Summary
يتم استخدام الآلية Flywalk نظام تتبع عالية الدقة الكمي للسلوك موجهة رائحة ذبابة الفاكهة في البطن.
Abstract
في بيئتها الطبيعية، والحشرات مثل الخل تطير ذبابة الفاكهة السوداء البطن مع قصف على كمية كبيرة من عطور متميزة كيميائيا. إلى تعقيد الأمور أكثر من ذلك، والروائح الكشف عنها من قبل الجهاز العصبي للحشرات هي عادة ليست واحدة بل خليط من المركبات تركيبتها ونسب تركيز تختلف. وهذا يؤدي إلى مبلغ لا نهائي تقريبا من المحفزات الشمية المختلفة التي يجب تقييمها من قبل الجهاز العصبي.
لفهم الجوانب التي من حافز رائحة تحدد تقييمها من قبل الطيران، ولذلك فمن المستحسن النظر بكفاءة السلوك الموجهة نحو رائحة العديد من عطور وخلطات رائحة. لربط السلوك إلى نشاط الخلايا العصبية مباشرة، يجب أن يكون كميا السلوك في إطار زمني للمقارنة وتحت ظروف التحفيز متطابقة كما في التجارب العصبية. ومع ذلك، فإن العديد من اختبارات بيولوجية حاسة الشم المستخدمة حاليا في ذبابة الفاكهة neuroethology هي بالأحرى specialized إما نحو الكفاءة أو نحو القرار.
Flywalk، تسليم رائحة وتتبع النظام الآلي، ويسد الفجوة بين الكفاءة والقرار. لأنها تتيح تحديد متى بالضبط حفزت حزمة رائحة ذبابة المشي بحرية، وتحديد animal's رد الفعل السلوكي الحيوي.
Introduction
الهدف الرئيسي من أي بحث neuroethological هو وجود علاقة سببية بين الدول نشاط الخلايا العصبية واحدة أو الدوائر العصبية وسلوك الكائن الحي. لتحقيق هذا الهدف نشاط الخلايا العصبية وينبغي رصد السلوك في ظل ظروف التحفيز متطابقة ويجب أن تكون هذه الشروط التحفيز مثالي مماثلة لتلك التي في الجهاز العصبي تحت المجهر تطورت لفهم. لا سيما عندما يتعلق الأمر اختبارات بيولوجية السلوكية، وهذه الشروط قد ثبت تاريخيا تطلبا جدا في الدروسوفيلاميلانوجاستر neuroethology حاسة الشم.
بعد إطلاق سراحه من المصدر، وأعمدة رائحة كسر بسرعة تصل إلى خيوط رقيقة مع نشر المضطرب الناجمة عن حركة الهواء كونها العامل الرئيسي الذي يحدد توزيع رائحة 1. ونتيجة لذلك، حشرة تبحر نحو مصدر الرائحة الخبرات التحفيز متقطعة مع حزم رائحة تتخللها فترات متفاوتة من الهواء النقي. على حد سواءوقد ثبت لاستغلال هذا النظام التحفيز متقطعة للملاحة ارتفاع عكس الريح على لقاء بلوم والغالب تتحرك عبر الرياح في غياب الروائح 2 - - المشي والحشرات الطائرة - بما في ذلك ذبابة الفاكهة 5. في حين أن إجراءات التحفيز في التجارب الفسيولوجية تحاكي إلى حد كبير تلك التي قد تواجه حشرة في بيئتها الطبيعية إما عن طريق توفير نفث واحدة من الروائح تتخللها فترات طويلة من الهواء النقي أو متواليات التحفيز ديناميكية 6-11، العديد من اختبارات بيولوجية السلوكية المستخدمة في ذبابة الفاكهة neuroethology مثل فخ فحص ، الساحات حقل مفتوح أو T-متاهة تعتمد على رائحة التدرجات 12-15. ومع ذلك، لأن التدرجات رائحة بالتعريف هي متغيرة في تركيز اعتمادا على مسافة واحدة من مصدر الرائحة، لا يمكن أن يعزى سلوك معين إلى تركيز رائحة الدقيق باستخدام هذه النماذج. بالإضافة إلى ذلك، المنحدر منالتدرج رائحة يعتمد بشكل كبير على الخصائص الفيزيائية للالرائحة. وهناك تدرج من مركب شديدة التقلب يكون أقل عمقا من تلك التي سببها مركب أقل تقلبا، وبالتالي أيضا من الصعب تتبع لكائن حي الاعتماد على قياس الاختلافات التركيز في الفضاء باعتبارها الوسيلة الوحيدة الملاحة 16-20، مما قد يؤدي إلى سوء فهم الأفضليات حاسة الشم ولا سيما في المقايسات الاختيار. وهذا التأثير هو أيضا ضار للغاية عند التحقيق في سلوك تجاه خليط من رائحة لأنه يؤدي إلى نسب مختلفة المكون مزيج عند كل نقطة في الفضاء، وبالتالي مرة أخرى يحول دون ارتباط واضح بين وظائف الأعضاء والسلوك.
بينما الذباب الخل تميل إلى تجميع على تخمر الفواكه، فهي الانفرادي في التنقل نحو مصادر الغذاء ومواقع وضع البيض. ومع ذلك، بدلا من اختبار الحيوانات الفردية العديد من النماذج السلوكية المستخدمة في ذبابة الفاكهة neuroetholoغراي دراسة السلوك الموجهة رائحة أفواج من الذباب وسجل جاذبية وجزء من الذباب اختيار رائحة أكثر من التحفيز السيطرة. وقد ساهمت هذه التجارب الفوج إلى حد كبير في فهم ذبابة neuroethology والعديد من الملاحظات التي أبداها استخدامها يمكن أن تؤكد التجارب واحد الطاير. ومع ذلك، فقد لوحظ أن الذباب يمكن أن تؤثر على كل قرار other's 21 و في الحالات القصوى تقييم رائحة يمكن ان تتحول من اللامبالاة إلى إبطال اعتمادا على الكثافة السكانية 22. بالإضافة إلى ذلك، النتائج من هذه الأنواع من التجارب في كثير من الأحيان لا توفر سوى نقطة نهاية سلسلة من القرارات السلوكية بدلا من مراقبة ما الطاير يقوم به بينما هو يفعل ذلك، وهو ما سيكون من المرغوب فيه عند محاولة ربط السلوك مع نشاط الخلايا العصبية. ويتناقض هذه التجارب فوج بدلا منخفضة الدقة التي كتبها عالية الدقة أساليب واحد يطير مثل الساحات رحلة المربوطة والمطاحن والتي تسمحلالملاحظة المباشرة من الاستجابات السلوكية في وقت تقديم الحوافز 20،23،24. ومع ذلك، والتجارب فوج لا تزال تحظى بشعبية، لأنها فعالة جدا وتعطي نتائج قوية حتى في نسبيا أحجام العينات منخفضة بسبب التباين بين الأفراد وبين المحاكمة وبلغ متوسط جزئيا خارج نظرا للمراقبة السكان على مدى فترات طويلة من الزمن. بينما رحلة المربوطة ومفرغة ربما توفر معيار الذهب بشأن عرض الحوافز والقرار الزماني، فقد تم تصميم الساحات تستخدم للحيوانات واحدة ولذلك فمن للحصول على أحجام العينات اللازمة لإجراء تحليل إحصائي تستغرق وقتا طويلا. وقد تم مؤخرا تطوير العديد من الطرق الأخرى التي تسمح للاكتساب البيانات بشكل أكثر كفاءة سلوكية عالية الدقة في توليفة مع نظام التحفيز واضحة المعالم. وتشمل هذه غير خاضعة للرقابة 3D تتبع من الذباب الخل متعددة في windtunnel في تركيبة مع دقيق 3D نموذج من عمود رائحة 5 25 ونموذج Flywalk 26.
في Flywalk، تقع 15 الذباب الفردية في أنابيب زجاجية صغيرة ومراقبتها باستمرار من قبل الكاميرا العامة في ظل ظروف الضوء الأحمر. تضاف الروائح إلى تيار الهواء المستمر من 20 سم / ثانية والسفر من خلال أنابيب زجاجية بسرعة ثابتة. وترطيب تيار الهواء بتمريرها من خلال 250 مل الزجاجات التي تحتوي على الماء المقطر (الرطوبة) قبل الدخول إلى نظام التسليم رائحة. يتم تسجيل مواقف flies' داخل منطقة مربع من الفائدة (ROI) تشمل أكثر من طول الأنابيب رائحة (باستثناء الحواف الخارجية للأنابيب (حوالي 5 ملم في كل جانب) حيث الذباب لا يمكن أن تتحرك أبعد السهم العلوي أو اتجاه الريح) في وقت قريب من العرض رائحة (الشكل 1A، B). يتم الاحتفاظ يطير الهويات المستمر من قبل ر نظام التتبعالاحجار الكريمه التجربة على أساس من Y-وظائف (أي حدود أنبوب زجاجي بهم). ويتحقق التحفيز رائحة باستخدام جهاز التحفيز متعدد المكون الذي يسمح بعرض ما يصل إلى 8 الروائح واحدة وجميع الخلطات الممكنة منها 26،29 (الشكل 1B). يتم التحكم في مسار التجربة من قبل الكمبيوتر الذي ينظم نظام التسليم رائحة وجمع درجات الحرارة والرطوبة المعلومات (الكمبيوتر 1، الشكل 1C). يتحكم هذا الكمبيوتر أيضا datalogger (بدء / إيقاف التسجيل) على جهاز كمبيوتر الثاني الذي يتابع باستمرار مواقف ذبابة في 20 لقطة في الثانية (الكمبيوتر 2). يطير المواقف، وضع صمام رائحة (أي نقطة في الوقت فتح صمام)، ID رائحة، درجة الحرارة والرطوبة حول دورات التحفيز رائحة يتم تسجيل على جهاز الكمبيوتر 2. وبهذه الطريقة معلومات عن رائحة ويطير متزامنة المواقف وتصديرها كملف .csv الملفات التي يمكن أن تزيد من معالجتها وتحليلها باستخدام إجراءات تحليل العرف مكتوب. بسببالنظام برمته هو الكمبيوتر التي تسيطر عليها، دون تدخل بشري ضروري خلال جلسة تجريبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد وصفت تفاصيل البناء والتقنية من Flywalk أماكن أخرى 26 (في حال وجود أي مشاكل إنشاء إعداد هذا، مزيد من المعلومات يمكن الحصول عليها من MK). نحن هنا نركز على تعليمات مفصلة عن طريقة التعامل مع نموذج من شأنها أن تساعد في الحصول على نتائج موثوقة.
1. يطير المناولة
- الخلفية الذباب في البلدان المنخفضة الدخل على الثقافات متوسطة الكثافة المتوسطة على الغذاء 27 ساعة تحت 12: 12 ساعة ضوء: نظام الظلام في 23-25 درجة مئوية والرطوبة النسبية 70٪. تحقيقا لهذه الغاية، والسماح الذباب 20-30 الكبار ظهرت حديثا لإنتاج الغذاء في قارورة كبيرة ل1 أسبوع، ثم تجاهل الذباب الكبار وانتظر ذرية في الظهور.
- جمع 30-40 ظهرت حديثا (عمر <24 ساعة) الذباب الكبار في السن ولهم في الجديدة قارورة تحتوي على المتوسط الغذائية 27 لمدة 3-5 أيام.
- أربع وعشرين ساعة قبل بدء التجربة السلوكية: نقل عن 30-40 تم جمعها سابقا 3-5 د من العمر (انظر 2.2) يطير إلى السادس الجديدآل تحتوي على الرطب المكونات رغوة المطاط أو ورقة الأنسجة رطبة باستخدام الشافطة.
ملاحظة: لا تخدير الذباب باستخدام CO 2.
2. إعداد إعداد Flywalk
- استخدام 250 مل الزجاجات كما الرطوبة. ملء الرطوبة مع 100 مل من الماء المقطر.
- إعداد قارورة رائحة.
- إعداد 500 ميكرولتر 10 -3 التخفيفات من الروائح نقية خلات الإيثيل، الإيثيل الزبدات، خلات isopentyl و2،3-butanedione في الزيوت المعدنية المذيبات.
- نعلق اثنين فحص الصمامات الكرة في رائحة القارورة. لاحظ أن الاختيار صمامات تسمح بتدفق الهواء أحادي الاتجاه فقط. ولذلك، ربط فحص الصمامات في مثل هذه الطريقة التي يمكن أن يدخل الهواء القارورة على جانب واحد وترك الأمر على الجانب الآخر.
- إزالة الغطاء من 200 ميكرولتر PCR أنبوب رد فعل. ماصة 100 ميكرولتر من كل تخفيف الرائحة في أنبوب رد فعل منفصل ووضع الأنابيب في قارورة رائحة منفصلة. كما تعد واحدة القارورة التي تحتوي على رائحة سوى منظمة اوكسفام الدولية المعدنية المذيباتل.
- بإحكام ختم القنينات رائحة من قبل إغلاقها باستخدام سدادات الفولاذ المقاوم للصدأ ومقاطع المطاط.
- ربط قارورة 5 رائحة (4 الروائح التي تحتوي على و1 تحتوي على الزيوت المعدنية) إلى نظام التسليم رائحة. تأكد من ربطها في اتجاه تدفق الصحيح. وهناك اتصال خاطئ لا يضر فقط التجربة المخطط لها، ولكنها يمكن أيضا تلوث نظام التسليم.
- تحقق من وجود تسرب بإغلاق منفذ للغرفة الخلط للجهاز التحفيز. تأكد من أن جميع تدفقات الهواء قبل جهاز التحفيز الآن تنخفض تدريجيا إلى الصفر. إن لم يكن، والتحقق من وجود تسرب والتي يمكن الآن التعرف على صوت الهسهسة الهواء ترك النظام.
- نقل بعناية 15 الذباب الفردية إلى 15 أنابيب زجاجية الفردية باستخدام الشافطة وأنابيب الزجاج وثيقة على كلا الجانبين باستخدام محولات المقابلة.
ملاحظة: نظرا لأن النظام يجب أن تكون مختومة بإحكام للتجارب الناجحة، تأكد من أن محولات تناسب أنابيب زجاجية بإحكامولاحظ أن أنابيب الزجاج قد كسر خلال هذه الخطوة. الحرص على تجنب وقوع اصابات خلال ارتداء قفازات واقية ونظارات واقية. - توصيل أنابيب الزجاج لإعداد Flywalk و، من هنا على، انتظر لمدة 15 دقيقة على الأقل قبل بدء التجربة للسماح الذباب إلى روض مع البيئة الجديدة.
- بعد ربط أنابيب الزجاج: التحقق من قراءات من المصب وتدفق متر الرقمية على جهاز الكمبيوتر 1 إذا كان 16 تدفقات الهواء بعد أنابيب زجاجية تضيف ما يصل الى تدفق الهواء دخول النظام. أيضا اطمئنان على الكمبيوتر 1، إذا الرطوبة بين 60٪ و 80٪.
- تصميم بروتوكول التحفيز السيطرة على تسلسل وتوقيت المحفزات رائحة عرضت على الذباب. للحصول على سبيل المثال البيانات وصفها، الحالية 4 الروائح والسيطرة (زيوت معدنية) منفردة وكل الثلاثي ممكن ومخاليط الرباعي من الروائح في وقت واحد لكل 40 مرة. تعيين مدة النبضة إلى 500 مللي ثانية في الفترة الفاصلة interstimulus من 90 ثانية وبطريقة عشوائية تسلسل التحفيز.
- التبديل على لىمصدر GHT (LED-العنقودية؛ λ = 630). تأكد من أن توفر ما يكفي من الضوء لكفاءة تتبع دون زيادة درجة الحرارة داخل أنابيب زجاجية.
- اقامة المنطقة من اهتمام من نظام التتبع عن طريق سحب إطار عبر المنطقة المراد رصدها في مثل هذه الطريقة التي يتم تضمين كافة أنابيب زجاجية 15 ويتم استبعاد ما يقرب من 5 ملم من حواف الأنابيب.
- انشاء 14 خطوط متوازية الفصل بين أنابيب الفردية في نظام التتبع عن طريق تغيير Y-مواقعهم في البرنامج النصي المقابل للحفاظ على الفرد الذباب التعرف في كافة مراحل التجربة. تأكد من وضع لهم في مثل هذه الطريقة أن هناك دائما واحد أنبوب زجاجي بين اثنين من هذه الخطوط الفاصل، لأنه سيتم تعقب ذبابة واحدة فقط بين أي مجموعة من سطرين.
- تأكد من تعيين المعلمات الكاميرا في مثل هذه الطريقة التي تطير يتم تعقب موثوق في جميع أنحاء أنابيب زجاجية. إذا فقدت الذباب على حواف المنطقة من الفائدة، وزيادة السطوع أو كسب تتبع الصورةoftware. تجنب الاهتزازات الميكانيكية للنظام تتبع. تتبع باستخدام البرمجيات التجارية وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة.
- بدء التجربة قبل بدء تشغيل بروتوكول التحفيز. سجل flies' XY-الإحداثيات في 20 إطارا في الثانية (لقطة في الثانية) وسجل في تركيبة مع وضع صمام رائحة في ملفات نصية.
تحليل 3. البيانات
ملاحظة: الخطوات التالية في تحليل البيانات والمؤتمتة باستخدام إجراءات العرف مكتوب المبرمجة في R. لأن هذه الخطوات هي الحاسمة للحصول على نتائج ذات مغزى ورغم ذلك قدم تحليل بطريقة خطوة بخطوة. البيانات الأولية لتحليل ملفات CSV. المحتوية على المعلومات متزامنة على وضع صمام رائحة، عدد النبض في التجربة و15 الطيران X-وظائف في سم على محور الزمن المشترك للدورة التحفيز رائحة واحدة. ويمكن تقديم التعليمات البرمجية المخصصة لتحليل البيانات عند الطلب.
- مفتوحة. CSV ملف، تجد الوقت نقطة من فتح صمام تدل عليه وتشانجى في العمود يمثل حالة صمام.
- حساب دالة خطية من موقف رائحة النموذج
و (ر) = ق ر * + ط
حيث t هو الوقت في دورة التحفيز، والصورة هي سرعة الرياح (هنا 20 سم / ثانية) واعتراض ط يمكن حسابها باستخدام نقطة في الوقت رائحة تدخل الأنابيب في موقف 0 (فتح صمام بالإضافة إلى التأخير). - العثور على نقطة الوقت الذي رائحة وتطير X-موقف تتقاطع لكل الطيران وتعيين هذه نقطة في الوقت إلى 0. ملاحظة: هذه الطريقة تتماشى مواقف سافر إلى كل individual's لقاء مع رائحة.
- استبعاد الذباب يجلس على حواف جدا من منطقة الفائدة.
- حساب سرعة من X-مواقف بقسمة النزوح على طول محور x بواسطة الفاصل الزمني (100 مللي ثانية) وإجراء تكرار لكل دورة التحفيز.
- للحصول على سرعة الوقت دورات كما هو مبين في الشكل 2E حساب متوسط السرعة وقتا بالطبع لكل ذبابة ورائحة وعن تلك في الوقت نفسه بالطبع لرائحة معينة.
- للحصول على النزوح الصافي كما هو مبين في الشكل 3C حساب تشريد صافي داخل 4 ثانية بعد نبض رائحة لكل حدث تتبع وبعد ذلك تشريد صافي متوسط في الطيران ورائحة.
4. تنظيف الداخلي
- نظيف أنابيب الزجاج
- إزالة الذباب ومحولات من أنابيب الزجاج ونقع أنابيب الزجاج في صناعة المنظفات.
- شطف أنابيب زجاجية تحت الماء الجاري المقطر وتجفيفها باستخدام الهواء المضغوط.
- أنابيب زجاجية الحرارة على حرارة 200 درجة مئوية لمدة 8 ساعات.
- رائحة نظيفة نظام التسليم
- إزالة كل قارورة رائحة وأنابيب من غرفة الخلط المركزية.
- إزالة محولات أنابيب من غرفة الخلط.
- غرفة الخلط نظيفة من قبل الشطف مع محلول التنظيف المختبر والمذيبات (مثل الإيثانول والأسيتون). تنفيذ هذه الخطوات تحت غطاء محرك السيارة المختبر.
- غرفة خلط الجافة باستخدام الهواء المضغوط وتسخينها على حرارة 200 درجة مئوية لمدة 8 ساعات.
- نظيفة رائحة قوارير وفحص الصمامات
- إزالة المكونات الصلب (فضلات المطاط طوقا) وفحص الصمامات من قارورة رائحة ونقع جميع المكونات في محلول التنظيف المختبر.
- مكونات يصوتن في حمام بالموجات فوق الصوتية وشطف لهم بالماء المقطر.
- تنظيف جميع المكونات ما عدا فحص الصمامات مع الإيثانول والأسيتون. تنفيذ هذه الخطوات تحت غطاء محرك السيارة المختبر.
- المكونات الجافة باستخدام الهواء المضغوط والحرارة لهم على حرارة 200 درجة مئوية لمدة 8 ساعات.
- فحص الصمامات نظيفة من الداخل عن طريق تنظيف لهم الإيثانول والأسيتون باستخدام حقنة (تنظر في اتجاه التدفق). تنفيذ هذه الخطوات تحت غطاء محرك السيارة مختبر يرتدي نظارات المختبر. لأن الأسيتون يهاجم أجزاء من المطاط، وعلى الفور فحص الصمامات الجافة عن طريق تنظيف لهم مع الهواء المضغوط.
- إزالة الروائح المتبقية التي كتبها النبض الهواء من خلال فحص الصمامات لعدة أيام. استخدام حاضنة عند 60 ° C والهواء 1 ثانية على / 1 ثانية الهواء خارج النظام لهذه الخطوة التنظيف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لأن يسمح الذباب لتوزيع بحرية داخل أنابيب زجاجية ما بين النبضات رائحة ويسافر نبض رائحة من خلال أنابيب زجاجية بسرعة ثابتة الذباب تواجه الرائحة في أوقات مختلفة تبعا لها موقف العاشر في وقت التحفيز. ونتيجة لذلك، يتم تأخير onsets من مسارات عكس الريح التي حركها 500 نبضة مللي ثانية من مغري 10 -3 التخفيف من خلات الإيثيل بنحو 1 ثانية عن الذباب في نهاية اتجاه الريح من أنابيب الزجاج وذلك مقارنة مع تلك الذباب يجلس أقرب إلى نهاية عكس الريح في سرعة الرياح من 20 سم / ثانية و 20 سم طول أنبوب زجاجي (الشكل 2A). تصحيح للفرق الزمني في رائحة لقاء لكل فرد على أساس لها موقف العاشر في وقت العرض رائحة يكشف أن التأخير الاستجابة لخلات الإيثيل متسقة بين الأفراد (الشكل 2B).
في المقابل، فإن متوسط مسار عكس الريح دون تصحيح لستأخر سفر دور قبل ما يقرب من 0.5 ثانية مقارنة مع متوسط مسار مع التصحيح (الشكل 2C، علما أن التصحيح للمرة رائحة يحتاج إلى إدخال نهاية عكس الريح من أنابيب الزجاج أجريت لكل من مسارات). وبالإضافة إلى ذلك، فإن مسار عكس الريح يعني تصحيح نبضه رائحة واحد يعرض أيضا منحدر حاد (أي أعلى سرعة المشي) من دون تصحيح واحد (الشكل 2D). وعلى غرار الملاحظات نبضه رائحة واحدة، وحذف التصحيح للسفر رائحة يؤدي إلى زيادة تأخير وانخفاض السعة استجابة في مجموعة بيانات كاملة تتكون من دورتين التجريبية (أي 30 الذباب) مع 40 عرضا من البقول رائحة كل (الشكل 2E) .
التحفيز المتكرر مع 500 البقول ميللي ثانية من جذابة 10 -3 التخفيفات إيثيل الزبدات (ETB)، خلات isopentyl (IAA)، خلات الإيثيل (ايتا) و2،3-butanedione (BEDN) يثير العواصف عكس الريح على التطوير التنظيميأو لقاء في الذباب الإناث جوعا، في حين أن التحفيز مع الزيوت المعدنية المذيبات (MOL) تثير أي ردود أو ضعيفة فقط. وقد سبق أن أظهرت التحفيز الميكانيكي وحده للحث على زيادة الحركة في نموذج مماثل 28. ومع ذلك، لأن التحفيز رائحة في نموذج Flywalk لا يغير إجمالي تدفق الهواء وزيادة حركة غائب معظمهم في حالة سيطرة على استخدام MOL، هذه العواصف عكس الريح تعكس ردود رائحة الحقيقية. يعني الوقت دورات استجابة النمطية بين الأفراد (الشكل 3A) ورائحة معينة في الكمون، السعة والمدة (الشكل 3A، B). الردود على خلات الإيثيل عرض بداية حادة، السعة العالية ومدة قصيرة. في المقابل، الردود على 2،3-butanedione عادة تعرض بداية لاحق قليلا، سعة الدنيا ومدة أطول. الزبدات الإيثيل وخلات isopentyl تثير ديناميات الزمنية مماثلة لخلات الإيثيل، ولكن ردود أقل في السعة. Correspondingly، كل الروائح تثير 4 تشريد عكس الريح العالي داخل 4 ثانية بعد لقاء رائحة من يفعل المذيبات والسلبية النفط السيطرة المعدنية (الشكل 3C).
باستخدام نفس 4 جاذبة، وقد تبين أنه سبق أن مخاليط ثنائية جاذبة هي جاذبية على الأقل مثل خليط المكونة أكثر جاذبية 29. هنا، يتم توسيع هذه الملاحظة عن طريق اختبار كل مخاليط الثلاثية الممكنة ومزيج الكامل لجميع جاذبة 4. وعلى غرار الملاحظة السابقة مع مخاليط ثنائية، كل هذه الأخلاط أكثر تعقيدا على الأقل جاذبية مثل مركب واحد الأكثر جاذبية الشكل (4A). يمزج الأكثر جاذبية هي تلك التي تحتوي على كل من خلات الإيثيل و2،3-butanedione. الردود على هذه الأخلاط 3 لا تختلف كثيرا عن بعضها البعض، وكذلك حركية الاستجابة هي لافت للنظر مماثلة (أرقام 4A، B). في المقابل، حذف خلات الإيثيل من blen الكاملد يؤدي إلى انخفاض في أقصى سرعة في عكس اتجاه الرياح، في حين حذف 2،3 butanedione يقصر الاستجابة (الشكل 4C). لأن خلات الإيثيل يثير ردود قصيرة عالية السعة، بينما 2،3 butanedione يثير ردود انخفاض السعة ولكن مدة أطول (أرقام 3B، 4D)، هذه الملاحظات تذكرنا لتقصي السابق، أن الاستجابات دورات الوقت نحو مزيج من جاذبة تميل إلى اتباع بالطبع وقت الاستجابة المثلى التي تم إنشاؤها من استجابة مزيج المكونة الوقت دورات 29. في هذه البينات يمكن بناؤها الأمثل لجميع جاذبة 4 على أساس زمن الاستجابة دورات نحو خلات الإيثيل و2،3-butanedione. إيثيل الزبدات و / أو خلات isopentyl ضرورية بالإضافة للوصول إلى أقصى سرعة المشي لوحظ في الاستجابات نحو مزيج الكامل (الشكل 4D). وبالتالي، فإن الزيادة في تعقيد الخليط 2-3 أو 4 عناصر يزيد من جاذبية الخليط همزيد من فين من ما يمكن توقعه من الملاحظة السابقة، أن الاستجابات نحو خليط من جاذبة تمثل الأمثل للاستجابات تجاه مكونات الخليط. ومع ذلك، فإن الاستنتاج العام الذي التكافؤ تأسيسية يتم حفظها في خليط من رائحة لا يزال صالحا أيضا لهذه الخلائط أكثر تعقيدا 29.
الشكل 1. مبدأ وتخطيط الإعداد Flywalk. (A) رسم تخطيطي لمبدأ. المربع الأصفر: رائحة التحفيز تتحرك من خلال أنبوب والناتجة في حركة عكس الريح الذبابة. كائن أسود: كاميرا لتتبع الاستجابات السلوكية. (B) تخطيطي لتدفق الهواء من خلال الإعداد مع تصفيتها الفحم الهواء يجري ترطيب وتنقسم إلى 8 قنوات، قبل الدخول إلى نظام التسليم رائحة 26،30. تفجير متابعة الشكل: 1، وثلاثة طريقة تمرير صمام الملف اللولبي جي تدفق الهواء إما عن طريق قارورة فارغة (ج؛ تدفق التعويضي) أو من خلال قنينة تحتوي على مصدر الرائحة (س؛ تدفق رائحة)؛ 2، فحص الصمامات الكرة لتقييد تدفق الهواء في اتجاه واحد وتجنب التلوث النظام؛ خلط الغرفة: مربع مبنية خصيصا، التي تقوم بجمع الجو من كل صمامات الملف اللولبي والتحويلات لتقسيم المتابعة متن الطائرة، حيث يتم تقسيم الهواء لمدة 15 أنابيب زجاجية محملة الذباب الفردية و1 أنبوب مجهزة درجة الحرارة والرطوبة أجهزة الاستشعار. ملاحظة: منظمات التدفق، وقياس تدفق بعد أنابيب زجاجية تضمن تدفق متطابقة في جميع الأنابيب. الأزرق ساحة يدل المنطقة ذات الاهتمام (ROI) من نظام التتبع. (C) تخطيطي لتدفق المعلومات بين الكاميرا تتبع، تتبع جهاز الكمبيوتر، ونظام التسليم رائحة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
OAD / 53394 / 53394fig2.jpg "/>
الشكل 2. الداخلي والأساس المنطقي وراء تحليل البيانات. (A) فرد الذباب تواجه رائحة في مواقع مختلفة، وبالتالي أوقات مختلفة. اللوحة اليسرى: رسم تخطيطي من المناصب ذبابة ممكنة في الوقت صمام رائحة التبديل. اللوحة اليمنى: البيانات الخام من العاشر مناصب من 15 الذباب حول عرض 500 نبضة مللي ثانية من 10 -3 التخفيف من خلات الإيثيل. ملاحظة يمشي عكس اتجاه الريح من الذباب الفردية في أوقات مختلفة اعتمادا على من الأشعة المواقف. اليسار خط متقطع: وقت صمام رائحة التبديل. وتحول اللقاء رائحة الذباب الفردية عن طريق تأخير جوهري نظام لرائحة للوصول إلى أنابيب زجاجية (د) وسرعة الرياح (ث). لذلك، يتم احتساب رائحة قاء فردي لكل ذبابة استنادا لموقف العاشر. أسفل اليمين: الانحياز س مواقف لل15 الذباب (الرمادي) ويعني X-موقف (الأسود الغامق). (B) نفس البيانات كما في A، ولكن تصحيح للتأخير وسرعة الرياح. بوتأوم: الانحياز س مواقف لل15 الذباب (الرمادي) ويعني X-موقف (أحمر غامق) بعد التصحيح. (C) مقارنة التقدم عكس الريح يعني من 15 الذباب التي تسببها واحدة 500 نبضة مللي ثانية من خلات الإيثيل مع وبدون تصحيح للسفر رائحة. لاحظ أن تصحح (أسود) التتبع يتم تصحيح لهذا التأخير، ولكن ليس للسفر رائحة. (D) يعني عكس الريح بسرعة 15 الذباب التي تسببها واحدة 500 نبضة مللي ثانية من خلات الإيثيل مع وبدون تصحيح للسفر رائحة. الخطوط المتقطعة تشير إلى سرعة محسوبة من قيم التقدم عكس الريح هو مبين في C، وخطوط جريئة عرض سرعة عكس الريح بعد تمهيد باستخدام 1 ش أجل 9 نقاط Savitzky-غولي التصفية. (E) التي لم تتم تصفيتها يعني سرعة في عكس اتجاه الرياح مع وبدون تصحيح للسفر رائحة لمدة 30 الذباب و40 نبضات من خلات الإيثيل كل (أي مجموعة بيانات كاملة). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذاالشكل.
. الشكل 3. ردود مثال لمدة 10 -3 التخفيفات من 4 الروائح الجذابة (A) اللون تلوينها ردا متوسط الوقت دورات من 30 الذباب الفردية إلى 500 ميللي ثانية البقول من 4 جاذبة والزيوت المعدنية المذيبات (MOL؛ ETB: الزبدات إيثيل؛ IAA: خلات isopentyl؛ ايتا: خلات الإيثيل، BEDN: 2،3 butanedione). يمثل كل صف الاستجابة وقتا بالطبع يعني ذبابة فرد واحد. وقدم كل الطاير مع كل رائحة لمدة 40 مرات و- لأن يسمح الذباب لتوزيع بحرية، وقد ترك المنطقة من مصلحة نظام تتبع - يعني تحسب الدورات زمن الاستجابة من كافة مسارات كاملة في ذبابة (ن = 7-39 مسارات في الطيران والرائحة). ويمثل الشريط الأصفر نبض رائحة. (B) زمن الاستجابة دورات ل4 جاذبة والزيوت المعدنية مذيب (ن = 30 الذباب؛ متوسط+/- SEM). (C) صافي النزوح عكس الريح داخل 4 ثانية بعد رائحة لقاء (البيانات نفسها كما في (A) و (B)، ن = 30 الذباب). صناديق مليئة تشير الحركة عكس الريح ذات دلالة إحصائية مقارنة سلبي النفط السيطرة المعدنية (P <0.05، وقعت يلكوكسن اختبار رتبة). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4. الردود نحو مخاليط الثلاثية والرباعي من جاذبة. (A) صافي النزوح عكس الريح لمدة 4 جاذبة وجميع الخلطات الثلاثي والرباعي منه مرتبة حسب استجابتها متوسط. رسائل مختلفة تشير إلى فروق ذات دلالة إحصائية بين استجابات (P <0.05، كروسكال واليس اختبار مجموع رتبة واللاحق يلكوكسن قعت اختبار رتبة، ن = 30الذباب). ويشير الصندوق الأسود أدناه الخلائط المحتوية على خلات الإيثيل و2،3butanedione. (B) استجابة دورات وقت الخلائط المحتوية على خلات الإيثيل و2،3-butanedione (يعني +/- وزارة شؤون المرأة، ن = 30 الذباب). ملاحظة مماثلة استجابة حركية. (C) مقارنة زمن الاستجابة دورات مخاليط دون خلات الإيثيل أو 2،3 butanedione وحركية استجابة حركها مزيج كامل (يعني +/- وزارة شؤون المرأة، ن = 30 الذباب). لاحظ انخفاض السعة دون ايتا والاستجابة أقصر من دون BEDN. (D) مقارنة الأمثل بالطبع الوقت (متقطع) التي شيدت من ايتا (الحمراء)، وBEDN (الأخضر) ومزيج كامل. الظلال تشير إلى أجزاء للدوام تفسير مكونات الخليط المختلفة. لاحظ أنه في دراسة سابقة قد أظهرت أن ردود نحو مخاليط ثنائية جاذبة يمكن التنبؤ من أطباق الوقت الأمثل إنشاؤها على أساس مزيج المكونة الوقت دورات 29. ويظهر هذا بالطبع الوقت الأمثل لايتا وBEDN باعتبارهخط متقطع. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
على الرغم من أن نظام Flywalk يبدو متطورة بدلا للوهلة الأولى، بعد تشكيلها وتشغيله سهلة الاستخدام وتعطي نتائج قوية للغاية. التشديد على اتساق النتائج المنتجة مع الأحيائي يمكن القول أن نتائج تمثيلية هو موضح هنا تم الحصول عليها بعد ما يقرب من 2 سنوات بعض النتائج هو مبين في دراسة سابقة 29 مع إعداد تعديلها باستخدام برنامج التتبع الجديدة ومصدر الضوء. ومع ذلك، فإن ردود جاذبة هي - على الرغم من سعة استجابة أعلى قليلا - مشابهة جدا لتلك التي نشرت سابقا بشأن ديناميتها.
هناك بعض الجوانب الهامة التي ينبغي النظر فيها على وجه الخصوص من أجل الحصول على نتائج ذات جودة عالية باستخدام Flywalk. الأهم من ذلك، يجب أن لا تنخفض الرطوبة أقل من 60٪ خلال التجربة. تستغرق جلسة تجريبية نموذجية لحوالي 8 ساعات. معقولة الحجم الإناث CS البرية من نوع الذباب جوعا لمدة 24 ساعة قبل السابقملصقة البقاء على قيد الحياة بسهولة لا يقل عن 12 ساعة في الإعداد المتوفرة الرطوبة التجريبية عالية بما فيه الكفاية. لتجنب المشاكل المتعلقة الرطوبة فإنه من المستحسن لتثبيت جهاز استشعار الرطوبة في أنبوب زجاجي فارغ (الشكل 1B) وتجنب وضع منظمات التدفق في تدفق الهواء في أي مكان بين الرطوبة وأنابيب الزجاج. بل هو أيضا ضروري للغاية للحصول على جودة البيانات أن النظام مختومة بإحكام. يجب أن تدفقات الهواء ترك النظام بعد أنابيب زجاجية تلخيص لتدفق الهواء دخول النظام. ويمكن أن يعزى معظم التجارب الفاشلة لتسرب في النظام وعناية كبيرة ينبغي اتخاذها قبل بدء التجربة للتأكد من أن النظام هو محكم. وأخيرا، كما هو الحال مع أي الإعداد المستخدمة في البحوث حاسة الشم، واحدة من القضايا اليومية الرئيسية لتجنب التلوث. تتم معظم أجزاء القادمة في اتصال مع الروائح من الزجاج والفولاذ، تفلون أو نظرة خاطفة، وبالتالي يمكن تسخينه إلى 200 درجة مئوية على الأقل، وهو ما يكفي لإزالة معظم سDORS إلا لمن لديهم نقطة الغليان مرتفعة بشكل خاص مثل الفيرومونات بالسلاسل الطويلة. لأن فحص الصمامات تحتوي على أجزاء من المطاط أنها لا يمكن أن تكون ساخنة تصل، وبالتالي فهي المصدر الرئيسي للتلوث، وهذا هو السبب وضعت بروتوكولا التنظيف معين لهم. ومع ذلك، فإنه من المستحسن أن تتبع الروائح قد حان صمام الاختيار خاص في اتصال مع. في حالة الشك بشأن نظافتها يحل محله.
وكحل وسط بين المقايسات المربوطة والتجارب فوج، لديها Flywalk بالطبع أيضا بعض العيوب بالمقارنة مع الطرق الأخرى. النموذج هو فعالة جدا عندما سلوك تجاه العديد من المحفزات المختلفة لابد من تقييمها ومقارنتها. والجدير بالذكر، لأن زمن الاستجابة بالطبع من 15 شخصا لمجرد نبضة واحدة من رائحة ما يشبه بقوة استجابة دورات الوقت التي تم الحصول عليها في مجموعة البيانات كاملة (أي 30 الذباب و40 عرضا لكل منهما؛ أرقام 2D، 2E مثل التكافؤ المتعة من رائحة واحدة فقط تحتاج إلى دراسة. أيضا، فإن القرار الزمني للنظم تتبع بصرية أقل في كثير من الأحيان من ذلك من أسرع اختبارات بيولوجية مثل رحلة المربوطة أو حلقة مفرغة. أقصر تأخير استجابة ورد في ذبابة الفاكهة السلوك الموجهة رائحة هي أقل بكثير من 100 ميللي ثانية بعد رائحة لقاء في نماذج المربوطة 20،23 وبالتالي تندرج ضمن إطار الوقت الذي لا يمكن حلها عند تحليل البيانات في 10 هرتز. ومع ذلك، ردود جاذبة في Flywalk تبدأ عادة خلال أول 100-300ميللي ثانية (الشكل 3B)، والذي هو أيضا تمشيا مع زيادة التأخير عكس الريح التي لوحظت في الذباب حرة تحلق 5. وبالتالي فإنه يبقى أن تحدد ما إذا كان هذا الاختلاف في تأخر الاستجابة في نماذج المربوطة مقارنة نفق الرياح وتسبب Flywalk الاختلافات في القرار المكانية و / أو الزماني في نماذج تتبع بصرية أو حدوث حالة استنفار أعلى من الذباب في الوضع المربوطة.
باختصار، Flywalk هو الأحيائي لا الاختيار، الذي يجمع بين عرض الحوافز رقابة شديدة من المقايسات المربوطة مع كفاءة التجارب فوج تستخدم بانتظام في ذبابة الفاكهة neuroethology. لأن نفس المجموعة من الأفراد يمكن الطعن مع العديد من المحفزات المختلفة، وقوتها معينة تكمن في قوة إحصائية عند المقارنة بين الاستجابات تجاه محفزات مختلفة. بالإضافة إلى ذلك، فإنه يستغل حقيقة التي تطير زيادة في عكس اتجاه الرياح على اللقاء من رائحة جذابة وبهذه الطريقة uncouples تقييم رائحةمن رائحة توطين المصدر دون الحاجة إلى التدرج باعتباره جديلة الاتجاه. وينبغي لذلك مناسبة بشكل مثالي لاستغلال الأدوات optogenetic المتاحة في ذبابة الفاكهة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
تعلن الكتاب أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.
Acknowledgments
نشكر دانيال فيت للحصول على المساعدة الفنية وبيدرو جوفيا في Electricidade إم بو (electricidadeempo.net) لتخصيص تتبع البرمجيات لمطالبنا. كما نشكر توم Retzke للحصول على الدعم أثناء عملية التصوير. وأيد هذه الدراسة من قبل جمعية ماكس بلانك.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flywalk setup | Custom | details available upon request | |
| stimulus device | Custom | details available upon request | |
| LED cluster | Custom | details available upon request | |
| HD Pro Webcam C920 | Logitech, Lausanne, Switzerland | ||
| 2 Computers | |||
| Flywalk Reloaded v1.0 software | Electricidade Em Pó (electricidadeempo.net) | ||
| Labview 11.0 software | National Instruments, Austin, TX | ||
| Standard fly food | Custom | ||
| Standard fly vials | Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Standard fly vials | Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| aspirator | Custom | ||
| mineral oil | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | ||
| odors | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | ||
| 200 µl PCR reaction tubes | Biozym Scientific GmbH, Oldendorf, Germany |
References
- Murlis, J., Elkinton, J. S., Cardé, R. T. Odor plumes and how insects use them. Annu. Rev. Entomol. 37, 505-532 (1992).
- Kennedy, J. S., Marsh, D.
- Budick, S. A., Dickinson, M. H. Free-flight responses of Drosophila melanogaster to attractive odors. J. Exp. Biol. 209 (15), 3001-3017 (2006).
- Buehlmann, C., Graham, P., Hansson, B. S., Knaden, M. Desert ants locate food by combining high sensitivity to food odors with extensive crosswind runs. Curr. Biol. 24 (9), 960-964 (2014).
- Van Breugel, F., Dickinson, M. H. Plume-tracking behavior of flying Drosophila emerges from a set of distinct sensory-motor reflexes. Curr. Biol. 24 (3), 274-286 (2014).
- Schuckel, J., Meisner, S., Torkkeli, P. H., French, A. S. Dynamic properties of Drosophila olfactory electroantennograms. J. Comp. Physiol. A. 194 (5), 483-489 (2008).
- Geffen, M. N., Broome, B. M., Laurent, G., Meister, M. Neural encoding of rapidly fluctuating odors. Neuron. 61 (4), 570-586 (2009).
- Nagel, K. I., Wilson, R. I. Biophysical mechanisms underlying olfactory receptor neuron dynamics. Nat. Neurosci. 14 (2), 208-216 (2011).
- Martelli, C., Carlson, J. R., Emonet, T. Intensity invariant dynamics and odor-specific latencies in olfactory receptor neuron response. J. Neurosci. 33 (15), 6285-6297 (2013).
- Szyszka, P., Gerkin, R. C., Galizia, C. G., Smith, B. H. High-speed odor transduction and pulse tracking by insect olfactory receptor neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 111 (47), 16925-16930 (2014).
- Nagel, K. I., Hong, E. J., Wilson, R. I. Synaptic and circuit mechanisms promoting broadband transmission of olfactory stimulus dynamics. Nat. Neurosci. 18 (1), 56-65 (2014).
- Larsson, M. C., Domingos, A. I., Jones, W. D., Chiappe, M. E., Amrein, H., Vosshall, L. B. Or83b encodes a broadly expressed odorant receptor essential for Drosophila olfaction. Neuron. 43 (5), 703-714 (2004).
- Knaden, M., Strutz, A., Ahsan, J., Sachse, S., Hansson, B. S. Spatial representation of odorant valence in an insect brain. Cell Rep. 1 (4), 392-399 (2012).
- Zaninovich, O. A., Kim, S. M., Root, C. R., Green, D. S., Ko, K. I., Wang, J. W. A single-fly assay for foraging behavior in Drosophila. J. Vis. Exp. (81), e50801 (2013).
- Farhan, A., Gulati, J., Groβe-Wilde, E., Vogel, H., Hansson, B. S., Knaden, M. The CCHamide 1 receptor modulates sensory perception and olfactory behavior in starved Drosophila. Sci. Rep. 3 (2765), 1-6 (2013).
- Flügge, C. Geruchliche Raumorientierung von Drosophila melanogaster. Z. Vgl. Physiol. 20 (4), 462-500 (1934).
- Borst, A., Heisenberg, M.
- Louis, M., Huber, T., Benton, R., Sakmar, T. P., Vosshall, L. B. Bilateral olfactory sensory input enhances chemotaxis behavior. Nat. Neurosci. 11 (2), 187-199 (2008).
- Gomez-Marin, A., Stephens, G. J., Louis, M. Active sampling and decision making in Drosophila chemotaxis. Nat. Commun. 2 (441), 1-10 (2011).
- Gaudry, Q., Hong, E. J., Kain, J., de Bivort, B. L., Wilson, R. I. Asymmetric neurotransmitter release enables rapid odour lateralization in Drosophila. Nature. 493 (7432), 42442-42448 (2013).
- Quinn, W. G., Harris, W. A., Benzer, S.
- Ramdya, P., Lichocki, P., et al. Mechanosensory interactions drive collective behaviour in Drosophila. Nature. 519 (7542), 233-236 (2014).
- Bhandawat, V., Maimon, G., Dickinson, M. H., Wilson, R. I. Olfactory modulation of flight in Drosophila is sensitive, selective and rapid. J. Exp. Biol. 213 (21), 3625-3635 (2010).
- Duistermars, B. J., Chow, D. M., Frye, M. A. Flies require bilateral sensory input to track odor gradients in flight. Curr. Biol. 19 (15), 1301-1307 (2009).
- Claridge-Chang, A., Roorda, R. D., et al. Writing memories with light-addressable reinforcement circuitry. Cell. 139 (2), 405-415 (2009).
- Steck, K., Veit, D., et al. A high-throughput behavioral paradigm for Drosophila olfaction - The Flywalk. Sci. Rep. 2 (361), 1-9 (2012).
- Lewis, E. B. A new standard food medium. Drosoph. Inf. Serv. 34, 117-118 (1960).
- Lebestky, T., Chang, J. S. C., et al. Two different forms of arousal in Drosophila are oppositely regulated by the dopamine D1 receptor ortholog DopR via distinct neural circuits. Neuron. 64, 522-536 (2009).
- Thoma, M., Hansson, B. S., Knaden, M. Compound valence is conserved in binary odor mixtures in Drosophila melanogaster. J. Exp. Biol. 217 (20), 3645-3655 (2014).
- Olsson, S. B., Kuebler, L. S., et al. A novel multicomponent stimulus device for use in olfactory experiments. J. Neurosci. Meth. 195 (1), 1-9 (2011).
