Summary
Vi måler perigenital mekanisk følsomhet og mastcelleaktivering i prostata av mannlige C57BL / 6 mus som gjennomgikk en tidlig liv stress paradigmet - neonatal mors separasjon, for å indusere en preklinisk modell av kronisk prostatitt / kronisk bekkensmertesyndrom.
Abstract
Kronisk prostatitt / kronisk bekkensmertesyndrom (CP / CPP) har en livstidsprevalens på 14% og er den vanligste urologisk diagnose for menn under 50 år, men det er den minst forståtte og studerte kroniske bekkensmerter lidelse. En betydelig undergruppe av pasienter med kroniske bekkensmerter rapport etter å ha opplevd tidlig liv stress eller misbruk, som kan betydelig påvirke funksjon og regulering av hypothalamus-hypofyse-binyre (HPA) aksen. Mastcelleaktivering, som har vist seg å være økt i både urin og uttrykt prostata sekreter av CP / CPP-pasienter og delvis reguleres av nedstrøms aktivering av HPA akse. Neonatal mors separasjon (NMS) har blitt brukt i over to tiår å studere resultatene av tidlig liv stress i gnagermodeller, inkludert endringer i HPA-aksen og visceral følsomhet. Her gir vi en detaljert protokoll for bruk av NMS som et preklinisk modell av CP / CPP i mannlige C57BL / 6 mus. Vi beskriver metodologifor å utføre NMS, vurdere perigenital mekanisk allodyni, og histologiske tegn på mastcelleaktivering. Vi tilbyr også bevis for at tidlig psykologisk stress kan ha langvarige effekter på mannlige urogenitale systemet hos mus.
Introduction
Kroniske bekkensmerter er ikke i seg selv en sykdom, men snarere et begrep knyttet til den pågående spontan og / eller fremkalt smerte oppleves av pasienter med diagnosen irritabel tarm syndrom (IBS), interstitiell cystitt / smertefull blære (IC / PBS), vulvodynia, eller kronisk prostatitt / kronisk bekkensmertesyndrom (CP / CPP). Disse syndromene er ofte comorbid og deler mange egenskaper ved at de har ingen assosiert patologi eller identifisert underliggende etiologi, men dysfunksjon i immunsystemet, sentralnervesystemet og det perifere nervesystemet har vist seg å bidra til å opprettholde og progresjon av disse lidelsene 1 -3. Pasienter med kronisk bekkensmerte er mer sannsynlig å presentere med symptomer på flere, ikke-bekken relaterte funksjonelle smerteforstyrrelser og humørforstyrrelser, inkludert angst, depresjon, panikklidelse og 4-6, som er blitt assosiert med endret funksjon av hypothalamic- hypofysebinyre (HPA) aksen 7-10. Eksponering for tidlig liv stress eller traumer er en betydelig risikofaktor for å utvikle HPA misdannelser og tilhørende kroniske smertesyndromer 10,11, og som sådan, rapporterer en betydelig undergruppe av pasienter med funksjonelle bekkensmerter lidelser etter å ha opplevd uønskede barndommen hendelser som overgrep eller omsorgssvikt 12-14.
Gnager modeller av neonatal mors separasjon (NMS), som innebærer å fjerne valpene fra sin dam for en viss periode av tid i løpet av preweaning perioden, har vært brukt i de siste to tiårene for å studere resultatene av tidlig liv stress. Generelt har NMS vist å øke HPA akse-aktivering, og resulterende angstlignende oppførsel, ved direkte påvirker genekspresjon i hypothalamus, samt forstyrre nedstrøms regulering fra limbiske strukturer 15-18. Forstyrrelse av riktig HPA-akse funksjon har vist seg å bidra til øket tykk- 19-22 16 sensitivitet vises av gnager NMS-modeller, men til tross for omfattende karakterisering av den langsiktige effekten av postnatal blærebetennelse 23-25, har virkningen av tidlig liv stress i stor grad gått unstudied i urogenitale organer. Derfor vil følgende studie beskriver hvordan du utfører NMS i mus og senere evaluere perigenital mekanisk følsomhet og mastcelleinfiltrasjon / aktivering i prostata å validere bruk av mannlige NMS mus som en preklinisk modell for CP / CPP.
Av alle de diagnostiserte kroniske bekkensmerter lidelser, er CP / CPP kanskje den minst godt anerkjent og preget syndrom, til tross for at en livstidsprevalens på rundt 14% 26 og årlige pasientkostnader anslått til $ 4400 (det dobbelte av ryggsmerter eller revmatoid arthritis 27). Pasienter med CP / CPP rapport smerter i perineum, endetarm, prostata, penis, testikler og / eller magen 28, oppleve en hiGher grad av psykisk stress enn kontrollpasienter 29, og ofte tilstede med symptomer på eller er diagnostisert med komorbide kroniske bekkensmerter eller stemningslidelser 5,29-31. Tilbakevendende infeksjon, utett epitel, nevrogen inflammasjon og autoimmunitet har alle blitt antatt som potensielle underliggende årsaker til CP / CPP 2,32,33, samt mastcelleaktivering og degranulering 34. Uttrykt prostata sekreter fra menn med CP / CPP hadde økt mastcelle tryptase og nervevekstfaktor (NGF) nivåer 34, og en senere studie bekreftet at tryptase og karboksypeptidase A (CPA3), en markør for mastcelleaktivering, ble også økt i urin av CP / CPP pasienter 35. Den potensielle rolle for mastceller i utbruddet og vedlikehold av CP / CPP har vært et stort fokus på dyr forskning på dette syndromet så langt. Den mest vanlig anvendte gnagermodell for å studere CP / CPP er en eksperimentell autoimmun prostatitt (EAP) modell generated ved subkutan injeksjon av prostata antigen i fullstendig Freunds adjuvans, noe som resulterer i varierende grader av betennelse i prostata, avhengig av artene og stammen som brukes 34,36-39. Mastcelleinfiltrasjon og aktivering / degranulering har vist seg å øke etter induksjon av EAP 34,35,40. Transgene mus mangelfull i enten mastceller 34 eller tryptase reseptoren PAR2 35 utvikler ikke prostatahyperplasi taktikk følsomhet følgende EAP, i motsetning til hvete EAP mus. Selv om denne preklinisk modell replikerer mange av egenskapene til human CP / CPP er induksjonen protokollen ikke en indikasjon på den menneskelige tilstand, som har en mangfoldig etiologi og ofte ikke involverer direkte inflammasjon, infeksjon eller skade på prostata.
Påvirkningen av tidlig liv stress på utvikling av CP / CPP hos mennesker har i stor grad gått uninvestigated; Men en studie av Hu, et al. 41, viste at megn som rapporterte en historie om barndom fysisk, følelsesmessig og / eller seksuelle overgrep var signifikant mer sannsynlig å oppleve symptomer på CP / CPP. Videre viste de at både smerte og urin skår ble økt hos pasienter med en historie med fysisk og psykisk mishandling. Vi har tidligere vist at det samme NMS paradigmet i kvinnelig C57BL / 6 mus produserer vaginal overfølsomhet og unormal genuttrykk i både vagina og urin tyder på dysfunksjonell HPA aksen utgang 16. Dette bevis kombinert med høy forekomst av CP / CPP pasienter med andre samtidige sykdommer, 42, inkludert IC / PBS og stemningslidelser, som er mer tydelig vist seg å være knyttet til tidlig liv stress eksponering 12-14, gir begrunnelsen for å bruke en NMS modell for å undersøke CP / CPP hos mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøkene beskrevet i denne protokollen i samsvar med NIH retningslinjer i samsvar med de retningslinjer som er angitt av University of Kansas Medical Center Institutional Animal Care og bruk komité.
1. Neonatal Maternal Separasjon (NMS)
- Overvåke gravide demninger daglig for søppel fødsler.
Merk: Dagen kullet er født anses P0. - På P1, fjerne demningen fra hjemmet buret og plasser i en ren sekundær container.
- Gni en håndfull av sengetøy mellom rene-hansker for å opprettholde duften av hjemmeburet.
- Legg til en dybde på 1 - 2 cm fra hjemmeburet bedding i en ren, hensiktsmessig merket 2 liter begerglass. Legg til omtrent halvparten av ytterligere anrikning strømateriale som er tilstede i hjemmeburet, f.eks nestlet, Crinkle papir, til den begerglass.
- Forsiktig plassere alle avkom fra en enkelt kull, enkeltvis, i det samme beger.
- Umiddelbart plasserebegerglasset i en inkubator holdt ved 33 ° C og 50% fuktighet i 180 min.
- Fjern demningen fra den andre posen og returnere henne til hjemmet buret. Returnere hjem buret til dens passende bolig plassering i vivarium.
- Gjenta denne prosedyren for hvert kull under NMS, bruker rene hansker og sekundære beholdere for hvert kull / dam.
- På slutten av 180 min separasjonsperioden, returnere kull til sine hjem bur i samme rekkefølge som de ble fjernet.
- Hente hjem buret de første kullet som ble skilt tidligere i dag. Fjern demningen fra hjemmet buret og plasser i en ren sekundær container.
- Fjern først begeret fra inkubatoren og gni en håndfull av sengetøy mellom rene hansker for å opprettholde duften av hjemmeburet ved håndtering valpene.
- Forsiktig flytte valpene, individuelt, fra begeret til hjemmet buret.
- Returnere noen berikelse og sengetøy igjen i begeret tilhjemmet buret.
- Tilbake demningen fra den andre posen til hjemmet buret og returnere den til dens passende bolig plassering i vivarium.
- Skyll begeret med vann og returnere det til inkubatoren. Bruk samme beger for hvert kull i løpet av separasjon prosedyren.
- Gjenta denne prosedyren for hvert kull under NMS i samme rekkefølge som de ble plassert i kuvøse.
- Gjenta hele denne prosedyren for hvert kull som gjennomgår NMS hver dag gjennom P21.
- Avvenne NMS og naive unger på P22 ved å plassere kullsøsken av samme kjønn sammen i rene bur komplett med mat og vann. Naive unger skal bli født og plassert under de samme vilkår som NMS mus, men gjennomgår ingen tilleggsbehandling utenom normal husdyrhold oppgaver.
2. Perigenital Mekanisk følsomhet
- von Frey Apparatus Setup
- Ta med mus til testing rom og tillate dem å akklimatisere for 30min mens resterende i sine hjem bur.
- Forberede testing området ved å plassere et absorberende underlags under en forhøyet netting-top table (79 cm x 28 cm) som gir nok plass til at den etterforsker for å nærme seg fra undersiden uten oppsiktsvekkende mus, ca 55 cm i høyden.
- Plasser opp til 12 mus, individuelt under klare, perforerte plast kamre (11 cm x 5 cm x 3,5 cm) på toppen av netting tabellen. Plassere tunge gjenstander på toppen av kamrene for å hindre mus fra å rømme.
- Musene akklimatiseres i ytterligere 30 min på skjermen før uttak terskel vurdering.
- Perigenital Mekanisk følsomhet Assessment
- Utfør opp-ned metoden bruker et standard sett med graderte von Frey monofilamenter 43. Bruk følgende monofilamentene: 1,65 g, 2,36 g, 2,83 g, 3,22 g, 3,61 g, 4,08 g, 4,31 g og 4,74 g.
- Hold i bunnen av 3,22 g monofilament og utsette den tilbaketrukne monofilament.
Merk: Enkelte modeller kan ikke ha en tilbaketrukket monofilament. - Plasser sonden slik at monofilament er vertikalt orientert og når musen er våken, immobile, og kroppsvekten fordeles jevnt mellom bakpotene bruke den til enten venstre eller høyre side av pungen, unngå midtlinjen, til en svak bend er observert i filamentet.
- Hold monofilament på plass i 10 sekunder eller inntil dyr viser en positiv reaksjon.
Merk: En positiv respons regnes for å være en rask rykk eller hoppe i respons til anvendelse monofilament eller slikking eller biting oppførsel rettet mot monofilament. Hvis musen beveger seg i løpet av 10 sek monofilament søknad uten å vise disse atferd, må monofilament testes på nytt etter en minimum 1 min lang hvileperiode. Hvis en mus verken trekk eller viser noen av ovennevnte atferd i løpet av 10 sek monofilament søknaden, regnes det som et negativt svar. - Spill responsen, enten negative eller positive, i en lab notisbok eller bærbar PC og gjenta denne prosedyren på alle de gjenværende mus bruker 3,22 g monofilament.
- Teste alle musene igjen med neste passende monofilament. Merk: Hvis musen viste en negativ reaksjon på 3,22 g monofilament, anvende 3,61 g monofilamentet på samme måte og registrere responsen. Hvis musen viste en positiv respons på 3,22 g monofilament, bruke 2,83 g monofilament og registrere responsen.
- Hold i bunnen av 3,22 g monofilament og utsette den tilbaketrukne monofilament.
- Fortsett å teste hver mus med den neste større eller mindre monofilament, som hensiktsmessig, for ytterligere fire søknader etter første positive respons er observert.
- Tilbake mus til hjem bur.
- Bruke verdien av den endelige von Frey monofilament anvendes i prøveserien i log enheter for å beregne en 50% g terskelverdi uttak som beskrevet i Chaplan et al., 43.
- Utfør opp-ned metoden bruker et standard sett med graderte von Frey monofilamenter 43. Bruk følgende monofilamentene: 1,65 g, 2,36 g, 2,83 g, 3,22 g, 3,61 g, 4,08 g, 4,31 g og 4,74 g.
- Tissue Processing
- Dissekere prostatavevet 44 fra mus som har blitt intracardially perfuserte med iskald 4% paraformaldehyde 45. Postfix vevet i 4% paraformaldehyd i 1 time ved RT og deretter cryoprotect i 30% sukrose i 1 x PBS ved 4 ° CO / N.
- Forbered en liten (30 ml) bad heptan og plassere den på tørris.
- Skyll prostatavevet i 1x PBS og tørre å bruke en lys plikt tørk.
- Sett prostatavevet inn i den kalde heptan inntil det er frosset.
- Umiddelbart plassere frosne prostatavevet i en cryomold inneholder monterings medier og sted på tørris til frosset.
- Oppbevares cryomolds ved -20 ° C.
- Tvers kutte prostatavevet inn i 7 mikrometer tykke frysesnitt med en kryostat.
- Plasser 8 - 12 ikke-seriefrysesnitt som strekker seg over lengden av vev, på positivt ladde objektglass.
- Lagres ferdig lysbilder ved -20 ° C inntil videre behandling.
- Forbereder syrnet toluidinblått
- Tilsett 1 g av toluidinblått O til 100 ml 70% etanol og virvle inntil i oppløsning for å fremstille en 1% stamløsning. Aksjen løsning kan lagres ved romtemperatur i opptil tre uker.
- Tilsett 1 g NaCl i 100 ml vann i et begerglass plassert på toppen av en røreplate.
- Juster pH i NaCl-løsning med 12 M HCl inntil en pH-området 0,5 til 1,0 er oppnådd.
- Klargjør 0,25% toluidinblått arbeidsløsning ved å kombinere 8 ml av toluidinblått stamløsning og 32 ml av den 1% NaCl-løsning. Pipettere opp og ned for å sikre total inkorporering av toluidinblått stamoppløsningen og blande ved hjelp av en vortex. Arbeids løsningen må gjøres frisk og kastes etter bruk.
- Flekker Prostata frysesnitt
- Fjern lysbilder som skal behandles fra fryseren og la den likevekt til RT for ca 30 mi.
- Vask vevssnittene ved individuelt å dyppe objektglass i ca. 1 sek inn i et 50 ml konisk rør inneholdende en tilstrekkelig mengde av 1 x PBS for å sikre at glidemontert vevssnitt blir helt neddykket. Tillat lysbilder lufttørke på et papirhåndkle.
- Plasser glir i en glasskrukke som inneholdt nok fargings 0,25% arbeids toluidinblått løsning for å sikre at glidemontert vevssnitt vil bli fullstendig neddykket og inkuberes i 10 - 15 minutter under en vippeplattform satt til 15 opm.
- Dypp lysbilder i 1x PBS for ca 1 sek for å vaske ut overflødig toluidinblått.
- Plasser lysbilder i en lysbilde boks eller rack på en slik måte at lysbildene er på sine sider for å tillate drenering.
- Tørk glir i en ovn ved 37 ° C i minst 2 timer eller O / N ved RT.
- Dehydrere lysbilder raskt ved hjelp av alkohol, slik at skinnene til helt tørr mellom eksponeringene alkohol. Tørr lysbilder av drenering på et papirhåndkle ennd tørke ryggen og kanter med en lys plikt tørk.
- Fordype lysbildene i 95% EtOH for ca 1 sek og la det tørke helt. Gjenta denne prosedyren 1 - 10 ganger før vev tørker mer blå enn lilla.
- Fordype lysbildene i 100% EtOH for ca 1 sek og la det tørke helt. Gjenta denne prosedyren 1 - 10 ganger før vevet er mørkt til medium blå, men ikke lilla.
- Fix flekken ved inkubasjon lysbildene i 100% xylen i 3 min. La det tørke.
- Dekkglassene med glyserol, PBS, eller xylen-basert permanent monterings medier. Drenere overflødig media og oppbevar ved RT.
- Kvantifisering mastceller
- Visualisere toluidinblått-farget vevssnitt på 20X forstørrelse ved hjelp av lysmikroskopi (figur 2).
- Telle det totale antall mastceller som er tilstede i den visualiserte område og skille mellom ikke-degranulated og degranulated mastceller. 40X Magnification kan være nødvendig for å bekrefte granulering status i enkelte mastceller.
Merk: Ikke-degranulated mastceller stille tett metachromasia med ingen eller svak kjernekraft disposisjon og / eller ingen granulær ekstrudering rundt cellen. Degranulated mastceller utviser mindre intens metachromasia og har en tydelig klart omriss av kjernen og / eller frie granuler i cytoplasmaet og utsiden av cellekanten. - Fortsett å vurdere det totale antall ikke-degranulated og degranulated mastceller i helheten av det aktuelle vev delen. Gjenta denne prosedyren på minst 7 flere separate deler, som spenner over lengden hver vev.
- Beregn prosentandelen av degranulated (DG) til summen av mastceller for hvert vev / mus i henhold til følgende ligning: (DG mastceller / Totalt antall mastceller) x 100.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mus som har gjennomgått NMS viste atferds bevis indikerer CP / CPP. Når den testes med en gradert serie av von Frey monofilamenter, 8 uker gamle NMS mus (n = 4) vises perigenital mekanisk allodyni i forhold til ubehandlede motparter (n = 5, figur 2). Dette er dokumentert som en signifikant reduksjon (p <0,01; Students t-test) i det mekaniske uttak terskelen som fremkalte en positiv atferdsmessig respons, registrert som en rask rykk eller hoppe i respons til monofilament anvendelse eller slikking eller biting oppførsel rettet mot monofilament .
Mus som ble eksponert for NMS vises også histologiske tegn på CP / CPP. Kryostatsnitt av prostata vev ble farget med forsurede o-toluidinblått å observere tryptase granulater plassert innenfor mastceller (figur 3A-D). Prosentandelen av mastceller som viste tegn på aktivering, f.eks diffuse metachromasia, granulater tilstede utsiden av cellerammen (figur 3D), var signifikant økt i prostatavev fra 8 uker gamle NMS mus, sammenlignet med naive (p <0,0001, Student t-test, figur 3E). Det totale antall infiltrert mastceller, uavhengig av korning status, var ikke signifikant forskjellig mellom naive (99,5 ± 15,2 celler / seksjon) og NMS mus (108,2 ± 22,5 celler / seksjon).
Figur 1. Prosedyre tidslinje. Den skjematisk skisserer en anbefalt tidslinje for å utføre den beskrevne metodikken. Neonatal mors separasjon (NMS) utføres daglig fra postnatal dag (P) 1 inntil P21 og mus er avvent på P22. Mus forblir uforstyrret utenfor normal husdyrhold inntil 8 ukers alder når de er testet for perigenital mekaniske sensitivity. Hvis den samme musene skal bli vurdert for mastcelle farging, bør en uke tillates å forløpe etter adferdstesting for å tillate eventuelle gjenværende stress effekter å løse.
Figur 2. Perigenital mekanisk følsomhet. Perigenital mekanisk følsomhet ble målt ved hjelp av von Frey monofilament søknad. Hannmus som gjennomgikk neonatal maternal separasjon (NMS) viste en signifikant reduksjon i uttak terskel, sammenlignet med naive mus, som indikerer mekanisk allodyni. Data representerer middel SEM, n = 4 i hver gruppe. * P <0,05, Student t-test.
Figur 3. mastcelleaktivering. Acidified toluidinblått ble anvendt for å visualisere tryptase granuler og beregne hvor stor andel av aktiverte / degranulated mastceller i kryostatsnitt av prostatavevet. Representative photomicrographs vises av toluidinblått-farget seksjoner fra naive (A) og NMS (B) prostata med piler som indikerer intakte (ikke-degranulated) og pilspisser indikerer aktivert (degranulated) mastceller. Høyere forstørrelse av bilder fra naive (C) og NMS (D) blære er vist for å illustrere histologiske forskjeller fra ikke-degranulated (C) og (D) degranulated mastceller. En signifikant høyere prosentandel av degranulated mastceller ble observert i prostata seksjoner fra NMS mus sammenlignet med naturlige mus (E). Data representerer middel SEM, n = 4 i hver gruppe. **** P <0,0001, t-test.= "_ Blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen gir metodikk for bruk av neonatal stress, i form av NMS, å indusere symptomologi indikasjon på CP / CPP hos voksne mannlige mus. Som voksne, NMS mus viser signifikant perigenital mekanisk allodyni, samt bevis for degranulering av mastceller i prostatavev. Bruken av NMS er en ny tilnærming til utvikling av en preklinisk modell av CP / CPP ved at det replikerer tidlig i livet stress som blir ofte rapportert av pasienter med kronisk underlivssmerter 12-14, i tillegg til at den inneholder en ikke-invasiv induksjon, så motsetning til mer brukte, kjemiske stoffer, og immunologisk-indusert betennelser i prostata 34,36-39. Videre NMS på mus har vist seg å produsere komorbid symptomology, herunder endrede angst-lignende og anhedonic atferd, økt vannlatings priser, og bakpote overfølsomhet (16; data ikke vist), lik de komorbide somatiske, humør og viscerale lidelser utstilt ved CP / CPP Patients 4-6.
Den største fordelen med å bruke NMS å indusere CP / CPP i mus er at den bruker en psykologisk intervensjon for å sette i gang fysiologiske forandringer. Pasienter med CP / CPP har variant etiologi som i stor grad ikke involverer tidligere infeksjon eller direkte skade prostata 1-3. Til tross for dette faktum, har publisert modeller av CP / CPP inkorporert direkte eller indirekte betennelse i prostata for å indusere overfølsomhet i perigenital region og / eller mastcelleaktivering. En betydelig andel av CP / CPP og kroniske bekkensmerter pasienter generelt, oppgir at de har opplevd tidlige liv motgang, som i stor grad har gått unstudied i gnagermodeller av urogenitale smertesyndromer. Tidligere arbeid fra vårt laboratorium har vist at NMS induserer vaginal hypersensitivitet og tilhørende forstyrrelse av riktig funksjon av HPA-akse 16. Fremtidig arbeid ved hjelp av denne modellen vil undersøke hvilke mekanismer som er drevet av tidlig liv stress å produsere tHan endret fenotype i voksen alder, så vel som for å utforske potensielle farmakologiske eller livsstil intervensjoner som kan brukes i en preklinisk eller klinisk setting.
Oppnå optimale og repeterbare resultater fra denne protokollen er avhengig av å observere flere viktige skritt som kanskje må være optimalisert avhengig av miljøet og utstyret som brukes. Tatt i betraktning at NMS dramatisk påvirker funksjonen av HPA-aksen, er det viktig å kontrollere for ytre stimuli og miljøbelastning under både nyfødte og voksne perioder. Alderstilpassede, ikke-håndtert naive mus skal bli født og plassert i samsvar med hver kohort av NMS mus for å kontrollere for eksterne stressfaktorer til stede i miljøet som kan påvirke utviklingen av HPA-aksen. Det er viktig å finne ut hvor mange mus trengs for å utføre tiltenkte eksperimentet før start avl eller bestiller gravide kvinner i dyret anlegget. Mens utfører NMS, greatest bekymring er avvisning av valpene ved demningen, derfor er det viktig å opprettholde duften av hjemmeburet hele NMS-protokollen. For å minimalisere virkningene av dagaktive rytmer, er det foreslått separasjon tid for NMS under midten av lyset syklus (fra kl 11 til 14:00). Perigenital følsomhetsmålinger bør innhentes i fullt modne voksne mannlige mus, ca 8 ukers alder, og tatt på samme tidspunkt på dagen for hver gruppe, helst tidlig i lys syklus for å falle sammen med bunnen i dagaktive rytmer. For å redusere forekomsten av ikke-fremkalte bevegelser under denne prosedyren, kan vurderinger utføres i et temperaturkontrollert, lydisolert rom med hvit støy fors (20 - 20.000 Hz). Det samme etterforsker bør vurdere alle abstinens terskler gjennom hele studien for å opprettholde konsistens i overholdelsen av positive og negative reaksjoner. Som alternativ til måling av 50% mekanisk terskel, tilbaketrekning frekvens til et enkelt monofilament couLD vurderes eller en elektronisk von Frey anordning 46 kan benyttes. For mastcelle-visualisering, bør alle lysbilder som skal analyseres behandles sammen for å sikre lik farging av mastceller, som fargeintensitet kan variere mellom eksperimentene. En pH-verdi under 1,0 er nødvendig for riktig kontrast mellom de dype lilla mastceller og den lyseblå bakgrunn. For mange skyllinger i alkohol kan vaske ut flekken fra mastceller og negativt påvirke kontrasten. Endelig kan innkopiering et rutenett på vev være nyttig i å telle celler i hele vev delen.
Flere hensyn bør gjøres før bruk av NMS å indusere CP / CPP eller relaterte sentralisert smertelidelser. For det første har det store flertallet av publikasjoner som har innarbeidet tidlig liv stress blitt gjort i rottemodeller av NMS, ved hjelp av en avkortet separasjon periode på P1 - P14. Mange grupper har vist at dette paradigmet genererer en IBS-lignende symptomology i rATS og mus 15; Men i vår tidligere studie en P1 - P14 separasjon periode i C57BL / 6 mus ikke generere en betydelig økning i vaginal følsomhet 16, heller ikke det generere kolorektal overfølsomhet (data ikke vist). Derfor kan arten og lengden av NMS bestemme bestemt utfall i voksen alder, inkludert alvorligheten av symptomologi og de spesifikke organ (e) som er påvirket. For det andre, de atferdsmessige og molekylære endringer som følge av NMS er i stor grad skyldes feilregulering av HPA-aksen 15-18, noe som tyder på at effekten er sentralt-mediert og kunne ha komorbide resultater, herunder endringer i angst og / eller depresjon lignende atferd og økt følsomhet i andre bekken organer eller fjernere steder. Dette komorbid fenotype er en indikasjon på hva som er allment sett klinisk og kan være mer representativ for CP / CPP pasienter som helhet 5,28-31,42. Tredje, basert på disse endringene som skjer som et resultat av HPA-aksen dysregulasjon, må virkningen av belastning være av største interesse både under NMS prosedyre og senere adferdstesting og in vitro analyse. Utgang fra HPA-akse er diurnal, med høyere effekt under de mer aktive mørke syklus og mindre utgang i løpet av flere hvile lys syklus, noe som kan påvirke utfallet av atferds eller in vitro-analyser, avhengig av tidspunktet for testing / ofre 47. På samme måte, eksponering for stressfaktorer, inkludert omgår perigenital mekanisk følsomhet testing, kan forbigående bevirke funksjon av HPA akse 18 og eventuelt endre genekspresjon i tilhørende områder av hjernen og nedstrøms perifere vev.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pregnant C57BL/6 female mice | Charles River | 027 | Timed or untimed pregnant females should be monitored daily for in-house birth. |
| 2 L glass beaker(s) | Sigma-Aldrich | CLS10002L | Each NMS litter will be held in the same beaker throughout the 21 day separation period. |
| VWR Forced Air Incubator, Basic | VWR International | 414005-124 | The incubator should be held at 33°C and 50% humidity. |
| Touch Test Sensory Evaluator, Kit of 20 (Semmes-Weinstein Von Frey Aesthesiometer for touch assessment) | Stoelting | 58011 | The following monofilaments should be used for perigenital sensitivity assessment: 1.65 g, 2.36 g, 2.83 g, 3.22 g, 3.61 g, 4.08 g, 4.31 g, and 4.74 g. |
| Animal Enclosure (12 mice 6 rats) | IITC | 435 | Be sure to place a heavy object on top of the individual, acrylic animal enclosures to prevent mice from escaping. |
| Mesh Stand for mice and rats (12 mice 6 rats) | IITC | 410 | Place stand on a stable table top for comfortable access. |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5493 | Dilute the 10x PBS stock to 1x PBS. |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | A 4% paraformaldehyde solution is needed to intracardially perfuse mice and postfix tissue in preparation for mast cell staining. |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | Cryoprotect fixed tissue in 30% sucrose solution at 4°C overnight. |
| Heptane | Sigma-Aldrich | 246654 | Chill heptane on dry ice to freeze tissue. |
| Standard Cryomold | VWR International | 4557 | To assist in freezing prostate tissue prior to cryostat sectioning |
| Tissue-Tek OCT Compound | Sakura | 4583 | 12 x 125 ml |
| VWR Superfrost Plus Micro Slide | VWR International | 48311-703 | 75 x 25 x 1 mm |
| Toluidine Blue O | Sigma-Aldrich | 198161 | Certified by the Biological Stain Commission. Suitable for use as a metachromatic stain for mast cells. |
| Ethanol, Absolute (200 Proof) | Fisher Scientific | BP2818-4 | Molecular Biology Grade, Fisher Bioreagents; 95% and 100% solutions will be needed to dehydrate stained cryosections before mast cell visualization. |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | Acidified NaCl solution should be made fresh before staining cryosections. |
| GeneMate Sterile 50 ml Centrifuge Tubes | BioExpress | C-3394 | Disposable tubes used to mix toulidine blue elements or dip slides into 1xPBS. |
| Coplin staining dish for 10 slides, with ground glass cover | Fisher Scientific | 08-815 | Hold up to 10 standard 3 x 1 in. (75 x 25mm) slides back-to-back. Use separate dishes for Toluidine Blue working solution, 95% EtOH, 100% EtOH, and xylene. |
| Xylenes (Histological) | Fisher Scientific | X3P | Once dehydrated, tissue is cleared with xylene. |
| Microscope Slide Boxes, 100-Place | VWR International | 82003 | Boxes can be used for storage and transportation of slides. |
| Fisherbrand Microscope Slide Box | Fisher Scientific | 22-363-400 | These slide boxes are typically small enough to fit inside a cryostate. |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Glycerol is a traditional mounting medium. |
| Mounting Medium, Richard-Allan Scientific | VWR International | 4111 | Mounting medium firmly bonds the coverslip to the slide. |
| Micro Cover Glasses, Rectangular, No. 1 | VWR International | 48393-106 | A coverslip is placed over the dehydrated and cleared tissue to protect the sample. |
| Light Microscope | Nikon | The Advanced Automated Research Microscope Eclipse 90i, used by our lab, has been discontinued and replaced Eclipse Ni-E. |
References
- Mehik, A., Leskinen, M. J., Hellstrom, P. Mechanisms of pain in chronic pelvic pain syndrome: influence of prostatic inflammation. World journal of urology. 21, 90-94 (2003).
- Schaeffer, A. J. Epidemiology and evaluation of chronic pelvic pain syndrome in men. International journal of antimicrobial agents. 31, Suppl 1. S108-S111 (2008).
- Wesselmann, U. Neurogenic inflammation and chronic pelvic pain. World journal of urology. 19, 180-185 (2001).
- Arnold, L. D., Bachmann, G. A., Rosen, R., Kelly, S., Rhoads, G. G. Vulvodynia: characteristics and associations with comorbidities and quality of life. Obstetrics and gynecology. 107, 617-624 (2006).
- Bullones Rodriguez, M. A., et al. Evidence for overlap between urological and nonurological unexplained clinical conditions. The Journal of urology. 189, S66-S74 (2013).
- Warren, J. W., van de Merwe, J. P., Nickel, J. C. Interstitial cystitis/bladder pain syndrome and nonbladder syndromes: facts and hypotheses. Urology. 78, 727-732 (2011).
- Heim, C., Newport, D. J., Bonsall, R., Miller, A. H., Nemeroff, C. B. Altered pituitary-adrenal axis responses to provocative challenge tests in adult survivors of childhood abuse. The American journal of psychiatry. 158, 575-581 (2001).
- Mayson, B. E., Teichman, J. M. The relationship between sexual abuse and interstitial cystitis/painful bladder syndrome. Current urology reports. 10, 441-447 (2009).
- Rao, U., Hammen, C., Ortiz, L. R., Chen, L. A., Poland, R. E. Effects of early and recent adverse experiences on adrenal response to psychosocial stress in depressed adolescents. Biological psychiatry. 64, 521-526 (2008).
- Videlock, E. J., et al. Childhood trauma is associated with hypothalamic-pituitary-adrenal axis responsiveness in irritable bowel syndrome. Gastroenterology. 137, 1954-1962 (2009).
- Tyrka, A. R., et al. Childhood parental loss and adult hypothalamic-pituitary-adrenal function. Biological psychiatry. 63, 1147-1154 (2008).
- Chitkara, D. K., van Tilburg, M. A., Blois-Martin, N., Whitehead, W. E. Early life risk factors that contribute to irritable bowel syndrome in adults: a systematic review. The American journal of gastroenterology. 103, 765-774 (2008).
- Jones, G. T., Power, C., Macfarlane, G. J. Adverse events in childhood and chronic widespread pain in adult life. Results from the 1958 British Birth Cohort. 143, 92-96 (2009).
- Peters, K. M., Killinger, K. A., Ibrahim, I. A. Childhood symptoms and events in women with interstitial cystitis/painful bladder syndrome. Urology. 73, 258-262 (2009).
- Mahony, S. M., Hyland, N. P., Dinan, T. G., Cryan, J. F. Maternal separation as a model of brain-gut axis dysfunction. Psychopharmacology. 214, 71-88 (2011).
- Pierce, A. N., Ryals, J. M., Wang, R., Christianson, J. A. Vaginal hypersensitivity and hypothalamic-pituitary-adrenal axis dysfunction as a result of neonatal maternal separation in female mice. Neuroscience. 263, 216-230 (2014).
- Ladd, C. O., Huot, R. L., Thrivikraman, K. V., Nemeroff, C. B., Plotsky, P. M. Long-term adaptations in glucocorticoid receptor and mineralocorticoid receptor mRNA and negative feedback on the hypothalamo-pituitary-adrenal axis following neonatal maternal separation. Biological psychiatry. 55, 367-375 (2004).
- Malley, D., Dinan, T. G., Cryan, J. F. Neonatal maternal separation in the rat impacts on the stress responsivity of central corticotropin-releasing factor receptors in adulthood. Psychopharmacology. 214, 221-229 (2011).
- Chung, E. K., Zhang, X. J., Xu, H. X., Sung, J. J., Bian, Z. X. Visceral hyperalgesia induced by neonatal maternal separation is associated with nerve growth factor-mediated central neuronal plasticity in rat spinal cord. Neuroscience. 149, 685-695 (2007).
- Coutinho, S. V., et al. Neonatal maternal separation alters stress-induced responses to viscerosomatic nociceptive stimuli in rat. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 282, G307-G316 (2002).
- Moloney, R. D., et al. Early-life stress induces visceral hypersensitivity in mice. Neuroscience letters. 512, 99-102 (2012).
- Wijngaard, R. M., et al. Peripheral alpha-helical CRF (9-41) does not reverse stress-induced mast cell dependent visceral hypersensitivity in maternally separated rats. Neurogastroenterol Motil. 24, 274-282 (2012).
- DeBerry, J., Ness, T. J., Robbins, M. T., Randich, A. Inflammation-induced enhancement of the visceromotor reflex to urinary bladder distention: modulation by endogenous opioids and the effects of early-in-life experience with bladder inflammation. J Pain. 8, 914-923 (2007).
- Randich, A., Uzzell, T., DeBerry, J. J., Ness, T. J. Neonatal urinary bladder inflammation produces adult bladder hypersensitivity. J Pain. 7, 469-479 (2006).
- Shaffer, A. D., Ball, C. L., Robbins, M. T., Ness, T. J., Randich, A. Effects of acute adult and early-in-life bladder inflammation on bladder neuropeptides in adult female rats. BMC urology. 11, 18 (2011).
- Pontari, M. A., Joyce, G. F., Wise, M., McNaughton-Collins, M. Urologic Diseases in America, P. Prostatitis. The Journal of urology. 177, 2050-2057 (2007).
- Calhoun, E. A., et al. The economic impact of chronic prostatitis. Archives of internal medicine. 164, 1231-1236 (2004).
- Nickel, J. C., et al. Category III chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome: insights from the National Institutes of Health Chronic Prostatitis Collaborative Research Network studies. Current urology reports. 9, 320-327 (2008).
- Mehik, A., Hellstrom, P., Sarpola, A., Lukkarinen, O., Jarvelin, M. R. Fears, sexual disturbances and personality features in men with prostatitis: a population-based cross-sectional study in Finland. BJU international. 88, 35-38 (2001).
- Clemens, J. Q., Brown, S. O., Calhoun, E. A. Mental health diagnoses in patients with interstitial cystitis/painful bladder syndrome and chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome: a case/control study. The Journal of urology. 180, 1378-1382 (2008).
- Rodriguez, M. A., et al. Evidence for overlap between urological and nonurological unexplained clinical conditions. The Journal of urology. 182, 2123-2131 (2009).
- Murphy, S. F., Schaeffer, A. J., Thumbikat, P. Immune mediators of chronic pelvic pain syndrome. Nature reviews. Urology. 11, 259-269 (2014).
- Parsons, C. L. The role of a leaky epithelium and potassium in the generation of bladder symptoms in interstitial cystitis/overactive bladder, urethral syndrome, prostatitis and gynaecological chronic pelvic pain. BJU international. 107, 370-375 (2011).
- Done, J. D., Rudick, C. N., Quick, M. L., Schaeffer, A. J., Thumbikat, P. Role of mast cells in male chronic pelvic pain. The Journal of urology. 187, 1473-1482 (2012).
- Roman, K., Done, J. D., Schaeffer, A. J., Murphy, S. F., Thumbikat, P. Tryptase-PAR2 axis in experimental autoimmune prostatitis, a model for chronic pelvic pain syndrome. Pain. 155, 1328-1338 (2014).
- Donadio, A. C., Depiante-Depaoli, M. Inflammatory cells and MHC class II antigens expression in prostate during time-course experimental autoimmune prostatitis development. Clinical immunology and immunopathology. 85, 158-165 (1997).
- Keetch, D. W., Humphrey, P., Ratliff, T. L. Development of a mouse model for nonbacterial prostatitis. The Journal of urology. 152, 247-250 (1994).
- Rivero, V. E., Cailleau, C., Depiante-Depaoli, M., Riera, C. M., Carnaud, C. Non-obese diabetic (NOD) mice are genetically susceptible to experimental autoimmune prostatitis (EAP). Journal of autoimmunity. 11, 603-610 (1998).
- Rudick, C. N., Schaeffer, A. J., Thumbikat, P. Experimental autoimmune prostatitis induces chronic pelvic pain. American journal of physiology. Regulatory, integrative and comparative physiology. 294, R1268-R1275 (2008).
- Rivero, V. E., Iribarren, P., Riera, C. M. Mast cells in accessory glands of experimentally induced prostatitis in male Wistar rats. Clinical immunology and immunopathology. 74, 236-242 (1995).
- Hu, J. C., Link, C. L., McNaughton-Collins, M., Barry, M. J., McKinlay, J. B. The association of abuse and symptoms suggestive of chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome: results from the Boston Area Community Health survey. Journal of general internal. 22, 1532-1537 (2007).
- Riegel, B., et al. Assessing psychological factors, social aspects and psychiatric co-morbidity associated with Chronic Prostatitis/Chronic Pelvic Pain Syndrome (CP/CPPS) in men - A systematic review. Journal of psychosomatic research. 77, 333-350 (2014).
- Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. Journal of neuroscience. 53, 55-63 (1994).
- Watkins, S. K., Zhu, Z., Watkins, K. E., Hurwitz, A. A. Isolation of immune cells from primary tumors. Journal of visualized experiments : JoVE. , e3791 (2012).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
- Martinov, T., Mack, M., Sykes, A., Chatterjea, D. Measuring changes in tactile sensitivity in the hind paw of mice using an electronic von Frey apparatus. Journal of visualized experiments : JoVE. , e51212 (2013).
- Lutgendorf, S. K., et al. Diurnal cortisol variations and symptoms in patients with interstitial cystitis. The Journal of urology. 167, 1338-1343 (2002).
