Summary
Il Flywalk sistema automatizzato di monitoraggio è utilizzato per ad alta risoluzione quantificazione del comportamento odore guidati in Drosophila melanogaster.
Abstract
Nel loro ambiente naturale, insetti come l'aceto mosca Drosophila melanogaster sono bombardati da una quantità enorme di odoranti chimicamente distinti. Per complicare ulteriormente le cose, gli odori rilevati dal sistema nervoso degli insetti non sono solitamente composti singoli ma miscele la cui composizione e rapporti di concentrazione variare. Questo porta ad una quantità quasi infinita di diversi stimoli olfattivi che devono essere valutata dal sistema nervoso.
Per capire quali aspetti di uno stimolo odore determinano la sua valutazione da parte del volo, è pertanto auspicabile esaminare in modo efficiente il comportamento odore-guidati verso molte odoranti e miscele odore. Per correlare direttamente comportamento da attività neuronale, comportamento dovrebbe essere quantificato in un lasso di tempo comparabile e in condizioni di stimolo identiche in esperimenti neurofisiologici. Tuttavia, molti test biologici olfattivi attualmente utilizzati in Drosophila neuroetologia sono piuttosto speciazato sia verso l'efficienza e verso la risoluzione.
Flywalk, un sistema di erogazione di odore e automatizzato di monitoraggio, colma il divario tra efficienza e risoluzione. Esso permette di determinare esattamente quando un pacchetto odore stimolato una mosca liberamente a piedi, ea quali per animali da reazione dinamica comportamentale.
Introduction
L'obiettivo primario di ogni ricerca neuroethological è di stabilire un nesso di causalità tra gli stati di attività dei singoli neuroni o circuiti neuronali e il comportamento di un organismo. Per raggiungere questo obiettivo l'attività neuronale e comportamento devono essere monitorati in condizioni di stimolo identiche e queste condizioni di stimolo dovrebbe idealmente essere simili a quelle del sistema nervoso sotto controllo evoluto per dare un senso. Soprattutto quando si tratta di saggi biologici comportamentali, questi requisiti hanno storicamente dimostrato abbastanza esigente in Drosophila melanogaster neuroetologia olfattiva.
Una volta liberato dalla fonte, pennacchi odore rapidamente si disgregano in filamenti sottili con diffusione turbolenta causato dal movimento dell'aria è il principale determinante della distribuzione odori 1. Come risultato, un insetto navigazione verso una fonte di odore sperimenta stimolazione intermittente con pacchetti odore intervallati da intervalli variabili di aria pulita. Entrambe le particamminare e insetti volanti - tra Drosophila - sono stati dimostrati per sfruttare questo regime stimolazione intermittente per la navigazione da aumento di bolina su incontro pennacchio e prevalentemente in movimento vento di traverso, in assenza di odori 2 - 5. Considerando che le procedure di stimolazione negli esperimenti fisiologici ampiamente imitare quelli di un insetto che si verifichi nel suo ambiente naturale dovendo provvedere a singoli sbuffi di odori intervallati da lunghi periodi di aria pulita o sequenze di stimolazione dinamiche 6 - 11, molti test biologici comportamentali utilizzate in Drosophila neuroetologia quali test trappola , arene campo aperto o T-labirinto si affidano a odori-gradienti di 12 - 15. Tuttavia, perché gradienti odore per definizione sono variabili in concentrazione in funzione della distanza dalla sorgente di odore, un particolare comportamento non può essere attribuito ad una concentrazione di odore preciso usando questi paradigmi. Inoltre, la pendenzaun gradiente di odore dipende in modo critico sulle proprietà fisico-chimiche del odorizzante. Un gradiente di un composto altamente volatile sarà meno profonda di quella generata da un composto meno volatile e quindi anche più difficile da monitorare per un organismo basandosi sulla misurazione differenze di concentrazione nello spazio come unico mezzo di navigazione 16 - 20, che può portare ad una errata interpretazione delle preferenze olfattive particolarmente nei saggi di scelta. Questo effetto è anche molto dannoso nell'ambito delle indagini comportamento verso miscele odore perché porta a rapporti dei componenti si fondono diverse in ogni punto dello spazio e quindi di nuovo preclude una chiara correlazione tra fisiologia e del comportamento.
Mentre le mosche aceto tendono ad aggregarsi in fermentazione di frutta, che sono solitari nella loro navigazione verso fonti di cibo e siti deposizione delle uova. Tuttavia, invece di test singoli animali molti paradigmi comportamentali utilizzati in Drosophila neuroethology esaminare il comportamento di odore-guidata delle coorti di mosche e di attrazione è segnato come la frazione di mosche che scelgono l'odore su uno stimolo di controllo. Questi esperimenti di coorte hanno contribuito notevolmente alla comprensione della mosca neuroetologia e molte delle osservazioni fatte con il loro impiego potrebbe essere confermato in esperimenti di singolo-fly. Tuttavia, è stato osservato che vola può influenzare ogni decisione other's 21 e in casi estremi la valutazione di un odore può passare da indifferenza all'annullamento seconda densità di popolazione 22. Inoltre, i risultati di questi tipi di esperimenti spesso forniscono solo il punto finale di una sequenza di decisioni comportamentali piuttosto che osservando ciò al volo sta facendo mentre lo fa, che sarebbe desiderabile quando si tenta di correlare comportamento con attività neuronale. Questi esperimenti di coorte piuttosto bassa risoluzione si contrappongono ad alta risoluzione metodi single-fly, come arene dei voli frenati e tapis roulant che permettonoper l'osservazione diretta delle risposte comportamentali al momento lo stimolo viene presentato 20,23,24. Tuttavia, gli esperimenti di coorte sono ancora popolari, perché sono molto efficienti e di risultati solidi anche a dimensioni comparabile bassa del campione perché la variabilità inter-individuale e inter-trial sono parzialmente in media a causa all'osservazione delle popolazioni per lunghi periodi di tempo prolungati. Mentre volo tethered e tapis roulant probabilmente offrono il gold standard per quanto riguarda la presentazione dello stimolo e risoluzione temporale, arene utilizzati sono progettati per singoli animali ed è quindi in termini di tempo per ottenere le dimensioni necessarie campione per un'analisi statistica. Molti altri approcci sono stati recentemente sviluppato che permettono una efficiente acquisizione di dati comportamentali ad alta risoluzione in combinazione con un regime di stimolo ben definita. Questi includono non supervisionato tracking 3D di più mosche di aceto in una galleria del vento in combinazione con un accurato modello 3D del pennacchio odore di 5 25 e il paradigma Flywalk 26.
In Flywalk, 15 mosche individuali si trovano in tubi di vetro di piccole e costantemente monitorate da una telecamera dall'alto in condizioni a luci rosse. Gli odori vengono aggiunti ad un flusso d'aria continuo di 20 cm / sec e viaggiano attraverso i tubi di vetro ad una velocità costante. Il flusso d'aria viene umidificata mediante passaggio 250 ml bottiglie contenenti acqua distillata (umidificatori) prima di entrare nel sistema di erogazione odore. Le posizioni flies' vengono registrati all'interno di una regione quadrata di interesse (ROI) comprendente la maggior parte della lunghezza dei tubi di odore (esclusi i bordi esterni dei tubi (circa 5 mm su ciascun lato) dove le mosche non possono muoversi ulteriormente alto o sottovento) intorno al momento della presentazione dell'odore (Figura 1A, B). Fly identità sono mantenuti costanti dal sistema di tracciamento tel corso l'esperimento sulla base delle loro posizioni Y (vale a dire i loro limiti tubo di vetro). Stimolazione odore si ottiene utilizzando un dispositivo di stimolo multi-componente che permette la presentazione di fino a 8 singoli odori e tutte le possibili miscele 26,29 (Figura 1B). Il corso di un esperimento è controllato da un computer regolando il sistema di erogazione odore e raccolta di temperatura e umidità informazioni (computer 1, Figura 1C). Questo computer controlla anche un datalogger (avvio / arresto della registrazione) su un secondo computer, che registra continuamente posizioni mosca a 20 fotogrammi al secondo (computer 2). Vola posizioni, stato della valvola odore (cioè il tempo-punto di apertura della valvola), ID odore, temperatura e umidità intorno cicli di stimolazione odore è registrato sul computer 2. In questo modo le informazioni su odore e volare posizioni sono sincronizzati ed esportati come file .csv-che possono essere ulteriormente elaborati e analizzati utilizzando routine di analisi-custom scritta. Perchél'intero sistema è controllato da computer, è necessario alcun intervento umano durante una sessione sperimentale.
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Protocol
La costruzione e dettagli tecnici di Flywalk sono state descritte altrove 26 (in caso di eventuali problemi di stabilire questo set up, ulteriori informazioni possono essere ottenute da MK). Qui ci concentriamo su istruzioni dettagliate sulla gestione del paradigma che aiuterà ad ottenere risultati affidabili.
1. Fly Handling
- Posteriore vola in basso a culture media densità su supporto alimentare 27 sotto una 12 ore: 12 ore di luce: regime buio a 23-25 ° C e 70% di umidità relativa. A tal fine, lasciare 20-30 adulto di recente è emerso vola a riprodurre in una grande fiala cibo per 1 settimana, poi scarta mosche adulte e aspettare che la prole di emergere.
- Raccogliere 30-40 nuovi emersi (età <24 ore) mosche adulte e invecchiare in in nuovo un flaconcino contenente mezzo cibo 27 per 3-5 giorni.
- Ventiquattro ore prima dell'inizio dell'esperimento comportamentale: Trasferire tutto 30-40 precedentemente raccolto 3-5 d vecchio (vedi 2.2) vola a un nuovo VIAl contenente un tappo di gomma di schiuma umida o un fazzolettino di carta umida con un aspiratore.
NOTA: non anestetizzare le mosche con CO 2.
2. Preparazione del Setup Flywalk
- Utilizzare bottiglie da 250 ml come umidificatori. Riempire umidificatori con 100 ml di acqua distillata.
- Preparare fiale odore.
- Preparare 500 microlitri 10 -3 diluizioni del odori puri acetato di etile, butirrato di etile, acetato e 2,3-isopentil butanedione in olio minerale solvente.
- Collegare due valvole di ritegno a sfera per l'odore fiala. Notare che il check valvole consentono solo per il flusso d'aria unidirezionale. Pertanto, collegare valvole di ritegno in modo tale che l'aria possa entrare nel flaconcino da un lato e lasciarla sull'altro lato.
- Rimuovere il coperchio di un tubo di reazione 200 microlitri PCR. Pipetta 100 ml di ogni diluizione odore in un tubo di reazione separata e posizionare i tubi in flaconi odore separati. Anche preparare un flaconcino contenente solo l'odore oi minerali solventel.
- Strettamente sigillare le fiale odore chiudendo utilizzando tasselli in acciaio inox e guarnizioni in gomma.
- Collegare i 5 flaconcini odore (4 contenente odori e 1 contenenti olio minerale) al sistema di erogazione odore. Assicurati di collegarli in direzione del flusso destra. Un collegamento errato non solo compromettere l'esperimento previsto, ma può anche contaminare il sistema di erogazione.
- Controllare eventuali perdite sigillando l'uscita della camera di miscelazione del dispositivo stimolo. Assicurarsi che tutti i flussi d'aria prima che il dispositivo di stimolo ora progressivamente scendono a zero. In caso contrario, controllare le perdite che possono ora essere identificati con il sibilo dell'aria in uscita dal sistema.
- Trasferire accuratamente 15 mosche individuali a 15 tubi in vetro individuo che usa un aspiratore e tubi di vetro chiudere su entrambi i lati con le schede corrispondenti.
Nota: Poiché il sistema è chiuso ermeticamente per esperimenti di successo, in modo che le schede si adattano tubi di vetro ermeticamentee notare che tubi di vetro può rompersi durante questa fase. Fare attenzione per evitare lesioni indossando guanti e occhiali protettivi. - Collegare i tubi di vetro al setup Flywalk e, da qui in poi, attendere almeno 15 minuti prima di iniziare l'esperimento per consentire le mosche abituare al nuovo ambiente.
- Dopo aver collegato i tubi di vetro: controllare le letture dei misuratori di portata a valle digitali sul computer 1 se i 16 flussi d'aria dopo i tubi di vetro si sommano al flusso d'aria che entra nel sistema. Verificate anche sul computer 1, se l'umidità è tra il 60% e l'80%.
- Progettazione protocollo stimolo controllare la sequenza e la tempistica di stimoli odore presentati alle mosche. Per ottenere ad esempio i dati descritti, presenti 4 odori e controllo (olio minerale) e singolarmente tutti i possibili ternari e quaternari miscele degli odori contemporaneamente per 40 volte ciascuno. Impostare la durata dell'impulso di 500 ms ad un intervallo di 90 secondi interstimulus e casuale sequenza di stimolo.
- Accendere il lifonte GHT (-cluster LED; λ = 630). Assicurati di fornire abbastanza luce per il monitoraggio efficiente senza aumentare la temperatura all'interno dei tubi di vetro.
- Impostare una regione di interesse del sistema di tracciamento trascinando una cornice all'interno dell'area da monitorare in modo tale che tutti i tubi di vetro 15 sono inclusi e sono esclusi circa 5 mm dei bordi dei tubi.
- Impostare 14 linee di separazione parallele tra singoli tubi del sistema di tracciamento modificando le loro posizioni Y nello script corrispondente per mantenere individuale vola identificabile tutto l'esperimento. Assicurarsi di posizionarli in modo tale che vi sia sempre un tubo di vetro tra due di tali linee di separazione, perché solo uno volare verrà tracciato tra qualsiasi insieme di due linee.
- Assicurarsi di impostare i parametri della telecamera in modo tale che le mosche sono tracciati affidabile durante i tubi di vetro. Se mosche sono persi ai bordi della regione di interesse, aumentare la luminosità o guadagno del monitoraggio software. Evitare vibrazioni meccaniche del sistema di tracciamento. Traccia utilizzando il software commerciale secondo il protocollo del produttore.
- Inizia esperimento avviando il protocollo stimolo. Record flies' XY-coordinate a 20 fps (fotogrammi al secondo) e accedere in combinazione con lo stato della valvola odore in file di testo.
Analisi 3. Dati
NOTA: Le seguenti operazioni nell'analisi dei dati sono automatizzate utilizza le routine custom scritti programmati in R. Poiché questi passaggi sono fondamentali per ottenere risultati significativi l'analisi sarà comunque presentata in modo step-by-step. I dati grezzi per l'analisi sono CSV-file contenenti informazioni sincronizzate sullo stato della valvola odore, il numero di impulsi nell'esperimento e 15 fly x posizioni in cm su un asse temporale comune per un odore ciclo di stimolazione. Codice personalizzato per l'analisi dei dati può essere fornita su richiesta.
- Aperto .csv file, trovare il tempo-punto di apertura della valvola significato da un chaESN nella colonna che rappresenta lo stato della valvola.
- Calcolare la funzione lineare della posizione dell'odore della forma
f (t) = s * t + i
dove t è il tempo nel ciclo di stimolazione, s è la velocità del vento (qui 20 cm / sec) e l'intercetta i può essere calcolata usando il time-point l'odore entra nelle provette a posizione 0 (apertura della valvola più ritardo). - Trovare il punto in cui l'odore tempo e volare x-position si intersecano per ogni mosca e impostare questo time-point a 0. Nota: In questo modo le posizioni mosca sono allineate ad ogni individual's incontro con l'odore.
- Escludi mosche seduti ai bordi molto della regione di interesse.
- Calcolare la velocità da X-posizioni dividendo spostamento lungo l'asse x per l'intervallo di tempo (100 msec) e ripetere la procedura per ogni ciclo di stimolazione.
- Per ottenere temporali corsi velocità come mostrato nella Figura 2E calcolare medio di time-course velocità per ogni mosca e odore e da quelle del time-course medio per un determinato odore.
- Per ottenere lo spostamento netto come mostrato in Figura 3C calcolare lo spostamento netto entro 4 secondi dopo l'impulso odori per ogni evento di inseguimento e successivamente lo spostamento netto medio per volo e odore.
4. Procedura di pulizia
- Clean Glass Tubes
- Rimuovere le mosche e gli adattatori da tubi di vetro e godersi tubi di vetro con detergente.
- Sciacquare tubi di vetro con acqua corrente distillata e asciugarle con aria compressa.
- Tubi di vetro termico a 200 ° C per 8 ore.
- Pulire Odore Delivery System
- Rimuovere tutti i flaconi di odori e tubi dalla camera di miscelazione centrale.
- Rimuovere adattatori tubi dalla camera di miscelazione.
- Pulire camera di miscelazione con il risciacquo con soluzione detergente laboratorio e solventi (ad esempio etanolo, acetone). Eseguire queste operazioni sotto il cofano di laboratorio.
- Camera di miscelazione a secco con aria pressurizzata e riscaldarlo a 200 ° C per 8 ore.
- Pulire Odore Fiale e Valvole
- Togliere il tappo in acciaio (guarnizione in gomma di scarto) e valvole di non ritorno di fiale di odori e godersi tutti i componenti nella soluzione detergente laboratorio.
- Componenti Sonicare in un bagno a ultrasuoni e sciacquare con acqua distillata.
- Pulire tutti i componenti ad eccezione di valvole di non ritorno con etanolo e acetone. Eseguire queste operazioni sotto il cofano di laboratorio.
- Componenti asciugare con aria compressa e di riscaldare a 200 ° C per 8 ore.
- Valvole di ritegno pulito dentro di loro lavaggio con etanolo e acetone utilizzando una siringa (ritengono direzione del flusso). Eseguire queste operazioni sotto il cofano laboratorio indossare occhiali di laboratorio. Perché acetone attacca parti in gomma, immediatamente valvole di ritegno a secco da vampate di calore con aria compressa.
- Rimuovere odori residui da pulsare aria attraverso le valvole di ritegno per diversi giorni. Utilizzare un incubatore a 60 ° C ed aria 1 sec acceso / 1 sec aria fuori regime per questa fase di pulizia.
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Representative Results
Poiché mosche possono distribuire liberamente all'interno dei tubi di vetro tra impulsi odore e l'impulso odore viaggia attraverso i tubi di vetro ad una velocità costante mosche incontrano l'odore in tempi diversi a seconda della loro posizione x al momento della stimolazione. Come risultato, le esacerbazioni delle traiettorie controvento evocati da un impulso di 500 msec di un attraente 10 -3 diluizione di acetato di etile sono ritardate di circa 1 sec per mosche alla fine sottovento loro tubi di vetro rispetto a quelli delle mosche ad avvicinarsi fine sopravento ad una velocità del vento di 20 cm / sec e 20 cm lunghezza del tubo di vetro (Figura 2A). Correzione della differenza temporale odore incontro per ogni individuo in base alla sua posizione x al momento della presentazione odore rivela che i ritardi di risposta verso etilacetato sono coerenti tra individui (Figura 2B).
Di conseguenza, la traiettoria media bolina senza correzione per oviaggio dor è ritardato di circa 0,5 secondi rispetto alla traiettoria media con correzione (Figura 2C; notare che la correzione per il momento l'odore ha bisogno di entrare alla fine sopravento dei tubi di vetro è stata eseguita per entrambe le traiettorie). Inoltre, la traiettoria bolina media corretta per un singolo impulso odore visualizza anche una pendenza (cioè una velocità superiore a piedi) di quella corretta (Figura 2D). Simile alle osservazioni di un singolo impulso di odore, omettendo la correzione per i viaggi odore porta ad un aumento di ritardo e l'ampiezza di risposta più basso in un set di dati completo composto da due sessioni sperimentali (cioè 30 mosche) con 40 presentazioni di impulsi odore ciascuno (Figura 2E) .
Stimolazione ripetuta con 500 impulsi msec di interessanti 10 -3 diluizioni di butirrato di etile (ETB), acetato di isopentile (IAA), acetato di etile (ETA) e 2,3-butanedione (BEDN) suscita ondate di bolina su odo incontro in mosche di sesso femminile affamati, mentre la stimolazione con l'olio minerale solvente (MOL) evoca non o solo risposte deboli. Stimolazione meccanica da solo è stato già dimostrato di indurre una maggiore movimento in un paradigma simile 28. Tuttavia, poiché l'odore stimolazione nel paradigma Flywalk non altera il flusso d'aria totale e una maggiore movimento è per lo più assente nella situazione di controllo usando MOL, questi picchi di bolina riflettere risposte odore veri. Sono stereotipati tra gli individui (Figura 3A) e la latenza specifica inodore medio corsi tempo-risposta, ampiezza e durata (Figura 3A, B). Risposte ad acetato di etile mostrano un esordio acuto, elevata ampiezza e breve durata. Al contrario, le risposte a 2,3-butandione tipicamente mostrano una induzione leggermente più tardi, avente ampiezza minore e una durata. Butirrato di etile e acetato isopentile suscitano dinamiche temporali simili come acetato di etile, ma le risposte sono più bassi in ampiezza. Corridingly, tutti e 4 gli odori stimolano una maggiore spostamento di bolina entro 4 secondi dopo l'incontro odore di quanto non faccia il solvente e negativo olio minerale di controllo (Figura 3C).
Utilizzando le stesse 4 attrattivi, è stato precedentemente dimostrato che le miscele binarie di attrattivi sono almeno altrettanto attraente come il più attraente miscela costituente 29. Ecco, questa osservazione è prorogato di testare tutte le possibili miscele ternarie e il pieno miscela di tutti e 4 attrattivi. Simile al precedente osservazione con miscele binarie, tutte queste miscele più complessi sono almeno attraente come il più attraente unico composto (Figura 4A). Le miscele più interessanti sono quelli che contengono entrambi etile acetato e 2,3-butandione. Le risposte a questi 3 miscele non differiscono in modo significativo gli uni dagli altri e anche la cinetica di reazione sono sorprendentemente simili (figure 4A, B). Al contrario, omettendo etilacetato dalla piena blend porta ad una diminuzione della velocità massima di bolina, omettendo 2,3-butandione accorcia la risposta (Figura 4C). Perché acetato di etile suscita brevi risposte di grande ampiezza, mentre 2,3-butanedione suscita reazioni di ampiezza inferiore, ma più lunga durata (Figure 3B, 4D), queste osservazioni ricordano nostra scoperta precedente, che le risposte di tempo corsi verso miscele di attrattivi tendono a seguire un tempo-corso risposta ottimale creato da risposta miscela costituente temporali corsi 29. In questo set di dati ottimale di tutti attrattivi 4 può essere costruito sulla base del tempo di risposta portate verso etile acetato e 2,3-butandione. Butirrato di etile e / o acetato isopentile sono necessarie in aggiunta a raggiungere la velocità massima a piedi osservata nelle risposte per il pieno miscela (Figura 4D). Pertanto, l'aumento della complessità della miscela da 2 a 3 o 4 componenti aumenta l'attrattiva della miscela even oltre quanto ci si aspetterebbe dall'osservazione precedente, che le risposte verso le miscele di sostanze attrattive rappresentano un ottimale delle risposte verso costituenti della miscela. Tuttavia, la conclusione generale che valenza costituente è conservata in miscele odore rimane valido anche per queste miscele più complesse 29.
Figura 1. Principio e il layout del setup Flywalk. (A) Schema del principio. Quadrato giallo: odore stimolo in movimento attraverso il tubo e conseguente movimento controvento della mosca; oggetto nero: telecamera per monitorare le risposte comportamentali. (B) Schema del flusso d'aria attraverso la messa a punto con l'aria carbone filtrata da umidificare e divisa in 8 canali, prima di entrare nel sistema di erogazione degli odori 26,30. Blow-up Figura: 1, tre vie passaggio elettrovalvola ing il flusso d'aria tramite un flacone vuoto (c; flusso compensatorio) o attraverso una fiala contenente la sorgente di odore (o; flusso odore); 2, valvole di ritegno a sfera per limitare il flusso d'aria in una direzione e per evitare la contaminazione del sistema; camera di miscelazione: scatola su misura, che raccoglie l'aria da tutte le elettrovalvole e trasferimenti di scissione di bordo, dove l'aria è divisa per 15 tubi di vetro carichi di singoli mosche e 1 tubo dotati di sensori di temperatura e umidità. Nota: regolatori di flusso e misuratori di portata dopo tubi di vetro garantiscono flusso identico in tutte le provette. Quadrato blu denota regione di interesse (ROI) del sistema di tracciamento. (C) Schema del flusso di informazioni tra macchina fotografica di monitoraggio, computer di monitoraggio e sistema di consegna degli odori. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 2. Procedura di logica e l'analisi dei dati. (A) Persona mosche incontrare l'odore in posizioni diverse e quindi tempi diversi. Pannello di sinistra: Schema di possibili posizioni mosca al momento della commutazione della valvola odore. A destra: i dati grezzi di X posizioni di 15 mosche intorno alla presentazione di un impulso di 500 ms di una diluizione di acetato di etile 10 -3. Nota cammina controvento delle singole mosche in tempi diversi a seconda delle loro x-posizioni. Linea tratteggiata sinistra: tempo di commutazione della valvola odore. Odore incontro dei singoli mosche viene spostata di un ritardo di sistema, intrinseco per l'odore di raggiungere i tubi di vetro (d) e la velocità del vento (w). Pertanto, l'odore incontro è calcolato individualmente per ciascun volo in base alla sua posizione x. In basso a destra: allineati X posizioni dei 15 mosche (grigio) e la media x posizioni (grassetto nero). (B) Gli stessi dati come in A, ma corretto per il ritardo e la velocità del vento. BottOM: allineato X posizioni dei 15 mosche (grigio) e significare posizione X (rosso grassetto) dopo la correzione. (C) Confronto di media progresso bolina di 15 mosche indotte da un impulso di 500 msec di acetato di etile con e senza correzione per viaggi odore. Si noti che la non corretta (nero) traccia viene corretto per il ritardo, ma non per viaggi odore. (D) Media sopravento velocità di 15 mosche indotte da un impulso di 500 msec di acetato di etile con e senza correzione per viaggi odore. Le linee tratteggiate indicano velocità calcolata dai valori di avanzamento di bolina mostrati in C, linee audaci visualizzare velocità di bolina dopo lisciando con un 9 punti filtro Savitzky-Golay 1 ° ordine. (E) non filtrato significa velocità di bolina con e senza correzione per i viaggi odori per 30 mosche e 40 impulsi di acetato di etile ciascuno (vale a dire un insieme di dati completo). Clicca qui per vedere una versione più grande di questofigura.
. Figura 3. Esempi di risposte per 10 -3 diluizioni di 4 attraenti odori (A) con codice colore medi di risposta di tempo corsi di 30 singoli mosche a 500 impulsi msec di 4 attrattivi e l'olio minerale solvente (MOL; ETB: butirrato di etile; IAA: acetato isopentile; ETA: acetato di etile; BEDN: 2,3-butanedione). Ogni riga rappresenta la risposta media tempo-corso di una mosca individuo. Ogni volo è stato presentato con l'odore per 40 volte e - perché le mosche sono autorizzati a distribuire liberamente e possono lasciare la regione di interesse del sistema di tracciamento - significano corsi a tempo di risposta sono calcolate da tutte le traiettorie completi al volo (n = 7-39 traiettorie Per Fly e odore). Barra gialla rappresenta l'impulso odore. (B) Tempo di risposta portate a 4 attrattivi e l'olio minerale solvente (n = 30; mosche media+/- Sem). (C) spostamento sopravento netto entro 4 secondi dopo odore incontro (stessi dati come in (A) e (B), n = 30 mosche). Scatole piene indicano statisticamente significativo movimento di bolina rispetto al olio minerale controllo negativo (p <0.05; Wilcoxon rank test). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Le risposte verso mischie ternarie e quaternari di attrattivi. (A) spostamento di bolina netto 4 attrattivi e tutte le miscele ternarie e quaternari della stessa ordinati per la loro risposta mediana. Diverse lettere indicano differenze statisticamente significative tra le risposte (p <0.05; Kruskal-Wallis prova della somma dei ranghi e post hoc di Wilcoxon rank test; n = 30mosche). Scatola nera in basso indica miscele contenenti acetato di etile e 2,3butanedione. (B) Risposta temporali corsi di miscele contenenti acetato di etile e 2,3-butanedione (media +/- sem; n = 30 mosche). Nota simili di risposta-cinetica. (C) Confronto di risposta temporali corsi di miscele, senza acetato di etile o 2,3-butanedione e cinetica di risposta evocata dalla piena miscela (media +/- sem; n = 30 mosche). Nota minore ampiezza senza ETA e di risposta più brevi, senza BEDN. (D) Confronto di tempo ottimale portate (tratteggiata) costruita ETA (rosso) e BEDN (verde) e la completa fusione. Sfumature indicano parti del tempo-corso spiegato da diversi componenti della miscela. Si noti che in un precedente studio è stato dimostrato che le risposte verso miscele binarie di attrattivi possono essere previste da un time-course optimum creato sulla base di miscela costituenti temporali corsi 29. Questa volta-corso ottimale per ETA e BEDN è mostrato come unlinea tratteggiata. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Anche se il sistema Flywalk appare piuttosto sofisticato, a prima vista, una volta istituito e funzionante, è facile da usare e produce risultati molto robusti. Per sottolineare la coerenza dei risultati ottenuti con il saggio biologico si può dire che i risultati rappresentativi riportati sono stati ottenuti quasi 2 anni dopo alcuni dei risultati riportati in un precedente studio 29 con una configurazione modificata utilizzando un nuovo software di monitoraggio e la sorgente luminosa. Tuttavia, le risposte sono attrattivi - nonostante ampiezze di risposta leggermente più elevati - molto simili a quelli precedentemente pubblicati sulle loro dinamiche.
Ci sono alcuni aspetti critici che dovrebbero essere considerati, in particolare, al fine di ottenere risultati di alta qualità utilizzando Flywalk. È importante sottolineare che l'umidità non deve scendere al di sotto del 60% nel corso di un esperimento. Una tipica sessione sperimentale dura circa 8 ore. Ragionevolmente imprese femminili CS wild-type mosche a digiuno per 24 ore prima che la exsperi- facilmente sopravvivere per almeno 12 ore in configurazione fornite umidità sperimentale è abbastanza alto. Per evitare problemi legati all'umidità è consigliabile installare un sensore di umidità in un tubo di vetro vuoto (Figura 1B) e per non mettere regolatori di flusso nel flusso d'aria in qualsiasi punto tra umidificatori e tubi di vetro. È inoltre assolutamente essenziale per la qualità dei dati che il sistema è chiuso ermeticamente. I flussi d'aria che escono dal sistema dopo che i tubi di vetro devono riassumere al flusso d'aria che entra nel sistema. La maggior parte esperimenti falliti possono essere attribuite a perdite nel sistema e grande cura dovrebbe essere presa prima dell'inizio dell'esperimento per assicurare che il sistema è a tenuta d'aria. Infine, come con qualsiasi setup utilizzati nella ricerca olfattiva, uno dei principali problemi quotidiani è quello di evitare la contaminazione. La maggior parte delle parti a contatto con gli odori sono in vetro, acciaio, Teflon o PEEK e possono pertanto essere riscaldato fino ad almeno 200 ° C, che è sufficiente a rimuovere la maggior parte odors ad eccezione di quelli con punti particolarmente alti di ebollizione, come feromoni a catena lunga. Perché valvole di ritegno contengono parti in gomma che non possono essere riscaldati più in alto e quindi sono la principale fonte di contaminazione, che è il motivo per cui un particolare protocollo di pulizia è stato ideato per loro. Tuttavia, è opportuno tenere traccia degli odori una particolare valvola è venuta a contatto con. In caso di dubbio per quanto riguarda la sua pulizia sostituirlo.
Come un compromesso tra saggi frenati ed esperimenti di coorte, Flywalk naturalmente ha anche alcuni svantaggi rispetto ad altri metodi. Il paradigma è molto efficiente quando il comportamento verso una moltitudine di stimoli diversi deve essere valutato e confrontato. In particolare, in quanto il tempo di risposta-corso di 15 persone per un solo impulso di un determinato odore assomiglia fortemente risposta temporali corsi ottenuti in un insieme di dati completo (cioè 30 mosche e 40 presentazioni ciascuno, figure 2D, 2E ad esempio la valenza edonica di un solo odore deve essere esaminato. Inoltre, la risoluzione temporale dei sistemi di monitoraggio visivo è spesso inferiore a quella dei biosaggi veloci come volo legato o tapis roulant. I ritardi di reazione più breve riportati nel comportamento odore guidato Drosophila sono ben al di sotto di 100 msec dopo odore incontro nel paradigmi tethered 20,23 e quindi rientrano in una finestra di tempo che non può essere risolta quando l'analisi dei dati a 10 Hz. Tuttavia, le risposte attractant in Flywalk iniziano tipicamente entro i primi 100-300msec (figura 3B), che è ben in linea con ritardi di sovratensione bolina osservate in volo libero mosche 5. Resta quindi da stabilire se questa differenza di ritardi di risposta nei paradigmi frenati rispetto alla galleria del vento e Flywalk è causata da differenze di risoluzione spaziale e / o temporale in paradigmi di monitoraggio visivo o da uno stato di eccitazione più elevato di mosche in situazione tethered.
In sintesi, Flywalk è un saggio biologico non-scelta, che unisce la presentazione dello stimolo altamente controllato di test frenati con l'efficienza di esperimenti di coorte regolarmente utilizzati in Drosophila neuroetologia. Poiché lo stesso insieme di individui può essere contestata con una moltitudine di stimoli diversi, la sua forza particolare risiede nella potenza statistica quando si confrontano le risposte verso stimoli diversi. Inoltre, sfrutta il fatto che vola controvento sovratensioni su incontro di un odore attraente e così disaccoppia valutazione dell'odoredalla localizzazione fonte odore senza la necessità di un gradiente come spunto direzionale. Dovrebbe pertanto essere idealmente concepito per sfruttare la casella degli strumenti optogenetic disponibile in Drosophila.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Ringraziamo Daniel Veit per l'assistenza tecnica e Pedro Gouveia a Electricidade Em Pò (electricidadeempo.net) per la personalizzazione del software di monitoraggio per le nostre richieste. Ringraziamo anche Tom Retzke per il supporto durante il processo di ripresa. Questo studio è stato sostenuto dalla Max Planck Society.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flywalk setup | Custom | details available upon request | |
| stimulus device | Custom | details available upon request | |
| LED cluster | Custom | details available upon request | |
| HD Pro Webcam C920 | Logitech, Lausanne, Switzerland | ||
| 2 Computers | |||
| Flywalk Reloaded v1.0 software | Electricidade Em Pó (electricidadeempo.net) | ||
| Labview 11.0 software | National Instruments, Austin, TX | ||
| Standard fly food | Custom | ||
| Standard fly vials | Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Standard fly vials | Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| aspirator | Custom | ||
| mineral oil | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | ||
| odors | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | ||
| 200 µl PCR reaction tubes | Biozym Scientific GmbH, Oldendorf, Germany |
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