Summary
该视频的目标是展示如何执行从福尔马林固定的石蜡包埋（FFPE）的参考标准细胞系和数字液滴的PCR（ddPCR）分析的自动化DNA提取，以检测稀有突变在临床环境中。 FFPE样品中检测突变表明ddPCR的FFPE样品中的临床应用。
Introduction
基因突变的关键调控基因的累积改变正常细胞的编程细胞样细胞的增殖，分化和存活，从而导致癌症1。在RAS-RAF-MAP激酶途径介导细胞对生长信号。致癌性的BRAF突变可以导致从驱动器中的突变的BRAF基因，这可能会导致BRAF癌蛋白成为过度活跃2。在BRAF基因的突变也导致通过MEK和ERK 3，这反过来，导致的生长因子介导的调控4-6过度细胞生长和增殖独立地过度活跃的下游信号。
有几个工具可以进行DNA突变分析，例如定量实时BRAF V600E突变的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）参考标准细胞株ddPCR。 ddPCR是一种基于PCR的方法，绝对定量相对于传统的定量实时PCR（qPCR的）7,8-提供更高的精度。 ddPCR还提供了更高的分辨率和精度的DNA模板稀有突变的检测，使更多的信息癌症研究和诊断的9。 ddPCR比传统的qPCR的其它优点包括其增强的灵敏度和准确度研究低模板拷贝数10-12时。这里，一个协议，用于自动提取的FFPE参考标准细胞系，接着通过确定BRAF V600E突变由ddPCR存在或不存在的DNA是证明。的软件进行数据分析，分析结果的图形表示的使用也有所说明。整个过程是相对简单且完全取决于样品进行概要的数量和常规PCR和ddPCR机器可用的数量。
以下方案描述的标准程序的BR AF V600E阳性FFPE参考标准细胞系（HD598，HD593，HD617，HD273和野生型（WT））是在一个完全自动化的仪器使用组织制备系统（TPS）协议执行的。随后，分离的DNA样品用于使用ddPCR系统BRAF V600E突变的存在进行分析。进行有针对性的突变分析所有样品已异形之后和数据被加载到数据分析软件。取决于样本的数目/组研究，数据分析，可能需要从一至数小时。该方法的实验部分要求的精度在处理的DNA和rological移液器和移液器，一朱庇特科学教育视频解释有关移液的上下文中了解更多“>移液到96孔板中，数据分析是用软件来执行时。
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Protocol
1. DNA提取FFPE参考标准细胞系
注意：对于这个过程，DNA提取自FFPE参考标准细胞系（HD598，HD593，HD617，HD273和野生型（WT））使用FFPE组织DNA分离试剂盒，如以下方案中所述进行。自动DNA提取按照制造商的总DNA分离指令来实现的。
- 使用切片机和原始FFPE块，前手工DNA提取和分析准备新鲜的部分，按照既定的程序。确保，所述组织部分（多个）样本的输入分析的不超过10微米的组合总厚度和表面面积不超过600毫米2为一个节。
1.2 TPS协议
注意：在表1所示的量对应处理48个样品所需要的最低限度，并且过程示出的是按照在TPS准则。在实验开始之前沉淀下来的电子管FFPE样品离心600 XG，以避免自动程序过程中样品的损失。
- 打开自动DNA分离仪和计算机。打开运行控制软件并插入自动加载托盘到TPS甲板装卸区。
- 分配的试剂成其相应的槽，如图1。
- 放置4个样品（BRAF WT，BRAF V600E 50％，5％和1％）的样品载体机架。
- 将吸头盒在第2和第3的槽，并检查提示每尖端多个过滤器的存在，这将中止运行。
- 确保裂解缓冲液和洗涤缓冲液的适当的混合通过反转他们3-5倍并将它们加载到在塔4（图1）的各个槽。
- 反转的几十倍或轻度vort后exing，加载洗脱缓冲液，磁珠，并在中柱5的小槽的FFPE缓冲器，留下1个时隙空指示的位置（图1， 表1）。
- 加载2ml的深孔板（DWP）到板载体（ 图1）。
- 执行以下最后步骤开始运行之前：
- 摘帽所有试管和试剂的低谷。确认足够的容量可在废液瓶。确认固体废弃物酒瓶是空的，内衬生物危害袋。确认该尖端排出板集中在废组件。
- 关闭前盖。
- 启动软件。打开NA_Prep_Main_MLSTARlet.med文件。
- 点击“开始”。仪器状态将从空闲切换到运行。
- 输入样本的数目为此运行。选择适合该运行（DNA = 0）所需的方法。输入第一个大体积的位置UME提示，选择“1”，如果所有的盘都满了。进入第一标准体积尖端的位置，选择“1”，如果所有托盘已满。
注：然后，仪器将通过自动化的步骤运行，而无需用户干预。详细的工作流程示于图2，一旦实验结束时，试剂的浪费和尖端注入废物组件。 - 通过使用荧光法定量纯化的基因组DNA。
注意：含有3.3毫微克/微升的最小浓度的DNA样品进行ddPCR分析（第2部分）。
2. DNA突变剖析：ddPCR协议
注意：该协议用于DNA突变谱由三个主要步骤：1）液滴代，2）常规PCR扩增，3）液滴阅读和4）的DNA的突变谱。
2.1。液滴产生
注：ddPCR SuperMix混合是推荐ddPCR，因为这个组合中包含所需的墨滴产生试剂。
- 为了避免污染，遵循标准预防措施，如戴手套，用干净的PCR罩，洁净移液管，低蛋白结合管。
- 确保人类基因组DNA样本的最小浓度为3.3纳克/微升。注意：纯化的DNA试样的浓度的量将基于％突变频率检测的分析而变化。
- 装配在96孔PCR板的反应混合物。解冻并平衡反应组分至RT。通过结合2X ddPCR SuperMix混合（10微升）和20引物（正向和反向，900纳米）和探头（250纳米）与每个纯化DNA样品（66ng / 2微升）使达到20微升蒸馏水制备PCR反应（如每个液滴发生器协议）
- 彻底涡混合以确保均匀和短暂离心分配之前收集在试管底部的内容。装载20＃181，L到墨盒液滴形成。
- 操作液滴发生器，根据制造商的推荐方案
- 将墨盒插入与定位在保持器的上部左侧的盒凹口的保持器。加入20微升的反应混合物含有样品到中间的，和70微升发生器油进入底部的孔中。
- 附上垫片横跨卡盒的顶部。确保垫圈是在支架的两端牢固地钩住;否则，足够的压力为产生液滴将无法实现。
- 按仪器顶部的绿色按钮，打开液滴生成，然后插入。当支架是在正确的位置，这两个电源（左右）和保持器（中间右）指示灯是绿色的。
- 按下顶部的按钮，仪器再次关闭大门，并开始产生液滴。注：按b后utton，歧管自身定位在出口井，通过微流体通道，其中创建液滴拉伸油和样品。水滴流入滴好，在那里积累。液滴指示灯（右）绿色闪烁10秒后，表示液滴产生正在进行中。
- 当液滴生成完成后，所有的3个指示灯变为绿色常亮;通过按下按钮打开车门，并从单位取出固定器。从支架上取下一次性垫圈并丢弃。注意：暗盒的顶端孔中含有液滴，中，下孔几乎空的，用少量的残余油。
2.2。为PCR准备
- 对于每个样品，吸管出40微升从顶部以及墨盒液滴内容插入到推荐的96孔PCR平板的单个以及在制造商的仪器协议指示。否德：使用多通道移液器是理想的转印液滴乳液。水滴缓慢而温和的愿望，建议尽量减少在传输过程中液滴剪切。
- 转移滴，以避免蒸发后，立即密封PCR板带箔。使用可刺穿箔片密封件是与PCR板密封件并在液滴读者针兼容。按照在PCR板封口机使用说明书中的说明。
- 设置板密封温度180℃，时间为5秒。
- 轻触箭头，打开纸盒门。放置支撑块的96孔的一面朝上放在托盘上。将96孔板在载体块，并确保所有板孔与支撑块对齐。
- 用1片材的可刺穿箔密封覆盖96孔板。一旦96孔板被固定在支撑块上，并覆盖上可刺穿箔密封，触摸密封按钮。托盘将关闭和热封将启动。
- 当热密封完成后，门自动打开;从热循环加热块取出盘子，然后取出加热块。
- 确保所有的井板通过检查，在箔洼地超过每显而易见密封良好。密封后，该板块已准备好热循环。
- 一旦液滴被除去，压在盒保持器的闩锁以将其打开。取出空墨盒并将其丢弃。
- 通过以下在表2中详述的参数执行常规PCR扩增。
2.3微滴读数（根据制造商建议的协议）
注意：继核酸靶的液滴中PCR扩增，液滴读者仪器分析单独使用2色检测系统 13的每个微滴。我们通常设置为检测FAM的ðVIC记者荧光。
- 点击“刷新系统”素滴阅读器，并使其准备ddPCR分析。
- 板装入液滴阅读器，然后单击“开始”。液滴读者吸取每一个样品，singulates的液滴和液流他们鱼贯过去双色探测器。检测器读出的液滴来枚举阳性和阴性样品。
- 当液滴阅读完毕后，打开车门，从装置中取出板固定器。从支架中取出96孔PCR板和丢弃它。
- 对于适当的保养，更换滴读者油，并根据需要清空废物容器。加入50毫升10％的漂白剂到废液瓶，以防止微生物的生长。
2.4 DNA的突变分析（按制造商建议的协议）
注意：PCR-阳性和PCR阴性液滴计数，以提供绝对的quantific通货膨胀目标BRAF V600E突变的DNA以数字形式，利用数据分析软件。
- 单击设置输入有关样品，实验，和实验信息。
- 在设置窗口中，加载板（filename.qlp），然后单击分析以打开和分析数据。数据分析接口被分成三个窗口：结果表，那么选择器选择和处理数据/图形显示。
- 在经处理的数据的窗口，对每一个目标浓度数据出现在孔中板图和表列中的结果表。点击集中可视化的浓度曲线的数据。
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Representative Results
对于我们的ddPCR分析中，我们研究了BRAF V600E突变FFPE参考标准的细胞系。液滴阅读器连接到笔记本电脑上运行的数据分析软件。每个单独的微滴荧光幅度来作为阳性或阴性上定义。由制造商提供的软件还允许输入用户定义的截止定义的正和负的液滴之间的阈值。样品中的正和负液滴的数量用于计算在拷贝/微升术语靶的浓度。
荧光检测和加工成二维散点图显示，定制软件被用来绘制适当闸门的每个液滴端点集群，并且每个栅内的液滴的数目进行计数。 如图3A所示，液滴由蓝点（FAM荧光信号）上面的明暗截止线的所有SAMPL表示ES（粉红色线）为阳性突变BRAF V600E。由蓝点的BRAF WT表示液滴（NTC;泳道2）样品可能是由于非特异性信号（假阳性）。假阳性信号（BRAF WT）正常化与其他突变样本。 如图3B所示，WT BRAF液滴由绿色的点（VIC荧光信号）来表示。在两个图中，灰点在底部被认为是荧光背景。 使用图3C所示的数据计算总突变等位基因频率，根据WT BRAF基因和检测出的相对百分比的BRAF V600E模板。所得ddPCR结果包含液滴事件计数和计算野生型和突变体DNA分子进行计数的BRAF V600E（50％，10％，5％，1％，0.5％，0.1％和0.05％），通过使用以下计算样本上述公式。
％突变频率=的（突变体复制/（野生型+突变复印件））×100
因此，BRAF V600E突变进行鉴定，并与参考标准（BRAF WT）验证。的50％，10％，5％，1％，0.5％，0.1％和0.05％的定义BRAF V600E突变等位基因频率被用来测试所述ddPCR系统的灵敏度和重现性。从我们的分析与已知的样品浓度，我们证实，ddPCR能够检测低至0.05％的BRAF V600E突变。在NTC或WT假阳性突变计数检测有可能会是由于非特异性探针水解为早些时候报道14。检测样品中两个以上拷贝已被认为是在肿瘤组织中15阳性。
图1.示意图描述，准备引渡试剂和样品装载 omated DNA提取仪。将样品在一个载运架和分配所述试剂成相应的槽如上述。采用自动化TPS协议，支持多种类型的样品，提供准确，并以最大的生产力可靠的结果。重新印有来自西门子医疗诊断的权限。 （礼貌西门子医疗诊断的）。
该组织准备系统的工作流程自动化的DNA提取图2.示意图。全自动DNA的提取过程FFPE组织中部分，包括负面的选择步骤石蜡，组织碎片清除和积极的选择步骤结合和洗脱显示。 重新印有来自西门子医疗诊断的权限。 （礼貌西门子医疗诊断的）。
图3.使用ddPCR体系，为BRAF V600E的精确量化 变异FFPE参考标准细胞系样本中 ，在一维地块正荧光幅度（A，B），可视化（1点-1droplet）。蓝点（A，FAM正）表示突变BRAF V600E阳性滴，而绿点（B，维多利亚州正）表示WT BRAF阳性液滴。这个决定使得在FFPE参考标准细胞系基因突变的精确量化。粉色线是微滴的正和负信号之间的鉴别阈值（℃）的丰度分数曲线显示蓝色标记，用于指示在浓度BRAF V600E突变（拷贝/微升），并绿色的标记表示浓度BRAF（WT）的（拷贝/微升）。通过数据分析软件中产生的所有误差棒代表95％的置信区间。
| 试剂 | 体积（ml） |
| 裂解液 | 106毫升 |
| 洗涤液1 | 101毫升 |
| 洗涤液2 | 72毫升 |
| 洗涤液3 | 106毫升 |
| 洗脱缓冲液 | 19毫升 |
| 磁珠 | 8毫升 |
| FFPE缓冲区 | 15毫升 |
| 蛋白酶K | 3.3毫升 |
试剂表1.总成交量（TPS套件）与48个样品需要进行DNA提取。
| 体温 | 时刻 | ＃周期 | |
| 酶激活 | 95℃ | 10分钟 | 1 |
| 变性 | 94℃ | 30秒 | 40 |
| 退火/延伸 | 60℃ | 1分钟* | |
| 抱 | 98℃ | 10分钟 | 1 |
| 抱 | 4℃ | 永世 | 1 |
| *调整斜坡率设置以2-2.5℃/秒。使用加热盖设置到105℃，并设置样品体积到40微升 | |||
表2.常规PCR热循环条件
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Discussion
这里，我们强调ddPCR的适用性和DNA分离自FFPE参考标准细胞系样品的特定基因突变的评估。在这项研究中，TPS自动化DNA分离方法用于其可以容易地适应，自动化，并能容纳多达48个不同的样品同时，允许较大规模的实验和较低的变异性。之一，在目前的工作中的DNA分离的局限性是，每FFPE样品是唯一的，并且将变化彼此在表面的污染物，微生物菌群，和/或人的遗传背景。在一般情况下，提取的DNA的质量和数量和整个基因组DNA扩增的成功取决于各种参数之前，期间和之后萃取。这些包括，类型和组织的金额，固定剂用于组织保存类型，固定持续时间，的石蜡块和储存条件年龄，以及所需DNA片段的长度要分析<SUP> 16。从组织切除石蜡是成功提取了最关键的一步，因为不溶解的石蜡导致样品的质量较差。在产生液滴，必须小心，以防止气泡的形成 - 这是成功突变检测的另一关键步骤。考虑到样品样品样品群之间和可能产生基于所述实验的动机的变异，可能需要在该过程的某些修改，以获得所需的结果。
另一个优点是，DNA的分离和ddPCR使用自动化系统，可在这个协议中进行的，并因此存在需要可忽略的错误和用户干预是很小的。隔离石蜡包埋的组织/细胞中的全基因组扩增的DNA是通过使用TPS系统获得的。一种在使用自动化DNA分离系统的缺点之一是，它是不符合成本有效的是使用少量的样品。相反，这种自动化科技教育也可为有限的样品进行磷，其它标准的DNA分离方法
最近的研究指出，使用液滴数字PCR（ddPCR）能够确定即使在从FFPE组织获得的混合体正常组织的存在的特定基因组位点的相对拷贝数。通过使用控制稀释系列，Nadauld，L。等。确定检测限（LOD）对于ddPCR测定和报告其对DNA的最小量的改进的灵敏度比标准的实时PCR 17。这里，FFPE参考标准细胞系用于证明ddPCR系统的突变检测能力。该ddPCR系统结果表明可能检测罕见变异等位基因的频率下降到0.05％的突变。总的来说，这些数据表明，ddPCR系统也允许在不同的突变等位基因和杂合临床肿瘤样品的相对差异的百分比的定量分析秒。大量FFPE样品的可用于特定基因突变的同时分析，这是人口宽遗传学研究的最佳技术。
最后，应该考虑到的突变频率都在这里表示为绝对定量，而不应被视为突变率或频率相对值。 ddPCR读数提供了靶DNA突变的绝对定量。这些值可用于验证在相同条件下制备的样品的突变频率，并测序过的相同区域。然而，这些绝对值重复性好，可用于突变的分布和频率的定量比较时最佳参数被控制。总之，ddPCR最近成为一个有效的工具，提供了核酸绝对定量FFPE和活检样品中，也可以进行双面打印的参考测定法测定的任一无rmalized成绩单浓度或DNA拷贝数。
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Disclosures
明Ryuri哦，思恩金，和年轻的DEUG金是ABION CRO的员工。
Acknowledgments
这项研究是由研发项目为国家研究基金会协会（NRF），通过科学，信息和通信技术及未来规划（批准号：2013M3C8A1075908）部资助支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hamilton MICROLAB STARlet IVD instrument | Siemens | 10701001 | Automated DNA isolation instrument |
| QX200 Droplet Generator | Bio-Rad | 772BR1119 | |
| QX200 Droplet Reader | Bio-Rad | 771BR1497 | |
| Conventional PCR machine capable of ramp-time adjustment | 621BR17718 | ||
| PX1 PCR plate sealer | Bio-Rad | 770BR1575 | |
| QuantaSoft software | Bio-Rad | ||
| DNA isolation kit | |||
| VERSANT Tissue Preparation Reagents Box 1 | Siemens | 10632398 | |
| VERSANT Tissue Preparation Reagents Box 1 | Siemens | 10632399 | |
| CO-RE tips | Siemens | ||
| ddPCR mutation analysis | |||
| ddPCR Supermix | Bio-Rad | BR186-3010 | 2X concentration |
| DG8 cartridge | Bio-Rad | BR186-4008 | |
| Droplet Generator oil | Bio-Rad | BR-186-3005 | |
| Gasket | Bio-Rad | BR186-3006 | |
| Droplet reader oil | Bio-Rad | BR-186-3004 |
References
- Vogelstein, B., et al. Genetic alterations during colorectal-tumor development. The New England journal of medicine. 319, 525-532 (1988).
- Davies, H., et al. Mutations of the BRAF gene in human cancer. Nature. 417, 949-954 (2002).
- Solit, D. B., et al. BRAF mutation predicts sensitivity to MEK inhibition. Nature. 439, 358-362 (2006).
- Wong, K. K. Recent developments in anti-cancer agents targeting the Ras/Raf/ MEK/ERK pathway. Recent patents on anti-cancer drug discovery. 4, 28-35 (2009).
- Brose, M. S., et al. BRAF and RAS mutations in human lung cancer and melanoma. Cancer research. 62, 6997-7000 (2002).
- Wang, L., et al. BRAF mutations in colon cancer are not likely attributable to defective DNA mismatch repair. Cancer research. 63, 5209-5212 (2003).
- Hindson, B. J., et al. High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number. Anal Chem. 83, 8604-8610 (1021).
- Pinheiro, L. B., et al. Evaluation of a Droplet Digital Polymerase Chain Reaction Format for DNA Copy Number Quantification. Anal Chem. 84, 1003-1011 (1021).
- Jones, M., et al. Low copy target detection by Droplet Digital PCR through application of a novel open access bioinformatic pipeline, 'definetherain'. Journal of virological methods. 202, 46-53 (2014).
- Strain, M. C., et al. Highly precise measurement of HIV DNA by droplet digital PCR. PloS one. 8, e55943 (2013).
- Miotke, L., Lau, B. T., Rumma, R. T., Ji, H. P. High sensitivity detection and quantitation of DNA copy number and single nucleotide variants with single color droplet digital PCR. Anal Chem. 86, 2618-2624 (2014).
- Bizouarn, F. Clinical applications using digital PCR. Methods in molecular biology. 1160, 189-214 (2014).
- McDermott, G. P., et al. Multiplexed target detection using DNA-binding dye chemistry in droplet digital PCR. Anal Chem. 85, 11619-11627 (2013).
- Milbury, C. A., et al. Determining lower limits of detection of digital PCR assays for cancer-related gene mutations. Biomolecular detection and quantification. 1, 8-22 (2014).
- Zhu, G., et al. Highly Sensitive Droplet Digital PCR Method for Detection of EGFR Activating Mutations in Plasma Cell-Free DNA from Patients with Advanced Non-Small Cell Lung Cancer. The Journal of molecular diagnostics: JMD. , (2015).
- Fan, H., Gulley, M. L. DNA extraction from paraffin-embedded tissues. Methods in molecular medicine. 49, 1-4 (2001).
- Nadauld, L., et al. Quantitative and Sensitive Detection of Cancer Genome Amplifications from Formalin Fixed Paraffin Embedded Tumors with Droplet Digital PCR. Translational medicine. 2, (2012).
