Summary
Kronik prostatit / kronik pelvik ağrı sendromu bir klinik öncesi modelini teşvik etmek amacıyla yenidoğan anne ayrılık, - Biz bir erken yaşam stresi paradigmasını uygulanan erkek C57BL / 6 farelerin prostat perigenital mekanik duyarlılık ve mast hücre aktivasyonunu ölçüyorlar.
Abstract
Kronik prostatit / kronik pelvik ağrı sendromu (CP / CPPS)% 14 yaşam boyu yaygınlığı vardır ve 50 yaşın altındaki erkeklerde en sık ürolojik tanı, henüz en az anlaşılan ve çalışılan kronik pelvik ağrı bir hastalıktır. Kronik pelvik ağrı raporu ile hastaların önemli bir alt kümesi belirgin hipotalamus-hipofiz-adrenal (HPA) eksen işleyişi ve düzenlenmesini etkileyen erken yaşam stresi ya da kötüye, deneyimli. Gösterilmiştir mast hücresi aktivasyonu, kısmen HPA ekseninin alt aktivasyonu ile düzenlenir, her iki idrar artmış ve CP / CPPS hastanın prostat salgıları ifade edilmesi. Yenidoğan anne ayırma (NMS) HPA eksenin ve visseral duyarlılık değişiklikleri de dahil olmak üzere, kemirgen modellerinde erken yaşam stresi sonuçlarını incelemek için iki yıldan uzun bir süredir kullanılmaktadır. Burada erkek C57BL / 6 farelerinde CP / KAPS preklinik model olarak NMS kullanılarak ayrıntılı protokol sağlar. Biz metodoloji tarifperigenital mekanik allodini ve mast hücresi aktivasyonu histolojik kanıtları değerlendirirken, NMS gerçekleştirmek için. Biz de erken psikolojik stres farelerde erkek ürogenital sistem üzerinde uzun süreli etkilere sahip olduğuna dair kanıt sağlamaktadır.
Introduction
Kronik pelvik ağrı başlı başına bir hastalık değildir, daha ziyade irritabl barsak sendromu (IBS) tanısı hastalar tarafından devam eden spontan ve / veya uyarılmış ağrı, interstisyel sistit / ağrılı mesane sendromu (IC / PBS), vulvodini ile ilgili bir terim, veya kronik prostatit / kronik pelvik ağrı sendromu (CP / CPPS). Bu sendromlar genellikle bağışıklık sistemi, merkezi sinir sistemi ve periferal sinir sistemi içinde işlev bozuklukları bu bozukluklara 1 bakım ve ilerlemesine katkıda gösterilmiştir, ancak bunlar, herhangi bir ilişkili patolojisini veya tespit altta yatan nedeni olduğu birçok özelliklere eşlik eden ve paylaşan -3. Kronik pelvik ağrısı olan hastalar semptomları ile ortaya olasılığı daha yüksektir ek olmayan pelvik ilgili hipotalamik değişmiş işleyişi ile ilişkili bulunmuştur anksiyete, depresyon ve panik bozukluk 4-6 da dahil olmak üzere fonksiyonel ağrı bozuklukları ve duygudurum bozuklukları, hipofizadrenal (HPA) eksen 7-10. Erken yaşam stres veya travma Pozlama HPA anormallikleri ve ilişkili kronik ağrı sendromları 10,11 ve gibi geliştirmek için önemli bir risk faktörüdür, fonksiyonel pelvik ağrı bozukluğu olan hastaların önemli bir alt kümesi gibi istismar veya ihmal gibi olumsuz çocukluk olayları deneyimli rapor 12-14.
Sütten kesim öncesi dönemde zaman belirli bir süre için kendi baraj yavrular kaldırmayı içerir neonatal anne ayrılık (NMS), kemirgen modelleri, erken yaşam stresi sonuçlarını incelemek için son iki yıldır kullanılmaktadır. Genel olarak, NMS doğrudan hipotalamus içinde gen ekspresyonunu etkileyebilen yanı sıra, limbik yapılarda 15-18 aşağı akış düzenleme bozulmasıyla, HPA eksen aktivasyonu ve elde edilen anksiyete benzeri davranışları geliştirmek için gösterilmiştir. Doğru HPA ekseninin işleyişinin bozulması artan kolorektal 19-22 katkıda gösterilmiştir 16 duyarlılık kemirgen NMS modelleri tarafından görüntülenen, ancak doğum sonrası mesane iltihabı 23-25 uzun vadeli etkisi geniş karakterizasyonu rağmen, erken yaşam stresinin etkisi büyük ölçüde ürogenital organlarda unstudied gitti. Bu nedenle, aşağıdaki çalışma farelerde NMS gerçekleştirmek ve daha sonra CP / KPAS için bir preklinik model olarak erkek NMS farelerin kullanımını doğrulamak için prostat perigenital mekanik duyarlılık ve mast hücre infiltrasyonu / aktivasyonunu değerlendirmek için nasıl anlatacağız.
Tanısı kronik pelvik ağrı bozukluklarının tüm CP / CPPS bel ağrısı ya da romatoid o iki belki de yaklaşık% 14 26 yaşam boyu yaygınlığı ve 4.400 $ (tahmini yıllık hasta maliyetlerinin olmasına rağmen en az iyi tanınan ve karakterize sendrom olduğunu artrit 27). Perine, rektum, prostat, penis, testisler ve / veya karın 28, hi deneyim CP / CPPS raporu ağrısı olan hastalarGher kontrol hastalara 29 den psikolojik stres derecesi, ve ya semptomları ile yaygın mevcut komorbid kronik pelvik ağrı ya da duygudurum bozuklukları 5,29-31 ile tanı konur. Tekrarlayan enfeksiyonu, sızan epiteli, nörojenik enflamasyon ve otoimmünite tüm potansiyel yatan / CPPS 2,32,33 CP nedenleri olarak mast hücresi aktivasyonu ve degranülasyonunu 34 olarak tahmin etti edilmiştir. Ayrıca artmıştır, mast hücresi aktivasyonu bir belirteç CP / KPAS'li erkeklerden ifade prostat salgıları mast hücre triptaz ve sinir büyüme faktörü (NGF) seviyeleri 34 artmış ve bir sonraki çalışma triptazın doğruladı ve A (CPA3) carboxypeptidase CP / CPPS hastalarının 35 idrar. başlangıç ve CP / KAPS bakım mast hücreleri için potansiyel rolü bugüne kadar bu sendromun hayvan araştırmalarının önemli bir odak noktası olmuştur. En sık kullanılan kemirgen modeli CP incelemek için kullanılan / CPPS deneysel otoimmün prostatit ise (DAP) modeli gen34,36-39 kullanılan türler ve suşu ile ilgili olarak, prostat iltihabı, çeşitli derecelerde sonuçlanan Tam Freund katkı maddesi, prostat antijeni deri altına enjeksiyon tutulmasıyla oluşturulmuştur. Mast hücresi infiltrasyonu ve aktivasyon / degranülasyon DAP 34,35,40 aşağıdaki indüksiyonu geliştirmek için gösterilmiştir. Mast hücreleri 34 veya triptaz reseptörü PAR2 35 ya eksik transgenik fareler vahşi tipli DAP fareler aksine DAP aşağıdaki prostat taktik duyarlılık geliştirmek yok. Bu preklinik model, insan CP / KPAS özelliklerinin birçoğu çoğaltır ederken, indüksiyon protokolü doğrudan inflamasyon, enfeksiyon ya da prostat yaralanma içermeyen, genellikle farklı etyolojisi vardır ve insan koşulu, göstergesi değildir.
İnsanlarda CP / KPAS gelişimine erken yaşam stresinin etkisi büyük ölçüde soruşturulmadan uğramış; Ancak, Hu ve ark. 41 tarafından yapılan bir çalışmada, bana gösterdin çocukluk fiziksel, duygusal öyküsü bildirdi ve / veya cinsel istismar CP / KPAS düşündüren belirtileri yaşamaya anlamlı olarak daha fazlaydı kim. Dahası, onlar acı ve idrar skorları hem fiziksel hem de duygusal istismar öyküsü olan hastalarda artmış olduğunu gösterdi. Biz daha önce dişi C57BL / 6 farelerinde aynı NMS paradigma vajinal hipersensitiviteye ve anormal gen ifadesini ürettiğini göstermiştir hem vajina ve işlevsiz HPA ekseninin çıkışı 16 düşündüren mesane. Daha net erken yaşam strese maruz kalma 12-14 ile bağlantılı olduğu gösterilmiştir IC / PBS ve duygudurum bozuklukları gibi diğer komorbiditeler 42, ile başvuran CP / CPPS hastalarının yüksek prevalans ile birlikte bu delil, bir kullanma gerekçelerini sağlar NMS modeli farelerde CP / KPAS araştırmak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokol açıklanan tüm deneyler Kansas Tıp Merkezi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu Üniversitesi tarafından belirlenen esaslara uygun olarak NIH kurallarına uygundur.
1. Yenidoğan Anne Ayırma (NMS)
- Çöp doğum günlük hamile baraj izleyin.
Not: doğar çöp P0 kabul edilir bir gün. - P1, ev kafes baraj kaldırmak ve temiz bir kap içine koyun ikincil.
- Evde kafes kokusunu korumak için temiz eldivenli elleri arasına yatak bir avuç ovun.
- Uygun 2 L cam beher etiketli, temiz içine ev kafes yatak 2 cm - 1 derinliğe ekleyin. Cam beher, ev kafes içinde mevcut olan herhangi bir ek zenginleşme yatak malzeme, örneğin, nestlet, kırışık kağıt yaklaşık yarısını ekleyin.
- Yavaşça aynı beher, bireysel, tek bir çöp gelen yavruların hepsi koyun.
- Hemen yerbir kuluçka makinesi içinde beher 180 dakika süreyle 33 o C ve% 50 nemlilikte tutulmaktadır.
- İkincil kaptan baraj çıkarın ve ev kafesine onu iade edin. Vivaryum içinde kendine uygun konut konumu ev kafes dönün.
- , NMS geçiren her çöp / baraj temiz eldiven ve ikincil kapları kullanarak her çöp için bu işlemi tekrarlayın.
- Bunlar çıkarıldı olarak 180 dakika ayırma sürenin sonunda, aynı sırada kendi kafeslerine ibrelerin döndürür.
- Günün erken ayrıldı ilk çöp ev kafes alın. Ev kafesinden baraj çıkarın ve temiz bir kap içine koyun ikincil.
- Inkübatör ilk beher çıkarın ve yavrular işlerken evde kafes kokusunu korumak için temiz eldivenli elleri arasına yatak bir avuç ovalayın.
- Yavaşça ev kafesine kaptan ayrı ayrı, yavruların taşıyın.
- Için beher kalan zenginleşme ve yatak dönev kafes.
- Ev kafesine ikincil kaptan baraj İade ve vivaryum içinde kendine uygun konut konumuna geri döndürebilir.
- Su ile durulayın ve beher inkübatör geri. Ayırma işlem boyunca her çöp için aynı beher kullanın.
- Onlar inkübatör yerleştirildi aynı sırayla NMS geçiren her çöp için bu işlemi tekrarlayın.
- Her çöp Yapılıyor NMS P21 ile her gün için tüm bu işlemi tekrarlayın.
- Yiyecek ve su ile tam temiz kafeslerde birlikte aynı cinsiyetten yavruları koyarak P22 üzerinde NMS ve naif yavrular vazgeçirmek. Naif yavru doğdu ve NMS fareler ile aynı koşullar altında muhafaza fakat normal hayvancılık görevleri dışında başka bir işleme tabi tutulabilir olmalıdır.
2. perigenital Mekanik Hassasiyet
- von Frey tertibat Ayar
- Test odasına fareler getirin ve onları için 30 gelmesini bekleyindk evlerinde kafeslerde kalan süre.
- Araştırmacı fareler, yüksekliği yaklaşık 55 cm şaşırtıcı olmadan alt gelen yaklaşmasına izin için yeterli alan sağlar yükseltilmiş bir tel örgü-üst tablo (79 cm x 28 cm) altında bir emici underpad koyarak test alanını hazırlayın.
- Şeffaf, delikli plastik odaları altında, ayrı ayrı, 12 fareye tel örgü tablosunun üstündeki (11 cm x 5 cm x 3,5 cm) kadar yerleştirin. Kaçan fareler önlemek için odaların üstünde ağır bir nesne yerleştirmeyin.
- Geri çekme eşiği değerlendirmesine önceki ekrana ek bir 30 dakika boyunca fareler alıştırıldı.
- Perigenital Mekanik Hassasiyet Değerlendirme
- Kademeli von Frey monofillerin 43 standart seti kullanarak yukarı-aşağı yöntemi uygulayın. Aşağıdaki monofilamanlar kullanın: 1.65 g, 2.36 g, 2.83 g, 3.22 g, 3.61 g, 4.08 g, 4.31 g, ve 4.74 g.
- 3.22 g monofilament tabanını tutun ve geri çekilmiş mono maruzFilament.
Not: Bazı modellerde bir geri çekilme monofilament olmayabilir. - Monofilament dikey odaklı böylece sonda yerleştirmek ve fare, uyarı hareketsiz ve onun vücut ağırlığı arka pençelerinin arasında eşit olarak dağıtılır zaman hafif bir kadar orta hat kaçınarak, skrotum sol veya sağ tarafına ya uygulamak eğme filament görülmektedir.
- 10 sn veya hayvan olumlu bir yanıt gösterene kadar yerinde monofilament tutun.
Not: bir pozitif tepki monofilin uygulama ya da yalama ya da monofilament yönelik ısırma davranışları karşılık olarak bir canlı pislik ya da atlama olarak kabul edilir. Bu davranışları görüntülemeden 10 sn monofilament uygulama sırasında fare hareket, monofilament asgari 1 dakika süren dinlenme dönemi izleyen tekrar test edilmesi gerekir. Bir fare ne hamle de 10 sn monofilament uygulama sırasında listelenen davranışların üzerinde herhangi sergilerse, bu olumsuz bir yanıt olarak kabul edilir. - Bir laboratuar dizüstü veya dizüstü bilgisayar, olumlu veya olumsuz, bir yanıt kaydedin ve 3.22 g monofilament kullanılarak, kalan farelerin tüm bu işlemi tekrarlayın.
- Daha sonraki uygun monofilament kullanan farelerin hepsi sınayın. Not: Fare 3.22 g monofilament olumsuz yanıt sergiledi ise, aynı şekilde 3.61 g monofilament uygulamak ve yanıtı kaydedin. Fare 3.22 g monofilament olumlu yanıt sergiledi ise, 2.83 g monofilaman uygulamak ve yanıtı kaydedin.
- 3.22 g monofilament tabanını tutun ve geri çekilmiş mono maruzFilament.
- İlk olumlu cevap görülmektedir sonra ek bir 4 uygulamalar için, uygun şekilde, bir sonraki daha büyük veya daha küçük monofilament kullanarak her fare test devam edin.
- Ev kafeslere fareler dönün.
- Chaplan ve arkadaşları. 43'de tarif edildiği gibi% 50 gr geri çekme eşiğinin için günlük birimlerinin deneme dizisi uygulanan son von Frey monofilin değerini kullanın.
- Kademeli von Frey monofillerin 43 standart seti kullanarak yukarı-aşağı yöntemi uygulayın. Aşağıdaki monofilamanlar kullanın: 1.65 g, 2.36 g, 2.83 g, 3.22 g, 3.61 g, 4.08 g, 4.31 g, ve 4.74 g.
- Doku İşleme
- Intrakardiyak buz soğukluğunda% 4 paraformaldehit ile perfüze 45 olan farelerden prostat dokusu 44 teşrih. Postfix'i oda sıcaklığında 1 saat süreyle% 4'lük paraformaldehit doku ve daha sonra 4 ° CO / N 1x PBS içinde% 30 sukroz içinde cryoprotect.
- Heptan küçük bir (30 mi) bir banyo hazırlayın ve kuru buz üzerine yerleştirin.
- 1x PBS prostat dokusunu durulayın ve bir hafif yük silin kullanarak kurutun.
- Dondurulmuş kadar soğuk heptan içine prostat dokusunu yerleştirin.
- Donmuş kadar hemen kuru buz üzerinde montaj medya ve yeri içeren bir cryomold dondurulmuş prostat dokusunu yerleştirin.
- Mağaza -20 ° C 'de cryomolds.
- Enine bir Kriyostat kullanarak 7 mikron kalınlığında cryosections halinde prostat dokusunu kesti.
- Pozitif yüklü mikroskop lamı üzerine, doku uzunluğu kapsayan 12 olmayan seri cryosections - 8 koyun.
- Mağaza fazla işlem kadar -20 ° C'de slaytlar tamamladı.
- Acidified Toluidin Blue Hazırlama
- % 1 'lik bir stok çözeltisi hazırlamak üzere çözelti içinde kadar, 100 ml% 70 etanol ve vorteks Toluidin Mavi O 1 g ekleyin. stok çözeltisi en fazla üç hafta boyunca oda sıcaklığında saklanabilir.
- Bir karıştırıcı plaka üzerine yerleştirilmiş bir çanak içinde 100 ml su, 1 g NaCI ekleyin.
- 1.0 elde edilir - 0.5 arasında bir pH aralığı kadar 12 M HCI kullanılarak NaCl çözeltisi pH ayarlayın.
- Toluidin Mavi stok çözeltisi 8 ml ve% 1 NaCl çözeltisi 32 ml birleştirerek% 0.25 Toluidin Mavi çalışma çözeltisi hazırlayın. Toluidin Mavi stok solüsyonu toplam birleşme sağlamak ve bir girdap kullanarak karıştırmak için aşağı yukarı pipet ve. çalışma çözeltisi taze yapılmış ve kullandıktan sonra atılmalıdır.
- Prostat cryosections Boyama
- Dondurucu işlenecek slaytları çıkarın ve yaklaşık 30 m oda sıcaklığına gelmesini sağlayınıziçinde.
- Bireysel slayt monte doku bölümleri tamamen sular altında olacak emin olmak için 1x PBS yeterli bir hacmi içeren 50 ml'lik konik tüp içine yaklaşık 1 saniye boyunca slaytlar batırarak doku bölümleri yıkayın. Slaytlar bir kağıt havlu üzerinde kuru hava için izin ver.
- Yeterince% 0.25 çalışan Toluidine Mavi çözeltisi içeren bir cam boyama kavanoza yerleştirin slaytlar slayt monte doku bölümleri tamamen sular altında olacak emin ve 10 inkübe - süre 15 rpm'de ayarlanmış bir platformdur rocker 15 dakika.
- Yaklaşık 1 saniye 1x PBS Dip slaytlar aşırı Toluidine Mavi yıkayın.
- Slaytlar, drenajı mümkün kılması için kendi tarafta olduğu şekilde bir slayt kutusu ya da rafa slaytlar yerleştirin.
- 2 saat oda sıcaklığında veya O / N, en az 37 ° C sıcaklıkta bir fırın içinde slaytlar kurutun.
- Alkol maruziyet arasındaki slaytlar tamamen kuru izin hızla alkol kullanarak slaytlar dehydrate. Bir kağıt havlu a üzerinde drenaj kuru slaytlarnd hafif görev ile silinerek arkaları ve kenarları silin.
- Yaklaşık 1 saniye% 95 EtOH slaytlar daldırın ve tamamen kuru izin verin. Doku mor daha mavi kuruyana kadar 10 kez - Bu işlemi 1 tekrarlayın.
- Yaklaşık 1 saniye% 100 EtOH slaytlar daldırın ve tamamen kuru bekleyin. Doku ve orta mavi karanlık, ama mor olmayana kadar 10 kez - Bu işlemi 1 tekrarlayın.
- 3 dakika boyunca% 100 ksilen slaytlar inkübe edilerek leke sabitleyin. Kurumasını bekleyin.
- Gliserol, PBS, ya da ksilen bazlı kalıcı montaj medya ile slaytlar lamel. Oda sıcaklığında aşırı medya ve mağaza boşaltın.
- Ükler Mast Hücreleri
- 20X büyütme ışık mikroskobu kullanılarak (Şekil 2) toluidin blue-lekeli doku bölümleri gözünüzde canlandırın.
- Görüntülenmiştir alanı içinde bulunan mast hücrelerinin toplam sayısını ve olmayan degranüle ve degranüle mast hücreleri arasında ayrım. 40X Magnificatiyon bazı mast hücrelerindeki granülasyon durumunu onaylamak için gerekli olabilir.
Not: Non-degranüle mast hücreleri ya da hiç soluk nükleer anahat ve / veya hücre çevresinde hiçbir granül ekstrüzyon ile yoğun metakromazi gösterirler. Degranüle mast hücreleri daha az yoğun metakromazi sergileyen ve sitoplazma içinde ve hücre sınırın dışında çekirdek ve / veya serbest granül bariz bir açık anahat var. - Mevcut doku kesitinin bütünüyle olmayan degranüle ve granüle mast hücrelerinin toplam sayısını değerlendirmek için devam edin. Uzunluğu, her dokuyu kapsayan, en az 7 ek ayrı bölümlerde bu işlemi tekrarlayın.
- Aşağıdaki denkleme göre her bir doku / fare için toplam mast hücreleri için granüle (DG) yüzdesini hesaplayın: (DG mast hücreleri / Toplam mast hücreleri) x 100.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
NMS geçiren fareler CP / KPAS göstergesidir davranışsal kanıt gösterdi. Von Frey monofiller, 8 haftalık fareler NMS kademeli bir dizi ile test edildiği zaman (n = 4) saf karşılıkları ile karşılaştırıldığında perigenital mekanik alodinya gösterilmiştir (n = 5, Şekil 2). Monofilament yönelik monofilin uygulama ya da yalama ve ısırma davranışları yanıt olarak canlı bir pislik ya da atlama olarak kaydedilir, pozitif bir davranış yanıtı ortaya çıkardı, mekanik geri çekme eşiği, bu önemli bir azalmaya (Student t-testi, p <0.01) olarak kanıtlanır .
NMS maruz kalan fareler, aynı zamanda CP / KAPS ilişkin histolojik bulgu gösterdi. Prostat dokusu kriostat kesitleri, mast hücreleri (Şekil 3A-D) içinde yer alan triptaz granüller gözlemlemek asitleştirilmiş o-Toluidin Mavisi ile boyanmıştır. aktivasyonu, örneğin, yaygın metachroma kanıt göstermiştir mast hücrelerinin yüzdesisia, hücre sınırına (Şekil 3D) granülleri mevcut dış anlamlı naif karşılaştırıldığında, 8 haftalık NMS farelerin prostat dokusu artmıştır (p <0.0001, Student t-testi, Şekil 3E). infiltre mast hücrelerinin toplam sayısı ne olursa olsun, granülasyon durumu, Naif (99.5 ± 15.2 hücre / bölüm) ve NMS farelerde (108.2 ± 22.5 hücre / bölüm) arasında anlamlı bir farklılık yoktu.
Şekil 1. Usul zaman çizgisi. Şematik açıklanan metodoloji gerçekleştirmek için önerilen zaman çizgisini özetliyor. P21 ve P22 fareler üzerinde sütten kadar Yenidoğan anne ayırma (NMS), 1 doğum sonrası gün (P) günlük yapılır. Onlar perigenital mekanik sens için test edildiğinde fareler 8 haftaya kadar normal bir hayvancılığın dışında bozulmadan kalıriTivity. Aynı fareler mast hücre boyama değerlendirilecek için gidiyoruz, bir hafta gidermek için herhangi bir kalıntı gerilme etkileri izin vermek için aşağıdaki davranışsal test geçmesini izin verilmelidir.
Şekil 2. perigenital mekanik duyarlılık. Perigenital mekanik duyarlılık von Frey monofilaman uygulaması kullanılarak ölçülmüştür. Neonatal anne ayrımı (NMS) uygulanan erkek fareler mekanik alodinya göstergesi naif farelere kıyasla, geri çekme eşiğinde önemli bir azalma göstermiştir. Veriler ortalama ± SEM temsil eder, n = her grup için 4. * P <0.05, Student t-testi.
Mavi Şekil 3. Mast hücre aktivasyonu. Asitleştirildikten toluidine triptaz granülleri görselleştirmek ve prostat dokusunun kriyostat kesitleri aktif / granüle mast hücrelerinin yüzdesini hesaplamak için kullanılmıştır. Temsilci fotomikrografikler aktif (granüllerini boşaltmış) mast hücrelerini gösteren sağlam (non-degranüle) ve ok uçları gösteren oklarla naif (A) den toluidin mavi boyanan kesitler ve NMS (B) prostat gösterilmiştir. Daha yüksek saf (C) den büyütme görüntü ve NMS (D), mesane olmayan granüle (C) den histolojik farkları göstermek için gösterilen ve (D), mast hücreleri granüllerini boşaltmış edilir. Naif farelerin (E) göre granüle mast hücreleri anlamlı ölçüde daha yüksek bir yüzdesi NMS farelerden prostat bölümler tespit edilmiştir. Veriler ortalama ± SEM temsil eder, n = her grup için 4. **** P <0.0001, Student t-testi.= "_ Blank"> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, yetişkin erkek farelerde CP / KAPS gösterge semptomolojisini indükleme NMS şeklinde neonatal stres kullanmak için bir yöntem sağlar. Yetişkinler olarak NMS fareler önemli düzeyde perigenital mekanik alodinya, hem de prostat dokusu mast hücre degranülasyonunu kanıt gösterir. NMS kullanımı olarak, genellikle kronik pelvik ağrı 12-14 olan hastalar tarafından bildirilen erken yaşam stresi, çoğaltır CP / KPAS bir klinik öncesi bir model geliştirilmesi yanı sıra non-invaziv indüksiyon birleşmeyle için yeni bir yaklaşım olduğunu daha yaygın kimyasal olarak kullanılan ve prostat 34,36-39 iltihabı immünolojik kaynaklı karşı. Tarafından sergilenen eşlik eden somatik, ruh hali ve iç organ bozukluklarına içindeki (veriler gösterilmemiştir 16) Ayrıca, farelerde NMS hipersensitivite değiştirilmiş anksiyete gibi ve anhedonik davranışlar gibi eşlik eden semptomları geliştirmez, artan miktürisyon oranları üretir ve arka pençe gösterilmiştir CP / CPPS PatieNTS 4-6.
Farelerde CP / KPAS ikna etmek NMS kullanmanın ana avantajı fizyolojik değişiklikleri başlatmak için psikolojik müdahale kullanmasıdır. CP / KPAS'li hastalar çoğunlukla prostat 1-3 önceki enfeksiyon veya direkt yaralanma içermeyen varyant etiyolojiye sahiptir. Buna rağmen, CP / KAPS geçme modelleri perigenital bölge ve / veya mast hücre aktivasyonunun aşırı duyarlılığa yol açan prostatın doğrudan ya da dolaylı olarak inflamasyon dahil etmişlerdir. Genel, raporda CP / CPPS ve kronik pelvik ağrı hastalarının önemli bir bölümü büyük ölçüde ürogenital ağrı sendromları kemirgen modellerinde unstudied gitti erken yaşam sıkıntı, deneyimli. Laboratuarımızda Önceki çalışma NMS vajinal aşırı duyarlılık ve 16 eksen HPA'nın düzgün işleyişinin bozulmasına neden olur ilişkili olduğunu göstermiştir. T üretmek için erken yaşam stresi ile tahrik edilmektedir mekanizmalarının araştırılması bu modeli kullanarak Gelecekteki çalışmalarO yetişkinlikte fenotipi değiştirilir, hem de klinik öncesi veya klinik ortamda uygulanabilir olası farmakolojik veya yaşam tarzına müdahaleler keşfetmek için.
Bu protokolde optimal ve tekrarlanabilir sonuçlar elde kullanılan çevreye ve ekipmana bağlı optimize edilmesi gerekebilir birkaç kritik adımlar gözlemleyerek bağlıdır. Bu dramatik HPA ekseninin işleyişini etkileyen NMS dikkate alındığında, hem yenidoğan ve erişkin dönemlerinde dış uyaranlara ve çevresel stres kontrol etmek için önemlidir. Yaştaki olmayan ele naif fareler doğdu ve HPA ekseninin gelişimini etkileyebilecek ortamda mevcut dış streslerinin kontrol etmek için NMS farelerin her grupta ile uyumlu olarak muhafaza edilmelidir. Bu üreme başlatılması veya hayvan tesis haline hamile kadın sipariş öncesinde amaçlanan deney gerçekleştirmek için gerekli farelerin sayısını belirlemek için önemlidir. Gerçekleştirirken NMS, greatest endişe, bu nedenle NMS protokol boyunca evde kafes kokusunu muhafaza etmek şarttır, baraj ile yavruların reddidir. Gündüz ritimleri etkilerini en aza indirmek için, NMS için önerilen ayırma zamanı (11:00-2:00) ışık döngüsünün ortasında sırasında. Perigenital duyarlılık ölçümleri, tamamen olgun yetişkin erkek farelerde yaşı yaklaşık 8 hafta elde edilen ve her bir grup için günün aynı zamanda alınmalıdır, tercihen erken ışık döngüsü içinde gündüz ritimleri de yalak denk. (- 20.000 Hz 20) bu işlem sırasında sigara uyarılmış hareketlerin oluşumunu azaltmak için, değerlendirmeler oynayan beyaz gürültü ile sıcaklık kontrollü, ses geçirmez bir odada yapılabilir. Aynı araştırmacı pozitif ve negatif tepkiler ayinlerle tutarlılığı korumak için çalışma boyunca tüm yoksunluk eşikleri değerlendirmelidir. % 50 mekanik eşiği, tek bir monofilament cou çekilme frekansını ölçme alternatif olarakLD değerlendirilebilir veya bir elektronik von Frey cihazı 46 de kullanılabilir. Mast hücre görselleştirme için, analiz edilecek olan tüm slaytlar boyama yoğunluğu deneyler arasında değişebilir olarak, mast hücrelerinin eşit lekeleme sağlamak için birlikte işleme tabi tutulmalıdır. 1,0 altındaki pH koyu mor mast hücreleri ve açık mavi arka arasında düzgün bir kontrast için gereklidir. Çok alkol birçok durulama mast hücrelerinden leke yıkayın ve olumsuz kontrast etkiler. Son olarak, doku üzerine bir ızgara atma bütün doku bölüm boyunca hücre sayımı yararlı olabilir.
Çeşitli hususlar önceden CP / CPPS veya ilgili merkezi ağrı bozukluklarının uyarılması için NMS kullanımına yapılmalıdır. P14 - Birincisi, erken yaşam stresi dahil olan yayınların büyük çoğunluğu P1 kesilmiş ayırma dönemi kullanılarak, NMS sıçan modellerinde yapılmıştır. Birçok grup bu paradigma r bir IBS gibi semptomolojisini üretir olduğunu göstermiştirATS ve fareler 15; Bununla birlikte, daha önceki çalışmamızda P1 - C57BL / 6 farelerinde P14 ayrılması süresi, vajinal hassasiyet 16 önemli bir artış üretmek yoktu, ne de kolorektal hipersensitivite oluşturmak (veriler gösterilmemiştir). Bu nedenle, NMS türleri ve uzunluk semptomolojisine şiddetine ve etkilenen spesifik organ (lar) da dahil olmak üzere, yetişkinlikte belirli sonucunu belirleyebilir. İkinci olarak, NMS kaynaklanan davranışsal ve moleküler değişiklikler etkisi merkezi olarak aracılık ve anksiyete değişiklikler ve / veya depresyon gibi davranışlar dahil eşlik eden sonuçlar, olabilir düşündüren, HPA ekseninin 15-18 bozulması nedeniyle büyük ölçüde vardır diğer pelvik organlarda ya da daha uzak yerlerde artmış duyarlılık. Bu eşlik eden fenotip yaygın klinik görülen şeyin göstergesidir ve bir bütün olarak 5,28-31,42 CP / CPPS hastalarının daha temsilcisi olabilir. Üçüncü olarak, HPA eksen dysregul bir sonucu olarak meydana gelen bu değişiklikler göreasyon, stres etkisi NMS prosedürü ve daha sonra davranış testleri esnasında ve in vitro analizlerde büyük endişe olmalıdır. HPA aksının Çıktı davranışsal ya da in vitro analizde test zamanına bağlı sonucunu etkileyebilecek daha sakin ışık döngüsü sırasında daha aktif karanlık döngüsü sırasında daha çıktı ve az çıkışı, gündüz ise / 47 kurban. Aynı şekilde, perigenital mekanik duyarlılık testi geçiren dahil stres, maruz kalma, geçici 18. eksen HPA'nın işleyişini etkileyebilir ve potansiyel ilişkili beyin bölgelerinde ve alt periferik dokularda içinde gen ifadesini değiştirir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pregnant C57BL/6 female mice | Charles River | 027 | Timed or untimed pregnant females should be monitored daily for in-house birth. |
| 2 L glass beaker(s) | Sigma-Aldrich | CLS10002L | Each NMS litter will be held in the same beaker throughout the 21 day separation period. |
| VWR Forced Air Incubator, Basic | VWR International | 414005-124 | The incubator should be held at 33°C and 50% humidity. |
| Touch Test Sensory Evaluator, Kit of 20 (Semmes-Weinstein Von Frey Aesthesiometer for touch assessment) | Stoelting | 58011 | The following monofilaments should be used for perigenital sensitivity assessment: 1.65 g, 2.36 g, 2.83 g, 3.22 g, 3.61 g, 4.08 g, 4.31 g, and 4.74 g. |
| Animal Enclosure (12 mice 6 rats) | IITC | 435 | Be sure to place a heavy object on top of the individual, acrylic animal enclosures to prevent mice from escaping. |
| Mesh Stand for mice and rats (12 mice 6 rats) | IITC | 410 | Place stand on a stable table top for comfortable access. |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5493 | Dilute the 10x PBS stock to 1x PBS. |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | A 4% paraformaldehyde solution is needed to intracardially perfuse mice and postfix tissue in preparation for mast cell staining. |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | Cryoprotect fixed tissue in 30% sucrose solution at 4°C overnight. |
| Heptane | Sigma-Aldrich | 246654 | Chill heptane on dry ice to freeze tissue. |
| Standard Cryomold | VWR International | 4557 | To assist in freezing prostate tissue prior to cryostat sectioning |
| Tissue-Tek OCT Compound | Sakura | 4583 | 12 x 125 ml |
| VWR Superfrost Plus Micro Slide | VWR International | 48311-703 | 75 x 25 x 1 mm |
| Toluidine Blue O | Sigma-Aldrich | 198161 | Certified by the Biological Stain Commission. Suitable for use as a metachromatic stain for mast cells. |
| Ethanol, Absolute (200 Proof) | Fisher Scientific | BP2818-4 | Molecular Biology Grade, Fisher Bioreagents; 95% and 100% solutions will be needed to dehydrate stained cryosections before mast cell visualization. |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | Acidified NaCl solution should be made fresh before staining cryosections. |
| GeneMate Sterile 50 ml Centrifuge Tubes | BioExpress | C-3394 | Disposable tubes used to mix toulidine blue elements or dip slides into 1xPBS. |
| Coplin staining dish for 10 slides, with ground glass cover | Fisher Scientific | 08-815 | Hold up to 10 standard 3 x 1 in. (75 x 25mm) slides back-to-back. Use separate dishes for Toluidine Blue working solution, 95% EtOH, 100% EtOH, and xylene. |
| Xylenes (Histological) | Fisher Scientific | X3P | Once dehydrated, tissue is cleared with xylene. |
| Microscope Slide Boxes, 100-Place | VWR International | 82003 | Boxes can be used for storage and transportation of slides. |
| Fisherbrand Microscope Slide Box | Fisher Scientific | 22-363-400 | These slide boxes are typically small enough to fit inside a cryostate. |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Glycerol is a traditional mounting medium. |
| Mounting Medium, Richard-Allan Scientific | VWR International | 4111 | Mounting medium firmly bonds the coverslip to the slide. |
| Micro Cover Glasses, Rectangular, No. 1 | VWR International | 48393-106 | A coverslip is placed over the dehydrated and cleared tissue to protect the sample. |
| Light Microscope | Nikon | The Advanced Automated Research Microscope Eclipse 90i, used by our lab, has been discontinued and replaced Eclipse Ni-E. |
References
- Mehik, A., Leskinen, M. J., Hellstrom, P. Mechanisms of pain in chronic pelvic pain syndrome: influence of prostatic inflammation. World journal of urology. 21, 90-94 (2003).
- Schaeffer, A. J. Epidemiology and evaluation of chronic pelvic pain syndrome in men. International journal of antimicrobial agents. 31, Suppl 1. S108-S111 (2008).
- Wesselmann, U. Neurogenic inflammation and chronic pelvic pain. World journal of urology. 19, 180-185 (2001).
- Arnold, L. D., Bachmann, G. A., Rosen, R., Kelly, S., Rhoads, G. G. Vulvodynia: characteristics and associations with comorbidities and quality of life. Obstetrics and gynecology. 107, 617-624 (2006).
- Bullones Rodriguez, M. A., et al. Evidence for overlap between urological and nonurological unexplained clinical conditions. The Journal of urology. 189, S66-S74 (2013).
- Warren, J. W., van de Merwe, J. P., Nickel, J. C. Interstitial cystitis/bladder pain syndrome and nonbladder syndromes: facts and hypotheses. Urology. 78, 727-732 (2011).
- Heim, C., Newport, D. J., Bonsall, R., Miller, A. H., Nemeroff, C. B. Altered pituitary-adrenal axis responses to provocative challenge tests in adult survivors of childhood abuse. The American journal of psychiatry. 158, 575-581 (2001).
- Mayson, B. E., Teichman, J. M. The relationship between sexual abuse and interstitial cystitis/painful bladder syndrome. Current urology reports. 10, 441-447 (2009).
- Rao, U., Hammen, C., Ortiz, L. R., Chen, L. A., Poland, R. E. Effects of early and recent adverse experiences on adrenal response to psychosocial stress in depressed adolescents. Biological psychiatry. 64, 521-526 (2008).
- Videlock, E. J., et al. Childhood trauma is associated with hypothalamic-pituitary-adrenal axis responsiveness in irritable bowel syndrome. Gastroenterology. 137, 1954-1962 (2009).
- Tyrka, A. R., et al. Childhood parental loss and adult hypothalamic-pituitary-adrenal function. Biological psychiatry. 63, 1147-1154 (2008).
- Chitkara, D. K., van Tilburg, M. A., Blois-Martin, N., Whitehead, W. E. Early life risk factors that contribute to irritable bowel syndrome in adults: a systematic review. The American journal of gastroenterology. 103, 765-774 (2008).
- Jones, G. T., Power, C., Macfarlane, G. J. Adverse events in childhood and chronic widespread pain in adult life. Results from the 1958 British Birth Cohort. 143, 92-96 (2009).
- Peters, K. M., Killinger, K. A., Ibrahim, I. A. Childhood symptoms and events in women with interstitial cystitis/painful bladder syndrome. Urology. 73, 258-262 (2009).
- Mahony, S. M., Hyland, N. P., Dinan, T. G., Cryan, J. F. Maternal separation as a model of brain-gut axis dysfunction. Psychopharmacology. 214, 71-88 (2011).
- Pierce, A. N., Ryals, J. M., Wang, R., Christianson, J. A. Vaginal hypersensitivity and hypothalamic-pituitary-adrenal axis dysfunction as a result of neonatal maternal separation in female mice. Neuroscience. 263, 216-230 (2014).
- Ladd, C. O., Huot, R. L., Thrivikraman, K. V., Nemeroff, C. B., Plotsky, P. M. Long-term adaptations in glucocorticoid receptor and mineralocorticoid receptor mRNA and negative feedback on the hypothalamo-pituitary-adrenal axis following neonatal maternal separation. Biological psychiatry. 55, 367-375 (2004).
- Malley, D., Dinan, T. G., Cryan, J. F. Neonatal maternal separation in the rat impacts on the stress responsivity of central corticotropin-releasing factor receptors in adulthood. Psychopharmacology. 214, 221-229 (2011).
- Chung, E. K., Zhang, X. J., Xu, H. X., Sung, J. J., Bian, Z. X. Visceral hyperalgesia induced by neonatal maternal separation is associated with nerve growth factor-mediated central neuronal plasticity in rat spinal cord. Neuroscience. 149, 685-695 (2007).
- Coutinho, S. V., et al. Neonatal maternal separation alters stress-induced responses to viscerosomatic nociceptive stimuli in rat. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 282, G307-G316 (2002).
- Moloney, R. D., et al. Early-life stress induces visceral hypersensitivity in mice. Neuroscience letters. 512, 99-102 (2012).
- Wijngaard, R. M., et al. Peripheral alpha-helical CRF (9-41) does not reverse stress-induced mast cell dependent visceral hypersensitivity in maternally separated rats. Neurogastroenterol Motil. 24, 274-282 (2012).
- DeBerry, J., Ness, T. J., Robbins, M. T., Randich, A. Inflammation-induced enhancement of the visceromotor reflex to urinary bladder distention: modulation by endogenous opioids and the effects of early-in-life experience with bladder inflammation. J Pain. 8, 914-923 (2007).
- Randich, A., Uzzell, T., DeBerry, J. J., Ness, T. J. Neonatal urinary bladder inflammation produces adult bladder hypersensitivity. J Pain. 7, 469-479 (2006).
- Shaffer, A. D., Ball, C. L., Robbins, M. T., Ness, T. J., Randich, A. Effects of acute adult and early-in-life bladder inflammation on bladder neuropeptides in adult female rats. BMC urology. 11, 18 (2011).
- Pontari, M. A., Joyce, G. F., Wise, M., McNaughton-Collins, M. Urologic Diseases in America, P. Prostatitis. The Journal of urology. 177, 2050-2057 (2007).
- Calhoun, E. A., et al. The economic impact of chronic prostatitis. Archives of internal medicine. 164, 1231-1236 (2004).
- Nickel, J. C., et al. Category III chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome: insights from the National Institutes of Health Chronic Prostatitis Collaborative Research Network studies. Current urology reports. 9, 320-327 (2008).
- Mehik, A., Hellstrom, P., Sarpola, A., Lukkarinen, O., Jarvelin, M. R. Fears, sexual disturbances and personality features in men with prostatitis: a population-based cross-sectional study in Finland. BJU international. 88, 35-38 (2001).
- Clemens, J. Q., Brown, S. O., Calhoun, E. A. Mental health diagnoses in patients with interstitial cystitis/painful bladder syndrome and chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome: a case/control study. The Journal of urology. 180, 1378-1382 (2008).
- Rodriguez, M. A., et al. Evidence for overlap between urological and nonurological unexplained clinical conditions. The Journal of urology. 182, 2123-2131 (2009).
- Murphy, S. F., Schaeffer, A. J., Thumbikat, P. Immune mediators of chronic pelvic pain syndrome. Nature reviews. Urology. 11, 259-269 (2014).
- Parsons, C. L. The role of a leaky epithelium and potassium in the generation of bladder symptoms in interstitial cystitis/overactive bladder, urethral syndrome, prostatitis and gynaecological chronic pelvic pain. BJU international. 107, 370-375 (2011).
- Done, J. D., Rudick, C. N., Quick, M. L., Schaeffer, A. J., Thumbikat, P. Role of mast cells in male chronic pelvic pain. The Journal of urology. 187, 1473-1482 (2012).
- Roman, K., Done, J. D., Schaeffer, A. J., Murphy, S. F., Thumbikat, P. Tryptase-PAR2 axis in experimental autoimmune prostatitis, a model for chronic pelvic pain syndrome. Pain. 155, 1328-1338 (2014).
- Donadio, A. C., Depiante-Depaoli, M. Inflammatory cells and MHC class II antigens expression in prostate during time-course experimental autoimmune prostatitis development. Clinical immunology and immunopathology. 85, 158-165 (1997).
- Keetch, D. W., Humphrey, P., Ratliff, T. L. Development of a mouse model for nonbacterial prostatitis. The Journal of urology. 152, 247-250 (1994).
- Rivero, V. E., Cailleau, C., Depiante-Depaoli, M., Riera, C. M., Carnaud, C. Non-obese diabetic (NOD) mice are genetically susceptible to experimental autoimmune prostatitis (EAP). Journal of autoimmunity. 11, 603-610 (1998).
- Rudick, C. N., Schaeffer, A. J., Thumbikat, P. Experimental autoimmune prostatitis induces chronic pelvic pain. American journal of physiology. Regulatory, integrative and comparative physiology. 294, R1268-R1275 (2008).
- Rivero, V. E., Iribarren, P., Riera, C. M. Mast cells in accessory glands of experimentally induced prostatitis in male Wistar rats. Clinical immunology and immunopathology. 74, 236-242 (1995).
- Hu, J. C., Link, C. L., McNaughton-Collins, M., Barry, M. J., McKinlay, J. B. The association of abuse and symptoms suggestive of chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome: results from the Boston Area Community Health survey. Journal of general internal. 22, 1532-1537 (2007).
- Riegel, B., et al. Assessing psychological factors, social aspects and psychiatric co-morbidity associated with Chronic Prostatitis/Chronic Pelvic Pain Syndrome (CP/CPPS) in men - A systematic review. Journal of psychosomatic research. 77, 333-350 (2014).
- Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. Journal of neuroscience. 53, 55-63 (1994).
- Watkins, S. K., Zhu, Z., Watkins, K. E., Hurwitz, A. A. Isolation of immune cells from primary tumors. Journal of visualized experiments : JoVE. , e3791 (2012).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
- Martinov, T., Mack, M., Sykes, A., Chatterjea, D. Measuring changes in tactile sensitivity in the hind paw of mice using an electronic von Frey apparatus. Journal of visualized experiments : JoVE. , e51212 (2013).
- Lutgendorf, S. K., et al. Diurnal cortisol variations and symptoms in patients with interstitial cystitis. The Journal of urology. 167, 1338-1343 (2002).
