Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Multifunksjonell Mikropipette-basert metode for innlemmelse og Stimulering av bakteriell Mechanosensitive ionekanaler i dråpe Interface bilag

Published: November 19, 2015 doi: 10.3791/53362
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 5, 3, 4
1Department of Mechanical Engineering, Virginia Polytechnic Institute and State University, 2School of Biomedical Engineering and Sciences, Virginia Polytechnic Institute and State University, 3Department of Biology, University of Maryland, 4College of Engineering, University of Georgia, 5Department of Engineering Sciences and Mechanics, Virginia Polytechnic Institute and State University

Summary

Kan brukes bakterie mechanosensitive kanaler som mechanoelectrical transdusere i biomolekylære enheter. Dråpe grensesnitt bilag (DIBS), celle-inspirerte byggesteinene til slike enheter, representerer nye plattformer å innlemme og stimulere mechanosensitive kanaler. Her viser vi en ny mikropipette-basert fremgangsmåte for å danne dibs, slik at studiet av mechanosensitive kanaler under mekanisk stimulering.

Abstract

MsCl, en stor ledningsevne mechanosensitive kanal (MSC), er en allestedsnærværende osmolyte utløsningsventil som hjelper bakteriene overlever brå hypo-osmotisk sjokk. Det har blitt oppdaget og strengt studert ved hjelp av patch-clamp teknikk for nesten tre tiår. Dens grunnleggende rolle sette spenning påføres til cellemembranen inn i permeabilitet respons det er en sterk kandidat for å fungere som en mechanoelectrical transduser i kunstige membran-baserte biomolekylære enheter. Visning som byggesteiner til slike enheter, kan dråpe grensesnitt dobbeltlag (DIBS) brukes som en ny plattform for inkorporering og stimulering av MsCl kanaler. Her beskriver vi en mikropipette basert metode for å danne dibs og måle aktiviteten av de inkorporerte MsCl kanaler. Denne metoden består av lipid-innkapslet vanndråper forankret til tuppen av to motstridende (koaksialt posisjon) borsilikatglass mikropipetter. Når dråpene bringes i kontakt, i en lipid bilag-grensesnittdannet. Denne teknikken gir kontroll over den kjemiske sammensetningen og størrelsen av hver dråpe, så vel som dimensjonene av bilaget grensesnittet. Ha en av de mikropipetter festet til en harmonisk piezoelektrisk aktuator gir muligheten til å levere en ønsket svingnings stimulus. Gjennom analyse av former av dråpene under deformasjon, kan den i spenn ved grenseflaten estimeres. Ved hjelp av denne teknikken, er den første aktivitet av MsCl kanaler i et system DIB rapportert. Foruten MS kanaler, kan virksomheten til andre typer kanaler bli studert ved hjelp av denne metoden for å bevise at multi-funksjonaliteten til denne plattformen. Metoden som presenteres her muliggjør måling av egenskaper fundamental membran, gir en bedre kontroll over dannelsen av symmetriske og asymmetriske membraner, og er en alternativ måte for å stimulere og studere mechanosensitive kanaler.

Introduction

I det siste tiåret har monteringen av kunstige lipidbilag blitt vesentlig avanserte gjennom utviklingen av dråpe grensesnittet bilaget metoden. Kjent som stabil og robust, pålegges DIBS seg som alternative modellsystemer til den klassiske malt (Mueller) og foldet (Montal-Mueller) planar bilag 1. Selv om ideen om å bruke dråper å skape lipidbilag dateres tilbake til 1960-tallet 2, har det ikke fått popularitet inntil nylig. Den første vellykkede forsøk ble rapportert av Takeushi gruppe 3, etterfulgt av flere studier som viser bilagsdannelse ved hjelp av et nettverk av små dråper av Bayley gruppe 4-6. Mer nylig ble innkapslingsteknikker foreslått av Leo gruppe 7-9, som var en pioner konseptet med å bruke DIBS som byggeklosser av nye stimuli-responsive materielle systemer 10. I tidligere studier har DIBS bevist sin evne til å svare på elektrisk 9,11, chemical 10,12, og optisk stimuli 13. Ulike biomolekyler med ulike stimuli-responsive funksjoner har blitt effektivt stimulert når tilberedt i DIB 10,14. I lys av disse vellykkede forsøk et viktig spørsmål blir reist: kunne DIB reagerer på mekanisk stimulans når egnede biomolekyler er innarbeidet? Grenseflate krefter som virker på en DIB forskjellige fra de i andre dobbeltlag system 15,16. Derfor kan spenningen i bilaget holdt av dråpene reguleres ved å regulere spenningen på vann-lipid-oljegrenseflater; et konsept ikke aktuelt med malte eller brettet bilags systemer.

MsCl kanaler, viden kjent som osmolyte slipper ventiler og grunnleggende elementer av bakteriell cytoplasmamembranen, reagerer på økt membran spenning 17,18. I tilfelle av hypo-osmotiske sjokk, flere kanaler bosatt i membranen av en liten celle 19 kan generere en massive permeabilitet respons til raskt frigjøre ioner og små molekyler, sparer bakterier fra lyse 20. Biophysically, MsCl er godt studert og karakterisert primært gjennom fremtredende patch clamp teknikken 21-23. Pålitelige strukturelle modeller som forklarer MsCl sin portmekanisme 24,25 foreslås basert på sin homolog krystallstruktur 26,27, modellering 28, og resultatene av omfattende eksperimentering 24,29-31. I henhold til en påført spenning på ~ 10 mN / m, lukket kanal, som består av en tett bunt av transmembran-helikser, transformeres inn i en ring av sterkt vinklet helikser som danner en ~ 28 en vannfylt pore ledende 21,24,32. Det er også blitt fastslått at hydrofobisiteten til tett port, plassert i skjæringspunktet mellom de indre TM1 domenene, bestemmer aktivering terskelen av kanalen 33. Tilsvarende ble det funnet at ved å redusere hydrofobisiteten av porten, den tension terskel kunne senkes 22. Denne egenskapen av MsCl gjort mulig utforming av forskjellige styrbare ventiler 34, primært for medikamentleverings formål. For alle de nevnte egenskapene, og basert på sin grunnleggende rolle sette cellemembranen dreven spenninger i elektrovirksomhet, gjør MsCl en flott plass som en mechanoelectrical svinger i Dibs.

I denne artikkelen presenterer vi en original mikropipette basert metode for å danne DIBS og måle aktiviteten av de inkorporerte MsCl kanaler under mekanisk stimulering. Vi rapporterer for første gang, responsen fra DIBS til mekanisk stimuli og funksjonell rekonstituering av V23T lavterskel mutant av MsCl i Dibs 35.

Den eksperimentelle systemet består av lipid innkapslet vanndråper forankret til tuppen av to motstridende borsilikatglass mikropipetter. Når dråpene bringes i kontakt med en lipid bilag-grensesnitt er foRMED. Denne teknikken gir kontroll over den kjemiske sammensetningen og størrelsen av hver dråpe (bulk), så vel som dimensjonene av bilaget grensesnittet. I tillegg kunne asymmetriske membraner med forskjellig lipid sammensetning i hvert blad lett bli dannet. Ha en av de mikropipetter festet til en harmonisk piezoelektrisk aktuator, gjør det mulig å anvende en forprogrammert enkelt syklus eller oscillerende stimulus. Spenningen blir levert til den kunstige membran gjennom komprimering av begge dråper som støtter den. Som et resultat av dråpedeformasjon, de områdene av vann-lipid-olje-grensesnitt øke, og samtidig vinkelen mellom dråpene synker, forårsaker en økning i membran spenning og forbigående MsCl aktivering. Gjennom analyse av former av dråpene under deformasjon, kan den i spenn ved grenseflaten estimeres. Selv om fokuset i denne artikkelen er på mekanisk-transduksjon egenskapene til DIB, vi også understreke at andre typer biomolekyler, slik som alamethicin, kan bli aktivert av denne multi-funksjonelle plattform. Vi presenterer her, alle de tekniske aspektene ved utarbeidelse, montering, og ta målinger med denne nye metoden i en steg-for-steg måte.

Protocol

1. Utarbeidelse av PEG-DMA Hydrogeler

  1. Velg et passende måle / blandebeholderen (kolbe, beger, osv.) For programmet. Rengjør den grundig med såpe og vann, og tørk den med lofri vev vindusviskere.
  2. Bruk hansker for å unngå å forurense glass med oljer fra fingertuppene. Skyll beholderen med nok deionisert vann for å fjerne såperester.
  3. Tørk av beholderen med lofri vev for å bli kvitt vannet, deretter spray med isopropylalkohol (IPA, 99,5%) og tørk til ren. Plasser den i et vakuumkammer for å tillate alle IPA helt fordampe. Rens resten av laboratorieutstyr som brukes i hydrogelen formingsprosessen med destillert vann.
  4. For å fremstille en 40% (w / v) PEG-DMA-løsning hydrogel, veier 4 g av poly (etylenglykol) dimetakrylat (PEG-DMA; molekylvekt = 1000 g / mol) polymer ved hjelp av en laboratorieskala.
  5. Plasser veide PEG-DMA i kolbe og varme ved hjelp av en sonicator bad på 45-55 ° C inntil det faste PEG-DMA er flytende. I løpet av prosessen, å dekke åpningen av kolben med Parafilm / vokspapir for å holde vannet ute.
  6. Når PEG-DMA har flytende, tilsett bufferløsning (500 mM KCl, 10 mM MOPS, pH 7,0) til totalt volum når ~ 10 ml (nok for flere eksperimenter i løpet av en seks måneders periode).
  7. Tilsett herder ved 0,5% (w / v). I dette tilfellet, tilsett 0,05 g av herdemidlet og 10 ml blanding. Plasser kolben tilbake i sonikator badet og at komponentene oppløses i oppløsning (ca. 10 min, 250 watt).

Merk: Når herdemidlet er blitt tilsatt til løsningen, vil hydrogelene herde (størkne) dersom de utsettes for en lyskilde for en tilstrekkelig tidsperiode. For å bidra til å bekjempe dette, vikle flasken / beholderen med svart tape og oppbevar den på et mørkt sted. Denne løsningen kan lagres i flere uker ved romtemperatur (22 ° C).

2. Utarbeidelse av liposomes

  1. Forbered 10 ml av en 2 mg / ml lipid-løsning ved tilsetning av 10 ml buffer (500 mM KCl, 10 mM MOPS, pH 7,0) for å 20 mg av 1,2-diphytanoyl- sn -glycero-3-fosfokolin (DPhPC) syntetisk lipider kjøpt som lyofilisert pulver. Sørg for at både lipidvesikler og bufferløsning er godt blandet (blandingen skal se homogen og disig når alt er oppløst).
  2. Freeze (-20 ° C) og helt tine nye lipidblandingen for totalt seks ganger. La blandingen tine ved romtemperatur, aldri i et oppvarmet miljø.
  3. Ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig ekstruder, ekstruderes lipidene ved å tvinge hele lipid suspensjonen først gjennom en 0,4 pm polykarbonatmembranfilter og deretter seks ganger gjennom et 0,1 pm membranfilter. Denne prosessen gir partikler med en diameter i nærheten av 100 nm (lik porestørrelsen på filteret).

MERK: Andre lipider og lipidforhold kan være forberedt på å bruke dette megthod. Liposomer bør lagres ved 4 ° C i flere uker.

3. MsCl Isolering og Rekonstituering

  1. Strek ut en temperatur agarose plate, inneholdende 100 ug / ml ampicillin, E. coli MJF465 celler med et plasmid som bærer pB10b V23T MsCl gen utvides med en seks-His-koden på 3'-enden (C-terminus). La maskinen kulturen over natten (12-16 timer) ved 37 ° C i en stasjonær inkubator. Plasmidet som er valgt for og fastholdt i celler med 100 ug / ml ampicillin i standard LB medium. Den neste dag sted 20 ml LB-medium med 100 ug / ml ampicillin i en dyrking vesikkel (en 50 ml kolbe, eller det som er tilgjengelig for å holde kulturen). Ta platen som ble dyrket over natten, og velg en koloni fra platen til å overføre (vaksinere) til det klargjorte 20 ml LB media med en steril vaksinasjon pinne. Tillat den 20 ml kultur til å vokse over natten (12-16 timer) ved 37 ° C ved 250 rpm på en risteinkubator.
  2. Dekanter 20 ml overnight kultur i 2-4 liter LB-medium. Ampicillin er ikke lenger nødvendig. Rist kolbene i en risteinkubator ved 250 rpm ved 37 ° C inntil OD600 når 0,5. Legg Isopropyl β-D-1-tiogalaktopyranosid (IPTG) til en endelig konsentrasjon på 0,6 mM, og kulturen la gå i en time (til OD600 = 0,8-1,0).
  3. Sette flaskene på is for å kjøle ned de kulturer og samle bakterier ved sentrifugering. Bruke seks 400 ml koniske rør (eller så mange som det tillates av rotor brukt) og sentrifuger i 5 til 8 minutter ved 7438 xg, som er tilstrekkelig til å pelletere bakteriene. Dekanter supernatanten, og gjenta prosedyren til alle cellene fra media er høstet. Antall spinn som kreves varierer ut fra hvor mye kultur som har blitt dyrket og rotoren brukes. For en 2 L kultur er det bare nødvendig å spinne ned cellene gang. Overfør alle høstes cellene i en enkelt sentrifugerør.
  4. Resuspender cellen pellets i ~ 20 ml av fransk presse buffer (100 mM KPi og 5 mM MgCl2, pH 7,4). Suspensjonen skal være tett (som fløte eller melk). Umiddelbart før fransk pressing av suspensjonen legge proteaseinhibitoren fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF) til en sluttkonsentrasjon på 2 mM og blandes kraftig.
  5. Fransk-press kulturen, i en 35 ml fransk-press celle, på 10 000 til 16 000 psi. Spinne ned suspensjonen for å skille ut den ubrutte cellene ved 7438 xg, 10 min ved 4 ° C.
  6. Sett av væsken i et eget rør, og legge til det lysozym og DNase (0,2 mg / ml hver). La supernatant riste i 10 minutter ved romtemperatur.

MERK: DNase er valgfritt; det reduserer viskositeten for den høyhastighetssentrifugering. Lysozym er kritisk; det fordøyer restene av celleveggen og bidrar til å øke utbyttet av membranen ekstraksjon utført med en mild, ikke-denaturerende detergent.

  1. Fordel supernatanten mix i to ultrasentrifuge rør og spinne dem på106,883-153,911 xg (avhengig av rotor) ved 4 ° C i 40 min. Etter sentrifugering blir supernatanten dekantert, og det brunaktige pellet på bunnen (total membranfraksjon) kan bli frosset i røret for langtidslagring (- 80 ° C) eller brukes for umiddelbar proteinrensing.
  2. Forbered 0,5-1 liter Høy imidazolbuffer: 100 mM NaCl + 500 mM -imidazol, titrere til pH 7.2 til 7.4 med konsentrert HCl. Legg merke til at imidazol er en god bufrende substans i seg selv.
  3. Forbered 0,5-1 L av lav Imidazol-buffer: 100 mM NaCl, + 15 mM imidazol, ved passende fortynning av bufferen ovenfor med 100 mM NaCl. Ingen pH-justering er nødvendig.
  4. Ta 100-150 ml av hver buffer i separate flasker, og tilsett 1% (w / v) b-oktyl glukopyranosid (OG). Rør løsningen godt og filtrerer den gjennom et 0,22 um filter. Disse løsningene er de lav- og høy-imidazol- kromatografi løsninger.
  5. Forbered Utvinning buffer, ta 50 ml Low-imidazolbuffer, og legge til 3% (w / v)OG og filtrere buffer.
  6. Bruke membran pellets av 0,5-2 g våtvekt for protein isolasjon. Legg 5-7 ml ekstraksjonsbuffer, resuspender pelleten, og homogenisere den i en 30 ml hånd-drevet homogenisator glass-stempel. Med 5-10 milde strøk foreta en homogen suspensjon uten klumper. Vær forsiktig, er skjærspenningen kjent for å forårsake protein denaturering.
  7. Spinne ned de uoppløselige partikler (mellomtoner sentrifuge med fast vinkel rotor, 38,478-68,405 xg, ved 4 ° C i 15 min). I mellomtiden, ta 3 ml Ni NTA perler (6 ml suspensjon) og vaske dem én gang med lav-imidazolbuffer (w / o OG) ved å riste dem i et 15 ml rør med skrukork. La perlene bosette seg på bunnen (~ 5-7 min) eller spinne dem ned på 129-201 xg i ett minutt ved 4 ° C. Når pelleten dannes, dekanter supernatanten forsiktig for hånd og gjenta prosedyren. Ekvilibrere perlene med 2-3 ml av 3% OG ekstraksjonsbuffer.
  8. Bland homogenisert blanding (membranpelleten og utvinning buffer) fra 3.12 med 3-3,5 ml Ni NTA perler. La blandingen ristes i en skrukork i 60 min (batch-lasting). Spinn perlene ned ved 201 xg (30 sek), dekanter supernatanten for hånd, og vaske perlene med 1% OG lav-imidazolbuffer gang. Pellet perler som i 3.13 igjen og resuspender dem i 20-30 ml friskt lav-imidazol-buffer.
  9. Pakke en liten kolonne (utstyrt med en øvre flyt adapter) med Ni NTA perler, og la perlene bosette ved å åpne stoppekranen å la ekstrakt strømmen gjennom (tillater ikke perlene til tørk). Vask kulene med en porsjon av 10 ml lav-imidazol buffer (1% OG) med stoppventilen åpen.
  10. Laste kromatografi maskin med ren lav- og høy-imidazol- buffere ca 25 ml hver på maskinen definert strømningshastighet (varierer per maskin); Dette gjøres ved å føre lav-imidazolbuffer gjennom systemet først. Zero den optiske opptakeren på OD 260 (baseline). Legg merke til at bufferen er ganske forskjellig fra vann på grunn lavverdig imidazol har jegmpurities som absorberer UV. Sett flyten adapter til kolonnen og fest den til maskinen.
  11. Vask kolonnen på nytt med lav-imidazol-buffer (1 ml / min) inntil OD for strømningen gjennom gjelder når grunnlinjen (det kan ta 10-20 ml). Dette fjerner de ubundne proteiner fra kolonnen.
  12. Anvende en lineær gradient av imidazol 20 til 500 mM, i 30 minutter, ved 1 ml / min. Begynne å samle 4 ml fraksjoner når OD 600 viser en økning. De to første fraksjoner er fulle av løst bundne proteiner, mens MsCl-6His begynner eluering ved ~ 40% av den lineære gradient. Flertallet av proteinet vises i fraksjoner 3 til 8.
    MERK: en lineær økning av OD vil bli observert på grunn av den økende% av -imidazol.
  13. Pool fraksjonene 3-4, 5-6, og 7-8 sammen. Eventuelt konsentrerer fraksjonene individuelt. Konsentrer fraksjonene 6-10 ganger bruker sentrifugal filtre. Etter en 20 minutters sentrifugering ved 804 xg og ved 4 ° C, resuspender den konsentrerte protein omhyggelig,proteinet har en tendens til å holde seg til filteret.
  14. Uttak 50 ul porsjoner, bland dem med SDS sample buffer, og sjekk for protein renhet bruker PAGE gel elektroforese.
    MERK: MsCl vil migrere som en uklar bånd på omtrent 17 kDa til bunnen av gelen.
  15. Bruk konsentrerte fraksjoner å kvantifisere protein ved hjelp av et protein assay kit, etter produsentens anvisninger. Et typisk utbytte av en 0,8 g membran pellet er opp til 0,2 mg rent protein i de kombinerte fraksjoner.
  16. Rekonstituere V23T MsCl inn DPhPC liposomer gjennom dialyse. Ta en 10 mg / ml kloroformoppløsning av DPhPC og aliquot 0,5 ml (dvs. 5 mg lipid) av den i tre disponible rund bunn (12 x 130 mm) glassrør. Tørk lipid under strømmen av nitrogen og fjerne restene av kloroform under vakuum (4-6 timer).
  17. Tilsett 15 mg 20 pulverisert OG til den tørre lipid i hvert rør, oppløse det i 2 ml dialysebuffer (100 mM KCl, 5 mM KPi, pH 7,2), vortex, og mildly sonicate. De OG-oppløst lipider bør danne en klar løsning.
  18. Legg konsentrerte V23T MsCl løsninger til hvert rør for å oppnå 1: 100, 1: 300 og 1: 1000 protein-til-lipid-forhold og vortex brønn. Klipp og vask tre stykker (~ 12 cm lang) i dialyseslangen (MWCO 8000, 7,5 mm diameter, har tre par nummererte klipp ferdige.)
  19. Plasser solubiliserte lipid-proteinblandinger inne i røret, forsiktig lukke endene med klips, og dialyser mot 2 liter buffer (100 mM KCl, 5 mM KPi, pH 7,2) i 48 timer ved 4 ° C med fire endringer av buffer hver 12 time. Etter dialyse, ble Proteo-liposomene er klare.

MERK: liposomoppløsningen kan bli supplert med 2 mM NaN3 (natriumazid) og lagret ved 4 ° C. Unngå å fryse.

4. Produksjon av oljereservoaret

  1. Bor to motstående hull (1,0 mm i diameter) hele veien gjennom veggen av en 2 tommers diameter, 1,5 cm lang akryl cylInder på 1 cm fra bunnen (figur 1A).
  2. Bor to 4 mm hull konsentrisk til det tidligere borede hull på 1 mm. Dypet av hullene skal være 1 mm hver (sørg for ikke å bore hele veien). Disse hullene er laget for å passe på gummipakningene.
  3. Sted og lim to gummipakninger med 1 mm indre diameter i de større hullene for å hindre olje fra å lekke.
  4. Lim maskinert sylinder til en 10 cm x 10 cm tynn akryl ark ved hjelp av noen multipurpose epoxy (figur 1).

På dagen for forsøket:

5. Fremstilling av elektroder

  1. Skjær en 7 cm lengde på to 250 pm diameter sølvtråder, og deretter dyppe sine tips i blekemiddel i to timer for å danne en sølv-klorid (AgCl) belegg. En grå farge indikerer at en AgCl belegget har blitt dannet (figur 2E).
  2. Ved hjelp av en glass cutter, dele en 10 cm lang, 1 / 0,58 OD / ID mm borosilikat klasse capilLary i to 5 cm kapillærer.
  3. Ved hjelp av en 34 måler Microfil nål fylle kapillærene med PEG-DMA hydrogel. For å hindre at hydrert hydrogel fra hevelse ut av kapillært, holde en 3 mm klaring på tips og sørge for at det ikke er luftbobler i kapillærene.
  4. Sett inn Ag / AgCl elektroder inn i hydrogel fylt kapillærene (Figur 2E).
  5. Cure PEG-DMA hydrogel ved fri-radikal-fotopolymerisering ved eksponering for UV-lys i 2 minutter ved en W ved bruk av en UV-flekk pistol.

6. Sette opp Experiment

MERK: Forsøket er satt opp under et Faraday bur jordet til jording på lappen forsterker.

  1. Fest en av mikropipetter til en rett microelectrode holder som har en hannkontakt (figur 2E).
  2. Koble microelectrode holderen til heads av plasteret forsterkeren (Figur 2A). Slik kobler du til headstage til bakken, lodde en 18 gauge isolert kobbertråd til en passende kontakt for heads.
  3. Monter heads på en 3-akse manuell micromanipulator. Fest headsmonteringsplate (det bør kjøpes sammen med mikromanipluatoren eller skreddersydde i et maskinverksted) til mikromanipluatoren og deretter koble heads til monteringsplaten ved hjelp av egnede skruer.
  4. Fest den andre mikropipette til lineær aktuator gjennom en lab-laget kontakt og deretter montere både på andre micromanipulator (figur 2B). De mikropipetter bør motsette hverandre, justert, og i vater horisontalt. Merk: merkevare og stil av manipulatorer ikke saken.
  5. I et hetteglass, bland 0,1 ml av DPhPC liposomer med 0,01 ml av V23T MsCl proteoliposome løsning.

MERK: Dette trinnet er nødvendig for å redusere protein-til-lipid-forhold (~ 0,0002), som er kritisk for dannelse av en stabil lipid bilayer.

  1. Ved hjelp av en 34 måler Microfil nål, fyll tips av begge mikropipetter med proteoliposome løsning (figur 3A).
  2. Plasser reservoaret på toppen av en oppreist mikroskop, og mate mikropipetter gjennom motstandernes 1 mm hull (figur 2B). MERK: noen mikroskop kan brukes så lenge på dråpene kunne sees tydelig.
  3. Fyll reservoaret til overflaten med heksadekan (99%). Den heksadekan trenger ikke ytterligere rensing.
  4. For å danne de sfæriske dråper på tuppen av mikropipetter, bruke en tredje 10 mikrometer-diameter borsilikatglass mikropipette, montert på en tredje micromanipulator, å dispensere utvannet V23T MsCl proteoliposome oppløsning (~ 0,00052 ml) på tuppen av mikropipetter og danner dråper (figur 3).
  5. Kontrollere størrelsen på dråpene (ved å redusere eller øke volumet) som ønsket, og la dem hvile i 10 min for monolagene for å danne fullstendig (Figur 3).
  6. Bringe dråpene i kontakt, vil oppstå bilagsdannelse i løpet av 1 til 2 min.

7. Sette opp programvare og utstyr

  1. Forbered programvaren ved å slå på datamaskinene, mikroskop, piezoelektrisk oscillator kontrolleren, funksjons generatorer, patch forsterker, og støysvak datainnsamling system.
    MERK: noen patch forsterkeren kunne brukes og følgende instruksjoner er spesielt for den vi brukte, og som er oppført i listen over materialer og utstyr.
  2. På frontpanelet av plasteret forsterker, satt på "Mode" knotter til VHOLD / IHOLD og V-Klammer.
  3. På frontpanelet sette "Lowpass" Bessel Filter til 1 kHz og Output Gain til to.
  4. Sett "Configuration" til hele cellen β = 1.
  5. Sørg for at resten av knottene er satt til null eller i nøytral posisjon.
  6. Prøve alle DIB strømmålinger på 5 kHzmed en 1 kHz Bessel anti-aliasing-filter.
  7. Kjøre programvare ved å dobbeltklikke på ikonet på skrivebordet.
  8. Klikk på "Konfigurer> Digitaliserer" for å åpne "Digitaliserer" dialog, og klikk deretter på "Endre" -knappen.
  9. I "Change Digitizer" dialogen velg "Digidata 1440 Series" fra "digital Type" liste.
  10. Klikk på Skann-knappen for å oppdage digitaliserings.
  11. Klikk "OK" for å avslutte "Change Digitaliserer" dialog, og klikk "OK" for å avslutte "Digitizer" dialogen.
  12. Klikk på "Konfigurer> Lab Bench".
  13. I inngangssignalene fanen i lab Bench Velg Analog i A under Digitizer kanaler. Sett skaleringsfaktor til 0.002.

8. Dannelse av det ytterste lipid bilaget

  1. Ved hjelp av en BNC kabel, koble utgangen av awaveform generator til ekstern kommando innspill foran slått (på baksiden av datainnsamlingssystemet). Send en 10 Hz, 500 mV pk-to-pk trekantet bølgeform til heads.
  2. Bruke mikromanipluatoren, flytte glass mikropipetter horisontalt for å få dråper i kontakt før de litt røre og vente på bilaget tynning å skje (vanligvis rundt 1 til 2 min) (Tall 3C og 3D).

MERK: Progresjon av bilaget dannelsesprosessen kan ses visuelt gjennom mikroskopet og kan overvåkes ved måling av strøm (figur 4).

  1. Justere størrelsen bilaget (~ 250 mikrometer i diameter) ved å kontrollere posisjonen til den som er montert på aktuatoren dråpe, ved hjelp av mikromanipulator. Merk: bilaget størrelse kan estimeres visuelt gjennom mikroskop. Denne fremgangsmåte gjør det lettere for forskeren til å kontrollere størrelsen av bilaget ved enkeltflytting dråpene ved hjelp av micromanipulators.

9. Dynamisk Eksitasjon og MsCl gating

  1. Når bilaget har dannet seg og som er stabilt (dvs. dobbeltlaget ikke bryter eller ledende), stimulerer dråpene ved å sende et sinusformet signal ved hjelp av en funksjonsgenerator.
  2. For å stimulere den MsCl protein inkorporert i bilaget, sende en sinusformet bølgeform med en 175 um topp-til-topp amplitude, frekvens 0,2 Hz, og 50% arbeidssyklus til den piezoelektriske servo-styreenheten. (Ulike typer kurver kunne sendes med forskjellige amplituder, frekvenser og driftssyklus)

10. prosessering og tolkning av resultater

  1. Redd strømmålinger, spilt inn med datainnsamling system, i .ABF format. Importere data (i .ABF format) til Matlab ved hjelp av en funksjon file "abfload", deretter analysere og behandle dataene. Den "abfload" filen er tilgjengelig for gratis online.
  2. Estimat tHan spenning i bilaget og arealutvidelse av dråpene, ved hjelp av videoer av dråpen under fulle aktiverings sykluser som er tatt opp med et passende kamera.
  3. Prosess videoene i Matlab, ved behandling av de enkelte rammer ved hjelp av bildebehandlingsteknikker for å estimere arealet av vann / oljeovergangen, så vel som vinkelen mellom dråpene. MERK: ved hjelp av en 2D ramme tatt fra video, detektere vann-olje-grensesnittet (dvs. kanten av dråpen) og deretter beregne overflatearealet ved omdreining.

Representative Results

Figurene 1 og 2 viser det eksperimentelle oppsettet, og utstyr som brukes til å registrere proteinaktivitet i løpet av mekanisk stimulering av lipid dobbeltlag-membranen. For å minimere elektrisk støy i våre målinger, er arbeidsstasjonen plassert i en lab-laget Faraday bur, jordet til jording på AxoPatch 200 B forsterker.

Dannelse av et stabilt isolerende lipid bilag er et viktig steg i denne studien. I dette arrangement sammen et lipid monolag ved olje / vann-grenseflaten av de vandige dråper nedsenket i et bad av et organisk løsningsmiddel. Når dråpene bringes i kontakt, er overflødig olje elimineres, og de motstående lipid monolag tynn til en to-molekyl tykt lipidbilag. Den vanligste teknikken som brukes i bilags karakterisering er spennings klemme. Med spennings-klemme, blir spenningen over bilaget holdes på en konstant verdi, mens strømmen blir målt. Figur 4 2) 5 av DPhPC lipid bilaget, kan arealet av den dannede dobbeltlaget beregnes. Bilaget området kan kontrolleres ved å endre posisjonen av dråpene (figur 4A). Ved hjelp av den piezoelektriske aktuatoren, kan forskjellige typer av bølgeformer (sinusformet, firkantet, trekantet, osv.) Ved forskjellige frekvenser, amplituder, og driftsperioder påføres på dråpene til horisontalt og aksialt svinge dem og dermed kunne bilags spenning og området endres (Figur 4B).

Når DIB er mekanisk stimulert, og samtidig opprettholde en konstant DC potensial over membranen, genererer et lavterskel (gain-of-funksjon) V23T mutant av MsCl pålitelige aktiviteter som hovedsakelig sub-ledende stater og tidvis fulle åpnings hendelser (Figur 5) . Disse eventene er identiske med de som er registrert ved hjelp av patch-clamp teknikk fra intakte indre E. coli-membraner og liposomer rekonstituert med det rensede V23T MsCl. Resultatene i figur 5 viser at portstyrings oppstår i respons til en økning i spenning, siden alle strømtopper observeres ved maksimal komprimering. På det meste kompresjon, er den relative areal utvidelse av dråpene maksimal og derfor er maksimal spenning på grensesnittet.

Alamethicin, en spenning-gated ionekanal og en av de mest studerte peptider, øker membranpermeabilitet når en likespenning påtrykkes over membranen 36. Evnen til det ytre lipid bilaget grensesnittet for å være vert for transmembranproteiner og peptider blir også testet ved å utføre spennings gating strømopptak ved hjelp alamethicin peptid. Alamethicin blandes med fosfolipid oppløsning til en endelig konsentrasjon på 100 ng / ml. Figur 6 viser strømmålinger i henhold spenning klemme (115 mV). Dråpene i dette eksperiment er trukket fra hverandre for å oppnå liten bilags-grensesnitt og dermed høyere motstand og mindre kapasitans. Den gating oppførselen til Alamethicin peptid er vist gjennom diskrete trinn av strøm (figur 6). Histogrammet på høyre side av tomten viser endringene i konduktans fra basisnivået (0.0962 NS), som er i hovedsak den første ledningsevnenivået av kanalen selv.

Figur 1
Figur 1:. En skjematisk beskriver de viktigste deler og dimensjoner på oljereservoaret oljereservoaret er produsert ved maskinen butikk på Virginia Tech. Den består av en maskinert sylindrisk akryl rør limt til overflaten av en akrylplate. Dimensjonene og design kan endres for å tilpasses forskjellige applikasjoner eller mer enn to mikropipetter./53362/53362fig1large.jpg "Target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2:. Experimental oppsett og mikropipetter forberedelse (A) Standarden arbeidsstasjon for forming, mekanisk stimulerende, og karakterisere grensesnittet dobbeltlag inkluderer et mikroskop, 3-akslet manipulatorer, et digitalt kamera, piezoelektrisk oscillator, vibrasjon isolasjon bord, og et Faraday bur (ikke vist). (B) Den eksperimentelle oppsett består av to motstående PEG-DMA-hydrogel fylt mikropipetter horisontalt plassert inne i et bad av heksadekan olje. Hvert av mikropipetter inneholder en Ag / AgCl-elektrode for å tilveiebringe elektrisk forbindelse. En tredje mikropipette fylt med proteoliposome Oppløsningen brukes til å danne dråper på spissen av de andre mikropipetter. (C) Den DIB aktuelle reaksjon kan målesved hjelp av en kombinasjon av plasteret forsterkeren og lav støy datainnsamlingssystem. (D) En lukket opp bilde som viser de vandige dråper som dannes ved spissen av mikropipetter. (E) Ag / AgCl-elektroder er laget ved å dyppe enden av to 250 mikrometer sølvtråder i blekemiddel. Elektrodene blir så matet gjennom to borsilikatglass kapillærer fylt med PEG-DMA hydrogel, som herdes med UV-lys for å størkne. En rett microelectrode holder med mannlige kontakten brukes til å koble en av mikropipetter til heads av plasteret forsterkeren.

Figur 3
Fig. 3: bilder som illustrerer dannelsen av dråpegrensesnitt dobbeltlag (A) En 10 mikrometer mikropipette fylt med proteoliposomes er plassert under mikroskopet i nærhet til mikropipette tips. Ved hjelp av en sprøyte koblet til mikropipette, dispensere små volumerav proteoliposomes å danne sfæriske små dråper til ønsket volum. La monolaget skjema ved å la dråpene til å sitte i ti minutter. Ta dråpene i kontakt; bilaget danner etter all olje på grenseflaten elimineres. (B) Når dobbeltlaget er dannet, kan den kjemiske sammensetningen på begge sider av grenseflaten kan styres ved å injisere ønskede kjemikalier ved anvendelse av en mikro-størrelse mikropipette. (C) Dråpene i øyeblikket for første kontakt. (D) De små dråper når det ytre lipid bilaget er dannet.

Figur 4
Figur 4: sanntidsmålinger viser både den opprinnelige tynning og påfølgende utvidelse av grensesnittet (A) Current målt i løpet av bilagsdannelse gjennom anvendelse av en trekantet elektrisk potensial.. Størrelsen av den målte strøm er direkte proporsjonal med capaciheten, og dermed området av bilaget grensesnittet. Jo nærmere dråpene bringes sammen, jo større arealet av grenseflaten, og vice versa. (B) Ved anvendelse av mekanisk eksitasjon, området av bilaget grensesnitt øker og minker på samme frekvens som det stimulerende signal.

Figur 5
Fig. 5: sanntidsmålinger viser responsen av bilaget til mekanisk eksitasjon, så vel som portstyringen av V23T mutant av MsCl Formen av strømresponsen er sinusformet, som er relatert til en sinusformet forandring i bilaget kapasitans som et resultat av bilaget området endres. De nåværende pigger, som opptrer ved toppen av hver syklus, indikerer sub-konduktans gating av V23T mutant. En polar tomten videre indikerer at gating oppstår på topp komprimering, noe som gjenspeiler en økning i spenning på bilaget grensesnittet.


Fig. 6: Strøm målinger i henhold til spenningsklemmen og tilhørende histogram av ledningsevnenivåer for gating aktivitet av inkorporerte Alamethicin kanaler gating oppførselen til Alamethicin peptid er vist gjennom den diskrete trinnvis økning i strøm. De konduktans nivåer matche godt med tidligere målinger utført av vår forskningsgruppe ved Virginia Tech 7.

Discussion

Mechanosensation betegner en av de første sensoriske overføringsveier som utviklet seg i levende organismer. Ved hjelp av dette fenomenet for å studere og forstå Mekano-elektriske egenskapene til DIB, er et avgjørende skritt mot funksjonelle stimuli-responsive materialer. Det innebærer inkorporering og aktivering av en mechanosensitive kanal, MsCl, i DIB som en mechanoelectrical transduser, og en strekkmåler for å detektere spenning økning i lipid bilaget grensesnittet. På et annet merke, kan funksjonen av MS kanaler reguleres gjennom de grunnleggende materialegenskaper lipiddobbeltlag inkludert tykkelse, egenverdi kurvatur, og kompressibilitet. I lys av ovennevnte, tilveiebringer mikropipette basert teknikk et verdifullt verktøy slik at forskeren evnen til å studere MS kanaler i Dibs og gir innsikt i strukturen i det ytre lipid bilaget, samt lipid-protein interaksjoner.

Over de siste tre tiårs, patch-clamp var den primære metode for å studere MS kanaler, da den tillater fastklemming av både spenning og strekk. Men patch-clamp krever noe utstyr og ikke egnet for miniatyrisering, en egenskap som kreves for prosjektering av sensoriske og konvertering enheter. Dibs på grunn av sin enkelhet, stabilitet og kompakthet representerer et egnet miljø for å undersøke aktiviteten av MsCl. Her har vi utvider tidligere fremskritt i DIB-dannelsesteknikker ved å foreslå en mikropipette basert teknikk, med muligheten til å kontrollere størrelsen på dråpene og bilaget grensesnitt, den kjemiske sammensetningen av hver dråpe, og spenningen ved grenseflaten gjennom dynamisk stimulering. Teknikken består av forankring vanndråper, som inneholder proteoliposomes, til tuppen av koaksielt motstridende glasskapillærer. Dråpene blir plassert i et bad av organisk løsningsmiddel, og når de bringes i kontakt med et lipidbilag dannes i grenseflaten.

De mikropipetter er festet til piezoelectric oscillatorer, slik at horisontal forskyvning av dråpene. Dynamisk komprimering av dråpene, resulterer i en økning av grenseflatespenningen i vannet oljeovergangen, og derfor en økning i dobbeltlaget spenning. To viktige aspekter skille denne metoden fra lignende og nylig publisert kontakt boble bilaget (CBB) teknikk 37. Ved å bruke den teknikk som presenteres her, er størrelsen av bilaget styres ved hjelp micromanipulators og dermed volumet av dråpene forblir konstant, i motsetning til i CBB metoden. I tillegg krever den CBB teknikk for trykkpumper, som ikke er nødvendig i metoden som presenteres i denne artikkelen å gjøre det enklere og enklere å bygge.

Vi er i stand til å innlemme og stimulere bakteriell MsCl for første gang, uten bruk av en patch pipette eller kjemiske modifikasjoner 38. Siden systemet letter dannelsen av robuste asymmetriske lipidbllag membraner, nærmere etterligner det lipid asymmetri i biologiske membraner. Dette gir oss muligheten til å studere effekter av kontrollert membran sammensetning eller asymmetri på aktiviteten til MsCl. I tillegg, gjennom bildebehandlingsteknikker, denne fremgangsmåten bidrar til å estimere spenningen på bilaget grensesnittet. Denne teknikken hjelper til å forstå prinsippene for interconversion mellom bulk og overflatekrefter i DIB, letter målinger av grunnleggende egenskapene membran, og bedrer forståelsen av MsCl respons til membran spenning.

Selv om denne metoden tar oss et skritt nærmere mot en biomolekylære stimuli-reagerende materiale og system til et annet fysiologisk miljø for å studere MsCl, er det begrensninger i systemet. Spenning i dette systemet ikke kan klemmes fast på grunn av tilstedeværelse av lipid-reservoaret i form av liposomer i hver dråpe, som har en tendens til å avlaste spenninger ved olje / vann-grenseflaten. Derfor, i dag mechanosensitive kanaler kan stimuleresi Dibs bare i en dynamisk regime. Tilstedeværelsen av luftbobler i systemet i betydelig grad påvirker den presisjon og reproduserbarhet av forsøkene. Luftbobler som er tilstede i hydrogelene kan medføre tap hvis elektrisk forbindelse.

Mens vi beskriver bruken av mikro pipette basert metode for stimulering av MsCl, kan den teknikk som brukes til å studere andre typer av MS-kanaler, og har potensiale til å bli brukt av forskere for å studere en rekke biomolekyler. For eksempel har lignende oppsett vært brukt i vårt laboratorium for å studere mechanoelectrical responsen for en kanal-fri dråpe grensesnitt dobbeltlag-membranen. Ulike proteiner kan bli rekonstruert og aktiveres ved hjelp av denne svært kontrollert oppsett, tar i betraktning at rekonstitusjonstiden miljøer i hver biomolekyl variere. Metoden som beskrives i denne artikkelen berører et betydelig bredere anvendelsespotensial som er bare begrenset til fantasien av forskeren.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forskning rapportert i denne publikasjonen er støttet av Air Force Office of Scientific Research Basic Initiative Grant FA9550-12-1-0464.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm filter Corning 430624
1,2-diphytanoy-sn-glycero-3-phosphocholine (DPhPC) Avanti Polar Lipids 850356P Purchased as lyophilized powder
34-gauge microfil World Precision Instruments MF24G-5
400 mL Centrifuge bottels ThermoFisher 3141 Nalgene
Agilent Function/Arbitrary Waveform Generator, 20 MHz Keysight Technologies 33220A
Ampicillian ThermoFisher BP1760 ACS Grade
Avanti® Mini-Extruder Avanti Polar Lipids 610000
Axio Scope.A1 Carl Zeiss -
AxioCam HSm Carl Zeiss -
Axopatch 200B Amplifier  Molecular Devices -
BCA protein assay kit Pierce  23225
BK Precision 4017B 10 MHz DDs Sweep/Function Generator Digi-Key BK4017B-ND
Borosilicate Glass Capillaries World Precision Instruments 1B100F-4
Dialysis tubing 7 Spectra/Por 132113 MWCO 8000, 7.5 mm diameter
DigiData 1440A system Molecular Devices -
DNAse Sigma-Aldrich DN25
DPhPC Avanti 850356C
E-625 PZT Servo-Controller  Physik Instrumente E-526
FPLC System Pharmacia Biotech -
HCl J.T. Baker 9535-33
Hexadecane, 99% Sigma-Aldrich 544-76-3
Homoginizer Wheaton 357426 15 mL
Imidazole Sigma-Aldrich I5513
IPTG Affymetrix 17886
IRGACURE® 2959 IRGACURE® 555047962
Isopore Membrane Filters  EMD Millipore VCTP02500
Isopropyl Alcohol VWR International BDH1133-4LP
KCl Sigma-Aldrich P3911 ACS Grade
KH2PO4 Mallinckrodt 7100 ACS Grade
Kimble-Chase Kontes 420401-1515 Flex-Column
LED-100 UV Spot Curing System Electro-Lite, corp. 81170
Lysozyme Sigma-Aldrich L6876
Manual Patch-Clamp Micromanipulators Thorlabs PCS-520N
MgCl2 ThermoFisher M33 ACS Grade
Microelectrode Holder  World Precision Instruments MEH1S
Micropipette Puller Sutter Instruments P-1000
MOPS, minimum 99.5% titration Sigma-Aldrich M1254-100G
N2 Gas Airgas UN1066
NaCl EMD SX0420-1 ACS Grade
Ni NTA agarose beads Qiagen 1000632
Optically Clear Cast Acrylic Tube, 2-1/2" OD x 2" ID McMaster-Carr 8486K545
P-601 PiezoMove Flexure-Guided Linear Actuator Physik Instrumente P-601
PAGE gel Bio-Rad 456-9033
Parafilm M® All-Purpose Laboratory Film Parafilm® PM999
Phenylmethylsulfonyl fluoride Sigma-Aldrich P7626
Poly(ethylene glycol)1000 dimethacrylate Polysciences, Inc. 15178-100
Polycarbonate (PCTE) Membrane Filters, Black, 0.4 Micron, 25mm, 100/Pk Sterlitech Corporation PCTB0425100
Potassium Chloride  Sigma-Aldrich P5405-500G
Powder Free Soft Nitrile Examination Gloves  VWR International CA89-38-272
Replacement Gasket 1.0mm World Precision Instruments GO1-100
SDS Sigma-Aldrich L5750
Silver wire GoodFellow 147-346-94 Different diameters could be used depending on the application 
Sodium Azide Affymetrix 21610
Test tubes ThermoFisher 14-961-27 12 x 130 mm
Tryptone ThermoFisher BP1421
Ultracal 30K Millipore UFC803024 Amicore Ultra 30 MWCO
VWR Light-Duty Tissue Wipers VWR International 82003-820
VWR Scientific 50D Ultrasonic Cleaner VWR International 13089
Water Purifier Barnstead D11931
Yeast ThermoFisher BP1422
β-octylglucopyranoside Anatrace O311S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Montal, M., Mueller, P. Formation of bimolecular membranes from lipid monolayers and a study of their electrical properties. P NATL ACAD SCI USA. 69, 3561-3566 (1972).
  2. Tsofina, L., Liberman, E., Babakov, A. Production of bimolecular protein-lipid membranes in aqueous solution. Nature. , (1966).
  3. Funakoshi, K., Suzuki, H., Takeuchi, S. Lipid Bilayer Formation by Contacting Monolayers in a Microfluidic Device for Membrane Protein Analysis. ANAL CHEM. 78, 8169-8174 (2006).
  4. Holden, M. A., Needham, D., Bayley, H. Functional bionetworks from nanoliter water droplets. J AM CHEM SOC. 129, 8650-8655 (2007).
  5. Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. Asymmetric droplet interface bilayers. J AM CHEM SOC. 130, 5878-5879 (2008).
  6. Maglia, G., et al. Droplet networks with incorporated protein diodes show collective properties. Nat Nano. 4, 437-440 (2009).
  7. Sarles, S. A., Stiltner, L. J., Williams, C. B., Leo, D. J. Bilayer formation between lipid-encased hydrogels contained in solid substrates. ACS APPL MATER INTER. 2, 3654-3663 (2010).
  8. Sarles, S. A., Leo, D. J. Regulated attachment method for reconstituting lipid bilayers of prescribed size within flexible substrates. ANAL CHEM. 82, 959-966 (2010).
  9. Sarles, S. A. Physical Encapsulation of Interface Bilayers. , Virginia Polytechnic Institute and State University. (2010).
  10. Sarles, S. A., Leo, D. J. Membrane-based biomolecular smart materials. SMART MATER STRUCT. 20, 094018 (2011).
  11. Sarles, S. A. The use of virtual ground to control transmembrane voltages and measure bilayer currents in serial arrays of droplet interface bilayers. SMART MATER STRUCT. 22, 094023 (2013).
  12. Sarles, S. A., Leo, D. J. Cell-inspired electroactive polymer materials incorporating biomolecular materials. SPIE Smart Structures and Materials+ Nondestructive Evaluation and Health Monitoring. , 797626 (2011).
  13. Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. Asymmetric droplet interface bilayers. Journal of the American Chemical Society. 130, 5878-5879 (2008).
  14. Bayley, H., et al. Droplet interface bilayers. MOL BIOSYST. 4, 1191-1208 (2008).
  15. White, S. H. Analysis of the torus surrounding planar lipid bilayer membranes. BIOPHYS J. 12, 432 (1972).
  16. Tien, H. T., Ottova, A. L. The lipid bilayer concept and its experimental realization: from soap bubbles, kitchen sink, to bilayer lipid membranes. J MEMBRANE SCI. 189, 83-117 (2001).
  17. Perozo, E. Gating prokaryotic mechanosensitive channels. NAT REV MOL CELL BIO. 7, 109-119 (2006).
  18. Kung, C., Martinac, B., Sukharev, S. Mechanosensitive channels in microbes. ANNU REV MICROBIOL. 64, 313-329 (2010).
  19. Bialecka-Fornal, M., Lee, H. J., DeBerg, H. A., Gandhi, C. S., Phillips, R. Single-cell census of mechanosensitive channels in living bacteria. PLoS ONE. 7, e33077 (2012).
  20. Levina, N., et al. Protection of Escherichia coli cells against extreme turgor by activation of MscS and MscL mechanosensitive channels: identification of genes required for MscS activity. The EMBO Journal. 18, 1730-1737 (1999).
  21. Chiang, C. -S., Anishkin, A., Sukharev, S. Gating of the large mechanosensitive channel in situ: estimation of the spatial scale of the transition from channel population responses. BIOPHYS J. 86, 2846-2861 (2004).
  22. Anishkin, A., Chiang, C. -S., Sukharev, S. Gain-of-function mutations reveal expanded intermediate states and a sequential action of two gates in MscL. J GEN PHYSIOL. 125, 155-170 (2005).
  23. Sukharev, S. I., Sigurdson, W. J., Kung, C., Sachs, F. Energetic and Spatial Parameters for Gating of the Bacterial Large Conductance Mechanosensitive Channel, MscL. J GEN PHYSIOL. 113, 525-540 (1999).
  24. Deplazes, E., Louhivuori, M., Jayatilaka, D., Marrink, S. J., Corry, B. Structural investigation of MscL gating using experimental data and coarse grained MD simulations. PLOS COMPUT BIOL. 8, e1002683 (2012).
  25. Bacterial ion channels and their eukaryotic homologs. Kubalski, A., Martinac, B. , (2005).
  26. Chang, G., Spencer, R. H., Lee, A. T., Barclay, M. T., Rees, D. C. Structure of the MscL homolog from Mycobacterium tuberculosis: a gated mechanosensitive ion channel. Science. 282, 2220-2226 (1998).
  27. Steinbacher, S., Bass, R., Strop, P., Rees, D. C. Structures of the prokaryotic mechanosensitive channels MscL and MscS. Mechanosensitive Ion Channels, Part A. , 1-24 (2007).
  28. Sukharev, S., Durell, S. R., Guy, H. R. Structural models of the MscL gating mechanism. BIOPHYS J. 81, 917-936 (2001).
  29. Perozo, E., Cortes, D. M., Sompornpisut, P., Kloda, A., Martinac, B. Open channel structure of MscL and the gating mechanism of mechanosensitive channels. Nature. 418, 942-948 (2002).
  30. Betanzos, M., Chiang, C. -S., Guy, H. R., Sukharev, S. A large iris-like expansion of a mechanosensitive channel protein induced by membrane tension. NAT STRUCT MOL BIOL. 9, 704-710 (2002).
  31. Corry, B., Jayatilaka, D. Simulation of structure, orientation, and energy transfer between AlexaFluor molecules attached to MscL. BIOPHYS J. 95, 2711-2721 (2008).
  32. Wang, Y., et al. Single Molecule FRET Reveals Pore Size and Opening Mechanism of MscL. eLife. 3, e01834 (2014).
  33. Anishkin, A., Akitake, B., Kamaraju, K., Chiang, C., Sukharev, S. Hydration properties of mechanosensitive channel pores define the energetics of gating. J Phys Condens Matter. 22, 454120 (2010).
  34. Koçer, A., Walko, M., Meijberg, W., Feringa, B. L. A light-actuated nanovalve derived from a channel protein. Science. 309, 755-758 (2005).
  35. Najem, J., Dunlap, M., Sukharev, S., Leo, D. J. Mechanosensitive Channels Activity in a Droplet Interface Bilayer System. MRS Proceedings. 1621, (2014).
  36. Fox, R. O., Richards, F. M. A voltage-gated ion channel model inferred from the crystal structure of alamethicin at 1.5-Å resolution. Nature. 300, 325-330 (1982).
  37. Iwamoto, M., Oiki, S. Contact Bubble Bilayers with Flush Drainage. Sci Rep. 5, (2015).
  38. Barriga, H. M., et al. Droplet interface bilayer reconstitution and activity measurement of the mechanosensitive channel of large conductance from Escherichia coli. J R Soc Interface. 11, 20140404 (2014).

Tags

Bioteknologi bioteknologi (generelt) dråpe Interface bilag MsCl DPhPC mechanosensitive kanaler membran spenning lipidbilag biomolekylære enhet mechanoelectrical svinger DIB
Multifunksjonell Mikropipette-basert metode for innlemmelse og Stimulering av bakteriell Mechanosensitive ionekanaler i dråpe Interface bilag
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Najem, J. S., Dunlap, M. D.,… More

Najem, J. S., Dunlap, M. D., Yasmann, A., Freeman, E. C., Grant, J. W., Sukharev, S., Leo, D. J. Multifunctional, Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers. J. Vis. Exp. (105), e53362, doi:10.3791/53362 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter