Protocol
1. טיהור של GTPase מתויג GST
- תרבות E. זן coli כגון BL21 הפך עם pGEX-Rac1 O / N ב 37 מעלות צלזיוס, רועד ב 220 סל"ד, 500 מיליליטר של תקשורת autoinduction (25 מ"מ Na 2 HPO 4, 25 מ"מ KH 2 PO 4, 50 מ"מ NH 4 Cl, 5 מ"מ Na 2 SO 4, 2 מ"מ MgSO 4, 2 מ"מ CaCl 2, 0.5% גליצרול, גלוקוז 0.05%, 0.2% לקטוז, 5 גרם Tryptone, תמצית שמרים 2.5 גרם, 100 מיקרוגרם / מיליליטר אמפיצילין).
- חיידקי קציר על ידי צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 10,000 XG, 4 מעלות צלזיוס.
- Resuspend גלולה חיידקים במגיבים מיצוי חלבון 20 מיליליטר, מעכבי פרוטאז 1x ודגירה של 20 דקות ב RT עם היפוך.
- להבהיר את lysate ידי צנטריפוגה ב40,000 XG למשך 30 דקות.
- להוסיף חרוזים מגנטיים 2 מיליליטר גלוטתיון, לשטוף עם פוספט שנאגרו המלוח (PBS: 10 מ"מ Na 2 HPO 4, 1.8 מ"מ KH 2 PO 4, 137 מ"מ NaCl, 2.7 מ"מ KCl).
- דגירה עבור שעה 2, ערבוב על ידי היפוך על 4 מעלות צלזיוס.
- לשטוף חרוזים טעונים חלבון ארבע פעמים עם 10 מיליליטר PBS, באמצעות סדרן חלקיקים מגנטי כדי לזרז את החרוזים בכל שלב.
- Resuspend חלבון טעון חרוזים ב 2 מיליליטר PBS ולאחסן ב -80 ° C ב 100 aliquots μl עד צורך.
2. ביטוי של חלבונים מחייב GTPase
- היום לפני הניסוי, פלסמידים transfect קידוד חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) -tagged גרסאות של כל חלבון קושר GTPase ל- 75 סנטימטר 2 בקבוק נפרד של HEK293T כדלקמן. לאימות של טעינת נוקלאוטיד, מתויג GFP transfect TrioD1 ל- 75 סנטימטר 2 בקבוק שלישי של HEK293T.
- לדלל polyethylamine עד 1 מ"ג / מיליליטר ב 100 μl סטרילי 150 מ"מ NaCl.
- להוסיף polyethylamine המדולל 27 μl 223 μl מופחת תקשורת בסרום.
- להוסיף פלסמיד דנ"א מיקרוגרם 12 עד 250 μl מופחת תקשורת בסרום.
- דגירה צינור אחד עבור 2 דקות ב RT. מערבבים את polyethylamine וDNA מתערבב בצינור יחיד ומערבולת למשך 2 דקות.
- דגירה של 15-20 דקות ב RT.
- החלף את המדיה הצמיחה (נשר מדיה השתנה Dulbecco, 10% בסרום שור עוברי, L-גלוטמין 2 מ"מ, ללא אנטיביוטיקה) על 90% HEK293T מחוברות עם 5 מיליליטר תקשורת צמיחה טרי.
- מוסיף את תערובת polyethylamine / DNA המשולב לבקבוק ודגירת O / N ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
3. טיהור של חלבונים מחייב GTPase
- יש לשטוף את צלוחיות של תאי transfected בPBS ולנקז בקבוק במשך 5 דקות, aspirating נוזל חופשי.
- לגרד את תאים ב500 חיץ תמוגה μl (50 מ"מ טריס-HCl (pH7.8), 1% Nonidet P-40, 1x מעכבי פרוטאז) לצינור microfuge.
- תאי Lyse על ידי ערבוב על ידי היפוך על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
- במהלך תמוגה, לשטוף שני המון חרוזים GFP-מלכודת 40 μl שלוש פעמים עם חיץ תמוגה טרי, חרוזים סדימנטציה ב2,700 XG למשך 2 דקות בין שוטף.
- להבהיר lysates על ידי צנטריפוגה ב21,000 XG במשך 10 דקות.
- העברה הבהירה lysate של כל אחד מחלבוני המתחרה להפריד חרוזים GFP-מלכודת שטפו ולאפשר חלבוני GFP-היתוך להיקשר לשעה 2, ערבוב על ידי היפוך על 4 מעלות צלזיוס. שמור lysate מתאי ה- GFP-TrioD1 על קרח.
- לשטוף חרוזים GFP-מלכודת נטענים פעמיים ב 50 מ"מ טריס-HCl (pH 7.8), 50 מ"מ NaCl, 0.7% (w / v) Nonidet P-40 ופעמים ב 50 מ"מ טריס-HCl (pH 7.6), 20 מ"מ MgCl 2 , סדימנטציה חרוזים ב2,700 XG למשך 2 דקות בין שוטף.
- Elute חלבוני GFP-היתוך על ידי הוספת 40 μl 0.2 M גליצין (pH 2.5) וpipetting למעלה ולמטה במשך 30 שניות. מייד חרוזים משקעים ב21,000 XG במשך 60 של ונוזל להעביר צינור microfuge חדש המכיל 4 μl 1 M טריס- HCl (pH 10.4). לעשות את זה מהר כדי לצמצם את הפגיעה בחלבון המטוהר.
- לנתח 1 μl של כל חלבון מטוהר על ידי כתם מערבי ובדיקה עם נוגדן אנטי GFP להקים תשואה היחסית באמצעות blott כמותייםing מערכת על פי הפרוטוקול של היצרן. לחלופין, לקבוע ריכוזי חלבון על ידי חומצת assay bicinchoninic (BCA), אבל זה מציג שגיאות אם החלבונים לא מגיבים עם assay באופן זהה או יש חלבונים מזהמים.
- להשוות ריכוז חלבון טוחנת על ידי התוספת של 50 מ"מ טריס-HCl (pH 7.6), 20 מ"מ MgCl 2.
4. טעינת נוקלאוטיד של GTPase
- להפשיר aliquot אחד חרוזים מגנטיים GST-Rac1, מוכנים בשלב 1.
- קח 90 μl של חרוזים GST-Rac1 ולשטוף שלוש פעמים עם 20 מ"מ טריס- HCl (pH 7.6), 25 מ"מ NaCl, 0.1 מ"מ DTT, 4 מ"מ EDTA, באמצעות סדרן חלקיקים מגנטי כדי לזרז את החרוזים בכל שלב.
- מאגר לשאוב מחרוזים ולהוסיף 100 μl 20 מ"מ טריס- HCl (pH 7.6), 25 מ"מ NaCl, 0.1 מ"מ DTT, 4 מ"מ EDTA.
- לדברי האם התמ"ג, GTP או לא טעינת נוקלאוטיד נדרש לניסוי התחרות, להוסיף 12 μl 100 מ"מ תמ"ג, μl 12 10 מ"מ ג.א.anosine 5 '- [γ-thio] אדנוזין (GTPγS) או לא נוקלאוטיד לחרוזי GST-Rac1 60 μl.
- לבקרות נוקלאוטיד-הטעינה, לפצל את חרוזים שנותרו לשלושה aliquots 10-μl ולהוסיף 2 μl 100 מ"מ תמ"ג, 2 μl 10 מ"מ GTPγS או לא נוקלאוטיד על צינור אחד.
- דגירה תערובות חרוז למשך 30 דקות ב 30 מעלות צלזיוס עם תסיסה.
- לייצב Rac1 מאוגד נוקלאוטיד על ידי תוספת של 1 M MgCl 2: 3 μl לתערובת הניסיונית (שלב 4.4), 0.5 μl לכל אחד מתערובות השליטה (שלב 4.5).
5. תחרות המחייבת.
- הגדרה 6 צינורות microfuge, המכיל:
200 μl 50 מ"מ טריס-HCl (pH 7.6), 20 מ"מ MgCl 2
חרוזים 10 μl ניסיוניים טעון נוקלאוטיד Rac1 (משלב 4.7)
חלבון 5 μl Rac1 מחייב (חלבון מחייב קבוע) - על צינור אחד, להוסיף חלבון B 0, 1, 2.5, 5, 10 או 20 μl מחייב Rac1 (חלבון מחייב משתנה). כרכים אלה מניחיםpproximately ריכוזי המניה שווים של חלבונים המחייבים קבועים ומשתנים וייתכן שיצטרכו להיות מותאמים.
- התאם כרכים של חלבונים מחייבים A ו- B אם יש הבדלים גדולים בזיקות המחייבות של שני חלבונים ואת זה צריך להיקבע באופן אמפירי באמצעות החזרות הניסיוניות. מרכיבים את הנפח הכולל של התערובת מחייב 235 μl על ידי תוספת של 50 מ"מ טריס-HCl (pH 7.6), 20 מ"מ MgCl 2.
- הגדר את צינור microfuge המכיל:
200 μl 50 מ"מ טריס-HCl (pH 7.6), 20 מ"מ MgCl 2
חרוזים 10 μl ניסיוניים טעון נוקלאוטיד Rac1 (משלב 4.7)
חלבון 10 μl Rac1 מחייב (חלבון מחייב קבוע) - הגדרת התמ"ג, GTPγS ולא צינורות שליטת נוקלאוטיד:
200 μl 50 מ"מ טריס-HCl (pH 7.6), 20 מ"מ MgCl 2
10 חרוזים Rac1 שליטת μl נטענים בשלב 4.5 עם תוצר, GTPγS או לא נוקלאוטיד והתייצבו בשלב 4.7.
180 μl Hlysate EK293T GFP-TrioD1, מוכן כמו בשלב 3.6
4 μl 1 M MgCl 2 - דגירה את התערובת לשעה 2, ערבוב על ידי היפוך על 4 מעלות צלזיוס.
- שטוף את החרוזים שלוש פעמים עם 50 מ"מ טריס-HCl (pH 7.6), 20 מ"מ MgCl 2.
- Elute מחויב חלבונים בμl 20 הפחתת חיץ מדגם (50 מ"מ טריס-HCl (pH 7), 5% SDS, גליצרול 20%, 0.02 מ"ג / מיליליטר bromophenol, 5% β-mercaptoethanol הכחול).
6. ניתוח של תחרות
- לפתור 10 μl של החלבון הקשור (שלב 5.6) על ידי ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide סולפט dodecyl נתרן (SDS-PAGE) וכתם מערבי.
- דגירה הקרום על 4 מעלות CO / N מדולל 1/1000 בנוגדן אנטי-GFP בחסימת המאגר מדולל ל1x PBS, 0.1% Tween-20 לזהות שניהם מחייב חלבוני GTPase מתויגים.
- לשטוף את הממברנה שלוש פעמים במשך 10 דקות עם PBS, 0.1% Tween-20.
- דגירה הממברנה במשך 30 דקות ב RT בDyLight שניות נגד ארנב 800 מצומדות-נוגדן ondary, בדילול מלא 1 / 10,000 בחסימת המאגר מדולל ל1x PBS, Tween-20 0.1%.
- לשטוף את הממברנה שלוש פעמים במשך 10 דקות עם PBS, 0.1% Tween-20.
- סרוק את הקרום באמצעות מערכת הדמיה אינפרא אדום, שימוש בתוכנה למדידת עוצמת להקה על פי הפרוטוקול של היצרן.
- עלילה עוצמת הלהקה של כל חלבון נגד נפח של המתחרה משתנה (חלבון B).
- מחלקים את הנפח של מתחרה משתנה בנקודה שבה הקווים מצטלבים בנפח של מתחרה קבועה (חלבון, 5 μl) כדי לקבוע את יחס המתחרה שבשיווי המשקל מושגת.
- לאימות מעמד נוקלאוטיד-טעינה, קרומי בדיקה לקינאז מופעל p21 1 (PAK1) (מפעיל) וה- GFP-TrioD1 (GEF), כמתואר בצעדים 6.1-6.6.
Representative Results
פרוטוקול זה נועד לחשב את הזיקות היחסית של שותפים מחייבים Rac1, ללא הצורך לדעת את הריכוז המדויק של המתחרים (איור 1). קביעת ריכוז חלבון מציגה שגיאות וכאשר בוחנת את תחרות בין מולקולות במסלול איתות אינו נחוצה. עם זאת, חשוב לדעת כי יש שני מתחרים באותו ריכוז טוחנת בפתרונות המניות כדי לאפשר יחסים פשוטים שיחושבו בעת הוספת נפחים שונים לassay. יש לי 40 μl של חרוזים GFP-מלכודת יכולת מחייבת של ~ 300 pmol כך מחוברות 75 סנטימטר 2 צלוחיות של מאוד לבטא בתאים יהיה להרוות את חרוזים, והתוצאה הוא שההכנות של שני חלבונים מחייבים השונים תהיה דומות לפני ההתאמה (איור 2 א). אם אחד מהחלבונים מבטא בצורה גרועה, בעיה זו ניתן להתגבר על ידי טיהור חלבון שמן בקבוק אחד או יותר של תאים.
ss = "jove_content"> המחייב של רוב effectors GTPase ורגולטורים תלוי בנוקלאוטיד-הטעינה של GTPase הפיתיון, ולכן חשוב לבדוק אם הטעינה הייתה מוצלחת. טעינה יכולה להיות מאומת על ידי מזרז חלבונים מחייבים ידועים מlysates התא. חלבוני מפעיל, כגון לאגד PAK1 לGTP-Rac1 וניתן זירז בקלות מlysates וזוהו על ידי מערבי סופג 8 (איור 2). GEFs להיקשר מעדיף לנוקלאוטיד ללא GTPase לייצב את מצב המעבר. כGEFs הוא של שפע נמוך, בדרך כלל לא פעיל ולעתים קרובות למחוק גרוע, עדיף לביטוי יתר GEF או בר GEF לGTPase ללא נוקלאוטיד מבחן. אנו משתמשים לעתים קרובות ההומולוגיה, הזוגית הראשונה של שלישייה, הביע כהיתוך GFP (GFP-TrioD1 9) (איור 2), אך כל GEF יעבוד. חלבונים שנקשרים לGTPase טעון התמ"ג הם נדירים יותר. לאחרונה דיווחו RCC2 כחלבון אחד כזה 7, או תמ"ג טעינה יכולה להיות מאומת פשוט כמו בינדיng ללא GEF ולא מפעיל.
הפלט מהניסוי יהיה כתם מערבי המתאר את שני שותפים מחייבים מתויג GFP חייבים GTPase. על ידי שימוש בנוגדנים חד לזהות שני החלבונים, ניתן לקבוע את הריכוזים שבי כמויות דומות של שני המתחרים לאגד ולכן הזיקות יחסי להסיק. בדוגמא זו תחרות בין תחום המדחף של חלבון Rac1-הסחר, coronin-1C (Rac1 מחייב חלבון), וחלבון Rac1-sequestering, RCC2 (Rac1 מחייב חלבון B), הוא הוכיחו (איור 3 א). על ידי שימוש בנפח קבוע של מדחף coronin-1C (5 μl), והוספת כמויות הולכות וגדל של RCC2, אנו יכולים לראות מGFP למחוק הוא הגיע לשיווי המשקל שב1.25-2.5 μl של RCC2 (כוכבית), הוכחה כי RCC2 יש חזק זיקה לRac1 מ coronin-1C. על ידי מדידת עוצמת להקות באמצעות מערבי סופג כמותי, וזומם ערכים ממוצע לכל competitor, נקודת שיווי המשקל יכולה להיות מחושבת בצורה מדויקת על ידי זיהוי הכרכים שבעקומות מצטלבות (איור 3).
אחד המכשולים האפשריים לassay תחרות מוצלח הוא אם השותפים מחייבים לקשור זה לזה, כמו גם מחייב Rac1. ב+ 3 א B איור אנחנו מדגימים תחרות בין RCC2 ותחום המדחף של coronin-1C, ולא coronin-1C באורך מלא. הסיבה לשימוש בcoronin הקטוע היא שcoronin-1C גם נקשר RCC2 דרך תחום הזנב. כאשר אורך מלא coronin-1C הוא טיטרציה נגד RCC2, כריכה של שני החלבונים מזוהה, עקב היווצרות משולשת מורכבת, ולא תחרות (איור 3 ג). אם תחרות מתרחשת, הכריכה של חלבון אחד תגדל ואילו ירידות האחרות, וסך מחויב GFP-ההיתוך יישאר קבוע. במקרים בהם מורכב משולש יוצר יש צורך לחתוך אחד של החלבון קושר GTPase כך שcompetitors אינטראקציה כבר לא.
איור 1. זרימת עבודה. ייצוג סכמטי של זרימת העבודה לקביעת הזיקה של חלבונים מחייב GTPase באמצעות מבחני תחרות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. אימות של חלבונים מטוהרים. () מטוהרים Rac1 מחייב חלבונים נותחו על ידי כתם מערבי, חיטוט באנטי-GFP כדי לקבוע את התשואה היחסית של שני החלבונים מתויג GFP. סוג זה של השוואה במהלך הניסוי מאפשר הריכוז של שני החלבונים להיות מותאם כך שיתאימו בניסוי המחייב. (ב) GDP, GTPγS ולא GST-Rac1 טעון נוקלאוטיד הודגר עם lysate מHEK293T להביע GFP-TrioD1 ומחויב חלבונים זוהו על ידי קשירת קשר לPAK1 אנדוגני או ביטוי יתר GFP-TrioD1. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. ניתוח כתם מערבי של חלבון ביחס מחייב. תפוקות דוגמא ממבחנים מחייב תחרות. טעון תמ"ג () Rac1 היה מעורב עם תחום מדחף 5 μl GFP-coronin-1C והגדלת נפחים של ה- GFP-RCC2 היו טיטרציה ב. ב חלבונים קשורים מערבי סופג לGFP, נושאים עם זיהוי ההפרש של שני החלבונים הם נמנעו ואות ה- GFP מדווחת יחס טוחנת בין שני חלבוני האיחוי. כוכביות לציין את יחסי תחרות על eitheצד r של נקודת שיווי המשקל. (ב) בעוצמות בנד של חלבוני היתוך GFP קשורים משלושה ניסויים בלתי תלויים נמדדו על ידי מערבי סופג כמותי, באמצעות נוגדנים משניים fluorophore מצומדות וממוצעים זממו כדי לחשב את הסכום של RCC2 הדרושים כדי להגיע לשיווי משקל. (C ) פלט דוגמא מניסוי שבו חלבוני Rac1 מחייבים להיקשר זה לזה ויוצרים מורכב משולש, ולא מתחרה. Rac1 היה מעורב עם GFP-RCC2 5 μl והגדלת נפחים של ה- GFP-coronin-1C באורך מלא טעון תמ"ג היה טיטרציה ב. הגידול בGFP-coronin-1C כבול ללא אובדן של ה- GFP-RCC2 כבול מציינת היווצרות מורכבת משולשת. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Disclosures
יש המחברים אין לחשוף.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bugbuster | Novagen | 70584-3 | |
| COMPLETE protease inhibitor | Roche | 05 056 489 001 | |
| Glutathione magnetic beads | Pierce | 88821 | |
| Polyethylenimine, branched, average Mw ~25,000 | Sigma Aldrich | 408727-100ML | |
| OPIMEM | Life Technologies | 31985-047 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Media | Sigma Aldrich | D5796 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10270-1-6 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-024 | |
| GFP-Trap_A | Chromotec | gta-20 | |
| GDP | Sigma Aldrich | G7127 | Highly unstable. Aliquot and store at -80 immediately upon reconstritution |
| GTPγS | Sigma Aldrich | G8634 | Highly unstable. Aliquot and store at -80 immediately upon reconstritution |
| Blocking Buffer | Sigma Aldrich | B6429 | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| Anti-GFP antibody | Living Colors | 632592 | Use at 1/1000 dilution |
| DyLight 800 conjugated goat anti-rabbit secondary antibody | Fisher Scientific | 10733944 | |
| Anti-PAK1 antibody | Cell Signaling | 2602S | Use at 1/1000 dilution |
| Odyssey SA Infrared Imaging System | Li-cor | 9260-11PC |
References
- Burridge, K., Rho Wennerberg, K. and Rac take center stage. Cell. 116 (2), 167-179 (2004).
- Raftopoulou, M., Hall, A. Cell migration: Rho GTPases lead the way. Dev Biol. 265 (1), 23-32 (2004).
- Rossman, K. L., Der, C. J., Sondek, J. GEF means go: turning on RHO GTPases with guanine nucleotide-exchange factors. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (2), 167-180 (2005).
- Worthylake, D. K., Rossman, K. L., Crystal Sondek, J. structure of Rac1 in complex with the guanine nucleotide exchange region of Tiam1. Nature. 408 (6813), 682-688 (2000).
- Scheffzek, K., Ahmadian, M. R. GTPase activating proteins: structural and functional insights 18 years after discovery. Cell Mol Life Sci. 62 (24), 3014-3038 (2005).
- Del Pozo,, A, M., et al. Integrins regulate GTP-Rac localized effector interactions through dissociation of Rho-GDI. Nat Cell Biol. 4 (3), 232-239 (2002).
- Williamson, R. C., et al. Coronin-1C and RCC2 guide mesenchymal migration by trafficking Rac1 and controlling GEF exposure. J Cell Sci. 127 (Pt 19), 4292-4307 (2014).
- Del Pozo, M. A., Price, L. S., Alderson, N. B., Ren, X. D., Schwartz, M. A. Adhesion to the extracellular matrix regulates the coupling of the small GTPase Rac to its effector PAK. Embo J. 19 (9), 2008-2014 (2000).
- Van Rijssel, J., Hoogenboezem, M., Wester, L., Hordijk, P. L., Van Buul, J. D. The N-terminal DH-PH domain of Trio induces cell spreading and migration by regulating lamellipodia dynamics in a Rac1-dependent fashion. PLoS. 7 (1), e29912 (2012).
- Self, A. J., Hall, A. Measurement of intrinsic nucleotide exchange and GTP hydrolysis rates. Methods Enzymol. 256, 67-76 (1995).
