स्वीकर्ता पार उत्तेजना का निर्धारण करें एनएम)। इस प्रकार के रूप पार उत्तेजना गुणांक (सीईसी) की गणना करने के लिए झल्लाहट स्वीकर्ता चैनल के अंदर पृष्ठभूमि घटाया छवियों का उपयोग करें:
    ftp_upload / 53,157 / 53157eq10.jpg "/> (समीकरण 10)
  5. सीईसी दाता उत्तेजना के लिए इस्तेमाल किया लेजर तीव्रता पर निर्भर करता है के रूप में, प्रत्येक माप दिन पर यह निर्धारित करते हैं। पूरी तरह पार उत्तेजना के माध्यम से उत्पन्न छवि की गणना करने के परिणामस्वरूप मुख्य चुनाव आयुक्त का प्रयोग करें।
    समीकरण 11 (समीकरण 11)
  6. इस प्रकार के रूप bleedthrough और पार उत्तेजना के लिए सही झल्लाहट की छवि की गणना:
    समीकरण 12 (समीकरण 12)
    नोट: निरपेक्ष संकेत झल्लाहट (नहीं बल्कि रिश्तेदार झल्लाहट उपज) टी-कोशिका झिल्ली बाध्य TCR से H57 एससीएफ वी की हदबंदी के प्रति संवेदनशील है। TCR झल्लाहट जांच की अत्यधिक हानि से बचने के लिए, दो परतों का निर्माण करने के लिए टी-कोशिकाओं के अलावा के बाद पहले 2 मिनट के भीतर 37 डिग्री सेल्सियस पर मापन का प्रदर्शन करना है। मात्रात्मक (≥ 95%) TCR लेबलिंग के साथ माप पहले 3 मिनट के बाद के भीतर कम से या 22.5 डिग्री सेल्सियस से नीचे ही संभव हैंबाईलेयर के लिए टी-कोशिकाओं के अलावा।

4. एकल अणु झल्लाहट माप

  1. नमूना पर 1-5 किलोवाट / माइक्रोन 2 की तीव्रता को जन्म देने के लिए दोनों लेज़रों की शक्ति को समायोजित करें। अधिक जानकारी के लिए Axmann एट अल को देखें। 4।
  2. लेबल हटाया एससीएफ वी (5-9 भागों) और Cy3 / AF555 लेबल एससीएफ वी (भाग 1) का मिश्रण के साथ ऊपर उल्लिखित के रूप में लेबल टी कोशिकाओं। नोट: केवल TCRs का एक अंश झल्लाहट दाता के साथ चिह्नित है इस तरह। यह पता लगाने योग्य बातचीत की संख्या कम कर देता है, लेकिन दाता bleedthrough से उत्पन्न शोर भी व्यक्ति एक अणु की घटनाओं झल्लाहट का समाधान करने के लिए महत्वपूर्ण है, जो (लगभग 5 1/2 1/2 10 से) काफी कमी आई है।
    नोट: यह एक बहुत बड़ा समय सीमा में SLB बाध्य pMHC (उप-दूसरे से TCR की हदबंदी की तुलना में (घंटे मिनट) के लिए होता है के रूप में TCR से H57 scFv जांच की हदबंदी, माप प्रभावित नहीं करता है दूसरारेंज)।
  3. खुर्दबीन मंच पर AF647 लेबल pMHCs के साथ ही ICAM और B7 विशेषता एक SLB रखें और bilayer स्पष्ट देखने में आता है, ताकि ध्यान समायोजित।
  4. वैकल्पिक: अन्तर्ग्रथन छोड़कर रोशनी के क्षेत्र के बहुमत के नकाब को (। Axmann एट अल 4 में दिखाया गया है) उत्तेजना मार्ग में एक भट्ठा एपर्चर डालें। सख़्त आईई कश्मीर / एमसीसी (सी) -Alexa स्त्राव 647 झल्लाहट स्वीकर्ता अणुओं रोशनी के क्षेत्र में स्थानांतरित कर सकते हैं इस तरह।
  5. (इमेजिंग बफर) के साथ दो परतों का निर्माण करने के लिए H57 एससीएफ वी सजाया टी कोशिकाओं को जोड़ें, और synapses देखने के क्षेत्र में दिखाई देते हैं जब तक प्रतीक्षा करें।
  6. तेजी से उत्तराधिकार में 2-रंग का पता लगाने का उपयोग कर 10 से 20 छवि सेट के एक दृश्य लें:
    i1) उत्तेजना 514 एनएम
    I2) उत्तेजना 647 एनएम
  7. 1 से 5 मिसे के लिए छवियों को बेनकाब और छवियों का एक सेट के रूप में प्राप्त करते हैं।
  8. घटनाओं झल्लाहट एक अणु की पहचान का आकलन करने के लिए, दाता bleedthrough और स्वीकर्ता पार excita के बारे में ही सुधार लागूtion। इसके अलावा, एक अणु की घटनाओं एकल स्वीकर्ता अणुओं के साथ तालमेल करने के लिए है और दिखाई देते हैं और एक कदम (भी 7 आंकड़ा देखें) में गायब हो जाना चाहिए झल्लाहट।
  9. ऑफ-दर निर्धारण
    1. एक अणु के रिकार्ड निशान कई अधिग्रहण समय फ्रेम के लिए घटनाओं झल्लाहट।
      नोट: 5c.c7 के बीच बंद-दर TCR और IE कश्मीर / K3 के चार अलग अलग देरी बार (42 मिसे, 490 मिसे, 1007 मिसे, 1989 मिसे) के साथ 25 डिग्री सेल्सियस पर मापा जाता है, इस उदाहरण में (इटैलिक में)।
    2. तालिका 1 में दिखाया गया के रूप में सूची झल्लाहट उनके ट्रेस लंबाई के अनुसार बताते हैं।
    3. एक उलटा संचयी क्षय समारोह दिखाया (रंग संख्या 1 टेबल से लिया जाता है) के रूप में (तालिका 2) में 1 टेबल कन्वर्ट।
    4. जिसके परिणामस्वरूप क्षय समारोह को सामान्य करने के लिए, कि विशेष समूह में सभी निशान का योग द्वारा 2 टेबल के निशान की संख्या में विभाजित। समय फ्रेम की संख्या के खिलाफ सामान्यीकृत मूल्यों प्लॉट। एक शून्य होता है, जो पिछली बार फ्रेम, छोड़ते हुए, जब decays पढ़ा जा सकता हैily एक एकल घातीय समारोह (चित्रा 8A) के साथ लगाया।
    5. एक्स = टी अंतराल = 0.042: चित्रा 8B में दिखाया गया है, उम्मीद मूल्य <n (टी अंतराल)>, यानी, इस उदाहरण में कार्यरत देरी समय टी अंतराल के खिलाफ ऊपर निर्धारित किया क्षय समारोह के प्रतिपादक के नकारात्मक उलटा (साजिश s और y = <n (टी अंतराल)> = 1 / 0.662 = 1.511, एक्स = 0.49 रों और y = 1 / 0.902 = 1.101, एक्स = 1.007 और Y = 1 / 1.131 = 0.884, एक्स = 1.989 और Y = 1 / 1.591 = .629)।
    6. फ़िट τ से दूर है और इस तरह के मूल के रूप में एक वैज्ञानिक डेटा विश्लेषण कार्यक्रम के एक गैर रेखीय फिटिंग समारोह का उपयोग किया जा सकता है समीकरण 3 पर आधारित <n ब्लीच>।
      नोट: इस उदाहरण में दिखाया गया है सबसे अच्छा फिट 2.12 +/- 0.23 रों से दूर एक τ पैदावार और एक 1.53 +/- 0.06 सेकंड का <n ब्लीच>।
    7. एचएएल की गणना• एल.एन. बंद = τ बंद टी 1/2 के साथ बंद 1/2 टी बातचीत का च जीवन (2) (इस उदाहरण में: 1.47 एस)।
  10. 2 डी-कश्मीर घ दृढ़ संकल्प
    1. समीकरण 6 के उपयोग के साथ कार्यरत झल्लाहट डाई जोड़ी के लिए रूपांतरण कारक सी निर्धारण और चित्रा (4 क) ऊपर उल्लिखित के रूप में।
    2. व्यक्तिगत TCR microclusters या पूरे synapses (आंकड़े -3 बी और 5) के लिए झल्लाहट पैदावार निर्धारित करते हैं।
    3. समीकरण 4 कन्वर्ट का प्रयोग TCR ऑक्यूपेंसी में सभी व्यक्तिगत झल्लाहट पैदावार (चित्रा 4C)।
    4. 2 डी-कश्मीर डी एस में सभी TCR ऑक्यूपेंसी कन्वर्ट करने के समीकरण 11 को लागू करें। नीचे दिया गया है के रूप में, अन्तर्ग्रथनी बाध्यकारी inhomogeneous है। अन्तर्ग्रथनी कश्मीर डी एस के लिए एक सार्थक उपाय सभी मापा microclusters (चित्रा 4D) के (लाल रंग में संकेत दिया) मंझला है।
  11. एस पर 2 डी-कश्मीर की गणना
    1. कश्मीर डी और बंद प्रयोगात्मक निर्धारित कश्मीर और कश्मीर डी मूल्यों बंद / कश्मीर = पर कश्मीर के साथ बड़े पैमाने पर कार्रवाई के कानून के साथ पर कश्मीर की गणना।
      नोट:       4 चित्र में दिखाया प्रयोग के लिए बंद अन्तर्ग्रथनी कश्मीर (आईई कश्मीर / एमसीसी 25 डिग्री सेल्सियस पर 5c.c7 TCR के साथ बातचीत) 0.41 s है -1। चित्रा 4E के रूप में दिखाया इसलिए कश्मीर डी साजिश (चित्रा 4D) भूखंड पर एके में परिवर्तित किया जा सकता है।

Representative Results

Fura-2 कैल्शियम डाई के माध्यम से intracellular कैल्शियम की रिकॉर्डिंग के साथ ही बाद में सेलुलर विश्लेषण उत्तेजक शक्ति और 4 चित्र में दिखाए गए हैं SLBs की इसलिए कार्यक्षमता को सत्यापित करने के लिए। स्पष्ट हो जाता है, कैल्शियम के स्तर के रूप में व्यक्त (टी कोशिकाओं में वृद्धि आधारभूत तुरंत जैसे ही वे उत्तेजक SLBs पर बसने के रूप में) एक साथ की जा रही सामान्यीकृत Fura-2 340nm / 380nm अनुपात। कैल्शियम का स्तर शीघ्र ही TCR सगाई और जिसमें से ब्लॉकों pMHCs टी सेल सक्रियण समाप्त हो जाता है, जो एक एंटीबॉडी के बाद इसके अलावा आधारभूत स्तर पर लौटने।

चित्रा 6 (4 चित्र में दिखाया गया है) झल्लाहट पैदावार को मापने के लिए कार्यरत है, जो और 2 डी-कश्मीर डी मूल्यों की गणना करने के लिए कार्य करता है जो स्वीकर्ता विरंजन, बाद झल्लाहट दाता वसूली से जुड़े एक ठेठ प्रयोग को दर्शाया गया है। झल्लाहट एक की तेजी से और पूरी पृथक के बाद AF555 के माध्यम से लेबल TCR प्रतिनिधित्व करता है जो झल्लाहट दाता तीव्रता में वृद्धि हुई है, कृपया ध्यान दें,cceptor प्रजातियों (यहाँ: pMHCs के साथ जुड़े AF647)। यह भी स्पष्ट झल्लाहट चैनल में मजबूत कमी है, यानी, झल्लाहट स्वीकर्ता विरंजन के बाद झल्लाहट दाता उत्तेजना के तहत झल्लाहट स्वीकर्ता चैनल। मुश्किल से दिखाई शेष संकेत दाता bleedthrough झल्लाहट करने के लिए मेल खाती है। व्यक्तिगत TCR microclusters या पूरे synapses के भीतर झल्लाहट पैदावार गणना संकेत दिया मापा तीव्रता मूल्यों (चित्रा 6B) पर आधारित हैं।

चित्रा 7 दो समय फ्रेम में दिख एक अणु झल्लाहट घटना के एक प्रक्षेपवक्र और समय व्यतीत हो जाने को दर्शाया गया है। शुरूआत में जैसा कि ऊपर उल्लिखित इस तरह के व्यवहार दोनों बाध्यकारी अन्तर्ग्रथनी TCR-pMHC के क्षय और photobleaching के कारण होता है। इन दोनों के योगदान के बीच भेदभाव करने, प्रयोगात्मक अधिग्रहण समय फ्रेम अवधि में अलग किया जाना है: photobleaching एक निरंतर बनी हुई है, जबकि झल्लाहट घटना प्रक्षेपवक्र लंबाई में परिवर्तन केवल बाध्यकारी कैनेटीक्स के कारण होता है। Tracelengths का एक quantitation, डब्ल्यू hich 7 चित्र में दिखाया ऑफ दरों और विरंजन की गणना के लिए आधार बनाता है, से 3 तालिकाओं में 1 प्रदान की जाती हैं।

2 डी-कश्मीर डी एस के निर्धारण थोक की रिकॉर्डिंग झल्लाहट दाता लेबल TCRs के लिए पैदावार झल्लाहट की आवश्यकता है। प्रयोगात्मक deduced निरंतर सी (चित्रा 4) के उपयोग के साथ, एक TCR microcluster या एक पूरी अन्तर्ग्रथन के लिए मापा झल्लाहट उपज TCR में अधिभोग परिवर्तित किया जा सकता है, यानी, pMHC-लगे हुए हैं और कुल TCRs के अनुपात (चित्रा 4C) । पूर्व के टी सेल के अलावा SLB पर उपस्थित ज्ञात pMHC घनत्व के साथ, एक मूल्यों अन्तर्ग्रथनी 2 डी-कश्मीर डी मूल्यों (चित्रा 4D) का निर्धारण करने के लिए लागू किया जा सकता है। ऑन-दरों में बड़े पैमाने पर कार्रवाई के कानून के साथ गणना की जा सकती है (पर 2 डी-कश्मीर = 2 डी-कश्मीर / 2 डी-कश्मीर घ बंद) चुना गया अन्तर्ग्रथनी से बंद-दर और 2 डी-केडी मूल्यों।

1 "src =" / फ़ाइलें / ftp_upload / 53,157 / 53157fig1.jpg "/>
चित्रा 1. तलीय गिलास समर्थित लिपिड bilayer (SLB) प्रणाली के योजनाबद्ध रूपरेखा। (ए) SLBs इसी लिपिड से मिलकर POPC (90-99%) और सिंथेटिक लिपिड डीजीएस नी NTA (1-10%) से बना है और साफ कांच सतहों छोटे unilamellar पुटिकाओं (एसयूवी) के साथ चार्ज किया जाता है जब अनायास रूप होते हैं। (बी) एक बार का गठन, ऐसे SLBs टी कोशिकाओं के लिए APCs के रूप में काम करने के लिए घुलनशील polyhistidine टैग बाह्य pMHCs से निकाली गई भागों, costimulatory B7-1 प्रोटीन और ICAM -1 आसंजन प्रोटीन, साथ क्रियाशील किया जा सकता है। SLBs तैयारी के बारे में अधिक जानकारी के लिए Axmann एट अल। 4 को देखें। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
Figu 2. Forster अनुनाद ऊर्जा पुन स्थानांतरण आधारित परख TCR-pMHC बगल में बाध्यकारी quantitate करने के लिए। (ए) एक pMHC आकर्षक एक H57 एकल श्रृंखला टुकड़ा के साथ complexed एक TCR की एक समग्र संरचना यहाँ बताया झल्लाहट आधारित दृष्टिकोण को दिखाता है। के बारे में 41A झल्लाहट के दौर से गुजर दो इसी fluorophores को अलग करने की कम दूरी पर ध्यान दें। Fluorophore-maleimides के लिए अपनाने साइटों हरे और लाल रंग में संकेत कर रहे हैं। (बी) के बगल में TCR-pMHC बातचीत का पता लगाने के सिद्धांत सचित्र है। केवल एससीएफ वी विशिष्ट परिसरों जो फार्म TCRs और pMHCs (यहाँ आईई कश्मीर), -decorated, एक औसत दर्जे का संकेत झल्लाहट को जन्म दे। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा एससीएफ वी एस मोनोमेरिक और पेप्टाइड से भरी हुई आईई कश्मीर -2x6H अणुओं को अंतिम जेल निस्पंदन कदम जन्म देने के 3. chromatograms। एक्स-कुल्हाड़ियों मिलीलीटर में प्रतिधारण मात्रा का प्रतिनिधित्व करते हैं, वाई-कुल्हाड़ियों मनमाना इकाइयों में 280 एनएम (एयू) absorbance का संकेत । (ए) H57 एससीएफ वी साइट विशेष एलेक्सा स्त्राव 555 maleimide प्रोटीन (कदम 1.2.5) से unreacted डाई अलग करने के लिए S75 के क्रोमैटोग्राफी के अधीन था के साथ लेबल। प्रतिधारण अंतराल के लिए 14 to15 मिलीलीटर (धराशायी लाइनों) इसी अंशों मोनोमेरिक H57 एससीएफ वी लेबल का प्रतिनिधित्व करते हैं। यूवी cleavable एएनपी अंतरिक्ष धारक पेप्टाइड के साथ complexed (बी) आईई कश्मीर -2x6H अणुओं, यूवी विकिरणित किया गया साइट विशेष रूप से एलेक्स के साथ incubated था 647 maleimide लेबल पेप्टाइड और अंत में मुक्त पेप्टाइड (कदम 1.1.2.4) से प्रोटीन को अलग करने के S200 क्रोमैटोग्राफी के अधीन है। शामिल ठीक से मुड़ा हुआ धराशायी लाइनों और मोनोमेरिक pMHCs के बीच अंतराल। (ए, बी) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. निर्धारण 2 डी-कश्मीर डी एस एंड एस पर 2 डी-कश्मीर। (ए) स्वीकर्ता विरंजन और TCR अधिभोग प्रयोगात्मक मापा गया था के बाद दाता वसूली द्वारा निर्धारित रूप में झल्लाहट उपज के बीच संबंध। धारा 4.2 के रूप में समझाया TCR अधिभोग व्यक्ति TCR microclusters के लिए निर्धारित किया जा सकता है। डेटा की एक रेखीय फिट लाइन द्वारा प्रदर्शित किया जाता है, जो की ढलान TCR के बीच का अनुपात सी के बराबर हैअधिभोग और झल्लाहट उपज। सी झल्लाहट प्रणाली और कार्यरत fluorophores (यहाँ Cy3 और Cy5) के लिए एक निरंतर विशिष्ट है। इस उदाहरण में यह (बी)। 1.988 झुकेंगे उपज डेटा व्यक्ति TCR microclusters के लिए निर्धारित किया गया है झल्लाहट (एन = 187, तापमान = 24 डिग्री सेल्सियस) स्वीकर्ता विरंजन के दाता वसूली के माध्यम से। हिस्टोग्राम सलाखों के नीचे संख्या अंतराल के भीतर ऊपरी सीमा का संकेत मिलता है। मापा गुणा करके (बी) में दिखाया गया डेटा (सी) रूपांतरण (ए) सी में निर्धारित निरंतर साथ पैदावार झल्लाहट। सलाखों के नीचे संख्या अंतराल के भीतर ऊपरी सीमा का संकेत मिलता है। (डी) हिस्टोग्राम (अर्द्ध लघुगणक, आधार = 4) व्यक्तिगत TCR microclusters के लिए मापा 2 डी-कश्मीर डी एस के वितरण का चित्रण। मंझला 2 डी-कश्मीर डी नीले रंग में संकेत दिया है। सलाखों के नीचे संख्या (ई) (डी) में दिखाया गया हिस्टोग्राम। अंतराल के भीतर ऊपरी सीमा से संकेत मिलता है पूर्णांक परिवर्तित कर दिया गयाOA 2 डी-कश्मीर 24 डिग्री सेल्सियस के लिए बंद अन्तर्ग्रथनी कश्मीर रोजगार -histogram (अर्द्ध लघुगणक, आधार = 4) पर (0.41 -1 एस)। मूल्य पर निर्धारित मंझला 2 डी-कश्मीर नीले रंग में संकेत दिया है। डेटा मूल रूप Huppa एट अल। 2 में प्रकाशित किए गए थे और एक नया प्रारूप में यहाँ कल्पना कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
SLBs चित्रा 5. कार्यात्मक सत्यापन टी सेल उत्तेजना और इमेजिंग के लिए कार्यरत हैं। Fura-2 के साथ भरी हुई (ए) TCR ट्रांसजेनिक टी सेल विस्फोटों प्रतिजनी pMHCs, ICAM -1 और बी 7 शरण उत्तेजक SLB के साथ सामना कर रहे थे। सेलुलर 340 एनएम और 380 एनएम पर उत्साहित Fura-2 उत्सर्जन के साथ-साथ डीआईसी छवियों दर्ज किए गए। संकेत के रूप में, उत्सर्जन तीव्रता के अनुपात मूल्यों 34 पर उत्साहित0 और 380 एनएम सही पैनल में दिखाया जाता है। उत्तेजक SLBs से संपर्क pMHC प्रयोगात्मक रन में एंटीबॉडी 14 मिनट अवरुद्ध करने के अलावा टी-कोशिकाओं आराम कर के बराबर intracellular कैल्शियम के स्तर में कमी के परिणामस्वरूप। (बी) में औसत Fura-2 अनुपात की एक ठेठ अस्थायी प्रोफ़ाइल टी कोशिकाओं में होती है एंटीबॉडी की मध्यस्थता नाकाबंदी के बाद प्रतिजन से वंचित गैर सक्रिय टी-कोशिकाओं या टी-कोशिकाओं की तुलना में 2-4 गुना अधिक है जो intracellular कैल्शियम में एक प्रारंभिक वृद्धि से। हरी हलकों (ए) में सचित्र समय अंक संकेत मिलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
झल्लाहट स्वीकर्ता विरंजन के बाद झल्लाहट दाता वसूली के माध्यम से मापा के रूप में चित्रा 6 थोक पैदावार झल्लाहट। एट अल 4)। छोड़ दिया डीआईसी छवि में दिखाया लाइन टी सेल अन्तर्ग्रथन की सीमा को इंगित करता है। (बी)। के रूप में अच्छी तरह से झल्लाहट स्वीकर्ता विरंजन (चरण 4) के बाद झल्लाहट दाता चैनल में तीव्रता में वृद्धि हुई है झल्लाहट स्वीकर्ता चैनल के अंदर की तीव्रता में नुकसान नोट व्यक्ति अन्तर्ग्रथनी क्षेत्रों के लिए या पूरे synapses के लिए संकेत के रूप में क्षमता मात्रा निर्धारित किया जा सकता झल्लाहट। निरीक्षण के लिए, पहले और झल्लाहट स्वीकर्ता विरंजन के बाद छवियों दो देखने सारणी (luts, हरे और भौतिकी) के उपयोग के साथ दिखाया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। चित्रा 7
चित्रा 7. एक अणु की घटनाओं दिखाई देते हैं और insingle कदम गायब हो और पूरी तरह से एक भी झल्लाहट स्वीकर्ता fluorophore साथ गठबंधन कर रहे हैं झल्लाहट। एक अणु झल्लाहट घटना के समय व्यतीत हो जाने के दिखाया गया है। छवियाँ एक के पीछे से प्रबुद्ध EMCCD कैमरे का उपयोग कर हासिल किया गया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

आंकड़ा 8
Τ बंद निर्धारण 8 चित्रा = 1 / मापा smFRET प्रक्षेप पथ से कश्मीर बंद। (ए) 5c.c7 TCR ट्रांसजेनिक टी सेल विस्फोटों आईई <पहचानने सजाया H57 एससीएफ वी -AF555 से निकाली गई नमूदार झल्लाहट संकेतों (की सामान्यीकृत संचयी रकमसमर्थन> / K3-AF647 चार अलग-अलग समय lags (42 मिसे, 490 मिसे, 1007 मिसे, 1989 मिसे) के लिए 24 डिग्री सेल्सियस) पर टिप्पणियों की कुल संख्या के एक समारोह के रूप में प्लॉट किए जाते थे कश्मीर। मोनो घातीय फिट कार्य करता है। उम्मीद मूल्यों <n (टी अंतराल)> के नकारात्मक उलटा इसी को जन्म दे (बी) के उम्मीद मूल्यों देरी टी अंतराल के खिलाफ साजिश रची और <n (टी अंतराल)> समीकरण का उपयोग फिट = τ बंद / {(<n ब्लीच> / बंद τ) + टी अंतराल} τ बंद उपज और <n ब्लीच>। के लिए यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

बगल में प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत मापने ऐसे TCR-pMHC 11 बंधन के रूप में कम आत्मीयता बातचीत के साथ काम कर रहे हैं, खासकर जब अति आवश्यक है। पर-दर के साथ-साथ ऐसी बातचीत की स्थिरता काफी बाध्यकारी जगह लेता है, जिसके तहत विशेष परिस्थितियों से प्रभावित हैं क्योंकि यह है। न्यूनतम इनवेसिव झल्लाहट आधारित इमेजिंग दृष्टिकोण पूरी तरह से इस तरह के कार्यों के लिए अनुकूल सिद्धांत रूप में इस प्रकार हैं, फिर भी पहले दूर किया जाना चाहिए कि बाधाओं के एक नंबर शामिल है। सेलुलर autofluorescence द्वारा उत्पन्न शोर माप की संवेदनशीलता को सीमित करता है और इसलिए कम से कम रखा जाना चाहिए। TIRF माइक्रोस्कोपी आदर्श चुनाव 13-15 के प्रोटीन के साथ सजाया एक तलीय गिलास समर्थित लिपिड bilayer के रूप में बहुत अच्छी तरह से 12 इस जरूरत कार्य करता है, लेकिन कांच के रूप में स्लाइड के functionalization की आवश्यकता है। एक आंशिक रूप से reconstitutive दृष्टिकोण का एक और लाभ पुनः संयोजक बाईलेयर निवासी झल्लाहट भागीदारों के बहुत मीटर हो सकता हैआसानी से छोटे और उज्जवल fluorophores के साथ एक मात्रात्मक, साइट विशेष और तर्कसंगत तरीके से लेबल अयस्क कोशिका की सतह व्यक्त प्रोटीन के साथ संभव होगा की तुलना में। पहले 2 परीक्षण किया गया था के रूप में TCRs, पुनः संयोजक एस सी एफ वी एस, टी-सेल मान्यता को प्रभावित नहीं करते हैं, जिसके साथ टैग कर रहे हैं। इसके अलावा, SLB की प्रोटीन संरचना, उदाहरण के लिए pMHCs के घनत्व और गौण कारकों के चुनाव से एक की विशिष्ट जरूरतों को समायोजित किया जा सकता है। हम पहले उत्तेजक pMHCs के घनत्व के साथ अलग प्रयोगों का प्रदर्शन किया है, लेकिन बंद 2 डी-कश्मीर और 2 डी-कश्मीर डी 2 में काफी अंतर का पता नहीं है।

अब तक यहां MHC वर्ग द्वितीय अणुओं की मान्यता, जिसका मुख्य कारण दोनों सिरों पर खुला है, जो उनके पेप्टाइड बाइंडिंग फांक, की प्रकृति के कारण, केवल के साथ पेश किया गया है और इस तरह की fluorophore कुर्की के लिए एक संयोजक सहित बड़े पेप्टाइड्स रह सकते हैं। कुछ मामलों में इस तरह के दृष्टिकोण को भी लेबलिंग एमएचसी सीएलए के लिए काम हो सकता हैएसएस मैं 16 अणुओं लेकिन बड़ी सावधानी के प्रयोगों में उनके उपयोग को सत्यापित करने के लिए लिया जाना चाहिए। सतह plasmon अनुनाद द्वारा इन विट्रो में मापा के रूप में टी सेल प्रसार assays के लिए, साथ ही कैनेटीक्स बाध्यकारी pMHC-TCR के माध्यम से मापा जा सकता है, जो एंटीजन की ओर टी-कोशिकाओं की संवेदनशीलता लिंकर और फ्लोरोफोरे के के अलावा द्वारा प्रभावित नहीं होना चाहिए पेप्टाइड। वैकल्पिक रूप से, मैं खुद को अणुओं MHC वर्ग भारी श्रृंखला (अप्रकाशित टिप्पणियों) के अनुक्रम में एक unpaired सिस्टीन की शुरूआत के साथ एक साइट विशेष ढंग से लेबल किया जा सकता है।

उचित आणविक जांच के उपयोग के साथ किसी भी synaptic प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत सिद्धांत रूप में वर्णित एक फैशन में अध्ययन किया जा सकता है। उदाहरण के लिए इस तरह की जांच, एससीएफ वी एस या डिजाइन Ankyrin दोहराएँ प्रोटीन (DARPins) 17, मोनोवैलेन्ट होना चाहिए और ब्याज की बातचीत को प्रभावित किए बिना स्थिरतापूर्वक अपने लक्ष्य के लिए बाध्य करना चाहिए। बेशक, संरचनात्मक informatioएन तर्कसंगत जांच डिजाइन के लिए उच्च वांछनीय नहीं बल्कि बिल्कुल आवश्यक है। झल्लाहट में भागीदारों की एक नई जोड़ी की स्थापना करते हैं, यह रिकॉर्ड और पहले थोक में झल्लाहट का विश्लेषण करने के लिए सिफारिश की है। लेबल लगाव की साइटें संकेत झल्लाहट को अधिकतम करने के लिए काफी अलग किया जा सकता है और यह भी झल्लाहट मापा पैदावार अंतर-डाई दूरी के आधार पर अलग है कि सत्यापित करने के लिए। सिस्टम अनुकूलित है एक बार, एक अणु संकेतों 10-30% करने के लिए उच्च बहुतायत झल्लाहट साथी की लेबलिंग को सीमित करने और एकल अणुओं रोशनी के क्षेत्र में ढूढने हैं जब तक कम बहुतायत झल्लाहट साथी विरंजन द्वारा दर्ज किया जा सकता है झल्लाहट।

पिछले नहीं बल्कि कम से कम यह SLBs कुछ अनुमानित कि ध्यान दिया जाना चाहिए, लेकिन नहीं एक शारीरिक प्लाज्मा झिल्ली के सभी पहलुओं। ऐसी झिल्ली वक्रता और लचीलापन, डोमेन compartmentalization, cytoskeletal rearrangements और सेल गतिशीलता के साथ ही सतह व्यक्त झिल्ली प्रोटीन की एक उच्च किस्म के रूप में गुणों SLBs द्वारा प्रतिनिधित्व नहीं कर रहे हैं, लेकिन टी प्रभावित हो सकता हैवह जांच के तहत प्रक्रिया। बहुत प्रयास TIRF इमेजिंग के लिए दुर्गम हैं जो शारीरिक synapses में एक अणु संकल्प के साथ प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत की निगरानी की अनुमति है कि इमेजिंग तौर तरीकों की स्थापना का निवेश करने की आवश्यकता होगी।

Acknowledgments

एमए वित्तीय और प्रशासनिक सहायता के लिए ऑस्ट्रियाई विज्ञान कोष (FWF, J3086-B11) और धन्यवाद का एक Schrödinger फैलोशिप मैक्स प्लैंक-सोसायटी द्वारा समर्थित किया गया। जी एस और झा वियना विज्ञान और प्रौद्योगिकी कोष (WWTF, LS13-030) द्वारा समर्थित थे।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB-media Fisher Scientific 10000713 bacterial expression
Sf900 II Life Technologies 10227402 insect cell media for baculo virus production
Insect-XPRESS with L-glutamine (Lonza) Fisher Scientific 10564038 insect cell media for baculo virus expression
Sf9 cells Life Technologies 11496-015 cells for virus production and expansion
High Five Cells Life Technologies B855-02 cells for potein expression
LB-media Fisher Scientific 10000713 bacterial expression
Centramate System Pall protein concentartion from large volumes
Centramate cassette 10kDa cutoff Pall OS010T12 protein concentartion from large volumes
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units EMD Millipore UFC900308 protein concentartion
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units EMD Millipore UFC800308 protein concentartion
Amicon Stirred Ultrafiltration Cell Model 200 mL EMD Millipore 5123 protein concentartion
Äkta pure 25L GE Healthcare 29-0182-24 protein purification
Superdex 200 10/300 GL GE Healthcare 17-5175-01 protein purification
Superdex 75 10/300 GL GE Healthcare 17-5174-01 protein purification
Mono Q 5/50GL GE Healthcare 17-5166-01 protein purification
Ni Sepharose 6 Fast Flow GE Healthcare 17-5318-01 protein purification
Tricorn 10/20 column GE Healthcare 28-4064-13 protein purification
Gilson HPLC system Gilson purificationof fluorochrome-coupled peptides
Pursuit XRs C18, 5 µm particle size, 21.2*250mm column size Agilent A6000250X212 purificationof fluorochrome-coupled peptides
Pursuit XRs C18, 5 µm particle size, 21.2*50 mm column size Agilent A6000050G212 purificationof fluorochrome-coupled peptides
Tricorn 10/20 column  GE Healthcare 28-4064-13 protein purification
Gilson HPLC system Gilson purificationof fluorochrome-coupled peptides
Pursuit XRs C18, 5 µm particle size, 21.2*250mm column size Agilent A6000250X212 purificationof fluorochrome-coupled peptides
Pursuit XRs C18, 5 µm particle size, 21.2*50 mm column size Agilent A6000050G212 purificationof fluorochrome-coupled peptides
Cy3 maleimide GE Healthcare PA23031 site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines
Cy5 maleimide GE Healthcare PA25031 site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines
Alexa Fluor 555 C2 Maleimide Life Technologies A-20346 site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines
Alexa Fluor 647 C2 Maleimide Life Technologies A-20347 site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines
Fura-2, AM, cell permeant Life Technologies F-1221 calcium-sensitive dye for cell labeling
dimethyl sulfoxide Sigma Aldrich 151874 for dissolving fura-2 am
Hank's Balanced Salt Solution plus calcium/magnesium Fisher Scientific 10225362 imaging buffer
PBS Life Technologies 14190-136
Bovine Serum Albumin lyophilized powder Sigma Aldrich A2153 supplement for imaging buffer
14-4-4S antibody affimetrix eBioscience 14-5980-81 blocking antibody for H2-I-Ek (recognized by the 5c.c7, 2B4 and AND TCR)
5 ml polypropylene round-bottom tube Becton Dickinson FALCON 352063
0.22 μm Ultrafree-MC centrifugal filter unit EMD Millipore UFC30GV0S
Syringe filter 0.2µm Millipore GVWP04700
TetraSpeck Microspheres, 0.1 µm, fluorescent blue/green/orange/dark red Life technologies T-7279
Microscope for fura-2-based calcium measurements  LEICA DMI4000B
Microscope for (single molecule) FRET measurements LEICA/ZEISS/NIKON/OLYMPUS for details please refer to parallel JoVE contribution by Axmann et al.
planar supported lipid bilayers for details please refer to parallel JoVE contribution by Axmann et al.
RPMI 1640, with L-Glutamine Life Technologies 11554416 T-cell media
non-essential amino acid 100X Hyclone SH30238.01 T-cell media supplement
penicillin/streptomycin/L-glutamine 100x Life Technologies 12000226 T-cell media supplement
2-mercaptoethanol Sigma Aldrich M6250 T-cell media supplement
mouse interleukin-2 recombinant protein BPS Bioscience 90185-B T-cell media supplement
Research Grade Fetal Bovine Serum Hyclone SV30160.03 T-cell media supplement
Origin (analysis program) OrigenLab http://www.originlab.com/ non-linear fitting of two parameters (tauoff, [ntlag])

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References

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जैव अभियांत्रिकी अंक 104 टी सेल प्रतिजन मान्यता रिसेप्टर ligand बातचीत कैनेटीक्स प्रतिरक्षाविज्ञानी अन्तर्ग्रथन कैल्शियम प्रवाह माप एक अणु माइक्रोस्कोपी Forster अनुनाद ऊर्जा स्थानांतरण
TCR-pMHC बंधन मापने<em&gt; बगल में</em&gt; एक झल्लाहट आधारित माइक्रोस्कोपी परख का उपयोग
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Axmann, M., Schütz, G. J.,… More

Axmann, M., Schütz, G. J., Huppa, J. B. Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay. J. Vis. Exp. (104), e53157, doi:10.3791/53157 (2015).

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