Summary
細菌機械受容チャネルは、生体分子デバイスでmechanoelectricalトランスデューサとして使用することができます。そのようなデバイスへの液滴のインタフェース二重層（DIBを）、セル風のビルディングブロックは、機械受容チャネルを組み込むと刺激する新しいプラットフォームを表します。ここでは、機械的な刺激の下で機械受容チャネルの研究を可能にする、のDIBを形成する新しいマイクロピペットベースの方法を示しています。
Abstract
MSCL、大コンダクタンス機械受容チャネル（MSC）は、細菌が急激に低浸透性ショックを乗り切る助けユビキタスオスモライトリリースバルブです。これは、発見され、厳密にはほぼ三十年のためのパッチクランプ法を用いて研究されています。透過性応答に細胞膜の張力を翻訳するその基本的な役割は、人工膜ベースの生体分子デバイスでmechanoelectrical変換器として機能する有力な候補になります。そのようなデバイスのビルディングブロックとして、液滴界面二重層（のDIB）はMSCLチャネルの取り込みおよび刺激のための新たなプラットフォームとして使用することができます。ここでは、のDIBを形成し、組み込まれたMSCLチャネルの活性を測定するためにマイクロピペットベースの方法を記載します。この方法は、二つの対向（同軸上に位置）ホウケイ酸ガラスマイクロピペットの先端に固定された脂質包まれた水性液滴で構成されています。液滴が接触するときに、脂質二重層のインタフェースであります形成されました。この技術は、化学組成と各液滴の大きさだけでなく、二重層界面の大きさを制御しています。高調波圧電アクチュエータに取り付けられたマイクロピペットの1つを有する、所望の振動刺激を送達する能力を提供します。変形中の液滴の形状を解析して、界面で作成張力を推定することができます。この技術を使用して、DIBシステム内のMsClチャネルの最初の活性が報告されています。 MSチャンネルに加えて、チャネルの他の種類の活動が、このプラットフォームの多機能性を証明し、この方法を用いて研究することができます。ここで紹介する方法は、基本的な膜特性の測定を可能に対称および非対称膜の形成をより細かく制御を提供し、刺激し、機械受容チャネルを研究する別の方法です。
Introduction
過去十年間に、人工脂質二重層のアセンブリは、実質的に液滴界面の二重層法の開発を通して進められています。安定した、堅牢として知られ、DIBには（ミューラー）塗装古典と折り畳まれた（Montal-ミューラー）の平面二重層1の代替モデル系として自分自身を課しました。脂質二重層を作成するための液滴を使用してのアイデアは1960年代2にさかのぼりますが、それは最近まで人気を獲得していません。最初に成功した試みはベイリー・グループ4-6により液滴のネットワークを使用して、二重層形成を証明するいくつかの研究が続いTakeushiグループ3、によって報告されました。より最近では、カプセル化技術は、新規な刺激反応材料システム10の構成要素としてのDIBを使用する概念を開拓レオグループ7-9によって提案されました。以前の研究では、DIBには、電気9,11、CHEMに対応する能力を証明していますiCalの10,12、および光刺激13。 DIB 10,14で再構成したときに別の刺激応答性官能基を有する様々な生体分子を効果的に刺激されました。これらの成功した試みの光の中で重要な問題が提起されています。適切な生体分子が組み込まれている場合、DIBは、機械的刺激に反応するだろうか？ DIBに作用する界面力は、他の2層系15,16と異なります。そのため、液滴に保持された二重層の張力は水 - 脂質 - 油界面の張力を調整することによって制御することができます。塗装または折り畳まれた二層システムでは適用できない概念。
広く浸透圧調節物質のリリースバルブおよび細菌細胞膜の基本的な要素として知られているMSCLチャンネルは、増加した膜張力17,18に反応します。低浸透性ショックの場合に、いくつかのチャネルは、小さい細胞の膜に存在する19 MASを生成することができSIVE透過性応答は、迅速溶解20から細菌を保存し、イオンおよび小分子を放出します。生物物理学的に、MSCLはよく研究されており、著名なパッチクランプ法21-23を通じて、主に特徴とします。 MSCLのゲーティング機構24,25を説明する信頼性の高い構造モデルは28をモデル化し 、その同族体の結晶構造26,27に基づいており、大規模な実験24,29-31の結果提案されています。 〜の張力下では10mN / mで、膜貫通ヘリックスの緊密な束で構成され、閉じたチャネルは、〜28オングストロームの水で満たされた導電性の孔21,24,32を形成大きく傾いたヘリックスのリングに変身。また、インナーTM1ドメインの交差点に位置する緊密なゲートの疎水性は、チャネル33の活性化閾値を決定することが確立されています。それに応じて、それが判明したゲートの疎水性を減少させることによって、tension個の閾値は、22に低減することができました。 MSCLのこのプロパティは、主に薬物送達のために、様々な制御バルブ34の設計可能にしました。電気生理学的活動に細胞膜過度の緊張を翻訳し、その基本的な役割に基づいて、すべての前述の特性とは、MSCLはDIBの中mechanoelectricalトランスデューサとしてぴったりになります。
この記事では、DIBのを形成し、機械的刺激に基づき設立されたMSCLチャネルの活性を測定するために、元のマイクロピペットベースの方法を提示します。私たちは、初めての機械的刺激とDIBの35でMSCLのV23T低閾値変異体の機能的再構成するのDIBの反応を報告しています。
実験システムは、2つの対向ホウケイ酸ガラスマイクロピペットの先端に固定された脂質包まれた水性液滴で構成されています。液滴が接触するときに脂質二重層インタフェースはFOでありますrmed。この技術は、各液滴（バルク）の化学組成とサイズの制御だけでなく、二層インターフェイスの寸法を提供しています。また、各リーフレットの様々な脂質組成を有する非対称膜を容易に形成することができました。 、高調波圧電アクチュエータに取り付けられたマイクロピペットのいずれかを持つことは、事前にプログラムされたシングルサイクルや振動刺激を適用する機能を提供します。張力はそれをサポートする両方の液滴の圧縮を介して人工膜に送達されます。液滴の変形の結果として、水 - 脂質 - 油界面の増加と同時に液滴との間の角度の領域は、膜張力および過渡MSCLの活性化の増加を引き起こし、減少します。変形中の液滴の形状を分析することによって、界面で作成された張力を推定することができました。この記事の焦点は、DIBのメカノトランスダクションの性質にあるにもかかわらず、我々はまた、バイオの他のタイプを強調例えば、アラメチシンなどの分子は、この多機能プラットフォームによって活性化することができます。我々は、ここでは、準備組み立て、および段階的にこの新しい方法で測定を行うのすべての技術的側面を提示します。
Protocol
PEG-DMAヒドロゲルの調製
- アプリケーションに適した計測/混合容器（フラスコ、ビーカー、 など 。）を選択します。洗剤と水を使って徹底的にきれいにしてから、糸くずの出ない組織ワイパーで拭いてください。
- 指先から油とガラス製品の汚染を避けるために手袋を着用してください。洗剤残留物を除去するのに十分な脱イオン水でコンテナを洗浄します。
- イソプロピルアルコール（IPA、99.5％）をスプレーし、きれいになるまで拭き、その後、水を取り除くため、糸くずの出ないティッシュでコンテナを拭きます。すべてIPAが完全に蒸発することを可能にするために真空チャンバー内に配置します。蒸留水でハイドロゲル形成プロセスで使用される実験装置の残りの部分を清掃してください。
- 40％（w / v）のPEG-DMAヒドロゲル溶液を調製し、ポリ（エチレングリコール）ジメタクリレート4gの重さ（PEG-DMAを、MW = 1,000グラム/モル）実験室スケールを用いてポリマー。
- 4で超音波洗浄器を用いて、フラスコと熱に計量し、PEG-DMAを配置固体PEG-DMAまで5-55℃の液化しました。処理中に、水を保つためにパラフィルム/ワックスペーパーでフラスコの開口部を覆います。
- PEG-DMA液化したら、総体積が（6ヶ月の期間にわたっていくつかの実験のために十分な）〜10ミリリットルに達するまで、（500ミリモルのKCl、10mMのMOPS、pH7.0）に緩衝液を加えます。
- （w / v）の0.5％の硬化剤を加えます。この場合には、10 mlの混合物に硬化剤を0.05gを加えます。バックソニケーター浴中にフラスコを置き、コンポーネント（10分、250ワット前後）溶液に溶解させます。
注：硬化剤を溶液に添加された後のに十分な時間、任意の光源にさらされた場合、ヒドロゲルは（固化）硬化します。これに対処しやすくするために、黒いテープでバイアル/容器をラップし、暗い場所に保管してください。この溶液を室温（22℃）で数週間保存することができます。
Liposの調製omes
- 1,2- diphytanoyl- SN -glycero -3-ホスホコリン（DPhPC）合成の20 mgの緩衝液10ml（500ミリモルのKCl、10mMのMOPS、pHが7.0）を添加することにより、2 mg / mlの脂質溶液10mlを調製脂質は凍結乾燥粉末として購入しました。 （すべてが溶解したとき、混合物が均一とかすんで見えるはずです）両方の脂質小胞と緩衝液を十分に混合していることを確認します。
- フリーズ（-20℃）し、完全に6回の合計のための新たな脂質混合物を解凍。決して加熱環境下で、室温で混合物の解凍をしてみましょう。
- 市販の押出機を用いて、0.1μmのメンブランフィルターを介して第1の0.4ミクロンのポリカーボネート膜フィルターに通し、その後6回全脂質懸濁液を強制することによって、脂質を押し出します。このプロセスは、（フィルタの孔サイズに等しい）は100nm付近の直径を有する粒子が得られます。
注：他の脂質および脂質比は、この私を用いて調製することができますTHOD。リポソームは、数週間のために4℃で保存する必要があります。
3. MSCLの単離と再構成
- 100μg/ mlのアンピシリン、Eを含むストリークアウト温度アガロースプレートを、 3 '末端（C末端）に6-Hisタグで拡張V23T MSCL遺伝子を運ぶpB10bプラスミドで大腸菌 MJF465細胞。静止インキュベーター内で37℃で培養一晩（12〜16時間）にプレートを許可します。プラスミドを選択するための標準LB培地中で100μg/ mlのアンピシリンを有する細胞内に保持されます。培養小胞（50ミリリットルフラスコまたは何の文化を保持するのに利用可能である）で100μg/ mlアンピシリンを含むLB培地の翌日場所20ミリリットル。一晩培養したプレートを取り、滅菌接種スティックを用いて調製20ミリリットルのLB培地に（接種）を転送するためにプレートからコロニーを選択します。 20ミリリットルの文化は振盪インキュベーター中で250rpmで37℃で一晩（12〜16時間）を成長させます。
- overn 20ミリリットルをデカントLB培地の2-4 LにIGHT文化。アンピシリンは、もはや必要とされません。 OD 600が 0.5に達するまで37℃、250rpmで振盪培養器で振盪フラスコ。 0.6mmの最終濃度にイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）を追加し、（OD 600 = 0.8から1.0へ）文化は別の時間のために行ってみましょう。
- 文化を冷却した後、遠心分離により細菌を収集するために氷の上にフラスコを置きます。細菌をペレット化するのに十分である7438×gで5-8分間遠心（使用ローターによって許可されたかのような多くの）6 400ミリリットルコニカルチューブを使用してください。上清を除去し、メディアからのすべての細胞を回収するまでの手順を繰り返します。必要なスピンの数を増殖させ、ロータが用いられてきた培地の量に基づいて変化します。 2リットルの培養のために、それは一度だけ、細胞をスピンダウンするために必要とされます。単一の遠心分離管にすべて回収した細胞を転送します。
- フレンチプレスバッファー（100mMのKPの〜20ml中の細胞ペレットを再懸濁しiおよび5mMのMgCl 2、pH7.4中）。サスペンションは、（クリームや牛乳など）、緻密でなければなりません。すぐに懸濁液を最終濃度2mMにプロテアーゼ阻害剤フッ化フェニルメチルスルホニル（PMSF）を追加し、激しく混ぜるフランス語プレスの前に。
- フレンチプレス万〜16,000 psiで35ミリリットルフレンチ圧力セル内の文化、。 7438×gで、4℃で10分で破壊されていない細胞を分離するためにサスペンションをスピンダウン。
- 別のチューブに上清を入れ、それリゾチームおよびDNアーゼ（0.2 mg / mlの各）に追加します。室温で10分間上清タンブルをしてみましょう。
注：DNアーゼはオプションです。それは、高速遠心分離のために粘度を低下させます。リゾチームは非常に重要です。それは細胞壁の残りを消化し、穏やかな非変性界面活性剤を用いて行った膜抽出物の収率を増加させるのに役立ちます。
- 2超遠心チューブに上清ミックスを配布し、でそれらを回転40分間4℃で（ローターによって異なります）106,883-153,911 XG。遠心分離後、上清をデカントし、底部に茶色がかったペレット（総膜画分）は、長期保存のためにチューブに凍結することができる（ - 80°C）、または即時のタンパク質精製のために使用されます。
- ハイイミダゾールバッファーの0.5-1 L準備：100mMのNaCl + 500 mMイミダゾールを、濃HClでpH 7.2-7.4に滴定します。イミダゾール自体が良い緩衝物質であることに注意してください。
- 適切に100mMのNaClで上記緩衝液を希釈することにより、100mMのNaCl、+ 15 mMイミダゾール：低イミダゾール緩衝液の0.5〜1 Lを用意。いいえpH調整は必要ありません。
- 別々のボトルに各バッファ100〜150ミリリットル取り、B-オクチルグルコピラノシド（OG）（w / v）の1％を追加します。よくソリューションを攪拌し、0.22μmのフィルターを通してそれをフィルタリングします。これらのソリューションは、低および高イミダゾールクロマトグラフィーソリューションです。
- 、抽出緩衝液を調製した低イミダゾール緩衝液を50mlを取り、3％を追加（w / v）のOGとバッファをフィルタリングします。
- タンパク質の単離のために0.5〜2グラム湿重量の膜ペレットを使用してください。 、抽出緩衝液5-7 mlを加えペレットを再懸濁し、30ミリリットルの手主導のガラスピストンホモジナイザーでそれを均質化します。 5-10穏やかなストロークでダマのない均質な懸濁液を作ります。十分に注意してください、せん断応力は、タンパク質の変性を引き起こすことが知られています。
- （15分間、4℃で、ミッドレンジの遠心分離機、固定角ローター、38,478-68,405 XG）不溶性粒子をスピンダウン。一方、ニッケルNTAビーズ（サスペンションの6ミリリットル）の3ミリリットルを取り、15ミリリットルのスクリューキャップチューブでそれらを振とうすることにより、低イミダゾールバッファー（W / O OG）で1回、それらを洗ってください。ビーズが底に（〜5-7分）を決済するか、4℃で1分間129から201×gで、それらをスピンダウンしてみましょう。ペレットが形成されると、丁寧に手で上清を除去し、手順を繰り返します。 3％OG抽出緩衝液2-3 mlのビーズを平衡化。
- 3からの均質化混合物（膜ペレットおよび抽出緩衝液）を混合します。3〜3.5ミリリットルのNi NTAビーズと12。 60分（バッチ・ロード）用のスクリューキャップチューブにミックスタンブルをしてみましょう。 、201×gで（30秒）でビーズをスピンダウン手で上清を除去し、一回1％のOG低イミダゾール緩衝液でビーズを洗浄します。再び3.13のように、ビーズをペレット化し、新鮮な低イミダゾールバッファ20〜30 ml中に再懸濁します。
- ニッケルNTAビーズで（上位フローアダプターを装備した）小さな列をパックし、ビーズは抽出物（ビーズが乾燥することはできません）を通って流れるようにするストップコックを開いて落ち着かせて。オープンストップコックで10ml低イミダゾールバッファー（1％のOG）の1つのアリコートでビーズを洗浄します。
- （マシンごとに異なります）マシン定義された流量で約25 mlずつの純粋な低および高イミダゾール緩衝液を用いてクロマトグラフィーマシンをロード。これは、最初にシステムを介して低イミダゾールバッファーを渡すことによって行われます。ゼロOD 260（ベースライン）の光記録装置。低品位イミダゾールIを持っているので、バッファは、水は全く異なることに注意してください紫外線を吸収するmpurities。列にフローアダプターを挿入し、マシンに接続します。
- フロースルーのODが来るまで（それ10〜20ミリリットルかかる場合があります）は、ベースラインに到達した（1ml /分で）低イミダゾール緩衝液で再びカラムを洗浄。これは、カラムからの非結合タンパク質を除去します。
- 1ml /分で、30分間、500 mMの20のイミダゾールの線形勾配を適用します。 OD 600が増加しているときに4ミリリットルの分画の収集を開始。 MSCL-の6Hisは直線勾配の〜40％で溶出を開始するのに対し、最初の二つの画分は、ゆるく結合したタンパク質でいっぱいです。タンパク質の大部分は、3〜8の分画で表示されます。
注：ODの線形上昇はイミダゾールの増加％に観察されます。 - 3-4、5-6、7-8が一緒に画分をプール。必要に応じて、個別の画分を濃縮します。画分を遠心分離フィルターを使用して、6〜10倍に濃縮します。 804×gで、4℃で20分間スピンした後、慎重に、濃縮されたタンパク質を再懸濁タンパク質は、フィルターに固執する傾向があります。
- 、50μlのアリコートを撤回SDSサンプルバッファーでそれらを混合し、PAGEゲル電気泳動を用いてタンパク質の純度を確認してください。
注：MSCLがゲルの底に約17キロダルトンのファジーバンドとして移行されます。 - 製造業者の指示に従って、タンパク質アッセイキットを用いてタンパク質を定量化するために濃縮された画分を使用します。 0.8グラムの膜ペレットからの典型的な収量は、合わせた画分中の純粋なタンパク質の0.2ミリグラムまでです。
- 透析を通じてDPhPCのリポソームにV23T MSCLを再構成します。 3使い捨ての丸底（12×130ミリメートル）ガラス管にそれの10 mg / mlのクロロホルムDPhPCの溶液とアリコート0.5ミリリットル（脂質のすなわち、5 mg）を取ります。窒素気流下で脂質を乾燥させ、真空（4-6時間）の下でクロロホルムの残骸を削除します。
- 透析緩衝液（100mMのKClを、5 mMののKPi、pHは7.2）、渦、およびMIの2ミリリットルでそれを溶解し、各チューブに乾燥脂質に粉末OGの15 20mgの追加ldly超音波処理。 OG可溶化脂質は、透明な溶液を形成しなければなりません。
- 100：1：300と1：1を実現するために各チューブに集中V23T MSCLソリューションを追加千タンパク質対脂質比と渦も。カットし、透析チューブの三枚（~12センチ）洗浄（MWCO 8000、7.5ミリメートルの直径を、準備番号のクリップの3ペアを持ちます。）
- 慎重にクリップで両端を閉じ、4つの変更で、4℃で48時間、バッファの2 L（100のKCl、5mMののKPi、pH7.2中）に対して透析、チューブ内部に可溶化脂質 - タンパク質の混合物を配置します12時間毎にバッファ。透析後、プロテオリポソームは、準備が整いました。
注：リポソーム溶液をアジ化ナトリウム、2 mMの（アジ化ナトリウム）を補充し、4℃で保存することができます。凍結は避けてください。
油層の4製造
- 直径2インチの壁を通って対向する二つの穴（直径1.0ミリメートル）のすべての方法をドリル、長さ1.5cmアクリルCYLボトム（ 図1A）から1センチメートルでインダー。
- 同心ドリル2つの4 mmの穴は、以前に1 mmの穴を掘削しました。穴の深さは1mmで、各（すべての方法をドリルダウンしないように注意してください）である必要があります。これらの穴は、ゴムガスケットに適合するように作られています。
- 漏れるオイルを防止するために大きな穴に1 mmの内径を有する二つのゴム製ガスケットを配置し、接着剤。
- 任意の多目的エポキシ（ 図1）を使用して、10センチメートルX 10センチメートル薄いアクリル板に機械加工シリンダーを接着。
実験の日に：
電極の5準備
- 2250μmの直径の銀ワイヤの7センチメートルの長さを切断し、次に塩化銀（AgClの）コーティングを形成するために2時間の漂白にその先端を浸します。灰色は、塩化銀のコーティングが（ 図2E）を形成したことを示しています。
- ガラスカッターを使用して、長さ10cm分け、1 / 0.58 OD / IDミリメートルホウケイ酸クラスcapil2 5cmの毛細血管にラリ。
- 34ゲージのmicrofil針を使用すると、PEG-DMAヒドロゲルと毛細血管を埋めます。キャピラリーの外に膨潤水和ヒドロゲルを防止するために、先端に3mmの隙間を維持し、毛細血管内に気泡がないことを確認してください。
- ヒドロゲル満たさ毛細血管（ 図2E）にはAg / AgCl電極を挿入します。
- UVスポットガンを用いてW 1で2分間のUV光への曝露の際にフリーラジカル重合を介してPEG-DMAヒドロゲルを硬化させます。
6.実験のセットアップ
注：実験はパッチアンプのアース接続に接地ファラデーケージの下に設定されています。
- オスコネクタ（ 図2E）を持つまっすぐな微小電極ホルダーにマイクロピペットのいずれかを接続します。
- パッチアンプ（ 図2A）のヘッドステージに微小電極ホルダーを接続します。ょんを接続するには地面にdstageは、ヘッドステージのための適切なコネクタに18ゲージの絶縁銅線をはんだ付けしてください。
- 3軸の手動マイクロマニピュレーターにヘッドステージをマウントします。ヘッドステージ取付板を取り付けます（これは機械工場で作られたマイクロマニピュレーターやカスタムと一緒に購入する必要があります）マイクロマニピュレーターにし、適切なネジを使用して取付板にヘッドステージを接続します。
- ラボ製コネクタを介してリニアアクチュエータに2つ目のマイクロピペットを取り付けた後、第2マイクロマニピュレーター（ 図2B）の両方をマウントします。マイクロピペットは、整列され、互いに対向し、水平方向に水平にする必要があります。注意：マニピュレータのブランドやスタイルは重要ではありません。
- ガラスバイアルで、V23T MSCLのプロテオリポソーム溶液を0.01ミリリットルとDPhPCリポソームの0.1ミリリットルを混ぜます。
注：この手順は、安定した脂質bilayeの形成に重要であるタンパク質対脂質比（〜0.0002）を、軽減するために必要とされますR。
- 34ゲージのmicrofil針を使用して、プロテオリポソーム溶液（ 図3A）との両方のマイクロピペットの先端を埋めます。
- 正立顕微鏡の上に貯蔵器を置き、反対側の1ミリメートルの穴（ 図2B）を介してマイクロピペットを養います。注：任意の顕微鏡があれば液滴がはっきりと見ることができたで使用することができます。
- ヘキサデカン（99％）で表面に貯水池を埋めます。ヘキサデカンはさらに精製を必要としません。
- 第10μmの直径ホウケイ酸ガラスのマイクロピペットを使用し、マイクロピペットの先端に球形の液滴を形成するために、マイクロピペットの先端に希釈V23T MSCLのプロテオリポソーム溶液（〜0.00052ミリリットル）を分与し、形成するために、第三のマイクロマニピュレータに取り付けられました液滴（ 図3）。
- 所望に応じて液滴（体積を減少または増加させることによって）の大きさを制御し、単層を完全に形成するためにそれらを10分間休ませ（Figure 3）。
- 接触液滴をもたらす、二層の形成は、1〜2分以内に発生します。
7.ソフトウェアおよび機器のセットアップ
- コンピュータ、顕微鏡、圧電発振器コントローラ、関数発生器、パッチ増幅器、低雑音データ収集システムをオンにすることによってソフトウェアを準備します。
注：任意のパッチアンプを使用することができ、次の手順では、我々が使用され、資機材リストに記載されているもののために特別です。 - パッチアンプのフロントパネルには、VHOLD / IHOLDとV CLAMPに「モード」ノブを設定してください。
- フロントパネルの「 ローパス」ベッセル 2に1 kHzから出力ゲインにフィルター設定します。
- 全細胞β= 1の「構成」に設定します。
- ノブの残りの部分はゼロまたは中立位置に設定されていることを確認。
- 5 kHzですべてのDIB電流測定サンプル1 kHzのベッセルアンチエイリアシングフィルタと。
- デスクトップのアイコンをダブルクリックしてソフトウェアを実行します。
- 「デジタイザ 」ダイアログを開き、「設定>デジタイザ」をクリックし、「変更」ボタンをクリックします。
- 「変更デジタイザ」ダイアログで「デジタイザタイプ」リストから「Digidata 1440シリーズ」を選択します。
- デジタイザを検出するために、[スキャン]ボタンをクリックします 。
- 「変更デジタイザ」ダイアログを終了してから、「デジタイザ」ダイアログを終了し、「OK」をクリックし、「OK」をクリックします。
- 「設定>ラボベンチ」をクリックしてください 。
- 実験台の入力信号]タブでは、デジタイザチャンネルの下オングストロームでアナログを選択します。 0.002のスケール係数を設定します。
脂質二重層の形成8
- BNCケーブルを使用すると、AWの出力を接続します外部コマンド入力前にaveformジェネレータは、（データ・アクイジション・システムの背面パネルに）切り替えます。ヘッドステージに10ヘルツ、500 mVのPKツーPK三角波を送信します。
- マイクロマニピュレーターを用いて、（通常は約1〜2分）、彼らは少し触れると発生する間伐二重層を待つまで接触液滴をもたらすために、水平ガラスマイクロピペットを移動する（ 図3Cおよび 3D）。
注：二重層形成プロセスの進行を顕微鏡で視覚的に見ることができ、電流測定によってモニターすることができる（ 図4）。
- 小滴の位置を制御することにより、二層のサイズ（直径〜250μm）を調整し、マイクロマニピュレーターを使用して、アクチュエータに搭載されています。注意：二重層の大きさは、顕微鏡を通して視覚的に推定することができました。この方法は、簡単に研究者が簡単にすることによって二層のサイズを制御できるようになりますマイクロマニピュレータを用いて液滴を移動させます。
9.ダイナミック励起およびMSCLゲーティング
- 二重層が形成され（ すなわち、二重層が破壊または導電性でない）安定していたら、関数発生器を使用して正弦波信号を送信することによって、液滴を刺激します。
- 二重層に組み込まMSCLタンパク質を刺激するために、圧電サーボコントローラ175ミクロンのピーク・ツー・ピーク振幅、0.2 Hzの周波数、および50％のデューティサイクルの正弦波形を送信します。 （波形の様々なタイプの異なる振幅、周波数、およびデューティサイクルで送信することができます）
10.処理と結果の解釈
- .ABF形式で、データ収集システムを使用して記録された電流の測定値を、保存。関数ファイル」abfload」を使用してMATLABに（.ABF形式）データをインポートするには、そのデータを分析し、処理します。 「abfload "ファイルには、無料のオンラインのために利用可能です。
- 見積もりトン適切なカメラを使用して記録されている完全な作動サイクル中の液滴の動画を使用して二層と液滴の面積拡大に彼は緊張、。
- 水/油の界面の面積、並びに液滴間の角度を推定するために画像処理技術を使用して、個々のフレームを処理することによって、MATLABで処理ビデオ、。注：ビデオから取った2Dフレームを使用するには、水-油界面（ すなわち、液滴のエッジ）を検出し、回転することによって表面積を推定します。
Representative Results
図1及び脂質二重膜の機械的刺激の過程でタンパク質活性を記録するために2ディスプレイ実験および機器を使用しました。我々の測定に電気的なノイズを最小限に抑えるため、ワークステーションは、ラボ製ファラデーケージ内に配置され、AxoPatch 200 Bアンプのアース接続に接地されています。
安定した絶縁脂質二重層の形成は、この研究の重要なステップです。この構成では、脂質単層は、有機溶剤の浴に浸漬水性液滴の油/水界面で組み立てます。液滴が接触するように配置されると、余分な油を排除し、2つの分子の厚さの脂質二重層に対向する脂質単分子層が薄くされます。二層の特性評価に使用される最も一般的な手法は、電圧クランプです。電流を測定しながら、電圧クランプを用いて、二重層の両端の電圧を一定値に維持される。 図4 cm 2）を5知ること、形成された二層の面積を算出することができます。二重層の領域は、液滴（ 図4A）の位置を変えることによって制御することができます。圧電アクチュエータを使用して、異なる周波数、振幅およびデューティサイクルの波形（正弦波、方形、三角形、 等 ）の異なるタイプが水平の液滴に適用され、軸方向にそれらを振動、したがって、二重層の張力及び面積を変更することができることができ（ 図4B）。
DIBを機械的に刺激されると、膜を横切る一定のDC電位を維持しながら、MSCLの低しきい値（機能獲得）V23T変異体は、主にサブ導通状態と時折フルオープンイベントを含む信頼性の高い活動を生成する（ 図5） 。これらのEVエントは、精製V23T MSCLで再構成し、無傷の内側大腸菌膜及びリポソームからのパッチクランプ法を用いて記録したものと同じです。 図5の結果は、ゲーティングを証明するすべての電流スパイクがピーク圧縮で観察されているので、張力の増加に応じて発生します。ピーク圧縮では、液滴の相対面積の拡大が最大であるため、界面での張力が最大です。
DC電圧は、膜36を横切って印加されたときアラメチシン、電位依存性イオンチャネルであり、最も研究されたペプチドの一つは、膜透過性を増加させます。膜貫通タンパク質およびペプチドをホストする脂質二重層界面の能力もアラメチシンペプチドを用いた電圧 - ゲート電流の記録を行うことによりテストされます。アラメチシンは、100ng / mlの最終濃度にリン脂質溶液と混合される。 図6は、下の電流測定値を示しています電圧クランプ（115 MV）。この実験では、小滴二層インターフェイスとより高い抵抗とより小さな静電容量を達成するために、引き離されています。アラメチシンペプチドのゲーティング動作は、現在の（ 図6）の離散的なステップを通して示されています。プロットの右側のヒストグラムは、基本的には、チャネル自体の最初のコンダクタンスレベルである基準レベル（0.0962 NS）から、コンダクタンスの変化を示しています。
図1：メイン部品やオイルリザーバの寸法を説明する模式オイルリザーバーはバージニア工科大学の機械工場で製造されています。これは、アクリル板の表面に接着し、機械加工、円筒状のアクリルの管で構成されています。寸法および設計は、異なるアプリケーションまたは二つ以上のマイクロピペットを収容するように修正することができます。/53362/53362fig1large.jpg「ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：実験セットアップとマイクロピペットの調製（A）を形成するための標準的なワークステーション、機械的刺激、及び界面二重層を特徴付けることは、顕微鏡、3軸マニピュレータ、デジタルカメラ、圧電発振器、除振台、ファラデーケージを含みます。 （図示せず）。 （B）実験は、水平ヘキサデカン油浴内に配置された2つの対向PEG-DMAヒドロゲル満たさマイクロピペットで構成されています。マイクロピペットの各々は、電気的接続を提供するためのAg / AgCl電極を含んでいます。プロテオリポソーム溶液で満たされた第三のマイクロピペットは、他のマイクロピペットの先端で液滴を形成するために使用されます。 （C）DIB電流応答を測定することができますパッチ増幅器及び低雑音データ収集システムの組み合わせを使用して。 （D）Aは、マイクロピペットの先端に形成された水性液滴を示す写真をクローズアップ。 （E）のAg / AgCl電極は、漂白剤二つ250μmの銀ワイヤの先端を浸漬することによりなされます。電極はその後固化するUV光で硬化されるPEG-DMAのヒドロゲルで充填された2つのホウケイ酸ガラスキャピラリーを介して供給されます。オスコネクタストレート微小電極ホルダーはパッチ増幅器のヘッドステージにマイクロピペットのいずれかを接続するために使用されます。
図3：液滴界面二重層の形成を示す写真（A）プロテオリポソームを充填した10μmのマイクロピペットは、マイクロピペット先端に近接する、顕微鏡の下に配置されています。マイクロピペットに接続された注射器を使用して、小容量を分配プロテオリポソームの所望の体積の球状液滴を形成します。液滴は10分間座ってできるようにすることで、単層の形をしてみましょう。接触液滴をもたらします。界面でのすべての油が除去された後、二重層が形成されます。 （B）二重層が形成されているが、界面の両側の化学組成は、マイクロサイズのマイクロピペットを使用して所望の化学物質を注入することによって制御することができます。 （C）最初の接触の瞬間に液滴。 （D）脂質二重層が形成された液滴。
図4：リアルタイム測定値は初期間伐やインタフェースのその後の展開の両方を示し、（A）電流は、三角形の電位のアプリケーションを介して二層形成の過程で測定しました。測定された電流の大きさはCapaciのに正比例していますタンス、したがって、二重層界面の面積。インタフェース、およびその逆の面積より大きく、液滴が一緒にされる近づきます。機械的励起を印加する（B）は 、二重層界面の面積が増加し、刺激信号と同じ周波数で減少します。
図5：リアルタイム測定は、機械的励起に二重層の応答だけでなく、MSCLのV23T変異体のゲーティングを示す電流応答の形状は、結果として二重層容量の正弦波変化に関係する、正弦波です。二層の面積変化。電流スパイクは、各サイクルのピーク時に発生する、V23T変異体のサブコンダクタンスゲーティングを示しています。さらに極座標プロットは、二層の界面での緊張の増加を反映して、ゲートがピーク圧縮で生じていることを示しています。
図6：電圧クランプと組み込まれたアラメチシンチャネルのゲーティング活動のためのコンダクタンスレベルの対応するヒストグラムの下の電流測定アラメチシンペプチドのゲーティング動作は、電流の個別の段階的増加によって示されています。コンダクタンスレベルはバージニア工科大学7で私たちの研究グループによって行われる前の測定値と非常によく一致します。
Discussion
Mechanosensationは生物に進化した第1の感覚の伝達経路のいずれかを意味します。 DIBのメカノ電気的特性を研究し、理解するため、この現象を利用して、機能的な刺激応答性材料に向けた重要なステップです。これは、脂質二重層インターフェースの張力の増加を検出することmechanoelectrical変換器とひずみゲージとしてDIBに、機械受容チャネル、MSCLの取り込みおよび活性化を伴います。別のノートでは、MSチャネルの機能は、厚さ、内部曲率、および圧縮を含む脂質二重層の基本的な材料特性を介して調節することができます。前述の光では、マイクロピペットベースの技術は、研究者のDIBで、MSチャンネルを研究し、脂質二重層の構造と同様に、脂質 - タンパク質相互作用への洞察を提供する能力を可能にする貴重なツールを提供します。
過去3十年にわたってSは、パッチクランプは、電圧と緊張の両方のクランプを可能にするので、MSチャネルを研究する主な方法でした。しかし、パッチクランプは小型化、感覚および変換デバイスのエンジニアリングのために要求される特性に適しかさばる機器ではなく、する必要があります。そのシンプルさ、安定性、および小型化に起因するのDIBはMSCLの活性を研究するために適した環境を表しています。ここでは、液滴と二層インターフェイスのサイズ、各液滴の化学組成、および動的刺激を介して界面における張力を制御する能力を、マイクロピペットベースの手法を提案することによってDIB形成技術の前の進歩を拡張します。技術は同軸上にガラスキャピラリーに反対の先端に、プロテオリポソームを含む、水性液滴を固定する構成されています。液滴は、有機溶媒の浴中に置き、界面での接触脂質二重層の形態で運ばれているとき。
マイクロピペットは、pに接続されています液滴の水平変位を可能iezoelectric発振器、。動的に液滴を圧縮し、水中油界面二重層と張力の増加したがってにおける界面張力の増加をもたらします。二つの主要な側面が類似しており、最近発表されたコンタクトバブル二重層（CBB）技術37からこのメソッドを区別しています。本明細書に提示される技術を使用して、二層の大きさは、マイクロマニピュレーターを使用して制御されるため、液滴の体積は、CBB法とは異なり、一定のままです。また、CBB技術が構築することが簡単で容易になり、本論文で提示された方法で必要とされていない圧力ポンプ、を求めています。
私たちは、組み込み、パッチピペットまたは化学修飾38を使用せず、初めての細菌MSCLを刺激することができます。システムは堅牢な非対称脂質二重膜の形成を促進するので、より密接リットルを模倣生体膜で見つかったIPID非対称。これは、私たちはMSCLの活性に対する制御膜組成や非対称性の影響を研究することができます。さらに、画像処理技術を介して、この方法は、二層界面における張力を推定するのに役立ちます。 DIBにバルクと表面力の間の相互変換の原理を理解する上でこの技術を支援は、基本的な膜特性の測定を容易にし、膜張力にMSCL応答の理解を向上させます。
この方法はMSCLを研究するために生体分子刺激応答性材料系に向けて、さまざまな生理的環境に歩近づく私たちがかかりますが、システムには限界があります。このシステムでは、張力により油/水界面での緊張を緩和する傾向が各小滴中のリポソームの形態で脂質リザーバの存在にクランプすることができません。そのため、現在では機械受容チャネルを刺激することができますのみ動的政権でのDIBインチシステム中の気泡の存在は、かなりの実験の精度、再現性に影響を与えます。ヒドロゲル内に存在する気泡は、電気的な接続の場合の損失を生じる可能性があります。
我々はMSCLの刺激のためのマイクロピペットに基づく方法の使用を記載しているが、技術は、MSのチャネルの他の種類を研究するために使用され、生体分子の多様性を研究するために研究者によって使用される可能性を有することができます。例えば、同様の設定は、チャネルフリー液滴界面の二分子膜のmechanoelectrical応答を研究するために我々の研究室で使用されています。様々なタンパク質が再構成し、各生体分子の再構築環境が変化することを考慮して取って、この高度に制御された設定を使用して活性化することができます。この資料に記載されているメソッドは、研究者の想像力に制限されてかなり広い応用の可能性にも触れて。
Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
この刊行物で報告研究は科学研究の基本的なイニシアティブ助成FA9550-12-1-0464の空軍オフィスによってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm filter | Corning | 430624 | |
| 1,2-diphytanoy-sn-glycero-3-phosphocholine (DPhPC) | Avanti Polar Lipids | 850356P | Purchased as lyophilized powder |
| 34-gauge microfil | World Precision Instruments | MF24G-5 | |
| 400 mL Centrifuge bottels | ThermoFisher | 3141 | Nalgene |
| Agilent Function/Arbitrary Waveform Generator, 20 MHz | Keysight Technologies | 33220A | |
| Ampicillian | ThermoFisher | BP1760 | ACS Grade |
| Avanti® Mini-Extruder | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
| Axio Scope.A1 | Carl Zeiss | - | |
| AxioCam HSm | Carl Zeiss | - | |
| Axopatch 200B Amplifier | Molecular Devices | - | |
| BCA protein assay kit | Pierce | 23225 | |
| BK Precision 4017B 10 MHz DDs Sweep/Function Generator | Digi-Key | BK4017B-ND | |
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Dialysis tubing | 7 Spectra/Por | 132113 | MWCO 8000, 7.5 mm diameter |
| DigiData 1440A system | Molecular Devices | - | |
| DNAse | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| DPhPC | Avanti | 850356C | |
| E-625 PZT Servo-Controller | Physik Instrumente | E-526 | |
| FPLC System | Pharmacia Biotech | - | |
| HCl | J.T. Baker | 9535-33 | |
| Hexadecane, 99% | Sigma-Aldrich | 544-76-3 | |
| Homoginizer | Wheaton | 357426 | 15 mL |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | |
| IPTG | Affymetrix | 17886 | |
| IRGACURE® 2959 | IRGACURE® | 555047962 | |
| Isopore Membrane Filters | EMD Millipore | VCTP02500 | |
| Isopropyl Alcohol | VWR International | BDH1133-4LP | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | ACS Grade |
| KH2PO4 | Mallinckrodt | 7100 | ACS Grade |
| Kimble-Chase | Kontes | 420401-1515 | Flex-Column |
| LED-100 UV Spot Curing System | Electro-Lite, corp. | 81170 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| Manual Patch-Clamp Micromanipulators | Thorlabs | PCS-520N | |
| MgCl2 | ThermoFisher | M33 | ACS Grade |
| Microelectrode Holder | World Precision Instruments | MEH1S | |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| MOPS, minimum 99.5% titration | Sigma-Aldrich | M1254-100G | |
| N2 Gas | Airgas | UN1066 | |
| NaCl | EMD | SX0420-1 | ACS Grade |
| Ni NTA agarose beads | Qiagen | 1000632 | |
| Optically Clear Cast Acrylic Tube, 2-1/2" OD x 2" ID | McMaster-Carr | 8486K545 | |
| P-601 PiezoMove Flexure-Guided Linear Actuator | Physik Instrumente | P-601 | |
| PAGE gel | Bio-Rad | 456-9033 | |
| Parafilm M® All-Purpose Laboratory Film | Parafilm® | PM999 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Poly(ethylene glycol)1000 dimethacrylate | Polysciences, Inc. | 15178-100 | |
| Polycarbonate (PCTE) Membrane Filters, Black, 0.4 Micron, 25mm, 100/Pk | Sterlitech Corporation | PCTB0425100 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P5405-500G | |
| Powder Free Soft Nitrile Examination Gloves | VWR International | CA89-38-272 | |
| Replacement Gasket 1.0mm | World Precision Instruments | GO1-100 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L5750 | |
| Silver wire | GoodFellow | 147-346-94 | Different diameters could be used depending on the application |
| Sodium Azide | Affymetrix | 21610 | |
| Test tubes | ThermoFisher | 14-961-27 | 12 x 130 mm |
| Tryptone | ThermoFisher | BP1421 | |
| Ultracal 30K | Millipore | UFC803024 | Amicore Ultra 30 MWCO |
| VWR Light-Duty Tissue Wipers | VWR International | 82003-820 | |
| VWR Scientific 50D Ultrasonic Cleaner | VWR International | 13089 | |
| Water Purifier | Barnstead | D11931 | |
| Yeast | ThermoFisher | BP1422 | |
| β-octylglucopyranoside | Anatrace | O311S |
References
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