Summary
इस वीडियो के लक्ष्य के लिए एक नैदानिक सेटिंग में दुर्लभ म्यूटेशन का पता लगाने के लिए formalin तय आयल एम्बेडेड (FFPE) संदर्भ मानक सेल लाइनों और डिजिटल छोटी बूंद पीसीआर (ddPCR) विश्लेषण से स्वचालित डीएनए निष्कर्षण प्रदर्शन करने के लिए प्रदर्शन करने के लिए है। FFPE नमूनों में म्यूटेशन का पता लगाने के FFPE नमूनों में ddPCR के नैदानिक उपयोगिता को दर्शाता है।
Introduction
कुंजी नियामक जीन में आनुवंशिक परिवर्तन के संचय कैंसर 1 के लिए अग्रणी, सेल प्रसार, भेदभाव, और अस्तित्व की तरह सामान्य कोशिका प्रोग्रामिंग बदल। आरएएस-आरएएफ-एमएपी काइनेज मार्ग विकास संकेतों के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं मध्यस्थता करता है। ऑन्कोजेनिक BRAF म्यूटेशन 2 अति बनने के लिए oncoprotein BRAF कारण हो सकता है जो BRAF जीन में म्यूटेशन ड्राइवर, से परिणाम कर सकते हैं। BRAF जीन में उत्परिवर्तन भी बारी में, वृद्धि कारक की मध्यस्थता विनियमन 4-6 की स्वतंत्र रूप से अत्यधिक सेल के विकास और प्रसार के लिए होता है, जो खल्क और ERK 3, के माध्यम से अति बहाव के संकेत में परिणाम।
कई उपकरण ऐसे ddPCR द्वारा formalin तय, आयल एम्बेडेड (FFPE) संदर्भ मानक सेल लाइनों में मात्रात्मक वास्तविक समय BRAF V600E म्यूटेशन के रूप में, डीएनए उत्परिवर्तन की रूपरेखा के लिए उपलब्ध हैं। ddPCR पूर्ण मात्रा का ठहराव के लिए एक पीसीआर आधारित विधि हैपारंपरिक मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर (qPCR) 7.8 की तुलना में अधिक सटीकता की पेशकश की। ddPCR भी अधिक सूचनात्मक कैंसर अनुसंधान और निदान 9 सक्षम करने, डीएनए टेम्पलेट्स में दुर्लभ म्यूटेशन का पता लगाने के लिए शक्ति और सटीकता को हल करने में अधिक प्रदान करता है। कम टेम्पलेट प्रतिलिपि संख्या 10-12 का अध्ययन करते समय पारंपरिक qPCR खत्म ddPCR का अतिरिक्त लाभ अपने बढ़ाया संवेदनशीलता और सटीकता शामिल हैं। इस के साथ साथ, स्वचालित रूप से ddPCR द्वारा BRAF V600E म्यूटेशन की उपस्थिति या अनुपस्थिति का निर्धारण करने के द्वारा पीछा FFPE संदर्भ मानक सेल लाइनों, से डीएनए निकालने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदर्शन किया है। डेटा विश्लेषण और परिणामों की एक चित्रमय प्रतिनिधित्व के लिए सॉफ्टवेयर का उपयोग भी वर्णित हैं। पूरी प्रक्रिया अपेक्षाकृत आसान है और पूरी तरह से प्रोफाइल किए गए नमूनों की संख्या और उपलब्ध पारंपरिक पीसीआर और ddPCR मशीनों की संख्या पर निर्भर करता है।
निम्नलिखित प्रोटोकॉल BR के लिए मानक प्रक्रियाओं का वर्णन वायुसेना V600E पॉजिटिव FFPE संदर्भ मानक सेल लाइनों (HD598, HD593, HD617, HD273 और wildtype (डब्ल्यूटी)) ऊतक तैयार करने की प्रणाली (टीपीएस) प्रोटोकॉल का उपयोग एक पूरी तरह से स्वचालित उपकरण में किया जाता है। बाद में, पृथक डीएनए नमूने ddPCR प्रणाली का उपयोग कर BRAF V600E म्यूटेशन की उपस्थिति के लिए विश्लेषण कर रहे हैं। सभी नमूनों profiled गया है के बाद लक्षित उत्परिवर्तन विश्लेषण किया जाता है और डेटा डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर में लोड कर दिया गया है। नमूनों की संख्या पर निर्भर करता है / समूहों का अध्ययन किया, डेटा विश्लेषण एक से कई घंटे के लिए आवश्यकता हो सकती है। कार्यप्रणाली की प्रयोगात्मक घटक निपटने में सटीकता की आवश्यकता डीएनए औरrological pipettes और Pipettors, pipetting के संदर्भ के बारे में के बारे में अधिक समझा एक जौव विज्ञान शिक्षा वीडियो "> 96 प्लेटों में pipetting, डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग किया जाता है।
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Protocol
FFPE निर्देश मानक सेल लाइनों से 1. डीएनए निष्कर्षण
नोट: इस प्रक्रिया के लिए, डीएनए निष्कर्षण नीचे प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप FFPE ऊतक डीएनए अलगाव किट का उपयोग कर FFPE संदर्भ मानक सेल लाइनों (HD598, HD593, HD617, HD273 और wildtype (डब्ल्यूटी)) से प्रदर्शन किया गया था। स्वचालित डीएनए निष्कर्षण कुल डीएनए अलगाव के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए हासिल की थी।
- एक microtome और मूल FFPE ब्लॉक का उपयोग करना, मैन्युअल स्थापित प्रक्रियाओं के अनुसार, पहले डीएनए निष्कर्षण और विश्लेषण के लिए नए सिरे से वर्गों तैयार करते हैं। ऊतक अनुभाग (एस) के लिए नमूना इनपुट 10 माइक्रोन की एक संयुक्त कुल मोटाई से अधिक नहीं है विश्लेषण किया कि यह सुनिश्चित करने के लिए और सतह क्षेत्र में एक भी वर्ग के लिए 600 मिमी 2 से अधिक नहीं है कि।
1.2 टीपीएस प्रोटोकॉल
नोट: तालिका 1 में दिखाया गया है की मात्रा 48 नमूने प्रक्रिया के लिए आवश्यक न्यूनतम के अनुरूप है, और प्रक्रियादिखाया टीपीएस के दिशा-निर्देशों के अनुसार है। प्रयोग शुरू करने से पहले स्वचालित कार्यक्रम के दौरान नमूने के नुकसान से बचने के लिए, 600 XG पर centrifugation द्वारा ई-ट्यूब में FFPE नमूने बसने।
- स्वचालित डीएनए अलगाव साधन और कंप्यूटर चालू करें। भागो नियंत्रण सॉफ्टवेयर खोलें और टीपीएस डेक लोडिंग क्षेत्र में एक ऑटो लोड ट्रे डालें।
- चित्रा 1 में दिखाया गया है उनके इसी नली में अभिकर्मकों बग़ैर।
- नमूना वाहक रैक में 4 नमूने (BRAF गुम्मट, BRAF V600E 50%, 5% और 1%) रखें।
- कॉलम 2 और 3 में नली में टिप बक्से जगह और चलाने को रद्द कर देगा, जो टिप प्रति एक से अधिक फिल्टर की उपस्थिति के लिए सुझावों की जाँच करें।
- उन्हें 3-5 बार inverting द्वारा lysis बफर और धोने बफर का उचित मिश्रण सुनिश्चित करें और स्तंभ 4 (चित्रा 1) में संबंधित नली में उन्हें लोड।
- कुछ ही समय में या हल्के Vort के लिए inverting के बादexing, (चित्रा 1, 1 टेबल) जहा पर एक स्लॉट खाली छोड़ रहा है, कॉलम 5 में छोटी नली में क्षालन बफर, चुंबकीय मोती, और FFPE बफर लोड।
- प्लेट वाहक (चित्रा 1) पर एक 2 मिलीलीटर गहरी अच्छी तरह से थाली (DWP) कर लेता है।
- एक रन शुरू करने से पहले निम्न अंतिम चरण करें:
- सभी ट्यूबों और अभिकर्मक नली खुलना। कि पर्याप्त क्षमता तरल अपशिष्ट बोतल में उपलब्ध है की पुष्टि करें। ठोस अपशिष्ट बोतल खाली और एक biohazard बैग के साथ लाइन में खड़ा है कि पुष्टि करें। टिप बेदखल प्लेट अपशिष्ट विधानसभा में केंद्रित है कि पुष्टि करें।
- सामने कवर बंद करें।
- सॉफ्टवेयर शुरू करो। NA_Prep_Main_MLSTARlet.med फ़ाइल खोलें।
- क्लिक करें "शुरू करो।" साधन स्थिति चलाने के लिए बेकार से स्विच जाएगा।
- इस दौड़ के लिए नमूनों की संख्या दर्ज करें। इस दौड़ (डीएनए = 0) के लिए वांछित विधि चुनें। पहली उच्च वॉल्यूम की स्थिति दर्जUme टिप, सभी ट्रे पूरा कर रहे हैं, तो "1" का चयन। सभी ट्रे पूरा कर रहे हैं, तो "1" का चयन, पहली मानक मात्रा टिप की स्थिति दर्ज करें।
नोट: साधन तो उपयोगकर्ता के हस्तक्षेप के बिना स्वचालित कदम के माध्यम से चलेंगे। एक विस्तृत कार्यप्रवाह चित्रा 2 में दिखाया गया है। प्रयोग समाप्त हो जाने के बाद, अभिकर्मक अपशिष्ट और सुझावों अपशिष्ट विधानसभा में इंजेक्ट कर रहे हैं। - एक fluorometric विधि का उपयोग करके शुद्ध जीनोमिक डीएनए यों।
नोट: 3.3 एनजी / μl की एक न्यूनतम एकाग्रता होते हैं, जो डीएनए नमूने ddPCR विश्लेषण (खंड 2) के अधीन हैं।
2. डीएनए उत्परिवर्तन रूपरेखा: ddPCR प्रोटोकॉल
नोट: 1) छोटी बूंद पीढ़ी, 2) पारंपरिक पीसीआर प्रवर्धन, 3) छोटी बूंद पढ़ने और 4) डीएनए उत्परिवर्तन की रूपरेखा: डीएनए उत्परिवर्तन की रूपरेखा के लिए प्रोटोकॉल 3 प्रमुख कदम शामिल हैं।
2.1। छोटी बूंद पीढ़ी
नोट: ddPCR Supermix हैइस मिश्रण की छोटी बूंद पीढ़ी के लिए आवश्यक अभिकर्मकों शामिल हैं, के रूप में ddPCR के लिए सिफारिश की है।
- , संक्रमण से बचने के इस तरह के एक स्वच्छ पीसीआर हुड, स्वच्छ pipets, और कम प्रोटीन बाध्यकारी ट्यूब का उपयोग, दस्ताने पहनने के रूप में मानक सावधानियों, का पालन करें।
- मानव जीनोमिक डीएनए नमूने की न्यूनतम एकाग्रता 3.3 एनजी / μl है कि सुनिश्चित करें। नोट: शुद्ध डीएनए नमूना एकाग्रता की राशि% उत्परिवर्तन आवृत्ति का पता लगाने के विश्लेषण के आधार पर अलग अलग होंगे।
- 96 अच्छी तरह से पीसीआर प्लेटों में प्रतिक्रिया मिश्रण इकट्ठा। गला लें और आरटी प्रतिक्रिया घटकों संतुलित करना। (के रूप में प्रत्येक शुद्ध डीएनए नमूना (66ng / 2 μl) आसुत जल के साथ 20 μl के लिए कर के साथ 2X ddPCR Supermix (10 μl) और 20 प्राइमरों (आगे और रिवर्स, 900 एनएम) और जांच (250 एनएम) के संयोजन से पीसीआर प्रतिक्रियाओं को तैयार ) छोटी बूंद जनरेटर प्रोटोकॉल के अनुसार
- वितरण से पहले ट्यूब के नीचे सामग्री इकट्ठा करने के लिए एकरूपता और संक्षेप में सेंट्रीफ्यूज सुनिश्चित करने के लिए अच्छी तरह मिक्स भंवर। लोड 20 & #181, छोटी बूंद गठन के लिए कारतूस पर एल।
- निर्माता की सिफारिश प्रोटोकॉल के अनुसार छोटी बूंद जनरेटर के संचालन,
- धारक के ऊपरी बाएँ पक्ष पर तैनात कारतूस में निशान के साथ धारक में कारतूस डालें। नीचे कुओं में बीच में नमूने युक्त प्रतिक्रिया मिश्रण के 20 μl, और जनरेटर के तेल के 70 μl जोड़ें।
- कारतूस के शीर्ष भर गैसकेट संलग्न। गैसकेट धारक के दोनों सिरों पर सुरक्षित रूप से झुका दिया है कि यह सुनिश्चित करें; अन्यथा, छोटी बूंद पीढ़ी के लिए पर्याप्त दबाव हासिल नहीं किया जाएगा।
- साधन के शीर्ष पर हरे बटन दबाकर छोटी बूंद जनरेटर खोलें और कारतूस डालें। धारक बिजली (दाएं से बाएं) और धारक (मध्य दाएं) सूचक रोशनी हरा कर रहे हैं, दोनों के सही स्थिति में है।
- दरवाजा बंद करने के लिए फिर से साधन पर शीर्ष बटन दबाएं और छोटी बूंद पीढ़ी आरंभ करें। नोट: ख दबाने के बादutton, बूंदों बनाई गई हैं, जहां microfluidic चैनलों के माध्यम से तेल और नमूने ड्राइंग आउटलेट कुओं पर एक कई गुना पदों पर ही है,। वे जमा जहां बूंदों, अच्छी तरह से छोटी बूंद में प्रवाह। 10 सेकंड छोटी बूंद पीढ़ी का कार्य प्रगति पर है कि इंगित करने के बाद छोटी बूंद सूचक प्रकाश (सही पर) हरे रंग की चमक।
- छोटी बूंद पीढ़ी पूरा हो गया है, सभी 3 सूचक रोशनी ठोस हरे रंग के लिए बदल; बटन दबाने से दरवाजा खुला, और यूनिट से धारक को हटा दें। धारक से डिस्पोजेबल गैसकेट निकालें और यह त्यागें। नोट: कारतूस के शीर्ष कुओं बूंदों होते हैं, और मध्य और निचले कुओं अवशिष्ट तेल की एक छोटी राशि के साथ, लगभग खाली हैं।
2.2। पीसीआर के लिए तैयारी
- निर्माता के साधन प्रोटोकॉल में संकेत के रूप में प्रत्येक नमूना के लिए, एक सिफारिश की 96 अच्छी तरह से पीसीआर थाली का एक भी कुएं में शीर्ष अच्छी तरह से कारतूस से छोटी बूंद सामग्री के 40 μl बाहर pipet। नहींते: एक मल्टी चैनल पिपेट का उपयोग बूंदों इमल्शन स्थानांतरित करने के लिए आदर्श है। बूंदों की धीमी और कोमल आकांक्षा स्थानान्तरण के दौरान छोटी बूंद बाल काटना कम से कम करने की सिफारिश की है।
- तुरंत वाष्पीकरण से बचने के लिए बूंदों में परिवर्तित करने के बाद पन्नी के साथ पीसीआर थाली सील। पीसीआर थाली मुहर और छोटी बूंद रीडर में सुइयों के साथ संगत कर रहे हैं कि pierceable पन्नी प्लेट जवानों का प्रयोग करें। पीसीआर थाली मुहर अनुदेश मैनुअल में निर्देशों का पालन करें।
- 180 डिग्री सेल्सियस के लिए थाली मुहर तापमान और 5 सेकंड के लिए समय निर्धारित करें।
- ट्रे दरवाजा खोलने के लिए तीर स्पर्श करें। 96 अच्छी तरह से ऊपर की ओर का सामना करना पड़ के साथ ट्रे पर समर्थन ब्लॉक स्थिति। समर्थन ब्लॉक पर 96 अच्छी तरह से थाली प्लेस और सभी प्लेट कुओं समर्थन ब्लॉक के साथ गठबंधन कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करें।
- Pierceable पन्नी सील के एक पत्र के साथ 96 अच्छी तरह से थाली को कवर किया। 96 अच्छी तरह से थाली समर्थन ब्लॉक पर सुरक्षित और pierceable पन्नी सील के साथ कवर किया जाता है एक बार, मुहर बटन स्पर्श करें। ट्रे बंद हो जाएगाऔर गर्मी सील आरंभ हो जाएगा।
- गर्मी सील पूरा हो गया है, दरवाजा अपने आप खुल जाता; थर्मल साइकिल चालन के लिए गर्मी ब्लॉक से थाली निकालें और फिर गर्मी ब्लॉक हटा दें।
- थाली में सभी कुओं पन्नी में गड्ढों में अच्छी तरह से प्रत्येक पर आसानी से स्पष्ट हैं कि जाँच करके सील कर रहे हैं कि सुनिश्चित करें। सील करने के बाद, प्लेट थर्मल साइकिल चालन के लिए तैयार है।
- बूंदों को हटा रहे हैं एक बार, इसे खोलने के लिए कारतूस धारक पर लैच दबाएँ। खाली कारतूस निकालें और यह त्यागें।
- तालिका 2 में विस्तृत पैरामीटर का पालन करते हुए पारंपरिक पीसीआर प्रवर्धन प्रदर्शन करते हैं।
2.3 बूंद पढ़ने (निर्माता की सिफारिश प्रोटोकॉल के अनुसार)
नोट: बूंदों में न्यूक्लिक एसिड लक्ष्य की पीसीआर प्रवर्धन के बाद, छोटी बूंद पाठक साधन व्यक्तिगत रूप से एक 2-रंग का पता लगाने प्रणाली 13 का उपयोग कर प्रत्येक छोटी बूंद का विश्लेषण करती है। हम आम तौर पर परिवार एक का पता लगाने के लिए सेटडी विक संवाददाता fluorophores।
- प्रधानमंत्री छोटी बूंद पाठक को 'फ्लश सिस्टम "क्लिक करें और ddPCR विश्लेषण के लिए तैयार करना।
- छोटी बूंद रीडर में प्लेट लोड और क्लिक करें "शुरू करते हैं।" छोटी बूंद पाठक, प्रत्येक नमूना रेस्पायरेट्रस बूंदों singulates, और एक 2-रंग डिटेक्टर अतीत एकल फाइल में उन धाराओं। डिटेक्टर सकारात्मक और नकारात्मक नमूनों की गणना करने में बूंदों पढ़ता है।
- छोटी बूंद पढ़ने पूरा हो गया है, दरवाजा खुला है और इकाई से प्लेट धारक को हटा दें। धारक से 96 अच्छी तरह से पीसीआर थाली निकालें और यह त्यागें।
- उचित रखरखाव के लिए, छोटी बूंद पाठक तेल की जगह है और जरूरत के रूप में बर्बाद गोदाम खाली है। माइक्रोबियल विकास को रोकने के लिए बेकार की बोतल के लिए 10% ब्लीच के 50 मिलीलीटर जोड़ें।
2.4 डीएनए उत्परिवर्तन रूपरेखा (निर्माता की सिफारिश प्रोटोकॉल के अनुसार)
नोट: पीसीआर सकारात्मक और पीसीआर नकारात्मक बूंदों पूर्ण quantific प्रदान करने के लिए गिने जाते हैंडेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर डिजिटल रूप में लक्ष्य BRAF V600E डीएनए उत्परिवर्तन का समझना।
- नमूने, assays, और प्रयोगों के बारे में जानकारी दर्ज करने के लिए सेटअप पर क्लिक करें।
- सेटअप विंडो में, एक प्लेट (filename.qlp) लोड, तो डेटा खोलने के लिए और विश्लेषण करने के लिए विश्लेषण पर क्लिक करें। परिणाम तालिका, खैर चयनकर्ता और संसाधित डेटा / चित्रमय प्रदर्शन: डेटा विश्लेषण इंटरफेस तीन खिड़कियों में विभाजित है।
- संसाधित डेटा विंडो में, प्रत्येक लक्ष्य के लिए एकाग्रता डेटा प्लेट नक्शे में कुओं में दिखाई देते हैं और परिणाम तालिका में सारणीबद्ध रहे हैं। एकाग्रता भूखंडों में डेटा कल्पना करने के लिए एकाग्रता क्लिक करें।
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Representative Results
हमारे ddPCR विश्लेषण के लिए, हम BRAF V600E उत्परिवर्तन FFPE संदर्भ मानक सेल लाइनों का अध्ययन किया। छोटी बूंद पाठक एक लैपटॉप कंप्यूटर चलाने के डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर को जोड़ता है। प्रत्येक व्यक्ति छोटी बूंद भी सकारात्मक या नकारात्मक होने के रूप में फ्लोरोसेंट आयाम के आधार पर परिभाषित किया गया है। निर्माता द्वारा प्रदान की सॉफ्टवेयर भी एक उपयोगकर्ता द्वारा निर्धारित कटऑफ सकारात्मक और नकारात्मक की बूंदों के बीच सीमा को परिभाषित करने के लिए दर्ज किए जाने की अनुमति देता है। एक नमूने में सकारात्मक और नकारात्मक बूंदों की संख्या प्रतियां / μl के मामले में लक्ष्य की एकाग्रता की गणना करने के लिए प्रयोग किया जाता है।
प्रतिदीप्ति का पता चला है और एक दो आयामी तितर बितर साजिश प्रदर्शन में संसाधित, कस्टम सॉफ्टवेयर प्रत्येक छोटी बूंद समापन बिंदु क्लस्टर के लिए उचित फाटकों आकर्षित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, और प्रत्येक गेट के भीतर बूंदों की संख्या गिना गया था। चित्रा 3 में दिखाया गया है, सभी sampl के लिए कट-ऑफ रेखा से ऊपर नीले डॉट्स (परिवार प्रतिदीप्ति संकेत) द्वारा प्रतिनिधित्व बूंदोंतों (गुलाबी लाइन) उत्परिवर्तित BRAF V600E लिए सकारात्मक थे। BRAF गुम्मट में नीले डॉट्स द्वारा प्रतिनिधित्व बूंदों (एनटीसी; 2 लेन) नमूना एक गैर विशिष्ट संकेत की वजह से हो सकता है (सकारात्मक झूठी)। झूठी सकारात्मक संकेतों (BRAF डब्ल्यूटी) अन्य उत्परिवर्तन के नमूनों के साथ सामान्यीकृत थे। चित्रा 3 बी में दिखाया गया है, गुम्मट BRAF बूंदों हरी डॉट्स (विक प्रतिदीप्ति संकेत) द्वारा प्रतिनिधित्व कर रहे हैं। दोनों भूखंडों में, तल पर ग्रे डॉट्स प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि के रूप में माना जाता है। समग्र उत्परिवर्ती एलील आवृत्तियों का पता चला रिश्तेदार गुम्मट BRAF के प्रतिशत और BRAF V600E टेम्पलेट्स पर आधारित, चित्रा -3 सी में दिखाया गया डेटा का उपयोग कर की गणना की गई। प्राप्त ddPCR परिणाम छोटी बूंद घटना मायने रखता है और गणना की जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती डीएनए अणु BRAF V600E (50%, 10%, 5%, 1%, 0.5%, 0.1% और 0.05%) के लिए नीचे का उपयोग करके गणना नमूनों में गिना जाता है शामिल उल्लेख सूत्र।
उत्परिवर्ती आवृत्ति = के% (उत्परिवर्तीकॉपी / (wildtype + उत्परिवर्ती प्रतिलिपि)) 100 x
तदनुसार, BRAF V600E म्यूटेशन की पहचान की और संदर्भ मानक (BRAF डब्ल्यूटी) के साथ सत्यापित किया गया। 50%, 10%, 5%, 1%, 0.5%, 0.1% और 0.05% की परिभाषित BRAF V600E उत्परिवर्तन allelic आवृत्तियों ddPCR प्रणाली की संवेदनशीलता और reproducibility परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया गया। ज्ञात नमूना सांद्रता के साथ हमारे विश्लेषण से, हम ddPCR BRAF V600E उत्परिवर्तन के रूप में कम 0.05% के रूप में पता लगाने में सक्षम है कि पुष्टि की। 14 जैसा कि पहले बताया एनटीसी या गुम्मट में झूठी सकारात्मक उत्परिवर्ती गिनती का पता लगाने के कारण संभवतः गैर विशिष्ट जांच हाइड्रोलिसिस करने के लिए हो सकता है। एक नमूने में दो से अधिक प्रतियां का पता लगाने के ट्यूमर के ऊतक 15 में सकारात्मक रूप में माना गया है।
Aut के लिए तैयार करने में अभिकर्मक और नमूना लदान का वर्णन चित्रा 1. योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व omated डीएनए निष्कर्षण साधन। एक वाहक रैक में नमूने रखें और के रूप में उल्लेख इसी नली में अभिकर्मकों बांटना। कई नमूना प्रकार का समर्थन करता है कि स्वचालित टीपीएस प्रोटोकॉल, रोजगार सटीक बचाता है, और अधिकतम उत्पादकता के साथ विश्वसनीय परिणाम है। सीमेंस हेल्थकेयर निदान से अनुमति के साथ फिर से छपी। (सीमेंस हेल्थकेयर निदान के सौजन्य से)।
स्वचालित डीएनए निष्कर्षण के लिए ऊतक तैयार प्रणाली कार्यप्रवाह चित्रा 2. योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। FFPE के लिए पूरी तरह से स्वचालित डीएनए अलगाव की प्रक्रिया में दिखाया जाता है नकारात्मक आयल के चयन के कदम, ऊतक मलबे को हटाने और बाध्यकारी और क्षालन की सकारात्मक चयन चरणों सहित वर्गों ऊतकों। सीमेंस हेल्थकेयर निदान से अनुमति के साथ फिर से छपी। (सीमेंस हेल्थकेयर निदान के सौजन्य से)।
BRAF V600E की सटीक मात्रा का ठहराव के लिए ddPCR प्रणाली की चित्रा 3. का प्रयोग करें FFPE संदर्भ मानक सेल लाइन के नमूनों में उत्परिवर्तन। 1D भूखंडों में सकारात्मक प्रतिदीप्ति आयाम के (ए, बी) दृश्य (1dot -1droplet)। (विक सकारात्मक बी,) गुम्मट BRAF पॉजिटिव बूंदों का प्रतिनिधित्व हरी डॉट्स जबकि नीले डॉट्स (ए, परिवार सकारात्मक), उत्परिवर्ती BRAF V600E पॉजिटिव बूंदों का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह संकल्प FFPE संदर्भ मानक सेल लाइनों में सटीक उत्परिवर्तन मात्रा का ठहराव सक्षम बनाता है। गुलाबी लाइन बूंदों के सकारात्मक और नकारात्मक संकेतों के बीच भेदभाव सीमा है। (सी) आंशिक बहुतायत साजिश BRAF V600E उत्परिवर्तन की (प्रतियां / μl) एकाग्रता से संकेत मिलता है कि नीले रंग के मार्कर से पता चलता है, औरहरे रंग मार्करों BRAF (डब्ल्यूटी) की (प्रतियां / μl) एकाग्रता से संकेत मिलता है। डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर के द्वारा उत्पन्न की सभी त्रुटि सलाखों के 95% विश्वास अंतराल प्रतिनिधित्व करते हैं।
| अभिकर्मकों | वॉल्यूम (एमएल) |
| लिसेस बफ़र | 106 मिलीलीटर |
| धो बफर 1 | 101 मिलीलीटर |
| धो बफर 2 | 72 मिलीलीटर |
| धो बफर 3 | 106 मिलीलीटर |
| क्षालन बफर | 19 मिलीलीटर |
| चुंबकीय मोती | 8 मिलीग्राम |
| FFPE बफर | 15 मिलीलीटर |
| Proteinase कश्मीर | 3.3 मिलीलीटर |
48 नमूनों के साथ डीएनए निष्कर्षण के लिए आवश्यक अभिकर्मकों की तालिका 1. कुल मात्रा (टीपीएस किट)।
| तापमान | समय | # साइकिल | |
| एनजाइम सक्रियण | 95 डिग्री सेल्सियस | दस मिनट | 1 |
| विकृतीकरण | 94 डिग्री सेल्सियस | 30 सेकंड | 40 |
| एनीलिंग / विस्तार | 60 डिग्री सेल्सियस | 1 मिनट * | |
| पकड़ | 98 डिग्री सेल्सियस | दस मिनट | 1 |
| पकड़ | 4 डिग्री सेल्सियस | सदैव | 1 |
| * 2-2.5 डिग्री सेल्सियस / सेकंड के लिए रैंप दर सेटिंग्स समायोजित करें। 105 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट एक गर्म ढक्कन का प्रयोग करें और 40 μl के लिए नमूना मात्रा निर्धारित | |||
तालिका 2 पारंपरिक पीसीआर thermocycling की स्थिति
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Discussion
यहाँ, हम एक विशेष जीन उत्परिवर्तन मूल्यांकन के लिए FFPE संदर्भ मानक सेल लाइन के नमूनों से ddPCR की प्रयोज्यता और डीएनए अलगाव पर प्रकाश डाला। इस अध्ययन में, टीपीएस स्वचालित डीएनए अलगाव विधि आसानी से, स्वचालित अनुकूलित किया जा सकता है, जो प्रयोग किया जाता है, और बड़े पैमाने पर प्रयोग और कम परिवर्तनशीलता के लिए अनुमति देता है, एक साथ 48 विभिन्न नमूनों को समायोजित कर सकते हैं। वर्तमान कार्य में डीएनए अलगाव की सीमाओं में से एक हर FFPE नमूना अद्वितीय है, और सतह contaminants, सूक्ष्म वनस्पति में एक-दूसरे से भिन्न हो जाएगा, और / या मानव आनुवंशिक पृष्ठभूमि है। सामान्य तौर पर, निकाले डीएनए गुणवत्ता और मात्रा और पूरे जीनोमिक डीएनए प्रवर्धन की सफलता के दौरान और निकालने के बाद, पहले विभिन्न मापदंडों पर निर्भर हैं। ये, प्रकार और ऊतकों की राशि, ऊतक संरक्षण के लिए इस्तेमाल लगानेवाला के प्रकार के निर्धारण की अवधि, आयल ब्लॉक और भंडारण की स्थिति की उम्र, साथ ही वांछित डीएनए खंड की लंबाई विश्लेषण किया जाना शामिल <समर्थन> 16। अघुलित आयल गरीब नमूना गुणवत्ता की ओर जाता है के रूप में ऊतकों से आयल का हटाया सफल निकासी के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम है। छोटी बूंद पीढ़ी के दौरान देखभाल बुलबुला बनने से रोकने के लिए लिया जाना चाहिए - इस सफल उत्परिवर्तन का पता लगाने के लिए एक और महत्वपूर्ण कदम है। नमूना आबादी के बीच पैदा होती है और प्रयोग के मकसद के आधार पर हो सकता है कि बदलाव के नमूने के लिए नमूना ध्यान में रखते हुए प्रक्रिया में कुछ संशोधनों के वांछित परिणाम प्राप्त करने के लिए आवश्यक हो सकता है।
एक और लाभ यह है कि डीएनए अलगाव है और ddPCR इस प्रोटोकॉल में स्वचालित प्रणाली का उपयोग किया जाता है, और इसलिए आवश्यक नगण्य त्रुटि और उपयोगकर्ता के हस्तक्षेप के बहुत कम है नहीं है। अलग आयल एम्बेडेड ऊतक / कोशिकाओं से डीएनए पूरे जीनोम प्रवर्धित टीपीएस प्रणाली का उपयोग करके प्राप्त किया गया था। स्वचालित डीएनए अलगाव प्रणाली का उपयोग करने में खामियों में से एक यह नमूनों की छोटी संख्या का उपयोग करने के लिए कुशल खर्च नहीं किया जाता है, वह है। इसके बजाय इस स्वचालित काएं कीपी, अन्य मानक डीएनए अलगाव की प्रक्रिया भी सीमित नमूने के लिए किया जा सकता है
हाल के एक अध्ययन का उपयोग कर छोटी बूंद डिजिटल पीसीआर (ddPCR) भी FFPE ऊतकों से प्राप्त intermingled सामान्य ऊतकों की उपस्थिति में विशिष्ट जीनोमिक loci के रिश्तेदार प्रतिलिपि संख्या निर्धारित करने में सक्षम है कि कहा गया है। एक नियंत्रण कमजोर पड़ने श्रृंखला का उपयोग करके, Nadauld, एल एट अल। DdPCR परख के लिए पता लगाने की सीमा (लोद) और निर्धारित मानक वास्तविक समय पीसीआर 17 की तुलना में डीएनए की न्यूनतम मात्रा पर इसके सुधार संवेदनशीलता की सूचना दी। इधर, FFPE संदर्भ मानक सेल लाइनों ddPCR प्रणाली के उत्परिवर्तन पता लगाने की क्षमता प्रदर्शित करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। ddPCR प्रणाली परिणामों नीचे 0.05% उत्परिवर्तन के लिए दुर्लभ उत्परिवर्तन allelic आवृत्तियों का पता लगाने के लिए की संभावना का संकेत दिया। सामूहिक रूप से, इन आंकड़ों ddPCR प्रणाली को भी विभिन्न उत्परिवर्ती alleles और विषमयुग्मजी नैदानिक ट्यूमर के नमूने में रिश्तेदार मतभेदों के प्रतिशत के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए सक्षम बनाता है कि संकेत मिलता हैएस। FFPE नमूनों की बड़ी संख्या में एक साथ विशिष्ट जीन म्यूटेशन के लिए विश्लेषण किया जा सकता है और इस आबादी विस्तृत आनुवंशिक अध्ययन के लिए एक इष्टतम तकनीक है।
अंत में, यह उत्परिवर्तन आवृत्तियों यहां का प्रतिनिधित्व कर रहे हैं पूर्ण मात्रा का ठहराव और उत्परिवर्तन दर या आवृत्ति के सापेक्ष मूल्य के रूप में नहीं माना जाना चाहिए रहे हैं कि ध्यान में रखा जाना चाहिए। ddPCR readout के लक्ष्य डीएनए उत्परिवर्तन का पूर्ण मात्रा का ठहराव प्रदान करता है। इन मूल्यों को एक ही शर्त के तहत तैयार नमूनों के उत्परिवर्तन आवृत्तियों मान्य करने के लिए प्रयोग किया जाता है, और एक ही क्षेत्र पर अनुक्रम किया जा सकता। हालांकि, इन निरपेक्ष मूल्यों प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हैं और इष्टतम मानकों को नियंत्रित कर रहे हैं जब उत्परिवर्तन वितरण और आवृत्ति के मात्रात्मक तुलना के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। अंत में, ddPCR हाल ही में कोई FFPE और बायोप्सी नमूने में न्यूक्लिक एसिड की पूर्ण quantitation देता है और भी या तो के निर्धारण के लिए संदर्भ assays के साथ duplexed जा सकता है कि एक मजबूत उपकरण के रूप में उभरा हैrmalized प्रतिलेख सांद्रता या डीएनए की नकल संख्या।
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Disclosures
म्युंग Ryuri ओह, सी यून किम, और युवा Deug किम ABION सीआरओ के कर्मचारी हैं।
Acknowledgments
इस शोध विज्ञान, सूचना और संचार प्रौद्योगिकी और भविष्य योजना (अनुदान सं 2013M3C8A1075908) मंत्रालय द्वारा वित्त पोषित नेशनल रिसर्च फाउंडेशन के समाज के लिए अनुसंधान एवं विकास कार्यक्रम (एनआरएफ) द्वारा समर्थित किया गया।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hamilton MICROLAB STARlet IVD instrument | Siemens | 10701001 | Automated DNA isolation instrument |
| QX200 Droplet Generator | Bio-Rad | 772BR1119 | |
| QX200 Droplet Reader | Bio-Rad | 771BR1497 | |
| Conventional PCR machine capable of ramp-time adjustment | 621BR17718 | ||
| PX1 PCR plate sealer | Bio-Rad | 770BR1575 | |
| QuantaSoft software | Bio-Rad | ||
| DNA isolation kit | |||
| VERSANT Tissue Preparation Reagents Box 1 | Siemens | 10632398 | |
| VERSANT Tissue Preparation Reagents Box 1 | Siemens | 10632399 | |
| CO-RE tips | Siemens | ||
| ddPCR mutation analysis | |||
| ddPCR Supermix | Bio-Rad | BR186-3010 | 2X concentration |
| DG8 cartridge | Bio-Rad | BR186-4008 | |
| Droplet Generator oil | Bio-Rad | BR-186-3005 | |
| Gasket | Bio-Rad | BR186-3006 | |
| Droplet reader oil | Bio-Rad | BR-186-3004 |
References
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