Protocol
1. Zuivering van GST-gelabeld GTPase
- Cultuur een E. coli-stam zoals BL21 getransformeerd met pGEX-Rac1 O / N bij 37 ° C, onder schudden bij 220 rpm in 500 ml autoinductie medium (25 mM Na 2 HPO 4, 25 mM KH 2PO 4, 50 mM NH4Cl, 5 mM Na 2 SO 4, 2 mM MgSO 4, 2 mM CaCl2, 0,5% glycerol, 0,05% glucose, 0,2% lactose, 5 g trypton, 2,5 g gistextract, 100 ug / ml ampicilline).
- Harvest bacteriën door centrifugeren gedurende 10 min bij 10.000 xg, 4 ° C.
- Resuspendeer bacteriële pellet in 20 ml eiwit extractie reagens, 1x proteaseremmer en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur met omkering.
- Verduidelijken het lysaat door centrifugatie bij 40.000 xg gedurende 30 min.
- Voeg 2 ml glutathion magnetische korrels, gewassen met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS: 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mM KH 2PO 4, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl).
- Incubeer 2 uur mengen door omkeren bij 4 ° C.
- Was-eiwit beladen korrels vier keer met 10 ml PBS, met behulp van een magnetisch deeltje sorter aan de korrels bij elke stap precipiteren.
- Resuspendeer proteïne-beladen kralen in 2 ml PBS en bewaar bij -80 ° C in 100 gl aliquots tot gebruik.
2. Expressie van GTPase-bindende eiwitten
- De dag voor het experiment, transfectie van plasmiden coderend voor groen fluorescent eiwit (GFP) gemerkte versies van elk GTPase-bindend eiwit in een afzonderlijke 75-cm2 kolf van HEK293T als volgt. Voor de validatie van nucleotide laden, transfecteren GFP-gelabeld TrioD1 in een derde 75-cm 2 kolf van HEK293T.
- Verdun polyethylamine tot 1 mg / ml in 100 pl steriel 150 mM NaCl.
- Voeg 27 ul verdund polyethylamine tot 223 ui verminderd serum media.
- Voeg 12 ug plasmide-DNA met 250 ul gereduceerd serum medium.
- Incubeer elke buis gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. Combineer de polyethylamine en DNA mengt in een enkele buis en vortex gedurende 2 min.
- Incubeer 15-20 minuten bij kamertemperatuur.
- Vervang het groeimedium (Dulbecco's Modified Eagle Media, 10% foetaal runderserum, 2 mM L-glutamine, zonder antibiotica) met 90% confluent HEK293T met 5 ml vers kweekmedium.
- Voeg de gecombineerde polyethylamine / DNA mengsel aan de kolf en geïncubeerd O / N bij 37 ° C, 5% CO2.
3. Zuivering van GTPase-bindingseiwitten
- Spoel kolven van getransfecteerde cellen in PBS en afvoer kolf gedurende 5 min, aspireren van vrije vloeistof.
- Schraap cellen in 500 pi lysisbuffer (50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 1% Nonidet P-40, 1x proteaseremmer) in microcentrifugebuis.
- Lyse cellen door mengen door omkeren bij 4 ° C gedurende 30 min.
- Tijdens lysis wassen twee partijen 40 pl GFP-Trap parels driemaal met verse lysisbuffer, sedimenteren kralen aan 2700 xg gedurende 2 min tussen wasbeurten.
- Verduidelijken lysaten door centrifugatie bij 21.000 xg gedurende 10 min.
- Overdracht geklaarde lysaat van elke deelnemer eiwitten gewassen GFP-trap parels gescheiden en laten GFP-fusie-eiwitten te binden voor 2 uur mengen door omkeren bij 4 ° C. Houd lysaat van GFP-TrioD1 cellen op ijs.
- Wassen geladen GFP-Trap kralen tweemaal in 50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 50 mM NaCl, 0,7% (w / v) Nonidet P-40 en tweemaal in 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl2 , sedimenteren kralen aan 2700 xg gedurende 2 min tussen de wassingen.
- Elueer GFP-fusie-eiwitten door toevoeging van 40 pi 0,2 M glycine (pH 2,5) en op en neer pipetteren van 30 sec. Onmiddellijk sediment korrels bij 21.000 xg gedurende 60 s en overdrachtvloeistof een nieuwe microcentrifugebuis bevattende 4 pi 1 M Tris-HCl (pH 10,4). Doe dit snel tot beschadiging van het gezuiverde eiwit te beperken.
- Analyseer 1 pi van elke gezuiverde eiwit door Western blot en probe met een anti-GFP antilichaam relatieve rendement stellen via een kwantitatief blotting volgens het protocol van de fabrikant. Alternatief bepalen eiwitconcentraties van bicinchoninezuur (BCA) assay maar dit introduceert fouten als de eiwitten reageren niet met de assay op een identieke wijze of er verontreinigende eiwitten.
- Equalize molaire eiwitconcentratie door de toevoeging van 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl2.
4. Nucleotide laden van GTPase
- Dooi een hoeveelheid van GST-Rac1 magnetische korrels, bereid in stap 1.
- Neem 90 pi GST-Rac1 kralen en was driemaal met 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 25 mM NaCl, 0,1 mM DTT, 4 mM EDTA, met een magnetische deeltjes sorter aan de korrels bij elke stap precipiteren.
- Aspireren buffer kralen en voeg 100 ul 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 25 mM NaCl, 0,1 mM DTT, 4 mM EDTA.
- Naargelang BBP, GTP of geen nucleotide lading is vereist voor het vergelijkend experiment, voeg 12 ul 100 mM BBP, 12 gl 10 mM guanosine 5 '- [γ-thio] trifosfaat (GTPyS) of geen nucleotide 60 gl GST-Rac1 kralen.
- Voor de nucleotide-loading controles splitsing van de resterende kralen in drie 10-ul monsters en voeg 2 pl 100 mM BBP, 2 pl 10 mM GTPyS of geen nucleotide aan elke buis.
- Incubeer bead mixen voor 30 min bij 30 ° C onder roeren.
- Stabiliseer-nucleotide gebonden Rac1 door toevoeging van 1 M MgCl 2: 3 pi de experimentele mix (stap 4,4), 0,5 pi aan elk controlepunt mengsels (stap 4,5).
5. Mededinging bindend.
- Opgezet 6 microfugebuizen buizen, elk met:
200 pl 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl2
10 ul experimenteel-nucleotide beladen Rac1 kralen (van stap 4.7)
5 gl Rac1-bindend eiwit A (constant bindingseiwit) - Aan elke buis, voeg 0, 1, 2,5, 5, 10 of 20 gl-Rac1 bindende eiwit B (variabele bindend eiwit). Deze volumes veronderstellen eenpproximately gelijke stock concentraties van de constante en variabele bindingseiwitten en moet mogelijk worden aangepast.
- Pas volumes bindende eiwitten A en B als er grote verschillen in de bindingsaffiniteiten van de twee eiwitten en dit moet empirisch worden bepaald door experimentele herhalingen. Vul het totale volume van het mengsel binding aan 235 pl door toevoeging van 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl2.
- Het opzetten van een microfugebuis bevat:
200 pl 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl2
10 ul experimenteel-nucleotide beladen Rac1 kralen (van stap 4.7)
10 gl Rac1-bindend eiwit A (constant bindingseiwit) - Het opzetten van het BBP, GTPyS en geen nucleotide controle buizen:
200 pl 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl2
10 ul controle Rac1 kralen in stap 4.5 met het BBP, GTPyS of geen nucleotide geladen en gestabiliseerd in stap 4.7.
180 pi HEK293T GFP-TrioD1 lysaat, bereid als in stap 3,6
4 gl 1 M MgCl2 - Incubeer het mengsel gedurende 2 uur mengen door omkeren bij 4 ° C.
- Was de parels driemaal met 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl2.
- Elueer eiwitten in 20 gl verminderen monsterbuffer (50 mM Tris-HCl (pH 7), 5% SDS, 20% glycerol, 0,02 mg / ml broomfenolblauw, 5% β-mercaptoethanol).
6. Analyse van de concurrentie
- Los 10 ul van het gebonden eiwit (stap 5,6) van natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) en Western blot.
- Incubeer het membraan bij 4 ° CO / N anti-GFP antilichaam verdund 1/1000 in de blokkeerbuffer verdund tot 1x in PBS, 0,1% Tween-20 voor beide gelabelde GTPase-bindende eiwitten te detecteren.
- Was het membraan drie keer gedurende 10 min met PBS, 0,1% Tween-20.
- Incubeer het membraan gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in DyLight 800-geconjugeerd anti-konijn secmiddelbaar antilichaam, verdund 1 / 10.000 in blockingbuffer verdund tot 1x in PBS, 0,1% Tween-20.
- Was het membraan drie keer gedurende 10 min met PBS, 0,1% Tween-20.
- Scan het membraan met behulp van een infrarood beeldvormingssysteem via de software bandintensiteit meten volgens het protocol van de fabrikant.
- Plot van de band intensiteit van elk eiwit tegen volume van de variabele concurrent (Protein B).
- Verdeel het volume van variabele deelnemer op het punt waar de lijnen elkaar snijden door het volume constant concurrent (Proteïne A, 5 ui) aan de deelnemer welke verhouding evenwicht wordt bereikt bepalen.
- Voor validatie van nucleotide-beladingsstatus, probe membranen voor p21-geactiveerd kinase 1 (PAK1) (een effector) en GFP-TrioD1 (a GEF), zoals beschreven in stappen 6,1-6,6.
Representative Results
Dit protocol is bedoeld om de relatieve affiniteiten van bindingspartners voor Rac1 berekenen zonder de exacte concentratie van de concurrenten kennen (Figuur 1). Bepaling van de eiwitconcentratie en introduceert fouten bij het overwegen concurrentie tussen moleculen in een signaleringsroute is niet noodzakelijk. Het is echter belangrijk te weten dat de twee concurrenten dezelfde molaire concentratie van de voorraadoplossingen om eenvoudige verhoudingen worden berekend bij het toevoegen van verschillende hoeveelheden tot de assay. 40 pl GFP-Trap kralen hebben een bindingscapaciteit van ~ 300 pmol dus confluente 75 cm2 kolven sterk tot expressie brengende cellen zullen verzadigen de korrels, waardoor de voorbereiding van de twee verschillende bindingseiwitten vergelijkbaar voor correctie wordt (figuur 2A). Als één van de eiwitten tot expressie slecht, kan dit probleem worden ondervangen door het zuiveren van eiwitten die uit meer dan één kolf cellen.
8 (figuur 2B). GEFs voorkeur binden aan nucleotide-vrij GTPase de overgangstoestand te stabiliseren. Als GEFs zijn van lage overvloed, meestal inactief en vaak vlek slecht, het is beter om een GEF of GEF fragment te testen-nucleotide vrij GTPase overexpressie. We gebruiken vaak het eerste Dbl homologie van Trio, uitgedrukt GFP-fusie (GFP-TrioD1 9) (figuur 2B), maar elke GEF zou werken. Eiwitten die zich binden aan de BBP geladen GTPase zijn zeldzamer. We hebben onlangs gemeld RCC2 als een dergelijk eiwit 7 of bbp-laden kan eenvoudig worden gevalideerd als Binding noch GEF noch effector.
De uitvoer van het experiment een Western blot die de twee GFP-gelabeld bindingspartners gebonden aan de GTPase zijn. Door een antilichaam tegen beide eiwitten te detecteren, kunnen de concentraties waarbij gelijke hoeveelheden van beide deelnemers binden worden bepaald en daarmee de relatieve affiniteiten afgeleid. In dit voorbeeld competitie tussen de propeller domein van de Rac1-eiwit trafficking, coronin-1C (Rac1-bindend proteïne A) en de Rac1-sequesterende eiwit RCC2 (Rac1-bindend eiwit B), is aangetoond (figuur 3A). Door het gebruik van een constant volume van coronin-1C propeller (5 pi) en toenemende hoeveelheden RCC2 toe te voegen, kunnen we zien aan de GFP uitwissen dat evenwicht wordt bereikt bij 1,25-2,5 ul RCC2 (asterisk), waaruit blijkt dat RCC2 heeft een sterkere affiniteit voor Rac1 dan coronin-1C. Door het meten van de intensiteit van de banden met behulp van kwantitatieve Western blotting en plotten gemiddelde waarden voor elke competitor, kan het evenwichtspunt nauwkeurig worden berekend door de volumes waarbij de curves snijden (figuur 3B) identificeren.
Een van de mogelijke obstakels voor succesvolle competitie assay is als de bindingspartners aan elkaar binden en binding aan Rac1. In figuur 3A + B tonen we concurrentie tussen RCC2 en de propeller domein van coronin-1C, in plaats full-length coronin-1C. De reden om het afgeknotte coronin dat coronin-1C bindt ook RCC2 via staartdomein. Wanneer full-length coronin-1C is getitreerd tegen RCC2, binding van beide eiwitten wordt gedetecteerd, als gevolg van ternair complex vorming, in plaats van de concurrentie (Figuur 3C). Als de concurrentie plaatsvindt, het binden van een eiwit zal toenemen, terwijl de andere afneemt, en de totale gebonden GFP-fusie zal constant blijven. In gevallen waarin een ternair complex vormt moet een van de GTPase-eiwit afkappen zodat de competsatoren niet meer communiceren.
Figuur 1. Workflow. Schematische weergave van de workflow voor het bepalen van de affiniteit van GTPase-bindende eiwitten met behulp van concurrentie assays. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Validatie van gezuiverde eiwitten. (A) Gezuiverd-GFP-gelabeld Rac1 bindende eiwitten op Western blot geanalyseerd, probing met anti-GFP om de relatieve opbrengst van beide eiwitten te bepalen. Dit type egalisatie tijdens het experiment maakt de concentratie van de twee eiwitten worden aangepast zodat ze overeenkomen met het bindingsexperiment. (B) GDP, GTPyS en no-nucleotide geladen GST-Rac1 werd geïncubeerd met lysaat van HEK293T die GFP-TrioD1 en gebonden gedetecteerd door het plotten van endogene PAK1 of overexpressie GFP-TrioD1 eiwitten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3 Western blot-analyse van relatieve eiwitbinding. Voorbeeld output van competitie-bindingstesten. (A) BBP geladen Rac1 werd gemengd met 5 pl GFP-coronin 1C-propeller domein en toenemende GFP-RCC2 werden getitreerd. Door Western blotting eiwitten voor GFP, problemen met differentiële detectie van de twee eiwitten worden vermeden en het GFP-signaal rapporteert de molaire verhouding tussen de twee fusie-eiwitten. Sterretjes geven de verhoudingen concurrentie op either zijde van het evenwichtspunt. (B) bandintensiteiten gebonden GFP fusie-eiwitten van drie onafhankelijke experimenten werden gemeten door kwantitatieve Western blotting met behulp fluorofoor geconjugeerde secundaire antilichamen en gemiddelden uitgezet om de hoeveelheid RCC2 te berekenen die nodig zijn om evenwicht te bereiken. (C ) Voorbeeld output van een experiment waarbij Rac1-bindende eiwitten binden aan elkaar en vormen een ternair complex dan concurrerende. BBP geladen Rac1 werd gemengd met 5 ui GFP-RCC2 en toenemende volumes van GFP-coronin-1C volledige lengte werden getitreerd in. De toename in gebonden GFP-coronin-1C zonder verlies van gebonden GFP-RCC2 geeft ternair complex formatie. Gelieve klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bugbuster | Novagen | 70584-3 | |
| COMPLETE protease inhibitor | Roche | 05 056 489 001 | |
| Glutathione magnetic beads | Pierce | 88821 | |
| Polyethylenimine, branched, average Mw ~25,000 | Sigma Aldrich | 408727-100ML | |
| OPIMEM | Life Technologies | 31985-047 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Media | Sigma Aldrich | D5796 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10270-1-6 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-024 | |
| GFP-Trap_A | Chromotec | gta-20 | |
| GDP | Sigma Aldrich | G7127 | Highly unstable. Aliquot and store at -80 immediately upon reconstritution |
| GTPγS | Sigma Aldrich | G8634 | Highly unstable. Aliquot and store at -80 immediately upon reconstritution |
| Blocking Buffer | Sigma Aldrich | B6429 | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| Anti-GFP antibody | Living Colors | 632592 | Use at 1/1000 dilution |
| DyLight 800 conjugated goat anti-rabbit secondary antibody | Fisher Scientific | 10733944 | |
| Anti-PAK1 antibody | Cell Signaling | 2602S | Use at 1/1000 dilution |
| Odyssey SA Infrared Imaging System | Li-cor | 9260-11PC |
References
- Burridge, K., Rho Wennerberg, K. and Rac take center stage. Cell. 116 (2), 167-179 (2004).
- Raftopoulou, M., Hall, A. Cell migration: Rho GTPases lead the way. Dev Biol. 265 (1), 23-32 (2004).
- Rossman, K. L., Der, C. J., Sondek, J. GEF means go: turning on RHO GTPases with guanine nucleotide-exchange factors. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (2), 167-180 (2005).
- Worthylake, D. K., Rossman, K. L., Crystal Sondek, J. structure of Rac1 in complex with the guanine nucleotide exchange region of Tiam1. Nature. 408 (6813), 682-688 (2000).
- Scheffzek, K., Ahmadian, M. R. GTPase activating proteins: structural and functional insights 18 years after discovery. Cell Mol Life Sci. 62 (24), 3014-3038 (2005).
- Del Pozo,, A, M., et al. Integrins regulate GTP-Rac localized effector interactions through dissociation of Rho-GDI. Nat Cell Biol. 4 (3), 232-239 (2002).
- Williamson, R. C., et al. Coronin-1C and RCC2 guide mesenchymal migration by trafficking Rac1 and controlling GEF exposure. J Cell Sci. 127 (Pt 19), 4292-4307 (2014).
- Del Pozo, M. A., Price, L. S., Alderson, N. B., Ren, X. D., Schwartz, M. A. Adhesion to the extracellular matrix regulates the coupling of the small GTPase Rac to its effector PAK. Embo J. 19 (9), 2008-2014 (2000).
- Van Rijssel, J., Hoogenboezem, M., Wester, L., Hordijk, P. L., Van Buul, J. D. The N-terminal DH-PH domain of Trio induces cell spreading and migration by regulating lamellipodia dynamics in a Rac1-dependent fashion. PLoS. 7 (1), e29912 (2012).
- Self, A. J., Hall, A. Measurement of intrinsic nucleotide exchange and GTP hydrolysis rates. Methods Enzymol. 256, 67-76 (1995).
