Summary
Wir messen perigenital mechanische Empfindlichkeit und Mastzellaktivierung in der Prostata von männlichen C57BL / 6-Mäuse, die eine frühe Leben Stress Paradigma erfuhr - Neugeborenen von Müttern Trennung, um einen präklinischen Modell der chronischen Prostatitis / chronischem Schmerzsyndrom des Beckens zu induzieren.
Abstract
Chronische Prostatitis / chronischem Schmerzsyndrom des Beckens (CP / CPPS) hat eine Lebenszeitprävalenz von 14% und ist die häufigste urologische Diagnose bei Männern im Alter von 50, aber es ist die am wenigsten verstanden und untersucht chronischen Unterbauchschmerzen Störung. Ein wesentlicher Teil der Patienten mit chronischen Unterbauchschmerzen Bericht mit frühen Leben Stress oder Missbrauch, die deutlich die Funktion und Regulation der Hypothalamus-Hypophysen-Nebennieren (HPA) Achse beeinflussen können erlebt. Mastzellaktivierung, die gezeigt wurde, dass in Urin erhöht und exprimiert Prostatasekreten von CP / CPPS- Patienten wird teilweise durch nachgeschaltete Aktivierung der HPA-Achse reguliert wird. Neugeborene von Müttern Trennung (NMS) ist seit mehr als zwei Jahrzehnten eingesetzt, um die Ergebnisse der frühen Leben Stress in Nagetiermodellen zu studieren, einschließlich Änderungen der HPA-Achse und viszeralen Empfindlichkeit. Hier bieten wir Ihnen ein detailliertes Protokoll für die Verwendung von NMS als präklinischen Modell der CP / CPPS in männlichen C57BL / 6 Mäusen. Wir beschreiben die Methodikzur Durchführung von NMS, die Beurteilung perigenital mechanischer Allodynie und histologischem Nachweis einer Mastzellaktivierung. Wir bieten auch Hinweise darauf, dass Anfang psychischer Stress kann langfristige Auswirkungen auf die männlichen Urogenitalsystems bei Mäusen haben.
Introduction
Chronische Schmerzen im Beckenbereich ist an sich nicht eine Krankheit, sondern ein Begriff, mit dem anhaltenden spontanen und / oder evozierte Schmerzen von Patienten mit Reizdarmsyndrom (IBS) diagnostiziert erlebt, interstitielle Zystitis / schmerzhafte Blasen-Syndrom (IC / PBS), vulvodynia verbunden sind, oder chronische Prostatitis / chronischem Schmerzsyndrom des Beckens (CP / CPPS). Diese Syndrome werden oft komorbid und teilen viele Eigenschaften, daß sie keine assoziierten Pathologie oder identifiziert zugrunde liegende Ätiologie, obwohl Dysfunktion im Immunsystem, das zentrale Nervensystem und peripheren Nervensystem wurde gezeigt, dass für den Unterhalt und das Fortschreiten dieser Erkrankungen beitragen 1 -3. Patienten mit chronischen Unterbauchschmerzen sind eher mit Symptomen präsentieren zusätzliche, nicht-Beckenbezogene Funktionsschmerzstörungen und affektiven Störungen, einschließlich Angstzustände, Depressionen, Panikattacken 4-6, die mit einer veränderten Funktion des Hypothalamus in Verbindung gebracht wurde Hypophyseadrenalen (HPA) Achse 7-10. Die Exposition gegenüber den ersten Lebens Stress oder Trauma ist ein signifikanter Risikofaktor für die Entwicklung von HPA Anomalien und die damit verbundenen chronischen Schmerzsyndromen 10,11 und als solche, berichten über einen erheblichen Teil der Patienten mit funktionellen Beckenschmerzerkrankungen mit erfahrenen negativen Kindheitsereignisse wie Missbrauch oder Vernachlässigung 12-14.
Nagetiermodellen der Neugeborenen von Müttern Trennung (NMS), die das Entfernen der Jungtiere von ihren Damm für einen bestimmten Zeitraum während der Entwöhnung Zeitraum beinhaltet, haben in den vergangenen zwei Jahrzehnten eingesetzt, um die Ergebnisse der frühen Leben Stress zu studieren. Im Allgemeinen NMS wurde gezeigt, dass HPA-Achse Aktivierung und die daraus resultierende Angst-ähnliche Verhaltensweisen zu erhöhen, indem die Genexpression direkt betreffen im Hypothalamus sowie stören nachgeschaltete Regelung von limbischen Strukturen 15-18. Störung der ordnungsgemäßen Funktionsweise HPA-Achse hat sich gezeigt, zu mehr kolorektalen 19-22 beitragen 16 Empfindlichkeit von Nagetier NMS Modelle angezeigt, aber trotz intensiver Charakterisierung der Langzeitwirkung der postnatalen Blasenentzündung 23-25, die Auswirkungen der frühen Leben Stress weitgehend unerforscht in der urogenitalen Organe weg. Daher wird die folgende Studie beschreiben die NMS bei Mäusen durchgeführt und später auszuwerten perigenital mechanische Empfindlichkeit und Mastzellinfiltrate / Aktivierung in der Prostata, um die Verwendung von männlichen Mäusen NMS als präklinischen Modell CP / CPPS- validieren.
Aller diagnostizierten chronischen Unterbauchschmerzen Erkrankungen ist CP / CPPS vielleicht die am wenigsten gut erkannt und gekennzeichnet Syndrom, trotz einer Lebenszeitprävalenz von etwa 14% 26 und $ 4400 (geschätzte jährliche Patientenkosten doppelt so hoch wie Rückenschmerzen oder rheumatoider Arthritis 27). Patienten mit CP / CPPS Bericht Schmerzen in den Damm, des Mastdarms, der Prostata, Penis, Hoden, und / oder Bauch 28, erleben Sie eine hallogher Maß an psychischer Stress als Kontrollpatienten 29, und üblicherweise mit Symptomen oder Gegenwart mit komorbiden chronischen Unterbauchschmerzen oder affektiven Störungen 5,29-31 diagnostiziert. Wiederkehrende Infektion, undichte Epithel, neurogene Entzündung und Autoimmunität alle als potentielle Ursachen der CP / CPPS- 2,32,33 sowie Aktivierung von Mastzellen-Degranulation und 34 wurde vermutet. Ausgedrückt Prostatasekret von Männern mit CP / CPPS hatte 34 Mastzelltryptase und Nervenwachstumsfaktor (NGF) Ebenen erhöht und eine spätere Studie bestätigt, dass Tryptase und Carboxypeptidase A (CPA3), einem Marker der Mastzellaktivierung, wurden auch in der erhöhten Urin von CP / CPPS Patienten 35. Die mögliche Rolle für die Mastzellen bei der Entstehung und Aufrechterhaltung des CP / CPPS ist ein wichtiger Schwerpunkt der Tierforschung auf diesem Syndrom bisher. Die am häufigsten verwendeten Tiermodell verwendet werden, um zu studieren CP / CPPS ist eine experimentelle autoimmune Prostatitis (EAP) Modell gendurch subkutane Injektion von Prostata-Antigen in komplettem Freundschen Adjuvans, das auf verschiedene Grade von Prostataentzündung je nach Tierart und Stamm 34,36-39 ergibt erated. Mastzellinfiltration und Aktivierung / Degranulation wurde gezeigt, dass nach der Induktion von EAP 34,35,40 erhöhen. Transgene Mäuse mangelhaft in Mastzellen entweder 34 oder Tryptase Rezeptor PAR2 35 nicht entwickeln Prostata Taktik Empfindlichkeit folgenden EAP, im Gegensatz zu Wildtyp-Mäusen EAP. Während dieser präklinischen Modell gibt viele der Eigenschaften des menschlichen CP / CPPS, ist die Induktion Protokoll nicht indikativ für den menschlichen Zustand, die eine vielfältige Ätiologie hat und oft keinen direkten Entzündungen, Infektionen oder Verletzungen der Prostata nicht einzubeziehen.
Der Einfluss der frühen Leben Stress auf die Entwicklung von CP / CPPS bei den Menschen wurde nicht untersucht weitgehend gegangen; aber eine Studie von Hu et al. 41, gezeigt, dass michn, die eine Geschichte der Kindheit körperliche, emotionale gemeldet, und / oder sexuellem Missbrauch wurden wesentlich häufiger zu Symptomen, die CP / CPPS erleben. Darüber hinaus zeigten sie, dass sowohl Schmerzen und Harnwege Werte wurden bei Patienten mit einer Vorgeschichte von physischen und emotionalen Missbrauch erhöht. Wir haben zuvor gezeigt, dass die gleichen NMS Paradigma bei weiblichen C57BL / 6-Mäusen produziert vaginalen Überempfindlichkeit und abnormale Genexpression sowohl in die Vagina und Blase andeutend dysfunktionalen HPA-Achse Ausgang 16. Dieser Nachweis kombiniert mit der hohen Prävalenz von CP / CPPS Patienten mit anderen Begleiterkrankungen 42, einschließlich IC / PBS und affektive Störungen, die mehr klar gezeigt worden, um mit den ersten Lebensstressexposition 12-14 verbunden werden können, liefert die Begründung für die Verwendung einer NMS Modell CP / CPPS bei Mäusen zu untersuchen.
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Protocol
Alle in diesem Protokoll beschriebenen Experimente entsprechen den NIH-Richtlinien im Einklang mit den von der University of Kansas Medical Center Institutional Animal Care und Verwenden Committee festgelegten Richtlinien.
1. Neugeborene von Müttern Separation (NMS)
- Überwachen Sie schwanger Dämme täglich Wurf Geburten.
Hinweis: Der Tag der Wurf ist geboren wird als P0. - Auf P1, entfernen Sie die Staumauer aus dem Käfig und in einen sauberen Sekundärbehälter.
- Reiben Sie eine Handvoll Betten zwischen clean-behandschuhten Händen, um Geruch des eigenen Käfig zu halten.
- In einer Tiefe von 1-2 cm von der Heimkäfig Betten in einem sauberen, entsprechend gekennzeichneten 2 L Becherglas. In etwa der Hälfte der zusätzliche Bereicherung Einstreu, die im Käfig vorhanden ist, zB nestlet, Knitterpapier, um das Becherglas.
- Sanft legen alle Welpen aus einer einzigen Wurf, einzeln, im selben Becher.
- Sofort platzierendas Becherglas in einem Brutschrank bei 33 ° C und 50% Luftfeuchtigkeit für 180 min gehalten.
- Entfernen Sie die Staumauer aus dem Sekundärbehälter und zurück sie in den Käfig. Bringen Sie den Käfig auf seine entsprechende Position innerhalb des Gehäuses Vivarium.
- Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden Wurf unterziehen NMS, mit sauberen Handschuhen und sekundären Behälter für jeden Wurf / Damm.
- Am Ende des 180 min Trennperiode geben die Würfe in ihre Heimatkäfige in der gleichen Reihenfolge wie sie entfernt wurden.
- Rufen Sie den Käfig des ersten Wurf, die früher in den Tag getrennt wurde. Entfernen Sie die Staumauer aus dem Käfig und in einen sauberen Sekundärbehälter.
- Nehmen Sie das erste Becherglas aus dem Inkubator und reiben Sie eine Handvoll Betten zwischen sauberen Handschuhen, um Geruch des eigenen Käfig zu halten, während der Handhabung der Welpen.
- Sanft bewegen die Welpen einzeln aus dem Becherglas auf den Käfig.
- Senden Sie alle Anreicherungs- und Bettwäsche in den Becher, um die verbleibendendie Heimat Käfig.
- Bringen Sie den Damm von der Sekundärbehälter an den Käfig und lege sie in ihre entsprechenden Gehäuse Ort innerhalb des Vivarium.
- Mit Wasser spült das Becherglas und wieder in den Inkubator. Verwenden Sie die gleiche Becher für jeden Wurf der gesamten Trennverfahren.
- Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden Wurf unterziehen NMS in der gleichen Reihenfolge, wie sie in den Inkubator gestellt wurden.
- Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede ganze Wurf unterzieht NMS jeden Tag durch P21.
- Entwöhnen NMS und naiv Welpen auf P22, indem Wurf des gleichen Geschlechts zusammen in saubere Käfige komplett mit Nahrung und Wasser. Naive Welpen geboren werden sollte und unter den gleichen Bedingungen wie NMS Mäusen untergebracht, aber keine zusätzliche Handhabung außerhalb der normalen Tierhaltung Aufgaben zu unterziehen.
2. perigenital Mechanische Empfindlichkeit
- von Frey Geräte-Setup
- Bringen Sie die Maus, um den Testraum und lassen Sie sie für 30 akklimatisierenmin, während übrigen in ihre Käfige.
- Bereiten Sie den Testbereich, indem eine absorbierende Unterlage unter einer erhöhten Drahtgitter-Top-Tisch (79 cm x 28 cm), die genügend Platz bietet, damit der Prüfer von der Unterseite ohne erschreckte die Mäuse, ca. 55 cm in der Höhe zu nähern.
- Platzieren Sie bis zu 12 Mäuse, individuell, nach klaren, perforierte Kunststoffkammern (11 cm x 5 cm x 3,5 cm) auf der Oberseite des Drahtgittertisch. Legen Sie einen schweren Gegenstände auf der Kammern an Mäuse an der Flucht zu verhindern.
- Akklimatisieren der Mäuse für weitere 30 min auf dem Bildschirm vor Wegziehschwelle Beurteilung.
- Perigenital Mechanische Empfindlichkeit Beurteilung
- Führen Sie die up-down-Methode mit einem Standard-Satz von abgestuften von Frey-Monofilamenten 43. Verwenden Sie die folgenden Monofilamente: 1,65 g, 2,36 g, 2,83 g, 3,22 g, 3,61 g, 4,08 g, 4,31 g und 4,74 g.
- Halten Sie die Basis des 3,22 g Monofile und setzen den eingefahrenen monoFilament.
Hinweis: Einige Modelle können nicht über eine zurückgezogene Monofilament. - Situate die Sonde, so daß das Monofilament vertikal ausgerichtet und, wenn die Maus-Meldung, unbeweglich, und sein Körpergewicht gleichmäßig auf die Hinterpfoten verteilt es auf der linken oder rechten Seite der Hodensack, die Vermeidung der Mittellinie, bis eine leichte Biegung im Filament beobachtet.
- Halten Sie das Monofilament in Platz für 10 Sekunden oder bis das Tier zeigt eine positive Reaktion.
Anmerkung: Eine positive Reaktion wird als einen flotten Ruck oder Sprung in Reaktion auf Monofil Anwendung oder Lecken oder Beißen Verhalten gegenüber dem Monofilament gerichtet werden. Wenn die Maus bewegt während der 10 sec Monofilament-Anwendung ohne Anzeige diese Verhaltensweisen, muss das Monofilament nach einem Mindest 1 min langen Ruhezeit erneut getestet werden. Wenn eine Maus weder bewegt noch weist bei allen oben genannten Verhaltensweisen während der 10 sec Monofilament Anwendung, wird es als eine negative Antwort. - Notieren Sie sich die Antwort, entweder negativ oder positiv, in einem Labor Notebook oder Laptop und wiederholen Sie diesen Vorgang auf alle verbleibenden Mäuse mit dem 3,22 g Monofilament.
- Testen Sie alle Mäuse wieder mit dem nächsten geeigneten Monofilament. Hinweis: Wenn die Maus zeigte eine negative Reaktion auf die 3,22 g-Monofilament, gelten die 3,61 g-Monofilament in der gleichen Weise, und notieren Sie die Antwort. Wenn die Maus zeigte eine positive Reaktion auf die 3,22 g-Monofilament, gelten die 2,83 g-Monofilament und notieren Sie die Antwort.
- Halten Sie die Basis des 3,22 g Monofile und setzen den eingefahrenen monoFilament.
- Weiter Testen jeder Maus mit der nächsten größeren oder kleineren Monofilament gegebenenfalls für weitere 4 Anwendungen, nachdem die erste positive Reaktion beobachtet wird.
- Rückgabe Mäuse Käfige.
- Verwenden Sie den Wert des letzten von Frey Monofilament in der Versuchsreihe angelegt in log-Einheiten, um eine 50% ige g Rücknahmeschwelle zu berechnen, wie in Chaplan et al. 43 beschrieben.
- Führen Sie die up-down-Methode mit einem Standard-Satz von abgestuften von Frey-Monofilamenten 43. Verwenden Sie die folgenden Monofilamente: 1,65 g, 2,36 g, 2,83 g, 3,22 g, 3,61 g, 4,08 g, 4,31 g und 4,74 g.
- Gewebeverarbeitung
- Sezieren Prostatagewebe 44 von Mäusen, die intrakardial mit eiskaltem 4% Paraformaldehyd 45 wurde durchströmt haben. Postfix das Gewebe in 4% Paraformaldehyd 1 h lang bei RT und dann in 30% Saccharose cryoprotect in 1x PBS bei 4 ° CO / N.
- Bereiten Sie eine kleine (30 ml) Bad Heptan und auf Trockeneis.
- Spülen Sie das Prostatagewebe in 1x PBS und trocken mit einer leichte wischen.
- Legen Sie die Prostatagewebe in die kalte Heptan, bis es gefroren ist.
- Unmittelbar Das tiefgefrorene Prostatagewebe in einem cryomold enthält Montage Medien und auf Trockeneis eingefroren, bis.
- Speicher cryomolds bei -20 ° C.
- Quer schneiden das Prostatagewebe in 7 um dicken Gefrierschnitten unter Verwendung eines Kryostaten.
- Platzieren 8-12 nicht-seriellen Kryoschnitten, die die Länge des Gewebes erstrecken, auf positiv geladenen Objektträgern.
- Speicher abgeschlossen Träger bei -20 ° C bis zur Weiterverarbeitung.
- Vorbereiten Aufgesäuerte Toluidinblau
- 1 g Toluidinblau O in 100 ml 70% Ethanol und vortexen, bis in der Lösung, um eine 1% ige Stammlösung herzustellen. Die Stammlösung kann bei Raumtemperatur bis zu drei Wochen gelagert werden.
- 1 g NaCl in 100 ml Wasser in einem Becher auf einer Rührplatte platziert.
- Den pH-Wert der NaCl-Lösung unter Verwendung von 12 M HCl bis zu einem pH-Bereich von 0,5 bis 1,0 erreicht wird.
- Bereiten Sie die 0,25% Toluidinblau Arbeitslösung durch die Kombination von 8 ml der Toluidinblau-Stammlösung und 32 ml der 1% NaCl-Lösung. Pipette auf und ab, um insgesamt Einbeziehung der Toluidinblau-Stammlösung zu gewährleisten und mischen mit einem Vortex. Die Arbeitslösung muss frisch hergestellt und nach der Verwendung entsorgt werden.
- Färbung Prostate Kryoschnitte
- Entfernen Sie die Folien aus dem Gefrierschrank verarbeitet werden und lassen auf RT für ca. 30 m ins Gleichgewichtin.
- Die Gewebeschnitte durch einzelnes Eintauchen der Objektträger für ca. 1 sec in ein 50 ml konisches Röhrchen ein ausreichendes Volumen an 1x PBS, das zu gewährleisten, dass die Objektträger angebrachten Gewebeschnitte werden vollständig überflutet waschen. Lassen Sie Folien trocken auf einem Papiertuch Luft.
- Die Objektträger in eine Glas Küvette enthält genug 0,25% Toluidinblau-Lösung arbeiten, um sicherzustellen, dass die Objektträger angebrachten Gewebeschnitten wird vollständig untergetaucht werden und Inkubation für 10 bis 15 min, während auf einem Wippschüttler bei 15 Umdrehungen pro Minute eingestellt.
- Dip Slides in 1x PBS für ca. 1 sec zum Auswaschen überschüssigen Toluidinblau.
- Die Objektträger in einem Objektträger-Box oder Zahnstange in der Weise, dass die Objektträger auf ihren Seiten, um für die Entwässerung zu ermöglichen.
- Trocknet die Folien in einem Ofen bei 37 ° C für mindestens 2 Stunden oder O / N bei RT.
- Entwässern gleitet schnell mit Alkohol, so dass die Objektträger vollständig trocknen zwischen Alkohol Belichtungen. Dry gleitet durch Entwässern auf einem Papiertuch einnd Wisch Rücken und Kanten mit einem leichte wischen.
- Tauchen Sie die Objektträger in 95% EtOH für ca. 1 sec und lassen Sie sie vollständig trocknen. Wiederholen Sie diesen Vorgang 1 - 10 Mal, bis Gewebe trocknet mehr blau als lila.
- Tauchen Sie die Objektträger in 100% EtOH für ca. 1 sec und lassen Sie sie vollständig trocknen. Wiederholen Sie diesen Vorgang 1 - 10 Mal, bis Gewebe ist dunkel bis mittelblau, aber nicht lila.
- Befestigen Sie den Fleck durch Inkubation der Objektträger in 100% Xylol für 3 min. Trocknen lassen.
- Deckglas der Objektträger mit Glycerin, PBS oder Xylol-basierten Festeinbau Medien. Überschüssiges Medien und lagern bei RT.
- Quantifizierung Mastzellen
- Visualisieren Sie die Toluidinblau-gefärbten Gewebeschnitte bei 20-facher Vergrößerung unter Verwendung von Lichtmikroskopie (Abbildung 2).
- Zählen Sie die Anzahl der Mastzellen im visualisiert Gebiets und zu differenzieren zwischen Nicht degranulierten und degranulierten Mastzellen. 40X magnificatIonen kann notwendig sein, um die Granulierung Status in einigen Mastzellen zu bestätigen.
Hinweis: Nicht degranulierten Mastzellen zeigen dichte Metachromasie ohne oder schwache Kern Umriss und / oder ohne Granulat Extrusion um die Zelle. Degranulierten Mastzellen weisen weniger intensiv Metachromasie und haben eine offensichtlich klare Gliederung des Kerns und / oder freien Körnchen im Zytoplasma und außerhalb der Zelle Grenze. - Weiterhin die Gesamtzahl der nicht-degranulierten und degranulierten Mastzellen in der Gesamtheit der aktuellen Gewebeabschnitt zu beurteilen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für mindestens 7 weitere separate Abschnitte, über die Länge jedes Gewebe.
- Berechnen des Prozentsatzes der degranulierten (DG) zum Gesamtmastzellen für jedes Gewebe / Maus nach der folgenden Gleichung: (DG Mastzellen / Total Mastzellen) x 100.
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Representative Results
Mäuse, die NMS unterzogen wurden, zeigten Verhaltenshinweise anzeigt CP / CPPS. Wenn es mit einer abgestuften Reihe von Frey-Monofilamenten, 8 Wochen alten NMS Mäusen getestet (n = 4) dargestellt perigenital mechanischer Allodynie im Vergleich zu naiven Pendants (n = 5, 2). Dies wird als eine signifikante Reduktion (p <0,01; Student-t-Test) belegt in der mechanischen Rücknahmeschwelle, die eine positive Verhaltensreaktion ausgelöst, als rege Ruck oder Sprung in Reaktion auf Monofil Anwendung oder Lecken oder Beißen Verhalten gegenüber dem Monofilament gerichtet aufgezeichnet .
Mäuse, die NMS ausgesetzt waren zeigte auch histologischen Befund einer CP / CPPS. Kryostatschnitte von Prostatagewebe wurden mit angesäuertem o-Toluidin-Blau gefärbt, um Tryptase Körner innerhalb Mastzellen (3A-D) untergebracht zu beobachten. Der Prozentsatz an Mastzellen, die Beweise für die Aktivierung, beispielsweise diffuse metachroma zeigtensia, Granulat vorhanden Außenseite der Zelle Rand (3D), wurde deutlich in Prostatagewebe ab 8 Wochen alten Mäusen NMS erhöht, im Vergleich zu naiven (p <0,0001, t-test, 3E). Die Gesamtzahl der unterwandert Mastzellen, unabhängig von Granulationsgewebe Status, unterschied sich nicht signifikant zwischen naiv (99,5 ± 15,2 Zellen / Abschnitt) und NMS-Mäuse (108,2 ± 22,5 Zellen / Abschnitt).
Abbildung 1. Verfahrenszeitlinie. Die schematische skizziert einen empfohlenen Zeitplan für die Durchführung der beschriebenen Methodik. Neugeborene von Müttern Trennung (NMS) wird täglich von postnatalen Tag (P) 1 durchgeführt, bis P21 und Mäuse werden auf P22 entwöhnt. Mäuse bleiben außerhalb der normalen Tierhaltung ungestört, bis 8 Wochen, wenn sie für perigenital mechanische sens getestetitivity. Wenn die gleiche Mäuse gehen, um für Mastzellfärbung beurteilt werden, sollten 1 Woche erlaubt sein, folgende Verhaltenstests verstreichen, um jegliche Restspannungseffekte zu lösen lassen.
Abbildung 2. perigenital mechanische Empfindlichkeit. Perigenital mechanische Empfindlichkeit wurde unter Verwendung von Frey Monofilament-Anwendung gemessen. Männliche Mäuse, die neonatale mütterlichen Trennung (NMS) wurden zeigten eine signifikante Verringerung der Ziehschwelle im Vergleich zu naiven Mäusen, was auf mechanische Allodynie. Daten stellen Mittelwert ± SEM, n = 4 für jede Gruppe. * P <0,05, Student-t-Test.
Abbildung 3. Mastzellaktivierung. Gesäuerte Toluidinblau wurde verwendet, um Tryptase Granulat visualisieren und berechnen den Anteil der aktivierten / degranulierten Mastzellen in Kryostatschnitten von Prostatagewebe. Repräsentative Mikrofotografien werden von Toluidinblau-gefärbten Schnitten von naiven (A) und NMS (B) Prostata mit Pfeilen intakten (nicht-degranulierten) und Pfeilspitzen anzeigt, aktiviert (degranuliert) Mastzellen gezeigt. Bilder mit höherer Vergrößerung von naiven (C) und NMS (D) Blase gezeigt, um histologische aus nicht degranulierten (C) veranschaulichen und degranuliert (D) Mastzellen. Ein signifikant höherer Prozentsatz degranulierten Mastzellen in Prostataschnitte von NMS Mäusen im Vergleich zu naiven Mäusen (E). Daten stellen Mittelwert ± SEM, n = 4 für jede Gruppe. **** P <0,0001, Student-t-Test.= "_ Blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Dieses Protokoll sieht Vorgehen beim Einsatz von Stress beim Neugeborenen ist, in Form von NMS, um Symptomatik bezeichnend für CP / CPPS in erwachsenen männlichen Mäusen zu induzieren. Als Erwachsene, zeigen die NMS-Mäusen signifikant perigenital mechanischer Allodynie, sowie Hinweise auf Mastzelldegranulation in Prostatagewebe. Die Verwendung von NMS ist ein neuer Ansatz zur Entwicklung eines präklinischen Modell der CP / CPPS, dass sie repliziert die frühen Leben Stress, die häufig von Patienten mit chronischen Schmerzen im Beckenbereich 12-14 berichtet wird, sowie das eine nicht-invasive Induktions als im Gegensatz zu üblicherweise verwendeten, chemie und immunologisch induzierte Entzündung der Prostata 34,36-39. Weiterhin NMS bei Mäusen wurde gezeigt, dass comorbid symptomology einschließlich veränderter Angstartig und anhedonic Verhaltensweisen erhöhte Miktion Raten zu erhalten, und Hinterpfote Empfindlichkeit (16; Daten nicht gezeigt), ähnlich den comorbid somatische, Stimmung und viszerale Erkrankungen, die durch zeigten CP / CPPS patients 4-6.
Der Hauptvorteil der Verwendung von NMS CP / CPPS- in Mäusen induziert ist, dass es eine psychologische Intervention auf physiologische Veränderungen initiieren. Patienten mit CP / CPPS haben Variante Ätiologie, die größtenteils nicht um vorherige Infektion oder direkte Schädigung der Prostata 1-3. Trotz dieser Tatsache wurden veröffentlicht Modellen von CP / CPPS- direkte oder indirekte Entzündung der Prostata eingeÜberEmpfindlichkeit des perigenital Region und / oder Aktivierung von Mastzellen zu induzieren. Ein erheblicher Anteil der CP / CPPS und chronischen Unterbauchschmerzen Patienten im allgemeinen Bericht mit frühen Leben Widrigkeiten, die weitgehend in Nagetiermodellen von urogenitalen Schmerzsyndromen unstudied gegangen erlebt hat. Frühere Arbeiten aus unserem Labor haben gezeigt, dass NMS induziert vaginalen Überempfindlichkeit und damit einhergehendem ordnungsgemäße Funktionieren der HPA-Achse 16. Zukünftige Arbeiten mit diesem Modell werden die Mechanismen, die von den ersten Lebens Stress angetrieben werden, um zu produzieren t untersuchener veränderte Phänotyp im Erwachsenenalter, wie auch für potenzielle pharmakologische oder Lifestyle-Interventionen, die in einem präklinischen oder klinischen Umfeld angewandt werden könnten erkunden.
Erreichen optimaler und wiederholbaren Ergebnisse dieses Protokoll hängt von mehreren kritischen Beobachtung nötigen Schritte, kann abhängig von der Umgebung und Anlagen verwendet zu optimieren. In Anbetracht, dass NMS dramatisch die Funktion der HPA-Achse betrifft, ist es wichtig, für die Außenreize und Spannungs sowohl während der neonatalen und adulten Perioden steuern. Gleichaltrigen, nicht behandelt naiven Mäusen sollte geboren und in Übereinstimmung mit jeder Gruppe von Mäusen, die für die NMS in der Umgebung, die die Entwicklung der HPA-Achse beeinflussen können vorhanden externe Stressoren Kontrolle untergebracht werden. Es ist wichtig, die Anzahl von Mäusen benötigt wird, um die beabsichtigte Experiment vor der Initiierung der Bestellung oder Zucht schwangeren Frauen in den Tiereinrichtung durchführen zu bestimmen. Während der Durchführung NMS, die greatest Sorge ist die Ablehnung der Jungtiere durch den Damm, daher ist es unerlässlich, den Duft der Käfig in der gesamten NMS Protokoll halten. Um die Auswirkungen der Tagesrhythmus zu minimieren, ist in der Mitte des Lichtzyklus (von 11.00 bis 14.00 Uhr) die vorgeschlagene Trennung Zeit für NMS. Perigenital Empfindlichkeitsmessungen sollten in vollständig reifen erwachsenen männlichen Mäusen erhalten werden kann, etwa 8 Wochen alt sind, und zur gleichen Tageszeit für jede Gruppe aufgenommen, vorzugsweise in den frühen Licht-Zyklus, mit dem Tiefpunkt im Tagesrhythmus übereinstimmen. (- 20.000 Hz 20), um das Auftreten von nicht-evozierte Bewegungen während dieses Verfahrens zu reduzieren, können Einschätzungen in einem temperaturgeregelten, schalldichte Zimmer mit weißem Rauschen spielen durchgeführt werden. Das gleiche Prüfer sollte alle Rücknahmeschwellen während der Studie zu bewerten, um die Kohärenz in der Einhaltung der positiven und negativen Antworten zu erhalten. Als Alternative zu der Messung der 50% mechanische Schwelle, die Rücknahme Frequenz auf einen einzigen Monofilament could beurteilt oder einem elektronischen von Frey-Vorrichtung 46 verwendet werden könnten. Mastzellenvisualisierung, sollten alle Folien, die zu analysieren sind, zusammen verarbeitet werden, um gleiche Färbung von Mastzellen gewährleisten, als Färbungsintensität kann zwischen den Experimenten variieren. Ein pH-Wert unter 1,0 ist für die richtige Kontrast zwischen den deep purple Mastzellen und dem hellblauen Hintergrund notwendig. Zu viele Spülungen in Alkohol aus den Mastzellen waschen Sie den Fleck und Kontrast negativ beeinflussen. Schließlich überlagert ein Raster auf das Gewebe kann hilfreich sein bei Zählen der Zellen in der gesamten Gewebeschnitt sein.
Mehrere Überlegungen sollte vor der Verwendung von NMS zu CP / CPPS oder verwandte zentrale Schmerzerkrankungen herbeigeführt werden. Erstens haben die große Mehrheit der Publikationen, die frühe Leben Stress integriert haben in Rattenmodellen der NMS geschehen ist, mit Hilfe eines verkürzten Trennung Zeitraum von P1 - P14. Viele Gruppen haben gezeigt, dass dieses Paradigma erzeugt ein IBS-ähnliche Symptomatik in rats und Mäusen 15; aber in unserer früheren Studie ein P1 - P14 Trennung Zeitraum in C57BL / 6 Mäusen nicht erzeugen eine signifikante Zunahme der vaginalen Empfindlichkeit 16, noch hat sie erzeugen colorectal Überempfindlichkeit (Daten nicht gezeigt). Daher kann die Art und Länge der NMS die bestimmten Ergebnis im Erwachsenenalter zu bestimmen, einschließlich der Schwere der Symptomatik und dem bestimmten Organ (e), die betroffen ist. Zweitens werden die Verhaltens und molekularen Veränderungen von NMS resultierende weitgehend auf Dysregulation der HPA-Achse 15-18, was darauf hindeutet, dass die Wirkung zentral vermittelte und konnte comorbid Ergebnisse, einschließlich Veränderungen in Angst- und / oder depressionsartige Verhalten und haben erhöhte Empfindlichkeit in anderen Beckenorgane oder mehreren entfernten Standorten. Diese comorbid Phänotyp anzeigt, was allgemein klinisch gesehen und kann mehr Vertreter CP / CPPS- Patienten als Ganzes 5,28-31,42 sein. Drittens auf der Grundlage dieser Veränderungen als Folge der HPA-Achse dysregul auftretendenation, sollte die Auswirkungen von Stress ein wichtiges Anliegen sowohl während der NMS Verfahren und später Verhaltenstests und in vitro-Analyse sein. Ausgang von der HPA-Achse ist tagaktiv, mit mehr Leistung während der aktivere Dunkel-Zyklus und weniger ausgegeben während der ruhigeren Licht-Zyklus, der das Ergebnis des Verhaltens oder in vitro-Analyse in Abhängigkeit von der Zeit der Prüfung beeinflussen könnten / 47 zu opfern. Ebenso die Exposition gegenüber Stressfaktoren, einschließlich unterziehen perigenital mechanische Empfindlichkeit des Tests kann vorübergehend bewirken Funktionieren der HPA-Achse 18 und Genexpression möglicherweise ändern innerhalb zugehörigen Hirnregionen und nachgelagerten peripheren Geweben.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pregnant C57BL/6 female mice | Charles River | 027 | Timed or untimed pregnant females should be monitored daily for in-house birth. |
| 2 L glass beaker(s) | Sigma-Aldrich | CLS10002L | Each NMS litter will be held in the same beaker throughout the 21 day separation period. |
| VWR Forced Air Incubator, Basic | VWR International | 414005-124 | The incubator should be held at 33°C and 50% humidity. |
| Touch Test Sensory Evaluator, Kit of 20 (Semmes-Weinstein Von Frey Aesthesiometer for touch assessment) | Stoelting | 58011 | The following monofilaments should be used for perigenital sensitivity assessment: 1.65 g, 2.36 g, 2.83 g, 3.22 g, 3.61 g, 4.08 g, 4.31 g, and 4.74 g. |
| Animal Enclosure (12 mice 6 rats) | IITC | 435 | Be sure to place a heavy object on top of the individual, acrylic animal enclosures to prevent mice from escaping. |
| Mesh Stand for mice and rats (12 mice 6 rats) | IITC | 410 | Place stand on a stable table top for comfortable access. |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5493 | Dilute the 10x PBS stock to 1x PBS. |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | A 4% paraformaldehyde solution is needed to intracardially perfuse mice and postfix tissue in preparation for mast cell staining. |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | Cryoprotect fixed tissue in 30% sucrose solution at 4°C overnight. |
| Heptane | Sigma-Aldrich | 246654 | Chill heptane on dry ice to freeze tissue. |
| Standard Cryomold | VWR International | 4557 | To assist in freezing prostate tissue prior to cryostat sectioning |
| Tissue-Tek OCT Compound | Sakura | 4583 | 12 x 125 ml |
| VWR Superfrost Plus Micro Slide | VWR International | 48311-703 | 75 x 25 x 1 mm |
| Toluidine Blue O | Sigma-Aldrich | 198161 | Certified by the Biological Stain Commission. Suitable for use as a metachromatic stain for mast cells. |
| Ethanol, Absolute (200 Proof) | Fisher Scientific | BP2818-4 | Molecular Biology Grade, Fisher Bioreagents; 95% and 100% solutions will be needed to dehydrate stained cryosections before mast cell visualization. |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | Acidified NaCl solution should be made fresh before staining cryosections. |
| GeneMate Sterile 50 ml Centrifuge Tubes | BioExpress | C-3394 | Disposable tubes used to mix toulidine blue elements or dip slides into 1xPBS. |
| Coplin staining dish for 10 slides, with ground glass cover | Fisher Scientific | 08-815 | Hold up to 10 standard 3 x 1 in. (75 x 25mm) slides back-to-back. Use separate dishes for Toluidine Blue working solution, 95% EtOH, 100% EtOH, and xylene. |
| Xylenes (Histological) | Fisher Scientific | X3P | Once dehydrated, tissue is cleared with xylene. |
| Microscope Slide Boxes, 100-Place | VWR International | 82003 | Boxes can be used for storage and transportation of slides. |
| Fisherbrand Microscope Slide Box | Fisher Scientific | 22-363-400 | These slide boxes are typically small enough to fit inside a cryostate. |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Glycerol is a traditional mounting medium. |
| Mounting Medium, Richard-Allan Scientific | VWR International | 4111 | Mounting medium firmly bonds the coverslip to the slide. |
| Micro Cover Glasses, Rectangular, No. 1 | VWR International | 48393-106 | A coverslip is placed over the dehydrated and cleared tissue to protect the sample. |
| Light Microscope | Nikon | The Advanced Automated Research Microscope Eclipse 90i, used by our lab, has been discontinued and replaced Eclipse Ni-E. |
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