Summary
Målet med den här videon är att visa hur man utför automatiserad DNA-extraktion från formalinfixerade paraffininbäddade (FFPE) referensstandard cellinjer och digital droppe PCR (ddPCR) analys för att upptäcka sällsynta mutationer i en klinisk miljö. Detektion av mutationer i FFPE proven visar den kliniska nyttan av ddPCR i FFPE proven.
Introduction
Ansamlingen av genetiska mutationer i viktiga reglerande gener förändrar normal cell programmering som celltillväxt, differentiering och överlevnad, vilket leder till cancer 1. RAS-RAF-MAP-kinasvägen förmedlar cellulära svar på tillväxtsignaler. Onkogen BRAF mutationer kan härröra från förare mutationer i BRAF-genen, vilket kan orsaka BRAF onkoprotein att bli överaktiv 2. Mutationer i BRAF-genen resulterar också i överaktiv nedströmssignalering via MEK och ERK 3, vilket i sin tur leder till överdriven celltillväxt och proliferation oberoende av tillväxtfaktorförmedlad reglering 4-6.
Flera verktyg finns tillgängliga för DNA-mutation profilering, såsom kvantitativa realtid BRAF V600E mutationer i formalinfixerade, paraffininbäddade (FFPE) referensstandard cellinjer från ddPCR. ddPCR är en PCR-baserad metod för absolut kvantifieringerbjuder högre noggrannhet jämfört med konventionell kvantitativ realtids-PCR (qPCR) 7,8. ddPCR ger också högre upplösningsförmåga och noggrannhet för detektion av sällsynta mutationer i DNA-mallar, vilket möjliggör mer informativ cancerforskning och diagnos 9. Ytterligare fördelar med ddPCR jämfört med konventionell qPCR inkluderar dess ökad känslighet och precision när man studerar låg mall kopieantal 10-12. Häri är ett protokoll för automatisk extraktion av DNA från FFPE referensstandard cellinjer, följt av bestämning av närvaron eller frånvaron av BRAF V600E mutationer genom ddPCR påvisas. Användningen av programvara för dataanalys och en grafisk representation av resultaten beskrivs också. Hela förfarandet är relativt enkelt och helt beror på antalet prover som skall profilerade och antalet konventionella PCR och ddPCR automater.
Följande protokoll beskriver standardprocedurer för BR AF V600E-positiva FFPE referensstandard cellinjer (HD598, HD593, HD617, HD273 och vildtyp (WT)) utförs i ett helt automatiserat instrument med hjälp av Vävnadsberedning System (TPS) protokollet. Därefter isoleras DNA-prover analyserades för närvaro av BRAF V600E mutationer med användning ddPCR systemet. Riktad mutationsanalys utförs efter alla prover har profilerade och data har laddats in i dataanalys programvara. Beroende på antalet prover / grupper studerades, dataanalys kan kräva från en till flera timmar. Den experimentella komponenten av metodiken kräver noggrannhet i hanteringen DNA ochrological Pipetter och pipetter, en JUPITER Science Education video som förklarar mer om om ramen för pipettering "> pipett till 96 brunnar, medan dataanalys utförs med hjälp av programvara.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. DNA-extraktion från FFPE Reference Standard cellinjer
Obs: För denna procedur, har DNA-extraktion utföras från FFPE referensstandard cellinjer (HD598, HD593, HD617, HD273 och vildtyp (WT)) med hjälp av FFPE Tissue DNA-isoleringskit som beskrivs i protokollet nedan. Automatiserad DNA-extraktion uppnåddes genom att följa tillverkarens instruktioner för total DNA-isolering.
- Med hjälp av en mikrotom och den ursprungliga FFPE blocket manuellt förbereda färska avsnitt före DNA-extraktion och analys, i enlighet med fastställda rutiner. Säkerställa att provet ingång för vävnadssektionen (er) analyseras inte överstiger en kombinerad total tjocklek av 10 ^ m och att ytarean inte överstiger 600 mm 2 för en enda sektion.
1,2 TPS-protokollet
Obs: De volymer som anges i tabell 1 motsvarar det minimum som krävs för att behandla 48 prover, och förfarandetsom visas är i enlighet med de TPS riktlinjer. Före start av experimentet sedimentera ner FFPE proven i e-röret genom centrifugering vid 600 xg, för att undvika förlust av prov under det automatiska programmet.
- Slå på den automatiserade DNA-isolering instrumentet och datorn. Öppna Kör kontroll programvara och sätt en automatisk lastfacket i TPS däckslastutrymmet.
- Dispensera reagenser till sina motsvarande fördjupningar såsom visas i fig 1.
- Placera 4 prover (BRAF WT, BRAF V600E 50%, 5% och 1%) i prov bärarställningarna.
- Placera spetsrutor i rännorna i kolumnerna 2 och 3 och kontrollera tips för förekomst av mer än ett filter per spets, vilket kommer att avbryta körningen.
- Säkerställ korrekt blandning av lysbufferten och tvättbuffert genom att vända dem 3-5 gånger och läsa in dem i respektive dalar i kolumn 4 (Figur 1).
- Efter att vända för några gånger eller mild vortexing, ladda elueringsbufferten, magnetiska kulor, och FFPE buffert i de små dalar i kolumn 5, lämnar en kortplats tomt där anges (Figur 1, Tabell 1).
- Ladda en 2 ml djup brunnar (DWP) på skivhållaren (Figur 1).
- Utför följande sista stegen innan en körning:
- Ta bort skyddet alla rör och reagenstråg. Kontrollera att tillräcklig kapacitet finns i avfallsflaskan vätskan. Kontrollera att avfallsflaskan fasta är tom och fodrad med ett biologiskt påse. Bekräfta att spetsutkastningsplattan är centrerad i avfallsaggregatet.
- Stäng frontluckan.
- Starta programmet. Öppna NA_Prep_Main_MLSTARlet.med filen.
- Klicka på "Start". Instrumentet status växlar från tomgång till kör.
- Ange antalet prover för denna körning. Välj den önskade metoden för denna körning (DNA = 0). Ange positionen för den första hög volymume spets, välja "1" om alla fack är fulla. Ange positionen för den första standardvolym spets, välja "1" om alla fack är fulla.
Obs: Instrumentet kommer sedan köra genom automatiserade steg utan att användaren behöver. En detaljerad arbetsflöde visas i figur 2. När experimentet har avslutats, är reagensavfall och tips injiceras i avfallsaggregatet. - Kvantifiera renat genomiskt DNA med hjälp av en fluorometrisk metod.
Obs: DNA-prover som innehåller en minsta koncentration på 3,3 ng / l utsätts för ddPCR analys (avsnitt 2).
2. DNA-Mutation profilering: ddPCR protokoll
Obs: Protokollet för DNA-mutation profilering består av 3 stora steg: 1) Dropp generation, 2) Konventionell PCR-förstärkning, 3) Dropp läsning och 4) DNA-mutation profilering.
2,1. Dropp generationen
Obs: ddPCR Supermix ärrekommenderas för ddPCR, eftersom denna blandning innehåller reagens som krävs för droppgenerering.
- För att undvika kontaminering, följa standard försiktighetsåtgärder, såsom handskar, med en ren PCR huva, rena pipetter, och låg proteinbindningsrören.
- Se till att den minimala koncentrationen av humant genomiskt DNA-prov är 3,3 ng / l. Obs: Mängden renat DNA provkoncentrationen varierar beroende på en analys av% mutationsfrekvens upptäckt.
- Montera reaktionsblandningar i 96-brunnars PCR-plattor. Tina och ekvilibrera reaktionskomponentema till RT. Förbered PCR-reaktioner genom att kombinera 2X ddPCR Supermix (10 ^) och 20 primers (framåt och bakåt, 900 nM) och sond (250 nM) med varje renat DNA-prov (66ng / 2 pl) göra upp till 20 pl med destillerat vatten (som per droppgeneratorn protokoll)
- Vortexa blandningen grundligt för att säkerställa homogenitet och kort centrifug för att samla innehållet i botten av röret innan dispensering. Last 20 & #181, l på patronen för droppbildning.
- Driften av droppgeneratorn, enligt tillverkarens rekommenderade protokoll
- Sätt patronen i hållaren med skåran i patronen placerat på den övre vänstra sidan av hållaren. Tillsätt 20 | il reaktionsblandning innehållande prover i mitten, och 70 ul av generatorolja i de nedre brunnarna.
- Fäst packningen över toppen av patronen. Se till att packningen är ordentligt ansluten i båda ändarna av hållaren; annars kommer tillräckligt tryck för droppgenerering inte uppnås.
- Öppna droppgeneratorn genom att trycka på den gröna knappen på ovansidan av instrumentet och sätt patronen. När innehavaren är i rätt läge, både kraften (vänster höger) och hållare (mitten till höger) indikatorlampor är gröna.
- Tryck på översta knappen på instrumentet igen för att stänga dörren och initiera dropp generation. Obs: När du trycker på button, ett grenrör placerar sig över utloppsbrunnar, dra olja och prover genom mikroflödessystem kanaler, där droppar skapas. Droppar strömma in droppen väl, där de samlas. Droppindikatorn (till höger) blinkar grönt efter 10 sekunder för att indikera att dropp generation pågår.
- När dropp generation är klar, alla 3 indikatorlampor ändras till ett fast grönt sken, öppna dörren genom att trycka på knappen och ta bort hållaren från enheten. Ta engångs packningen ur hållaren och kassera den. Anmärkning: De övre brunnarna i patronen innehåller droppar, och de mellersta och nedre brunnarna är nästan tom, med en liten mängd kvarvarande olja.
2.2. Förberedelse för PCR
- För varje prov pipettera ut 40 pl droppinnehållet från toppen väl patronerna i en enda brunn av en rekommenderad 96-brunnars PCR-platta enligt vad som anges i tillverkarens instrument protokoll. Nejte: Med hjälp av en flerkanals pipett är idealisk för överföring av droppar emulsioner. Långsam och försiktig uppsugning av droppar rekommenderas för att minimera dropp klippning vid förflyttningar.
- Täta PCR-plattan med folie omedelbart efter överföring droppar för att undvika avdunstning. Använd genomstickfolieplatta tätningar som är kompatibla med PCR-plattförsegling och nålarna i droppen läsaren. Följ instruktionerna i PCR plattförseglare bruksanvisning.
- Ställ in plattförsegling temperaturen till 180 ° C och tiden till 5 sek.
- Tryck på pilen för att öppna dörren facket. Placera stödblocket på brickan med 96 brunnar uppåt. Placera 96-brunnar på stödblocket och säkerställa att alla plattbrunnar är inriktade med stödblocket.
- Täck 96-brunnar med 1 ark trängningsbart folieförseglingen. När 96-brunnar är fastsatt på stödblocket och täcktes med det genomträngbara folietätning, trycker tätnings knappen. Facket stängsoch värmeförsegling kommer att inleda.
- När värmeförsegling är klar öppnas dörren automatiskt; ta bort plattan från värmeblocket för termisk cykling och ta bort värmeblocket.
- Se till att alla brunnar i plattan tätas genom att kontrollera att fördjupningar i folien är lätt uppenbara över varje brunn. När förseglade, är plattan klar för termisk cykling.
- När dropparna tas bort, tryck på spärrarna på patronhållaren för att öppna den. Ta den tomma kassetten och kassera den.
- Utför konventionell PCR-amplifiering genom att följa de parametrar som anges i tabell 2.
2.3 Dropp läsning (enligt tillverkarens rekommenderade protokoll)
Anmärkning: Efter PCR-amplifiering av nukleinsyramålet i dropparna, dropp läsaren instrumentet analyserar varje droppe individuellt med användning av en två-färgdetekteringssystemet 13. Vi normalt inställd på att upptäcka FAM end VIC reporter fluoroforer.
- Klicka på "Spola systemet" till prime droppen läsaren och göra den redo för ddPCR analys.
- Ladda plattan i dropp läsaren och klicka på "start". Dropp läsare aspirerar varje prov, singulates dropparna, och strömmar dem i en enda fil förbi en 2-färg detektor. Detektorn avläser dropparna att räkna positiva och negativa prov.
- När dropp läsning är klar, öppna dörren och ta bort plåthållaren från enheten. Ta bort 96 brunnar PCR-platta från hållaren och kassera den.
- För korrekt underhåll, byt dropp läsaren olja och tömma avfallsbehållaren vid behov. Tillsätt 50 ml av 10% blekmedel till avfallsflaskan för att förhindra mikrobiell tillväxt.
2.4 DNA mutation profilering (enligt tillverkarens rekommenderade protokoll)
Obs: PCR-positiva och PCR-negativa droppar räknas för att ge absolut quantification av mål BRAF V600E DNA-mutationer i digital form, med hjälp av dataanalys programvara.
- Klicka på Inställningar för att ange information om proverna, analyser och experiment.
- I fönstret Setup ladda en platta (filename.qlp), och klicka sedan på Analysera för att öppna och analysera data. Dataanalys gränssnittet är uppdelat i tre fönster: Resultat Tabell, väl Selector och bearbetade data / grafisk display.
- I den bearbetade data fönstret, data för varje mål koncentrations visas i brunnarna i plattan kartan och i tabellform i resultattabellen. Klicka Koncentration att visualisera data i koncentrations tomter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För vår ddPCR analys, studerade vi BRAF V600E mutation FFPE referensstandard cellinjer. Dropp Läsaren ansluts till en bärbar dator med dataanalys programvara. Varje enskild droppe är definierad på grundval av fluorescerande amplitud som antingen positiv eller negativ. Den programvara som tillhandahålls av tillverkaren ger också en användardefinierad cutoff som anges för att fastställa tröskeln mellan de positiva och negativa droppar. Antalet positiva och negativa droppar i ett prov användes för att beräkna koncentrationen av mål i form av kopior / | il.
Fluorescens detekteras och bearbetas till en tvådimensionell punktdiagram display, anpassade program användes för att dra korrekta grindar för varje droppe endpoint kluster, och antalet droppar inom varje port räknades. Som visas i figur 3A, droppar representeras av blå prickar (FAM fluorescenssignalen) över cut-off line för alla samples (rosa linje) var positiva för muterat BRAF V600E. Droppar som representeras av blå prickar i BRAF WT (NTC, Lane 2) prov skulle kunna bero på en icke-specifik signal (falsk positiv). Falska positiva signaler (BRAF WT) normaliserades med andra mutations prover. Såsom visas i figur 3B, är WT BRAF droppar representeras av gröna punkter (VIC fluorescens signal). I båda tomter, de grå prickar längst ner betraktas som fluorescensbakgrund. De övergripande muterade allelfrekvensema beräknades med hjälp av de data som visas i figur 3C, baserat på de relativa procentsatserna för WT BRAF och BRAF V600E mallar upptäckts. Erhölls ddPCR resultaten innehålla dropphändelseräkning och beräknat vildtyp och mutant-DNA-molekylen räknas för BRAF V600E (50%, 10%, 5%, 1%, 0,5%, 0,1% och 0,05%) prov som beräknats med hjälp av nedanstående ovannämnda formel.
% Av Mutant frekvens = (Mutantkopiera / (Vildtyps + Mutant kopia)) x 100
Följaktligen var BRAF V600E mutationer identifieras och verifieras med referensstandard (BRAF WT). Definierad BRAF V600E mutations alleliska frekvenserna av 50%, 10%, 5%, 1%, 0,5%, 0,1% och 0,05% användes för att testa känsligheten och reproducerbarheten hos ddPCR systemet. Från vår analys med kända provkoncentrationer, bekräftade vi att ddPCR kan upptäcka så låg som 0,05% av BRAF V600E mutation. Detektering av falska positiva mutant räknas i NTC eller WT eventuellt bero på ospecifik probhydrolys som rapporterats tidigare 14. Detektion av mer än två kopior i ett prov har ansetts vara positiva i tumörvävnad 15.
Figur 1. Schematisk bild som beskriver reagens och provladdning som förberedelse för aut omated DNA-extraktion instrument. Placera proverna i en bärarställningarna och fördela reagenserna i motsvarande tråg som nämns. Anställa automatiserad TPS protokoll som stöder flera provtyper, levererar korrekt, och tillförlitliga resultat med maximal produktivitet. Re-tryckt med tillstånd från Siemens Healthcare Diagnostics. (artighet av Siemens Healthcare Diagnostics).
Figur 2. Schematisk representation av Vävnadsberedning System arbetsflöde för automatiserad DNA-extraktion. Helt automatiserad DNA isoleringsförfarandet för FFPE vävnader sektioner, inklusive negativa selektionssteg på paraffin, vävnadsrester avlägsnas och positiva selektions stegen med bindning och eluering är visade. Re-tryckt med tillstånd från Siemens Healthcare Diagnostics. (artighet av Siemens Healthcare Diagnostics).
Figur 3. Användning av ddPCR system för exakt kvantifiering av BRAF V600E mutation i FFPE referens standard cell line-prover. (A, B) Visualisering av positiva fluorescens amplituder i 1D tomter (1dot -1droplet). Blå prickar (A, FAM positiv) representerar muterade BRAF V600E-positiva droppar, medan de gröna prickar (B, VIC positiv) representerar WT BRAF-positiva droppar. Denna bestämning möjliggör exakt mutation kvantifiering FFPE referensstandard cellinjer. Den rosa linjen är diskriminationströskeln mellan positiva och negativa signaler om dropparna. (C) Den fraktionella överflöd tomten visar blå markörer som anger koncentrationen (kopior / l) av BRAF V600E mutation, ochde gröna markörerna indikerar koncentrationen (kopior / l) av BRAF (WT). Alla felstaplar som genereras av dataanalys programvara representerar 95% konfidensintervall.
| Reagens | Volym (ml) |
| Lysis Buffer | 106 ml |
| Tvättbuffert 1 | 101 ml |
| Tvättbuffert 2 | 72 ml |
| Tvättbuffert 3 | 106 ml |
| Elution Buffer | 19 ml |
| Magnetiska pärlor | 8 ml |
| FFPE buffert | 15 ml |
| Proteinas K | 3,3 ml |
Tabell 1. Total volym av reagens (TPS kit) som krävs för DNA-extraktion med 48 prover.
| Temperatur | Tid | # Cykler | |
| Enzymaktivering | 95 ° C | 10 min | 1 |
| Denaturering | 94 ° C | 30 sek | 40 |
| Annealing / förlängning | 60 ° C | 1 min * | |
| Håll | 98 ° C | 10 min | 1 |
| Håll | 4 ° C | Evigt | 1 |
| * Justera ramphastighet inställningar till 2-2,5 ° C / sek. Använd ett uppvärmt lock inställd på 105 ° C och ställ in provvolymen till 40 ^ | |||
Tabell 2. Konventionell PCR termocykling villkor
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här lyfter vi tillämpligheten av ddPCR och isolering av DNA från FFPE referensstandard cellinje prover för en specifik gen mutation bedömning. I denna studie, är TPS automatiserad DNA isolering metod som lätt kan anpassas, automatiserad, och kan rymma upp till 48 olika prov samtidigt, vilket möjliggör större skaleförsök och lägre variabilitet. En av begränsningarna hos DNA-isolering i detta arbete är att varje FFPE provet är unik och kommer att variera en varandra i ytföroreningar, mikrobiell flora, och / eller humana genetiska bakgrunder. I allmänhet, extraherades DNA-kvalitet och kvantitet och framgången för hela genom-DNA-amplifiering är beroende av olika parametrar före, under och efter extraktion. Dessa inkluderar typ och mängd av vävnad, typ av fixativ som används för vävnads konservering, varaktighet fixering, ålder paraffin block och lagringsförhållanden, samt längden på den önskade DNA-segment som skall analyseras <sup> 16. Borttagning av paraffin från vävnaden är det mest kritiska steget för en lyckad extraktion som oupplöst paraffin leder till dålig prov kvalitet. Under dropp generationen, måste man vara försiktig för att förhindra bubbelbildning - detta är en annan avgörande steg för en lyckad mutation upptäckt. Med tanke på prov till prov variation som kan uppstå mellan provpopulationer och grundar sig på motivet för experimentet, kan vissa ändringar i förfarandet som krävs för att uppnå önskat resultat.
En annan fördel är att DNA-isolering och ddPCR genomförs med hjälp av automatiserade system i detta protokoll, och därmed finns det försumbar fel och åtgärder från användaren krävs är mycket minimal. Isolera hela-genomet-förstärkt DNA från paraffininbäddade vävnads / celler erhölls genom att använda TPS-system. En av nackdelarna med att använda automatiserad DNA isoleringssystemet är att det inte är kostnadseffektivt att använda litet antal prover. I stället för denna automatiserade step, annan standard DNA isoleringsförfarandet kan också göras för begränsade prover
En färsk studie uppgav att du använder dropp digital PCR (ddPCR) kan bestämma det relativa antalet kopior av specifik genomisk lokus även i närvaro av blandade normal vävnad erhållen från FFPE vävnader. Genom att använda en kontrollspädningsserier, Nadauld, L. et al., Bestäms gränserna för detektion (LOD) för ddPCR analysen och rapporteras dess förbättrad känslighet på minimala mängder DNA jämfört med standardrealtids-PCR 17. Här, är FFPE referensstandard cellinjer användas för att visa mutationen detektionsförmågan för ddPCR systemet. De ddPCR systemet Resultaten visade möjligheten att upptäcka sällsynta mutations alleliska frekvenserna ned till 0,05% mutation. Tillsammans står dessa data tyder på att ddPCR systemet gör det också möjligt kvantitativ analys av procentandelar av olika muterade alleler och relativa skillnaderna i heterozygot klinisk tumörprovs. Stort antal FFPE prover kan analyseras med avseende på specifika genmutationer samtidigt och detta är en optimal teknik för populations breda genetiska studier.
Slutligen bör det tas hänsyn till att mutationsfrekvenser representerade är absolut kvantifiering och bör inte betraktas som relativa värdet av mutationshastighet eller frekvens. ddPCR avläsning ger absolut kvantifiering av mål-DNA mutation. Dessa värden kan användas för att validera mutationsfrekvenser av prover framställda under samma betingelser, och sekvenser över samma region. Dessa absoluta värden är reproducerbara och kan användas för kvantitativ jämförelse av distribution och frekvens mutation när optimala parametrar kontrolleras. Sammanfattningsvis har ddPCR nyligen dykt upp som ett kraftfullt verktyg som ger absolut kvantifiering av nukleinsyror i FFPE och biopsiprov och kan även dubbelsidigt med referens analyser för bestämning av antingen ingenrmalized avskrift koncentrationer eller DNA-kopia nummer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Myung Ryuri Åh, Si Eun Kim, och Young Deug Kim är anställda i ABION CRO.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av FoU-program för samhället av National Research Foundation (NRF), som finansieras av ministeriet för vetenskap, IT & Framtid Planning (Grant nr 2013M3C8A1075908).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hamilton MICROLAB STARlet IVD instrument | Siemens | 10701001 | Automated DNA isolation instrument |
| QX200 Droplet Generator | Bio-Rad | 772BR1119 | |
| QX200 Droplet Reader | Bio-Rad | 771BR1497 | |
| Conventional PCR machine capable of ramp-time adjustment | 621BR17718 | ||
| PX1 PCR plate sealer | Bio-Rad | 770BR1575 | |
| QuantaSoft software | Bio-Rad | ||
| DNA isolation kit | |||
| VERSANT Tissue Preparation Reagents Box 1 | Siemens | 10632398 | |
| VERSANT Tissue Preparation Reagents Box 1 | Siemens | 10632399 | |
| CO-RE tips | Siemens | ||
| ddPCR mutation analysis | |||
| ddPCR Supermix | Bio-Rad | BR186-3010 | 2X concentration |
| DG8 cartridge | Bio-Rad | BR186-4008 | |
| Droplet Generator oil | Bio-Rad | BR-186-3005 | |
| Gasket | Bio-Rad | BR186-3006 | |
| Droplet reader oil | Bio-Rad | BR-186-3004 |
References
- Vogelstein, B., et al. Genetic alterations during colorectal-tumor development. The New England journal of medicine. 319, 525-532 (1988).
- Davies, H., et al. Mutations of the BRAF gene in human cancer. Nature. 417, 949-954 (2002).
- Solit, D. B., et al. BRAF mutation predicts sensitivity to MEK inhibition. Nature. 439, 358-362 (2006).
- Wong, K. K. Recent developments in anti-cancer agents targeting the Ras/Raf/ MEK/ERK pathway. Recent patents on anti-cancer drug discovery. 4, 28-35 (2009).
- Brose, M. S., et al. BRAF and RAS mutations in human lung cancer and melanoma. Cancer research. 62, 6997-7000 (2002).
- Wang, L., et al. BRAF mutations in colon cancer are not likely attributable to defective DNA mismatch repair. Cancer research. 63, 5209-5212 (2003).
- Hindson, B. J., et al. High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number. Anal Chem. 83, 8604-8610 (1021).
- Pinheiro, L. B., et al. Evaluation of a Droplet Digital Polymerase Chain Reaction Format for DNA Copy Number Quantification. Anal Chem. 84, 1003-1011 (1021).
- Jones, M., et al. Low copy target detection by Droplet Digital PCR through application of a novel open access bioinformatic pipeline, 'definetherain'. Journal of virological methods. 202, 46-53 (2014).
- Strain, M. C., et al. Highly precise measurement of HIV DNA by droplet digital PCR. PloS one. 8, e55943 (2013).
- Miotke, L., Lau, B. T., Rumma, R. T., Ji, H. P. High sensitivity detection and quantitation of DNA copy number and single nucleotide variants with single color droplet digital PCR. Anal Chem. 86, 2618-2624 (2014).
- Bizouarn, F. Clinical applications using digital PCR. Methods in molecular biology. 1160, 189-214 (2014).
- McDermott, G. P., et al. Multiplexed target detection using DNA-binding dye chemistry in droplet digital PCR. Anal Chem. 85, 11619-11627 (2013).
- Milbury, C. A., et al. Determining lower limits of detection of digital PCR assays for cancer-related gene mutations. Biomolecular detection and quantification. 1, 8-22 (2014).
- Zhu, G., et al. Highly Sensitive Droplet Digital PCR Method for Detection of EGFR Activating Mutations in Plasma Cell-Free DNA from Patients with Advanced Non-Small Cell Lung Cancer. The Journal of molecular diagnostics: JMD. , (2015).
- Fan, H., Gulley, M. L. DNA extraction from paraffin-embedded tissues. Methods in molecular medicine. 49, 1-4 (2001).
- Nadauld, L., et al. Quantitative and Sensitive Detection of Cancer Genome Amplifications from Formalin Fixed Paraffin Embedded Tumors with Droplet Digital PCR. Translational medicine. 2, (2012).
