Summary
Estamos midiendo la sensibilidad y la activación de las células mástil mecánica perigenital en la próstata de macho C57BL / 6 ratones que se sometieron a un paradigma principios de estrés de la vida - la separación materna neonatal, con el fin de inducir un modelo preclínico de síndrome de dolor pélvico / crónica prostatitis crónica.
Abstract
La prostatitis crónica / síndrome de dolor pélvico crónico (CP / CPPS) tiene una prevalencia de vida del 14% y es el diagnóstico urológico más común para los hombres menores de 50, sin embargo, es el trastorno de dolor pélvico crónico menos comprendido y estudiado. Un subconjunto significativo de pacientes con dolor pélvico crónico reporte haber experimentado estrés de la vida temprana o abuso, lo que puede afectar notablemente el funcionamiento y la regulación del eje hipotálamo-pituitario-adrenal (HPA). Activación de los mastocitos, que se ha demostrado ser aumentado tanto en orina y expresó secreciones prostáticas de pacientes CP / CPPS, está parcialmente regulada por la activación aguas abajo del eje HPA. Separación materna neonatal (SNM) se ha utilizado durante más de dos décadas a estudiar los resultados del estrés de la vida temprana en modelos de roedores, incluyendo cambios en el eje HPA y la sensibilidad visceral. Aquí le ofrecemos un protocolo detallado para el uso de NMS como un modelo preclínico de CP / CPPS en machos C57BL / 6 ratones. Se describe la metodologíapara la realización de NMS, la evaluación de la alodinia mecánica perigenital, y evidencia histológica de activación de los mastocitos. También proporcionamos evidencia de que el estrés psicológico temprana puede tener efectos a largo plazo sobre el sistema urogenital masculina en ratones.
Introduction
El dolor pélvico crónico no es en sí una enfermedad, sino más bien un término asociado con el dolor continuo espontáneo y / o evocado que sufren los pacientes con diagnóstico de síndrome de intestino irritable (SII), cistitis / síndrome de vejiga dolorosa intersticial (IC / PBS), la vulvodinia, o el síndrome de dolor pélvico prostatitis crónica / crónica (CP / CPPS). Estos síndromes son a menudo comórbida y comparten muchas características en que no tienen ninguna patología asociada o etiología subyacente identificado, aunque la disfunción en el sistema inmunológico, sistema nervioso central, sistema nervioso periférico y se ha demostrado que contribuyen al mantenimiento y la progresión de estos trastornos 1 -3. Los pacientes con dolor pélvico crónico son más propensos a presentar síntomas de adicional, trastornos de dolor funcionales y trastornos del estado de ánimo, incluyendo la ansiedad, la depresión y el trastorno de pánico 4-6, que se ha asociado con el funcionamiento alterado de la hipotálamo no relacionados con pélvico- pituitarioadrenal (HPA) 7-10. La exposición al estrés de la vida temprana o trauma es un factor de riesgo importante para el desarrollo de anomalías HPA y asociados síndromes de dolor crónico 10,11 y, como tal, un subconjunto significativo de pacientes con trastornos de dolor pélvico funcionales reportan haber experimentado eventos adversos de la infancia como el abuso o negligencia 12-14.
Modelos de roedores de la separación materna neonatal (SMN), que consiste en la eliminación de las crías de su presa por un período determinado de tiempo durante el período predestete, se han utilizado durante las últimas dos décadas a estudiar los resultados del estrés de la vida temprana. En general, NMS se ha demostrado que aumenta la activación del eje HPA, y comportamientos similares a la ansiedad resultantes, afectando directamente la expresión génica en el hipotálamo, así como la interrupción de la regulación aguas abajo de las estructuras límbicas 15-18. La interrupción de funcionamiento adecuado del eje HPA se ha demostrado que contribuyen a una mayor colorrectal 19-22 16 sensibilidad representada por los modelos NMS roedores, pero a pesar de una amplia caracterización de los efectos a largo plazo de la inflamación de la vejiga después del parto 23-25, el impacto del estrés primeros años de vida ha pasado casi sin estudiar en los órganos urogenitales. Por lo tanto, el siguiente estudio describe cómo realizar NMS en ratones y posteriormente evaluar la sensibilidad mecánica perigenital y la infiltración de mastocitos / activación en la próstata para validar el uso de ratones NMS masculinos como un modelo preclínico para CP / CPPS.
De todos los trastornos de dolor pélvico crónico diagnosticados, CP / CPPS es tal vez el síndrome de menos bien reconocida y caracterizada, a pesar de tener una prevalencia de aproximadamente el 14% 26 y los costos anuales de pacientes estimados en $ 4,400 (el doble que el de la lumbalgia o reumatoide artritis 27). Los pacientes con CP / CPPS informe dolor en el perineo, el recto, próstata, pene, testículos, y / o el abdomen 28, experimentan una altagrado gher de estrés psicológico que los pacientes de control 29, y por lo general se presentan con síntomas de o son diagnosticados con el dolor o el estado de ánimo trastornos pélvicos crónicos comórbidas 5,29-31. Infección recurrente, el epitelio que gotea, inflamación neurogénica, y autoinmunidad han sido conjeturado como posibles causas subyacentes de la CP / CPPS 2,32,33, así como la activación de los mastocitos y degranulación 34. Las secreciones prostáticas expresadas a partir de los hombres con CP / CPPS habían aumentado los niveles de triptasa de mastocitos y factor de crecimiento nervioso (NGF) 34, y un estudio posterior confirmado que la triptasa y carboxipeptidasa A (CPA3), un marcador de la activación de los mastocitos, también se incrementaron en el orina de pacientes CP / CPPS 35. El papel potencial de los mastocitos en el inicio y mantenimiento de la CP / CPPS ha sido un foco importante de la investigación con animales en este síndrome hasta el momento. El modelo de roedor más comúnmente empleada utilizado para estudiar CP / CPPS es una prostatitis autoinmune experimental (EAP) modelo de generaciónnerada por inyección subcutánea de antígeno de próstata en adyuvante completo de Freund, lo que resulta en variados grados de inflamación prostática dependiendo de la especie y cepa utilizada 34,36-39. Infiltración de células de mástil y la activación / desgranulación se ha demostrado que aumenta después de la inducción de la PEA 34,35,40. Los ratones transgénicos deficientes en cualquiera de los mastocitos 34 o el receptor de triptasa PAR2 35 no desarrollan la sensibilidad táctica prostática siguiente EAP, a diferencia de los ratones de tipo salvaje de EAP. Si bien este modelo preclínico replica muchas de las características del CP humana / CPPS, el protocolo de inducción no es indicativo de la condición humana, que tiene una etiología diversa y muchas veces no implica inflamación directa, infección o lesión de la próstata.
La influencia del estrés de la vida temprana en el desarrollo de CP / CPPS en los seres humanos en gran medida ha ido sin investigar; Sin embargo, un estudio realizado por Hu, et al. 41, demostró que men que reportaron una historia de la infancia física, emocional y / o abuso sexual fueron significativamente más propensos a experimentar síntomas sugestivos de CP / CPPS. Además, demostraron que tanto el dolor y las puntuaciones urinarios se incrementaron en los pacientes con antecedentes de abuso físico y emocional. Hemos demostrado anteriormente que el mismo paradigma NMS en hembra C57BL / 6 ratones produce hipersensibilidad vaginal y la expresión génica anormal tanto en la vagina y la vejiga sugestivo de HPA disfuncional eje de salida 16. Esta evidencia combinada con la alta prevalencia de pacientes CP / CPPS que presentan otras comorbilidades 42, incluyendo IC / PBS y los trastornos del estado de ánimo, que más claramente han demostrado estar relacionado con la exposición al estrés de la vida temprana 12-14, proporciona la justificación para el uso de un modelo NMS para investigar CP / CPPS en ratones.
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Protocol
Todos los experimentos descritos en este protocolo se ajustan a las directrices del NIH de conformidad con las directrices especificadas por la Universidad de Kansas Medical Center Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión.
1. Separación Materno Neonatal (SMN)
- Monitorear las presas embarazadas diaria para los nacimientos de basura.
Nota: El día de la camada nace se considera P0. - En P1, retire la presa de la jaula y coloque en un recipiente secundario limpio.
- Frote un puñado de ropa de cama entre manos limpias enguantada para mantener la esencia de la jaula.
- Añadir una profundidad de 1-2 cm de la ropa de cama jaula en un lugar limpio, debidamente etiquetado 2 vaso de precipitados L vidrio. Añadir aproximadamente la mitad de cualquier material adicional de enriquecimiento de ropa de cama que está presente en la jaula de alojamiento, por ejemplo, papel de la arruga nestlet, al vaso de precipitados de vidrio.
- Colocar suavemente todos los cachorros de una sola camada, de forma individual, en el mismo vaso de precipitados.
- Inmediatamente coloqueel vaso de precipitados en una incubadora a cabo en 33 ° C y 50% de humedad durante 180 min.
- Retire la presa desde el recipiente secundario y su regreso a la jaula. Devuelva la jaula a su ubicación vivienda adecuada dentro del vivero.
- Repita este procedimiento para cada camada de someterse NMS, utilizando guantes limpios y contenedores secundarios para cada camada / presa.
- Al final del período de separación de 180 min, devolver las camadas a sus jaulas en el mismo orden en que fueron retirados.
- Recuperar la jaula de la primera camada que fue separado al principio del día. Retire la presa de la jaula y coloque en un recipiente secundario limpio.
- Retire el primer vaso de la incubadora y frotar un puñado de ropa de cama entre las manos enguantadas limpias para mantener el olor de la jaula durante la manipulación de los cachorros.
- Mueva suavemente los cachorros, de forma individual, desde el vaso a la jaula.
- Vuelva cualquier enriquecimiento y la ropa de cama que queda en el vaso de precipitados ala jaula.
- Vuelva la presa del recipiente secundario a la jaula y devolverlo a su ubicación vivienda adecuada dentro del vivero.
- Enjuague el vaso con agua y devolverla a la incubadora. Utilice el mismo vaso para cada camada durante todo el procedimiento de separación.
- Repita este procedimiento para cada camada de someterse NMS en el mismo orden en que se colocaron en la incubadora.
- Repita este procedimiento para cada sometido camada NMS todos los días a través de P21.
- Destete cachorros NMS e ingenuos en P22 colocando camada del mismo sexo juntos en jaulas limpias completos con los alimentos y el agua. Cachorros Naïve deben nacer y alojados en las mismas condiciones que los ratones NMS, pero se someten a ninguna manipulación adicional fuera de las tareas normales de cría de animales.
2. perigenital Sensibilidad mecánica
- Configuración Aparato von Frey
- Llevar los ratones a la sala de pruebas y permitir que se aclimaten a 30min mientras permanecen en sus jaulas.
- Preparar la zona de pruebas mediante la colocación de una almohadilla inferior absorbente debajo de una mesa de alambre de malla superior elevada (79 cm x 28 cm) que proporciona espacio suficiente para permitir que el investigador para acercarse desde la parte inferior sin sobresaltando los ratones, aproximadamente 55 cm de altura.
- Coloque hasta 12 ratones, en forma individual, bajo, cámaras de plástico perforadas claras (11 cm x 5 cm x 3,5 cm) en la parte superior de la tabla de malla de alambre. Coloque un objeto pesado en la parte superior de las cámaras para evitar que los ratones se escape.
- Aclimatar los ratones durante 30 minutos adicionales en la pantalla antes de la evaluación umbral de retirada.
- Evaluación perigenital sensibilidad mecánica
- Lleve a cabo el método de arriba-abajo utilizando un conjunto estándar de graduadas monofilamentos de von Frey 43. Utilice los siguientes monofilamentos: 1,65 g, 2,36 g, 2,83 g, 3,22 g, 3,61 g, 4,08 g, 4,31 g, y 4,74 g.
- Sostenga la base del 3,22 g de monofilamento y exponer el mono retraídafilamento.
Nota: Algunos modelos pueden no tener un monofilamento retraída. - Situar la sonda para que el monofilamento se orienta en sentido vertical y cuando el ratón está alerta, inmóvil, y su peso corporal se distribuye en partes iguales entre las patas traseras aplicarlo ya sea a la izquierda oa la derecha del escroto, evitando la línea media, hasta un ligero curva se observa en el filamento.
- Mantenga el monofilamento en su lugar durante 10 segundos o hasta que el animal muestra una respuesta positiva.
Nota: Una respuesta positiva se considera que es un tirón rápido o saltar en respuesta a la aplicación de monofilamento o lamer o morder el comportamiento dirigido hacia el monofilamento. Si se mueve el ratón durante la aplicación monofilamento 10 seg sin mostrar estas conductas, el monofilamento deben ser reexaminados después de un período de descanso de 1 minuto de longitud mínima. Si un ratón ni se mueve ni presenta cualquiera de los anteriores comportamientos enumerados durante la aplicación de monofilamento de 10 seg, se considera una respuesta negativa. - Registre la respuesta, ya sea positiva o negativa, en un cuaderno de laboratorio o portátil y repita este procedimiento en todos los ratones restantes utilizando el 3,22 g de monofilamento.
- Prueba de todos los ratones de nuevo utilizando la siguiente monofilamento apropiado. Nota: Si el ratón exhibió una respuesta negativa a la 3,22 g de monofilamento, se aplica la 3,61 g de monofilamento de la misma manera y registrar la respuesta. Si el ratón mostró una respuesta positiva a la 3,22 g de monofilamento, aplicar el 2.83 g monofilamento y registrar la respuesta.
- Sostenga la base del 3,22 g de monofilamento y exponer el mono retraídafilamento.
- Continúe probando cada ratón utilizando la siguiente monofilamento mayor o menor, según el caso, durante 4 aplicaciones adicionales después de que se observó la primera respuesta positiva.
- Ratones Regreso a jaulas.
- Utilice el valor de la final de monofilamento de von Frey aplicada en la serie de ensayo en unidades logarítmicas para calcular un umbral de retirada del 50% g como se describe en Chaplan et al. 43.
- Lleve a cabo el método de arriba-abajo utilizando un conjunto estándar de graduadas monofilamentos de von Frey 43. Utilice los siguientes monofilamentos: 1,65 g, 2,36 g, 2,83 g, 3,22 g, 3,61 g, 4,08 g, 4,31 g, y 4,74 g.
- Procesamiento de tejidos
- Diseccionar tejido prostático 44 de los ratones que han sido intracardially perfundidos con helada paraformaldehído al 4% 45. Postfix el tejido en paraformaldehído al 4% durante 1 hora a RT y luego cryoprotect en 30% de sacarosa en 1x PBS a 4 ° CO / N.
- Preparar una pequeña (30 ml) Baño de heptano y colocarlo en hielo seco.
- Enjuague el tejido de la próstata en 1x PBS y seque utilizando un trabajo liviano limpie.
- Introduce el tejido de la próstata en el heptano frío hasta que se congela.
- Inmediatamente coloque el tejido prostático congelado en un criomolde contiene medios de montaje y lugar en hielo seco hasta congelado.
- Tienda criomoldes a -20 ° C.
- Transversalmente cortar el tejido de la próstata en 7 cryosections micras de espesor usando un criostato.
- Coloque 8 - 12 cryosections no de serie que abarcan la longitud del tejido, en portaobjetos de microscopio cargados positivamente.
- Tienda terminó diapositivas a -20 ° C hasta su posterior procesamiento.
- Preparación Acidificados azul de toluidina
- Añadir 1 g de azul de toluidina O a 100 ml de etanol 70% y agitar hasta en solución para preparar una solución madre 1%. La solución madre se puede almacenar a temperatura ambiente durante un máximo de tres semanas.
- Añadir 1 g de NaCl a 100 ml de agua en un vaso de precipitados colocado en la parte superior de una placa de agitación.
- Ajustar el pH de la solución de NaCl usando HCl 12 M hasta un intervalo de pH de 0,5 - 1.0 se logra.
- Preparar la solución de trabajo de azul de toluidina 0,25% combinando 8 ml de la solución madre de azul de toluidina y 32 ml de la solución de NaCl 1%. Pipetear hacia arriba y hacia abajo para asegurar la incorporación total de la solución madre azul de toluidina y mezclar utilizando un vórtice. La solución de trabajo debe estar recién hecho y se desecha después de usar.
- La tinción de próstata criosecciones
- Retire las transparencias para ser procesados del congelador y deje que se equilibre a la temperatura ambiente durante aproximadamente 30 men.
- Lavar las secciones de tejido por inmersión individualmente las diapositivas durante aproximadamente 1 seg en un tubo cónico de 50 ml que contiene un volumen suficiente de 1x PBS para asegurar que las secciones de tejido de deslizamiento montado serán completamente sumergidos. Permitir que las diapositivas se sequen al aire sobre una toalla de papel.
- Colocar los portaobjetos en un tarro de tinción de vidrio que contiene suficiente solución de trabajo azul de toluidina 0,25% para asegurar que los cortes de tejido de diapositivas montadas serán completamente sumergidos y se incuban durante 10 - 15 min, mientras que en una mecedora plataforma fijado en 15 rpm.
- Diapositivas Dip en 1x PBS durante aproximadamente 1 segundo para lavar el exceso de azul de toluidina.
- Colocar los portaobjetos en una caja de portaobjetos o un estante de tal manera que las diapositivas están en sus lados para permitir el drenaje.
- Secar los portaobjetos en un horno a 37 ° C durante un mínimo de 2 horas o O / N a temperatura ambiente.
- Deshidratar diapositivas rápidamente usando el alcohol, lo que permite a las diapositivas completamente seco entre las exposiciones de alcohol. Diapositivas en seco por el drenaje en una toalla de papel unnd espaldas de limpieza y bordes con un trabajo ligero limpie.
- Sumergir los portaobjetos en EtOH al 95% durante aproximadamente 1 segundo y deje que se seque completamente. Repita este procedimiento 1 - 10 veces hasta que el tejido se seca más azul que violeta.
- Sumergir los portaobjetos en EtOH al 100% durante aproximadamente 1 segundo y deje que se seque completamente. Repita este procedimiento 1 - 10 veces hasta que el tejido es oscuro al azul medio, pero no de color púrpura.
- Fijar la mancha incubando las diapositivas de 100% xileno durante 3 min. Deje que se seque.
- Cubreobjetos las diapositivas con glicerol, PBS, o medio de montaje permanente a base de xileno. Escurrir el exceso de medios de comunicación y almacenar a temperatura ambiente.
- Las células cebadas Cuantificación
- Visualice las secciones de tejido teñidas de azul de toluidina al 20X de aumento utilizando microscopía de luz (Figura 2).
- Cuente el número total de los mastocitos presentes en la zona visualizada y diferenciar entre los mastocitos no degranulados y degranulados. 40X magnífication puede ser necesario para confirmar el estado de granulación en algunos mastocitos.
Nota: Los mastocitos no degranulados exhiben metacromasia densa con ninguna o leve contorno nuclear y / o sin extrusión granular alrededor de la celda. Mastocitos desgranulados exhibir menos intensa metacromasia y tener un esquema claro obvio del núcleo y / o gránulos libres en el citoplasma y el exterior del borde de la celda. - Continuar para evaluar el número total de los mastocitos no degranulados y degranulados en la totalidad de la sección de tejido actual. Repita este procedimiento en al menos 7 secciones separadas adicionales, que abarca la longitud de cada tejido.
- Calcular el porcentaje de degranulated (DG) a las células cebadas totales para cada tejido / ratón de acuerdo a la siguiente ecuación: (mastocitos dg / Total de mastocitos) x 100.
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Representative Results
Los ratones que han sido sometidos a NMS mostró evidencia de comportamiento indicativos de CP / CPPS. Cuando se prueba con una serie graduada de monofilamentos de von Frey, ratones NMS 8 semanas de edad (n = 4) que se muestra la alodinia mecánica perigenital en comparación con homólogos no tratados (n = 5, Figura 2). Esto se evidencia como una reducción significativa (p <0,01; prueba t de Student) en el umbral de retirada mecánica que provocó una respuesta de comportamiento positivo, registrado como un tirón rápido o saltar en respuesta a la aplicación de monofilamento o lamer o comportamiento de morder dirigida hacia el monofilamento .
Los ratones que fueron expuestos a NMS también muestran evidencia histológica de CP / CPPS. Secciones de criostato de tejido de la próstata se tiñeron con o-toluidina acidificado azul para observar gránulos triptasa alojados dentro de las células cebadas (Figura 3A-D). El porcentaje de mastocitos que mostró evidencia de activación, por ejemplo, metachroma difusasia, gránulos presentes fuera del borde de la celda (Figura 3D), fue significativamente mayor en el tejido de la próstata de los ratones NMS 8 semanas de edad, en comparación con el ingenuo (p <0,0001, prueba t de Student, Figura 3E). El número total de los mastocitos infiltrados, independientemente del estado de granulación, no fue significativamente diferente entre los ingenuos (99,5 ± 15,2 células / sección) y los ratones de NMS (108,2 ± 22,5 células / sección).
Figura 1. Línea de tiempo de procedimiento. El esquema describe una línea de tiempo recomendado para la realización de la metodología descrita. Separación materna neonatal (SMN) se lleva a cabo todos los días de día postnatal (P) 1 hasta P21 y los ratones son destetados en P22. Los ratones se mantienen inalteradas las afueras de la cría animal normal hasta 8 semanas de edad en la que se realizarán las pruebas de sens mecánicos perigenitalesitivity. Si el mismo ratones se va a evaluar para la tinción de los mastocitos, una semana debe permitirse que transcurra después de las pruebas de comportamiento para permitir cualquier efecto de tensiones residuales para resolver.
Figura 2. perigenital sensibilidad mecánica. Perigenital sensibilidad mecánica se midió usando la aplicación de monofilamento de von Frey. Los ratones macho que se sometieron a la separación materna neonatal (NMS) muestran una reducción significativa en el umbral de retirada, en comparación con los ratones no tratados previamente, indicativo de la alodinia mecánica. Los datos representan media ± SEM, n = 4 para cada grupo. * P <0,05, prueba t de Student.
Figura 3. activación de las células mástil. Toluidina acidificado azul se utilizó para visualizar gránulos de triptasa y calcular el porcentaje de mastocitos activados / desgranulados en secciones de criostato de tejido de la próstata. Representativos se muestran fotomicrografías de toluidina secciones teñidas de azul de naïve (A) y NMS (B) de próstata con flechas que indican intactas (no-degranulated) y puntas de flecha indican activados (desgranulados) mastocitos. Las imágenes de mayor magnificación de ingenuo (C) y NMS (D) de la vejiga se muestran para ilustrar las diferencias histológicas de no degranulados (C) y (D) degranulados mastocitos. Un porcentaje significativamente mayor de los mastocitos desgranulados se observaron en las secciones de próstata de ratones NMS en comparación con ratones naïve (E). Los datos representan media ± SEM, n = 4 para cada grupo. **** P <0,0001, prueba t de Student.= "_ Blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este protocolo proporciona la metodología para el uso de estrés neonatal, en forma de NMS, para inducir sintomatología indicativa de CP / CPPS en ratones machos adultos. Como adultos, los ratones muestran NMS alodinia mecánica perigenital significativa, así como pruebas de desgranulación de los mastocitos en el tejido prostático. El uso de NMS es un nuevo enfoque para el desarrollo de un modelo preclínico de CP / CPPS en que replica el estrés de la vida temprana que a menudo se informó por los pacientes con dolor pélvico crónico 12-14, así como la incorporación de una inducción no invasiva, como en contraposición a los usados más comúnmente, químicamente y la inflamación de la próstata 34,36-39 inmunológicamente inducida. Además, NMS en ratones se ha demostrado que producen sintomatología comórbido, incluyendo comportamientos similares a la ansiedad y anhedónicos alterados, aumento de las tasas de micción, hipersensibilidad y la pata trasera (16; datos no mostrados), similares a los somáticos, estado de ánimo y trastornos viscerales comórbidas exhibidas por CP / CPPS Patients 4-6.
La principal ventaja de utilizar NMS para inducir CP / CPPS en ratones es que utiliza una intervención psicológica para iniciar los cambios fisiológicos. Los pacientes con CP / CPPS tienen etiología variante de que en gran medida no implica infección previa o lesión directa a la próstata 1-3. A pesar de este hecho, los modelos publicados de CP / CPPS han incorporado inflamación directa o indirecta de la próstata para inducir la hipersensibilidad de la región perigenital y / o activación de los mastocitos. Una proporción significativa de CP / CPPS y los pacientes con dolor pélvico crónico, en general, el informe de haber experimentado la adversidad primeros años de vida, que ha pasado gran parte sin estudiar en modelos de roedores de los síndromes de dolor urogenital. Trabajos anteriores de nuestro laboratorio ha demostrado que induce NMS hipersensibilidad vaginal y los trastornos asociados del buen funcionamiento del eje HPA 16. El trabajo futuro usando este modelo investigará los mecanismos que son impulsados por el estrés primeros años de vida para producir talteró fenotipo en la edad adulta, así como para explorar posibles intervenciones farmacológicas o de estilo de vida que podrían aplicarse en un entorno preclínico o clínico.
El logro de resultados óptimos y repetibles de este protocolo depende de la observación de varios pasos críticos que pueden necesitar ser optimizado en función del entorno y el equipo utilizado. Teniendo en cuenta que NMS afecta dramáticamente el funcionamiento del eje HPA, es importante para el control de los estímulos externos y el estrés ambiental durante los períodos neonatales y adultos. , Ratones ingenuos manipulados-no Emparejados por edad deberían nacer y alojados en concordancia con cada cohorte de ratones NMS para el control de los factores de estrés externos presentes en el medio ambiente que pueden afectar el desarrollo del eje HPA. Es importante para determinar el número de ratones necesarios para llevar a cabo el experimento deseado antes de iniciar la cría o el pedido hembras embarazadas en la instalación animal. Durante la realización de NMS, los greatest preocupación es el rechazo de los cachorros de la presa, por lo tanto, es imprescindible para mantener el aroma de la jaula de alojamiento en todo el protocolo de NMS. Para minimizar los efectos de los ritmos diurnos, el tiempo de separación sugerido para NMS es durante la mitad del ciclo de luz (11 a.m.-2 p.m.). Medidas de sensibilidad perigenital deben ser obtenidos en ratones machos completamente maduros adultos, aproximadamente 8 semanas de edad, y tomar a la misma hora del día para cada grupo, preferiblemente temprano en el ciclo de luz coincidiendo con el punto más bajo en los ritmos diurnos. Para reducir la aparición de movimientos no evocado durante este procedimiento, las evaluaciones se pueden realizar en una, a prueba de sonido de la sala de temperatura controlada con ruido blanco jugando (20 - 20.000 Hz). El mismo investigador debe evaluar todos los umbrales de retirada durante todo el estudio para mantener la consistencia en la observancia de las respuestas positivas y negativas. Como alternativas a la medición de la mecánica umbral de 50%, la frecuencia de retirada a un único monofilamento COUld evaluarse o un aparato de von Frey electrónico 46 podría ser utilizado. Para la visualización de los mastocitos, todas las diapositivas que van a ser analizadas deben ser procesados juntos para garantizar la igualdad de tinción de los mastocitos, como la intensidad de tinción puede variar entre los experimentos. Un pH por debajo de 1.0 es necesario para el contraste adecuado entre las profundas mastocitos púrpura y el fondo azul claro. Demasiados enjuagues en el alcohol pueden lavar la mancha de los mastocitos y afectar negativamente el contraste. Finalmente, la superposición de una cuadrícula sobre el tejido puede ser útil en el recuento de células a lo largo de toda la sección de tejido.
Se deben hacer varias consideraciones antes de la utilización de NMS para inducir CP / CPPS o trastornos de dolor centralizado relacionados. En primer lugar, la gran mayoría de las publicaciones que han incorporado el estrés primeros años de vida se han realizado en modelos de rata de NMS, el uso de un período de separación truncada de P1 - P14. Muchos grupos han demostrado que este paradigma genera una sintomatología IBS-como en rats y los ratones 15; sin embargo, en nuestro estudio anterior un P1 - P14 período de separación en ratones C57BL / 6 ratones no generó un aumento significativo en la sensibilidad vaginal 16, ni tampoco generar hipersensibilidad colorrectal (datos no mostrados). Por lo tanto, la especie y la duración de SNM pueden determinar el resultado específico en la edad adulta, incluyendo la gravedad de la sintomatología y el órgano (s) específica que está afectada. En segundo lugar, los cambios de comportamiento y moleculares resultantes de NMS son en gran parte debido a la desregulación del eje HPA 15-18, lo que sugiere que el efecto está mediado centralmente y podría tener resultados comórbidas, incluyendo cambios en la ansiedad-y / o comportamientos parecidos a la depresión y aumento de la sensibilidad en otros órganos pélvicos o lugares más distantes. Este fenotipo comorbilidad es indicativo de lo que comúnmente se ve clínicamente y puede ser más representativa de pacientes CP / CPPS en su conjunto 5,28-31,42. En tercer lugar, sobre la base de estos cambios que se producen como resultado de HPA eje dysregulación, el impacto del estrés debe ser de suma preocupación, tanto durante el procedimiento de NMS y pruebas de comportamiento más tarde y en el análisis in vitro. Salida desde el eje HPA es diurna, con mayor producción durante el ciclo de oscuridad más activa y menor producción durante el ciclo de luz más de reposo, lo que podría afectar el resultado del comportamiento o en el análisis in vitro en función del momento de la prueba / sacrificar 47. Del mismo modo, la exposición a factores de estrés, incluyendo en fase de pruebas de sensibilidad mecánica perigenital, puede afectar transitoriamente funcionamiento del eje HPA 18 y potencialmente alterar la expresión de genes dentro de las regiones del cerebro asociadas y los tejidos periféricos aguas abajo.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pregnant C57BL/6 female mice | Charles River | 027 | Timed or untimed pregnant females should be monitored daily for in-house birth. |
| 2 L glass beaker(s) | Sigma-Aldrich | CLS10002L | Each NMS litter will be held in the same beaker throughout the 21 day separation period. |
| VWR Forced Air Incubator, Basic | VWR International | 414005-124 | The incubator should be held at 33°C and 50% humidity. |
| Touch Test Sensory Evaluator, Kit of 20 (Semmes-Weinstein Von Frey Aesthesiometer for touch assessment) | Stoelting | 58011 | The following monofilaments should be used for perigenital sensitivity assessment: 1.65 g, 2.36 g, 2.83 g, 3.22 g, 3.61 g, 4.08 g, 4.31 g, and 4.74 g. |
| Animal Enclosure (12 mice 6 rats) | IITC | 435 | Be sure to place a heavy object on top of the individual, acrylic animal enclosures to prevent mice from escaping. |
| Mesh Stand for mice and rats (12 mice 6 rats) | IITC | 410 | Place stand on a stable table top for comfortable access. |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5493 | Dilute the 10x PBS stock to 1x PBS. |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | A 4% paraformaldehyde solution is needed to intracardially perfuse mice and postfix tissue in preparation for mast cell staining. |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | Cryoprotect fixed tissue in 30% sucrose solution at 4°C overnight. |
| Heptane | Sigma-Aldrich | 246654 | Chill heptane on dry ice to freeze tissue. |
| Standard Cryomold | VWR International | 4557 | To assist in freezing prostate tissue prior to cryostat sectioning |
| Tissue-Tek OCT Compound | Sakura | 4583 | 12 x 125 ml |
| VWR Superfrost Plus Micro Slide | VWR International | 48311-703 | 75 x 25 x 1 mm |
| Toluidine Blue O | Sigma-Aldrich | 198161 | Certified by the Biological Stain Commission. Suitable for use as a metachromatic stain for mast cells. |
| Ethanol, Absolute (200 Proof) | Fisher Scientific | BP2818-4 | Molecular Biology Grade, Fisher Bioreagents; 95% and 100% solutions will be needed to dehydrate stained cryosections before mast cell visualization. |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | Acidified NaCl solution should be made fresh before staining cryosections. |
| GeneMate Sterile 50 ml Centrifuge Tubes | BioExpress | C-3394 | Disposable tubes used to mix toulidine blue elements or dip slides into 1xPBS. |
| Coplin staining dish for 10 slides, with ground glass cover | Fisher Scientific | 08-815 | Hold up to 10 standard 3 x 1 in. (75 x 25mm) slides back-to-back. Use separate dishes for Toluidine Blue working solution, 95% EtOH, 100% EtOH, and xylene. |
| Xylenes (Histological) | Fisher Scientific | X3P | Once dehydrated, tissue is cleared with xylene. |
| Microscope Slide Boxes, 100-Place | VWR International | 82003 | Boxes can be used for storage and transportation of slides. |
| Fisherbrand Microscope Slide Box | Fisher Scientific | 22-363-400 | These slide boxes are typically small enough to fit inside a cryostate. |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Glycerol is a traditional mounting medium. |
| Mounting Medium, Richard-Allan Scientific | VWR International | 4111 | Mounting medium firmly bonds the coverslip to the slide. |
| Micro Cover Glasses, Rectangular, No. 1 | VWR International | 48393-106 | A coverslip is placed over the dehydrated and cleared tissue to protect the sample. |
| Light Microscope | Nikon | The Advanced Automated Research Microscope Eclipse 90i, used by our lab, has been discontinued and replaced Eclipse Ni-E. |
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