Summary
このビデオの目的は、臨床の場で珍しい変異を検出するために、ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）参照標準細胞株およびデジタル滴PCR（ddPCR）分析から、自動化されたDNAの抽出を実行する方法を実証することです。 FFPEサンプルにおける変異を検出することはFFPEサンプルでddPCRの臨床的有用性を示します。
Introduction
重要な調節遺伝子における遺伝的変異の蓄積は、癌1に至る、細胞増殖、分化、および生存のような正常細胞のプログラミングを変更します。 RAS-RAF-MAPキナーゼ経路は、増殖シグナルに対する細胞応答を仲介します。発癌性BRAF変異は2過活動になるために腫瘍性タンパク質BRAFを引き起こす可能性があるBRAF遺伝子内のドライバの突然変異に起因することができます。 BRAF遺伝子内の変異はまた、順番に、独立して成長因子により媒介される調節4-6の過剰な細胞成長および増殖をもたらし、MEKおよびERK 3を介して過剰下流シグナル伝達をもたらします。
いくつかのツールは、そのようなddPCRにより、ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）参照標準細胞株における定量的リアルタイムBRAF V600E変異として、DNA変異プロファイリングのために利用可能です。 ddPCRは絶対定量のためのPCRベースの方法であり、従来の定量的リアルタイムPCR（qPCR）7,8と比較して、より高い精度を提供しています。 ddPCRは、より有益ながん研究と診断9を可能に 、DNAテンプレートでは珍しい変異の検出のためのより高い分解能と精度を提供します。低テンプレートコピー数10-12を研究する際、従来の定量PCRを超えるddPCRのさらなる利点は、その高感度と精度が含まれます。本明細書において、自動的にddPCRによってBRAF V600E突然変異の有無を決定することにより、その後FFPE参照標準細胞株からDNAを抽出するためのプロトコルが示されています。データ分析及び結果のグラフ表示のためのソフトウェアの使用方法も記載されています。全体の手順は比較的簡単で、完全にプロファイリングするサンプルの数と使用可能な従来のPCRとddPCRマシンの数によって異なります。
以下のプロトコルは、BRのための標準的な手順を説明します AF V600E陽性FFPE参照標準細胞株（HD598、HD593、HD617、HD273および野生型（WT））は、組織調製システム（TPS）プロトコルを使用して完全に自動化された測定器で行われています。続いて、単離されたDNAサンプルをddPCRシステムを用いたBRAF V600E突然変異の存在について分析されます。すべての試料がプロファイルされた後、標的変異分析が実行され、データは、データ解析ソフトウエアにロードされています。サンプルの数に応じ/群を研究、データ分析は、1〜数時間必要とする場合があります。方法論の実験的な構成要素は、取り扱いの精度を必要とするDNAをし、rologicalピペット・ピペッター、ピペット操作の状況についての詳細を説明するJoveの科学教育ビデオ"> 96ウェルプレートにピペット操作、データ解析ソフトウェアを使用して実行されています。
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Protocol
FFPE参照標準細胞株からのDNA抽出1
注意：この手順では、DNA抽出は、以下のプロトコールに記載されているようFFPE組織のDNA単離キットを使用してFFPE参照標準細胞株（HD598、HD593、HD617、HD273および野生型（WT））から行われました。自動化されたDNAの抽出は、全DNAの単離のための製造者の指示に従うことによって達成されました。
- ミクロトームと元のFFPEブロックを使用して、手動で確立された手順に従って、DNA抽出の前および分析に新鮮な切片を作製。組織切片（複数可）は、分析のためのサンプル入力が10μmを合わせた全体の厚さを超えると、表面積は、単一のセクションの600ミリメートル2を超えないようにしていないことを確認してください。
1.2 TPSプロトコル
注：表1に示す体積が48のサンプルを処理するために必要な最小値に対応し、手順TPSガイドラインに従っても示されています。実験を開始する前に自動化されたプログラム中のサンプルの損失を回避するために、600×gで遠心分離することにより、電子管でFFPEサンプルを落ち着きます。
- 自動化されたDNA単離楽器とコンピュータの電源を入れます。実行制御ソフトウェアを開き、TPSデッキローディングエリアに自動ロードトレイを挿入します。
- 図1に示すように、それらに対応する谷に試薬を分注します。
- サンプルキャリアラックに4つのサンプル（BRAF WT、BRAF V600E 50％、5％、1％）を配置します。
- 列2および3に谷に先端ボックスを配置し、実行を中止しますチップごとに複数のフィルタの存在のためのヒントをご確認ください。
- 彼らに3〜5回反転させることによって、溶解緩衝液および洗浄緩衝液の適切な混合を確認して、列4（ 図1）内の各谷にロードします。
- 数回または軽度vortのために反転した後、exing、（ 図1、表1）に示される場合、空の1スロットを残して、列5の小さな谷に溶出バッファー、磁気ビーズ、およびFFPEバッファをロードします。
- プレートキャリア（ 図1）上に2ミリリットルディープウェルプレート（DWP）をロードします。
- 実行を開始する前に、以下の最終手順を実行します。
- すべてのチューブおよび試薬トラフをキャップを取ります。十分な容量が廃液ボトルに使用可能であることを確認してください。固形廃棄物ボトルが空とバイオハザードバッグが並んでいることを確認してください。先端イジェクトプレートは廃棄物アセンブリの中央に配置されていることを確認してください。
- フロントカバーを閉じます。
- ソフトウェアを起動します。 NA_Prep_Main_MLSTARlet.medファイルを開きます。
- 「開始」をクリックします。機器ステータスが実行中にアイドルから切り替わります。
- この実行のためのサンプル数を入力します。このラン（DNA = 0）のための所望の方法を選択してください。第一の高容量の位置を入力してください梅先端、すべてのトレイがいっぱいであれば「1」を選択します。すべてのトレイがいっぱいであれば「1」を選択し、最初の標準ボリューム先端の位置を入力します。
注意：機器は、ユーザーの介入なしに自動化された手順を介して実行されます。詳細なワークフローが図2に示されている。実験が終了すると、試薬の無駄やヒントは、廃棄アセンブリに注入されます。 - 蛍光法を用いて精製したゲノムDNAを定量化します。
注：3.3 NG /μLの最小濃度を含むDNAサンプルをddPCR分析（セクション2）に供されます。
2. DNA変異プロファイリング：ddPCRプロトコル
注：1）液滴生成、2）従来のPCR増幅、3）液滴の読み取りおよび4）のDNA変異プロファイリング：DNA変異プロファイリングのためのプロトコルは、3つの主要なステップで構成されています。
2.1。液滴発生
注意：ddPCRスーパーミックスですこのミックスは、液滴の生成に必要な試薬が含まれているとして、ddPCRにお勧め。
- 汚染を避けるために、このような管を、手袋を着用してクリーンなPCRフードを使用して、きれいなピペット、低タンパク質結合などの標準予防策に従います。
- ヒトゲノムDNAサンプルの最小濃度は3.3 ngの/μlであることを確認してください。注：精製DNA試料濃度の量は％突然変異頻度検出の分析に基づいて変化するであろう。
- 96ウェルPCRプレートに反応混合物を組み立てます。解凍し、RTに反応成分を平衡化します。 （として、各精製されたDNAサンプル（66ng / 2μl）を蒸留水で20μlに構成すると2倍ddPCRスーパーミックス（10μL）および20のプライマー（フォワードおよびリバース、900 nm）をプローブ（250 nM）を組み合わせることにより、PCR反応を準備）液滴発生器プロトコルあたり
- 分注前にチューブの底に内容物を集めるために均質かつ短時間遠心分離を確実にするために十分に混合し、ボルテックス。ロード20＆＃181;液滴形成用カートリッジにリットル。
- 製造業者の推奨するプロトコルごとに液滴発生器の動作、
- ホルダーの左上側に位置するカートリッジのノッチ付きホルダーにカートリッジを挿入します。底のウェルに中央にサンプルを含む反応混合物20μlの、および発電機油の70μLを追加します。
- カートリッジの上部にガスケットを取り付けます。ガスケットがしっかりとホルダーの両端にフックされていることを確認してください。そうでなければ、液滴生成のための十分な圧力が得られないであろう。
- 楽器の上に緑のボタンを押して、液滴発生器を開き、カートリッジを挿入します。ホルダーが正しい位置にある場合、両方の電源（右、左）とホルダー（中央右）インジケータライトが緑色です。
- ドアを閉じるにはもう一度機器の一番上のボタンを押して、液滴生成を開始。注：Bを押した後utton、液滴が生成されるマイクロ流体チャネルを介して、オイルやサンプルを描く出口井戸の上にマニホールド位置自体、。彼らが蓄積どこ液滴は、十分に液滴内に流れ込みます。 （右の）液滴インジケータライトは、液滴の生成が進行中であることを示すために、10秒後に緑点滅します。
- 液滴の生成が完了すると、すべての3のインジケータランプが緑色に変化します。ボタンを押してドアを開き、ユニットからホルダーを取り外します。ホルダーから使い捨てガスケットを取り外し、それを捨てます。注：カートリッジの上部のウェルは、液滴を含み、中段、下段ウェルは、残油を少量、ほぼ空になっています。
2.2。 PCRのための準備
- メーカーの機器のプロトコルに示されているように、各サンプルについて、推奨される96ウェルPCRプレートの1ウェルにトップだけでなく、カートリッジからの液滴の内容を40μlをピペット。ノーTE：マルチチャンネルピペットを使用すると、液滴エマルジョンを転送するための理想的です。液滴のゆっくりと穏やかな吸引は、転送時に液滴の剪断を最小化することをお勧めします。
- すぐに蒸発を避けるために、液滴を移送した後、ホイルでPCRプレートをシール。 PCRプレートシーラーと液滴リーダーに針と互換性のある穿刺可能なホイルプレートシールを使用してください。 PCRプレートシーラーの取扱説明書の指示に従ってください。
- 180°Cまでのプレートシーラーの温度と5秒までの時間を設定します。
- トレイのドアを開くために矢印をタッチします。 96ウェル側を上に向けてトレイに支持ブロックを置きます。支持ブロック上に96ウェルプレートを配置し、すべてのプレートのウェルを支持ブロックの位置が合っていることを確認してください。
- 穿刺可能なホイルシールの1枚で、96ウェルプレートをカバー。 96ウェルプレートを支持ブロックに固定し、穿刺可能なホイルシールで覆われると、シール]ボタンをタッチします。トレイが閉じますそして、ヒートシールが開始されます。
- ヒートシールが完了すると、ドアが自動的に開きます。熱サイクルのヒートブロックからプレートを取り外した後、ヒートブロックを削除します。
- プレートのすべてのウェルは、箔で窪みを各ウェルの上に容易に明らかであることを確認することで密封されていることを確認してください。密封した後、プレートは、熱サイクルの準備ができています。
- 液滴が除去された後、それを開くために、カートリッジホルダのラッチを押してください。空のカートリッジを取り外し、それを捨てます。
- 表2に詳述したパラメータに従って、従来のPCR増幅を行います。
2.3液滴読書（メーカーの推奨プロトコルに従って）
注：液滴中の核酸標的のPCR増幅に続いて、液滴リーダ装置は、2色検出システム 13 を使用して個々の液滴を分析します。当社は通常、FAM ANを検出するように設定しますD VICレポーター蛍光団。
- プライム液滴リーダーに「フラッシュシステム」をクリックして、ddPCR分析できる状態に。
- 液滴リーダーにプレートをロードし、クリックして "スタート"液滴リーダーは、それぞれのサンプルを吸引液滴を個別化し、2色検出器を過ぎて単一のファイルにそれらをストリーミングします。検出器は、正と負のサンプルを列挙するために液滴を読み込みます。
- 液滴読み込みが完了したら、ドアを開けてユニットからプレートホルダーを取り外します。ホルダーから96ウェルPCRプレートを取り外して、それを捨てます。
- 適切なメンテナンスのために、液滴リーダーオイルを交換し、必要に応じて廃棄物容器を空にします。微生物の増殖を防ぐために、廃棄物ボトルに10％漂白剤を50mlを加えます。
2.4 DNA変異プロファイリング（メーカーの推奨プロトコルに従って）
注：PCR陽性およびPCR陰性液滴は絶対quantificを提供するためにカウントされますデータ分析ソフトウェアを使用してデジタル形式で標的BRAF V600E DNA変異のエーション。
- サンプル、アッセイ、および実験に関する情報を入力するために、セットアップをクリックします。
- セットアップウィンドウでは、プレート（filename.qlp）をロードし、データを開き、分析するための分析をクリックします。結果表、まあセレクタおよび処理されたデータ/グラフィカル表示：データ解析インタフェースは3つのウィンドウに分かれています。
- 処理されたデータウィンドウで、各ターゲットの濃度データは、プレートマップのウェルに表示され、結果を表にまとめました。濃度のプロット内のデータを視覚化するために濃度をクリックしてください。
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Representative Results
私たちのddPCR分析のために、我々は、BRAF V600E突然変異のFFPE参照標準細胞株を研究しました。液滴リーダはデータ分析ソフトウェアを実行しているラップトップコンピュータに接続します。各個々の液滴が正または負であるとして蛍光振幅に基づいて定義されます。製造業者によって提供されるソフトウェアは、ユーザー定義のカットオフは、正と負の液滴間の閾値を定義するために入力することを可能にします。サンプル中の正および負の液滴の数は、コピー/μLの点で標的の濃度を計算するために使用されます。
蛍光が検出された二次元散布図の表示に加工し、カスタム・ソフトウェアは、各液滴のエンドポイントのクラスタのための適切なゲートを描画するために使用し、各ゲート内の液滴の数をカウントしました。 図3Aに示すように、すべてのsamplためのカットオフライン上記青色ドット（FAMの蛍光シグナル）で表される液滴ES（ピンクの線）は、 変異 BRAF の V600E陽性でした。 BRAF WTに青い点で表さ液滴（NTC;レーン2）サンプルは、非特異的シグナル（偽陽性）が原因である可能性があります。偽陽性シグナル（BRAF WT）は、他の突然変異サンプルで標準化しました。 図3Bに示すように、WT BRAF滴が緑色ドット（VIC蛍光シグナル）によって表されます。両方のプロットでは、一番下にあるグレーのドットは、蛍光の背景として考えられています。全体の変異対立遺伝子頻度を検出WT BRAFおよびBRAF V600Eテンプレートの相対的な割合に基づいて、 図3Cに示すデータを用いて計算しました。 （50％、10％、5％、1％、0.5％、0.1％及び0.05％）は、以下を用いて計算したサンプルを得ddPCR結果は、液滴イベントカウントを含み、計算された野生型及び変異体DNA分子は、BRAF V600Eのカウント式に言及しました。
変異周波数=（変異の％コピー/（野生型+突然変異体のコピー））×100
したがって、BRAF V600E変異を同定し、参照標準（BRAF WT）で確認しました。 50％、10％、5％、1％、0.5％、0.1％および0.05％の定義されたBRAFの V600E突然変異対立遺伝子頻度はddPCRシステムの感度および再現性を試験しました。既知の試料濃度との分析から、我々はddPCRはBRAF V600E突然変異の0.05％と低いが検出できることを確認しました。 14以前に報告されたように、NTCまたはWTにおける偽陽性変異体数の検出は、おそらく非特異的なプローブの加水分解のためである可能性があります。サンプル中の二つ以上のコピーの検出は、腫瘍組織15に陽性と考えられてきました。
AUTの準備のための試薬 およびサンプルロードを記述する図1模式図 omated DNA抽出器具。キャリアラックにサンプルを置き、述べたように、対応する谷に試薬を分注します。複数のサンプルタイプをサポートして自動化されたTPSプロトコルを採用し、最大の生産性と正確、かつ信頼性の高い結果が実現します。シーメンスヘルスケア・ダイアグから許可を得て再印刷。 （シーメンスヘルスケア・ダイアグの礼儀）。
FFPE 図 2. 自動DNA抽出のための組織調製システムワークフローの模式図。完全に自動化されたDNA単離手順は、パラフィンの陰性選択工程を含むセクションを組織、組織片を除去し、結合および溶出の正の選択のステップが示されています。 シーメンスヘルスケア・ダイアグから許可を得て再印刷。 （シーメンスヘルスケア・ダイアグの礼儀）。
BRAF V600Eの正確な定量化のためのddPCRシステムの図3. FFPE参照標準セルラインサンプル中の変異 。1Dプロットに正の蛍光振幅の（A、B）の可視化（1ドット-1droplet）。緑のドット（B、VIC正）は、WT BRAF陽性滴を表現しながら、ブルードット（A、正FAM）は、変異BRAFの V600E陽性液滴を表します。この決意は、FFPE参照標準細胞株における正確な突然変異の定量化を可能にします。ピンクの線は、液滴の正と負の信号の間の判別閾値である。（C）小数存在プロットはBRAF V600E突然変異の濃度（コピー/μL）を示す青色のマーカーを示し、そして緑のマーカーは、BRAF（WT）の濃度（コピー/μl）を示しています。データ解析ソフトウェアにより生成されたすべてのエラーバーは95％信頼区間を表します。
| 試薬 | 容量（ml） |
| 溶解バッファー | 106ミリリットル |
| 洗浄バッファー1 | 101ミリリットル |
| 洗浄バッファー2 | 72ミリリットル |
| 洗浄緩衝液3 | 106ミリリットル |
| 溶出バッファー | 19ミリリットル |
| 電磁ビーズ | 8ミリリットル |
| FFPEバッファ | 15ミリリットル |
| プロテイナーゼK | 3.3ミリリットル |
48サンプルとDNA抽出のために必要な試薬の表1の総体積（TPSキット）。
| 温度 | タイム | ＃サイクル | |
| 酵素活性化 | 95°C | 10分 | 1 |
| 変性 | 94°C | 30秒 | 40 |
| アニーリング/伸長 | 60°C | 1分* | |
| ホールド | 98°C | 10分 | 1 |
| ホールド | 4°C | フォーエバー | 1 |
| * 2〜2.5℃/秒にランプ・レート設定を調整します。 105℃に設定された加熱蓋を使用し、40μlにサンプルボリュームを設定 | |||
表2.従来のPCRサーモサイクリング条件
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Discussion
ここでは、特定の遺伝子変異の評価のためのFFPE参照標準セルラインサンプルからddPCRの適用性とDNAの分離を強調表示します。本研究では、TPS自動DNA単離方法は、容易に、自動化された適合させることができるが使用される、より大きな規模の実験と低い変動性を考慮して、同時に48の異なるサンプルまで収容することができます。本研究におけるDNA分離の制限の1つはすべてのFFPEサンプルはユニークであり、かつ表面汚染物、微生物叢、および/またはヒトの遺伝的背景に互いに変化することがあります。一般的には、抽出されたDNAの質と量と全ゲノムDNA増幅の成功は、中に抽出した後、前に様々なパラメータに依存します。これらは、型および組織の量、組織の保存に使用される固定剤の種類、固定の持続時間、パラフィンブロックおよび保管条件の年齢、ならびに所望のDNAセグメントの長さを分析することを含みます<SUP> 16。未溶解パラフィンが悪いサンプルの質につながるような組織からのパラフィンの除去は、抽出成功のための最も重要なステップです。小滴生成中に、注意が気泡の形成を防ぐために注意しなければならない - これは、成功した変異検出のための別の重要なステップです。サンプル集団との間で発生し、実験の動機に基づくかもしれない変化をサンプリングするサンプルを考慮すると、プロシージャ内の特定の変更は、所望の結果を得るために必要とされる場合があります。
別の利点は、DNAの単離であるとddPCRは、このプロトコルでは、自動化システムを使用して行われ、従って、必要なごくわずかなエラー、ユーザーの介入が非常に最小限でした。パラフィン包埋組織/細胞から単離する全ゲノム増幅DNAは、TPS系を用いて得ました。自動化されたDNA単離システムを使用する際の欠点の一つは、少数のサンプルを使用することが効率的でコストされていない、ということです。代わりに、この自動化されたSTEのP、他の標準的なDNA単離手順は、限られたサンプルに対して実行することができます
最近の研究は、液滴デジタルPCR（ddPCR）を使用してさえFFPE組織から得られた混ざり正常組織の存在下で特定のゲノム遺伝子座の相対的コピー数を決定することができると述べています。対照希釈系列を用いて、Nadauldは、L. ら ddPCRアッセイの検出限界（LOD）を測定し、標準的なリアルタイムPCR 17と比較して、DNAの最小限の量に対する感度の改善を報告しました。ここで、FFPE参照標準細胞株はddPCR系の変異検出能力を実証するために使用されます。 ddPCRシステムの結果は、0.05％の変異まで稀突然変異対立遺伝子頻度を検出する可能性を示しました。まとめると、これらのデータはddPCRシステムはまた、種々の変異対立遺伝子及びヘテロ接合臨床腫瘍サンプル中の相対的な差の百分率の定量分析を可能にすることを示します秒。 FFPEサンプルの多くは、同時に、特定の遺伝子変異について解析することができ、これは、集団ワイド遺伝学的研究のための最適な技術です。
最後に、突然変異頻度がここに表されていることを考慮しなければならない絶対的な定量化され、突然変異率または周波数の相対的な値と考えるべきではありません。 ddPCR読み出しは、標的DNAの変異の絶対的な定量化を提供します。これらの値は、同一条件で調製した試料の突然変異頻度を検証するために使用され、同一の領域にわたって配列決定することができます。しかしながら、これらの絶対値は、再現可能であり、最適なパラメータを制御する場合、変異分布と周波数の定量的な比較のために使用することができます。結論として、ddPCRは最近、無FFPEと生検試料中の核酸の絶対定量を与え、また、いずれかの決意のための基準アッセイで二重化することができます強力なツールとして浮上しています転写産物の濃度またはDNAのコピー数をrmalized。
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Disclosures
ミョンRyuriああ、Siのウンキム、ヤングDeugキムはABION CROの従業員です。
Acknowledgments
この研究は、ICTの未来計画（認可番号2013M3C8A1075908）、科学省によって資金を供給、国立研究財団（NRF）の社会のためのR＆Dプログラムによってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hamilton MICROLAB STARlet IVD instrument | Siemens | 10701001 | Automated DNA isolation instrument |
| QX200 Droplet Generator | Bio-Rad | 772BR1119 | |
| QX200 Droplet Reader | Bio-Rad | 771BR1497 | |
| Conventional PCR machine capable of ramp-time adjustment | 621BR17718 | ||
| PX1 PCR plate sealer | Bio-Rad | 770BR1575 | |
| QuantaSoft software | Bio-Rad | ||
| DNA isolation kit | |||
| VERSANT Tissue Preparation Reagents Box 1 | Siemens | 10632398 | |
| VERSANT Tissue Preparation Reagents Box 1 | Siemens | 10632399 | |
| CO-RE tips | Siemens | ||
| ddPCR mutation analysis | |||
| ddPCR Supermix | Bio-Rad | BR186-3010 | 2X concentration |
| DG8 cartridge | Bio-Rad | BR186-4008 | |
| Droplet Generator oil | Bio-Rad | BR-186-3005 | |
| Gasket | Bio-Rad | BR186-3006 | |
| Droplet reader oil | Bio-Rad | BR-186-3004 |
References
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