Summary
O Flywalk sistema de rastreamento automático é usado para alta resolução de quantificação do comportamento guiado por odor em Drosophila melanogaster.
Abstract
Em seu ambiente natural, insetos, como o vinagre voar Drosophila melanogaster são bombardeados com uma quantidade enorme de odorants quimicamente distintos. Para complicar ainda mais, os odores detectados pelo sistema nervoso dos insetos geralmente não são compostos isolados, mas misturas cuja composição e rácios de concentração variar. Isto leva a uma quantidade quase infinito de diferentes estímulos olfactivos que têm de ser avaliados pelo sistema nervoso.
Para entender quais aspectos de um estímulo odor determinar a sua avaliação pela mosca, é desejável, portanto, examinar de forma eficiente o comportamento guiado por muitos no sentido de odor odores e misturas de odores. Para se correlacionam diretamente comportamento para a atividade neuronal, o comportamento deve ser quantificada em horários similares e em condições idênticas às de estímulo em experimentos neurofisiológicos. No entanto, muitos bioensaios olfativos usados atualmente em Drosophila neuroethology são bastante specialized quer no sentido da eficiência ou em direção a resolução.
Flywalk, um sistema de entrega de odor e monitoramento automatizado, preenche a lacuna entre eficiência e resolução. Ele permite a determinação de um pacote exactamente quando odor estimulada uma mosca que anda livremente, e para determinar as ANIMAL reacção comportamental dinâmica.
Introduction
A meta primordial de qualquer investigação neuroetológica é estabelecer um nexo de causalidade entre os estados de atividade de neurônios individuais ou circuitos neuronais eo comportamento de um organismo. Para alcançar este objetivo a atividade neuronal e comportamento devem ser monitorados em condições idênticas de estímulo e essas condições de estímulo deveriam idealmente ser semelhantes aos do sistema nervoso sob escrutínio evoluído para fazer sentido. Especialmente quando se trata de bioensaios comportamentais, estas exigências têm historicamente se mostrado bastante exigente em Drosophila melanogaster neuroethology olfativo.
Uma vez liberada a partir da fonte, plumas odor quebrar rapidamente se em filamentos finos com difusão turbulenta causada pelo movimento do ar é o principal determinante da distribuição odor 1. Como resultado, um inseto navegar para atingir uma fonte de odor experimenta a estimulação intermitente com pacotes de odor intercaladas com intervalos variáveis de ar limpo. ambosandando e insetos voadores - incluindo Drosophila - foram demonstradas para explorar essa regime estimulação intermitente para a navegação de afluência contra o vento em cima de encontro pluma e predominantemente movendo cross-vento na ausência de odores 2 - 5. Considerando que os procedimentos de estimulação em experimentos fisiológicos imitar em grande parte aqueles um inseto pode enfrentar em seu ambiente natural, quer proporcionando puffs únicas de odores intercalados com longos períodos de ar limpo ou sequências de estimulação dinâmica 6 - 11, muitas bioensaios comportamentais utilizados na Drosophila neuroethology como ensaio armadilha , arenas em campo aberto ou T-maze contar com odor gradientes 12 - 15. No entanto, porque os gradientes de odor, por definição, são variáveis na concentração, dependendo da distância a partir da fonte de odor, um comportamento particular não pode ser atribuída a uma concentração de odor usando preciso desses paradigmas. Além disso, a inclinação daum gradiente de odor depende criticamente sobre as propriedades físico-químicas do odorante. Um gradiente de um composto altamente volátil será mais rasa do que o criado por um composto menos volátil e, portanto, também mais difícil de controlar de um organismo depender de medição de diferenças de concentração no espaço como o único meio de navegação 16 - 20, o que pode conduzir a uma interpretação incorrecta de preferências olfativas particularmente em ensaios escolha. Este efeito também é altamente prejudicial ao investigar comportamento em relação a misturas de odores, pois leva a diferentes proporções de mistura de componentes em cada ponto no espaço e, portanto, mais uma vez se opõe a uma clara correlação entre a fisiologia e comportamento.
Enquanto moscas do vinagre tendem a se agregar em fermentação de frutas, eles são solitários em sua navegação em direção a fontes de alimento e locais de oviposição. No entanto, em vez de testar animais individuais muitos paradigmas comportamentais utilizados em Drosophila neuroetholoGy examinar o comportamento guiado por odor de coortes de moscas e atração é marcado como a fracção de moscas que escolhem o odor ao longo de um estímulo controle. Estas experiências de coorte têm contribuído grandemente para a compreensão da mosca neuroethology e muitas das observações feitas por usá-los pode ser confirmada em experimentos single-mosca. No entanto, tem sido observado que voa pode influenciar cada decisão alheia 21 e em casos extremos, a avaliação de um odor pode mudar de indiferença à evasão dependendo da densidade populacional 22. Além disso, os resultados destes tipos de experimentos muitas vezes fornecem apenas o ponto final de uma sequência de decisões comportamentais ao invés de observar o que a mosca está fazendo enquanto ele estiver fazendo isso, o que seria desejável ao tentar correlacionar o comportamento com a atividade neuronal. Estas experiências de coorte, em vez de baixa resolução são contrastados por métodos de alta resolução single-mosca, como arenas de voos cativos e esteiras que permitempara uma observação directa das respostas de comportamento no momento em que o estímulo é apresentado 20,23,24. No entanto, as experiências de coorte ainda são populares, porque eles são muito eficientes e fornecem resultados robustos, mesmo em baixo comparativamente tamanhos de amostra, porque a variabilidade inter-individual e inter-julgamento são parcialmente média para fora devido à observação de populações ao longo de períodos de tempo prolongados. Enquanto voo tethered e esteira provavelmente fornecer o padrão-ouro, relativa apresentação do estímulo e resolução temporal, as arenas utilizadas são projetados para animais individuais e por isso é necessário para obter os tamanhos de amostra para uma análise estatística demorado. Várias outras abordagens têm sido recentemente desenvolvidos para permitir uma aquisição eficiente de alta-resolução dos dados comportamentais em combinação com um regime de estímulo bem definida. Estes incluem não vigiada seguimento 3D de várias moscas do vinagre em um túnel de vento em combinação com um modelo 3D preciso da pluma de odor 5 25 e o paradigma Flywalk 26.
Em Flywalk, 15 moscas individuais situam-se em pequenos tubos de vidro e continuamente monitorizada por uma câmara de suspenso, sob condições de luz vermelha. Os odores são adicionados a uma corrente de ar contínua de 20 cm / seg e viajar através dos tubos de vidro a uma velocidade constante. A corrente de ar é humidificado fazendo-o passar através de 250 ml garrafas contendo água destilada (humidificadores) antes de entrar no sistema de libertação de odores. As posições flies' são registados dentro de uma região quadrado de interesse (ROI) que abrange a maior parte do comprimento dos tubos de odor (mas excluindo as bordas exteriores dos tubos (aproximadamente 5 mm de cada lado), em que as moscas não pode mover-se mais para cima ou a favor do vento) em torno do tempo de apresentação de odor (Figura 1A, B). Voar identidades são mantidas constantes pelo sistema de rastreamento de turante o experimento com base em suas posições Y (ou seja, os seus limites de tubo de vidro). Estimulação odor é conseguida usando um dispositivo de estímulo multi-componente que permite a apresentação de até 8 odores individuais possíveis e todas as suas misturas 26,29 (Figura 1B). O curso de uma experiência é controlada por um computador de regulação do sistema de entrega e recolha de odor temperatura e humidade informações (computador 1, Figura 1C). Este computador também controla um datalogger (iniciar / parar a gravação) em um segundo computador que rastreia continuamente posições voar a 20 quadros por segundo (computador 2). Voe posições, estado da válvula odor (ou seja, ponto de tempo de abertura da válvula), odor ID, temperatura e umidade em torno de ciclos de estimulação odor são registradas no computador 2. Desta forma, informações sobre odor e voar posições são sincronizados e exportados como .csv-arquivos que podem continuar a ser processados e analisados utilizando rotinas de análise escrito sob medida. porquetodo o sistema é controlado por computador, sem intervenção humana, é necessário durante uma sessão experimental.
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Protocol
As técnicas de construção e detalhes de Flywalk foram descritos em outro 26 (no caso de eventuais problemas de estabelecer esta configuração, mais informações podem ser obtidas a partir de MK). Aqui vamos nos concentrar em obter instruções detalhadas sobre o manuseio do paradigma que vai ajudar a obter resultados confiáveis.
1. Fly Manuseamento
- Voa traseira em baixa a média densidade culturas em meio de comida 27 horas sob uma luz 12: 12 horas: regime escuro a 23-25 ° C e 70% de umidade relativa. Para este fim, permitir 20-30 adulto recém-surgido voa para reproduzir em um grande frasco de comida para uma semana, em seguida, descartar moscas adultas e esperar por descendentes a surgir.
- Recolha 30-40 recém-emergidas (idade <24 horas) moscas adultas e idade-los em no novo um frasco contendo meio alimentar 27 para 3-5 dias.
- Vinte e quatro horas antes do início do experimento comportamental: Transferir todos 30-40 previamente coletadas 3-5 d de idade (ver 2.2) voa para uma nova vial contendo um tampão de espuma de borracha úmida ou um lenço de papel úmido usando um aspirador.
NOTA: Não anestesiar moscas usando CO 2.
2. Preparação do Setup Flywalk
- Use 250 ml garrafas como umidificadores. Encha humidificadores com 100 ml de água destilada.
- Prepare frascos de odor.
- Preparar 500 ul 10 -3 diluições dos odores puros de acetato de etilo, butirato de etilo, acetato de isopentilo e 2,3-butanodiona em óleo mineral solvente.
- Anexar duas válvulas de retenção bola por odor frasco. Note que o check válvulas permitem unidirecional única fluxo de ar. Por conseguinte, conectar válvulas de retenção de tal forma que o ar possa entrar no frasco de um lado e deixá-la no outro lado.
- Remover a tampa de um tubo de reacção de PCR de 200 uL. Pipetar 100 ul de cada diluição de odor num tubo de reacção separado e coloque os tubos em frascos separados de odor. Também preparar um frasco contendo apenas o odor oi solvente mineraleu.
- Firmemente selar os frascos de odor por fechá-los usando tampões de aço inoxidável e juntas de borracha.
- Ligar os frascos de 5 (4 odor contendo odores e 1 contendo óleo mineral) para o sistema de libertação de odores. Certifique-se de conectá-los na direção do fluxo direita. Uma conexão errada não só irá comprometer a experiência projectada, mas também podem contaminar o sistema de entrega.
- Verifique a existência de fugas por meio de selagem da saída da câmara de mistura do dispositivo de estímulo. Certifique-se que todos os fluxos de ar antes do dispositivo de estímulo agora cair progressivamente a zero. Se não, verifique se há vazamentos que agora podem ser identificados pelo som de assobio de ar que sai do sistema.
- Transferir cuidadosamente 15 moscas individuais para 15 tubos de vidro individuais usando um aspirador e tubos de vidro perto de ambos os lados usando os adaptadores correspondentes.
Nota: Como o sistema deve ser hermeticamente fechado por experiências bem sucedidas, verifique se os adaptadores caber tubos de vidro hermeticamentee note que os tubos de vidro podem quebrar durante esta etapa. Tome cuidado para evitar lesões através do uso de luvas e óculos de protecção. - Ligue os tubos de vidro para a configuração Flywalk e, a partir de agora, espere pelo menos 15 minutos antes do início do experimento para permitir moscas para se habituar ao novo ambiente.
- Depois de prender os tubos de vidro: verifique a leitura dos medidores de vazão a jusante digitais no computador 1 se os 16 fluxos de ar após os tubos de vidro adicionar até o fluxo de ar que entra no sistema. Além disso, verifique no computador 1, se a umidade é entre 60% e 80%.
- Projeto do protocolo de estímulo controlar a sequência e tempo de estímulos odor apresentadas às moscas. Para obter os dados descritos por exemplo, odores e 4 apresentam o controlo (óleo mineral) isoladamente e todos ternário possível e as misturas quaternário dos odores simultaneamente para 40 vezes cada um. Definir a duração do pulso para 500 ms, com um intervalo de 90 segundos interstimulus e aleatório seqüência de estímulo.
- Ligue o lifonte ght (LED-cluster; λ = 630). Certifique-se de fornecer luz suficiente para o acompanhamento eficiente sem aumentar a temperatura no interior dos tubos de vidro.
- Defina-se uma região de interesse do sistema de seguimento, arrastando uma moldura em frente da área a ser monitorizada, de tal modo que todos os 15 tubos de vidro estão incluídos e aproximadamente 5 mm das extremidades dos tubos são excluídos.
- Configure 14 linhas de separação entre tubos paralelos individuais no sistema de rastreamento alterando suas posições Y no script correspondente para manter indivíduo identificável moscas durante todo o experimento. Certifique-se de posicioná-los de tal forma que há sempre um tubo de vidro entre duas dessas linhas separadoras, porque apenas uma mosca serão rastreadas entre qualquer conjunto de duas linhas.
- Certifique-se de definir os parâmetros da câmara de tal forma que as moscas são controladas de forma confiável ao longo dos tubos de vidro. Se moscas são perdidos nas extremidades da região de interesse, aumentar o brilho ou o ganho de seguimento software. Evite vibrações mecânicas do sistema de rastreamento. Acompanhe utilizando software comercial de acordo com o protocolo do fabricante.
- Iniciar a experiência, iniciando o protocolo de estímulo. Grave flies' XY coordenadas a 20 fps (frames por segundo) e log em combinação com o estado da válvula odor em arquivos de texto.
Análise 3. Dados
NOTA: Os passos seguintes na análise de dados são automatizadas utilizando rotinas escritas personalizados programados em R. Porque estes passos são cruciais para a obtenção de resultados significativos na análise irá, todavia, ser apresentados em uma maneira passo-a-passo. Os dados brutos para a análise são-arquivos .csv que contêm informações sobre o estado sincronizado válvula odor, número de pulsos no experimento e 15 posições mosca-x em cm em um eixo de tempo comum para um ciclo de estimulação odor. Código personalizado para análise de dados podem ser fornecidos mediante solicitação.
- Open-arquivo .csv, encontrar tempo ponto de abertura da válvula indicado por um chaESL na coluna que representa o estado da válvula.
- Calcula-se a função linear da posição da forma de odor
F (t) = s * t + i
onde t é o tempo no ciclo de estimulação, s é a velocidade do vento (aqui 20 cm / seg) e a intersecção i pode ser calculado usando o ponto de tempo entra o odor dos tubos na posição 0 (abertura da válvula mais atraso). - Encontre o ponto de tempo em que o odor e voar x-posição cruzam para cada voar e definir esse ponto de tempo para 0. Nota: Esta maneira posições mosca estão alinhados para cada individual's encontro com o odor.
- Excluir moscas sentadas nas próprias bordas da região de interesse.
- Calcular a velocidade de X-posições, dividindo o deslocamento ao longo do eixo x por o intervalo de tempo (100 msec) e repetir o procedimento para cada ciclo de estimulação.
- Para acelerar o tempo de obtenção de pratos, como mostrado na Figura 2E calcular curso de tempo da velocidade média para cada mosca e de odor e aqueles do curso de tempo significativo para um determinado odor.
- Para obter o deslocamento líquido, tal como mostrado na Figura 3C calcular o deslocamento de líquido dentro de 4 segundos após o pulso de odor para cada evento de controle e, depois, o deslocamento líquido médio por mosca e odor.
4. Procedimento de Limpeza
- Limpe o vidro Tubes
- Remover moscas e adaptadores de tubos de vidro e tubos de vidro de molho com detergente.
- Lavar tubos de vidro em água corrente destilada e seque-as usando ar pressurizado.
- Tubos de vidro térmico a 200 ° C durante 8 h.
- Limpe Odor Delivery System
- Remove todos os frascos de odor e a tubagem da câmara de mistura central.
- Remover adaptadores de tubos a partir da câmara de mistura.
- Câmara de mistura limpa, lavando-o com solução de limpeza de laboratório e solventes (por exemplo, etanol, acetona). Execute estas etapas sob o capô laboratório.
- Câmara de mistura a seco usando ar sob pressão e aquecer a 200 ° C durante 8 h.
- Limpe Odor Frascos e Válvulas de retenção
- Remova o plugue de aço (junta de borracha de descarte) e válvulas de retenção de frascos de odor e aproveitar todos os componentes na solução de limpeza de laboratório.
- Componentes sonicate em um banho de ultra-som e lavá-los com água destilada.
- Limpe todos os componentes, exceto válvulas de retenção com etanol e acetona. Execute estas etapas sob o capô laboratório.
- Componentes secos que utilizam ar pressurizado e aquecê-los a 200 ° C durante 8 h.
- Válvulas de retenção limpo por dentro por rubor-los com etanol e acetona, utilizando uma seringa (considere direção do fluxo). Execute estas etapas sob o capô laboratório usando óculos de laboratório. Porque acetona ataca peças de borracha, imediatamente válvulas de retenção secas por rubor-los com ar pressurizado.
- Remover os odores residuais pulsando ar através de válvulas de retenção por vários dias. Utilize uma incubadora a 60 ° C e de 1 seg no ar / 1 seg de ar fora regime para este passo de limpeza.
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Representative Results
Como as moscas são autorizadas a distribuir livremente nos seus tubos de vidro entre os pulsos de odor e o pulso de odor viaja através dos tubos de vidro a uma velocidade constante moscas encontrar o odor em momentos diferentes, dependendo da sua posição-x, no momento da estimulação. Como resultado, os inícios das trajectórias de fluxo ascendente evocados por um pulso de 500 ms de um atraente 10 -3 diluição de acetato de etilo são atrasadas em cerca de 1 segundo para as moscas na extremidade a jusante da seus tubos de vidro em comparação com os de moscas situada mais próxima a extremidade do lado do vento a uma velocidade de vento de 20 cm / seg e 20 cm de comprimento do tubo de vidro (Figura 2A). Corrigindo para a diferença temporal em encontro de odor para cada indivíduo com base na sua posição-x no momento da apresentação odor revela que os atrasos de resposta para com acetato de etilo são consistentes entre indivíduos (Figura 2B).
Do mesmo modo, a trajetória barlavento média sem correção para oviagens dor é adiada por cerca de 0,5 segundos em comparação com a trajetória média com correção (Figura 2C; note que a correção para o momento em que o odor precisa para entrar no final contra o vento dos tubos de vidro foi realizada para ambas as trajetórias). Além disso, o percurso de fluxo ascendente média corrigida por um único pulso de odor também exibe um declive mais acentuado (ou seja, uma velocidade de marcha mais elevada) do que o não corrigidos (Figura 2D). Similar às observações para um único pulso de odor, omitindo a correcção para o curso de odor conduz a um aumento do atraso e amplitude de resposta inferior num conjunto de dados completo, consistindo em duas sessões experimentais (isto é, 30 moscas) com 40 apresentações de pulsos de odor cada (Figura 2E) .
Estimulação repetida com 500 pulsos ms de atraentes 10 -3 diluições de butirato de etila (ETB), acetato de isopentilo (IAA), acetato de etilo (ETA) e 2,3-butanodiona (Bedn) provoca surtos barlavento sobre odou encontro em moscas fêmeas famintas, enquanto que a estimulação com o óleo mineral solvente (MOL) evoca nenhum ou apenas respostas fracas. A estimulação mecânica sozinho foi anteriormente mostrado para induzir o aumento da circulação em um paradigma semelhante 28. No entanto, porque a estimulação odor no paradigma Flywalk não altera o fluxo de ar total e aumento do movimento é quase ausente na situação controle usando MOL, estes surtos barlavento refletir respostas odor verdadeiros. São estereotipado entre indivíduos (Figura 3A) e na latência média específica de odor cursos de tempo-resposta, amplitude e duração (Figura 3A, B). As respostas ao acetato de etilo exibir um inicio afiado, amplitude elevada e de curta duração. Em contraste, as respostas a 2,3-butanodiona geralmente exibem um início um pouco mais tarde, uma amplitude menor e uma maior duração. Butirato de acetato de etilo e isopentilo eliciar dinâmicas temporais semelhantes como acetato de etilo, mas as respostas são mais baixos em amplitude. Correspondingly, todos os 4 odores provocar um deslocamento do lado do vento superior a cerca de 4 segundos após encontro odor do que o óleo mineral solvente e controlo negativo (Figura 3C).
Usando os mesmos 4 atractores, que foi previamente demonstrado que as misturas binárias de atractivos são pelo menos tão atractivas como a mistura constituinte mais atraente 29. Aqui, essa observação é prorrogado por testar todas as possíveis misturas ternárias e a mistura completa de todos os 4 atractivos. Semelhante à observação anterior com misturas binárias, todas estas misturas de mais complexos são pelo menos tão atractivas como o único composto mais atraente (Figura 4A). As misturas mais atraentes são aquelas que contêm ambas acetato de etilo e 2,3-butanodiona. As respostas a estas misturas 3 não diferem significativamente um do outro, e também a cinética de resposta são notavelmente semelhantes (Figuras 4A, B). Em contraste, omitindo-se acetato de etilo a partir do blen completad leva a uma diminuição na velocidade máxima contra o vento, enquanto que omitindo 2,3-butanodiona encurta a resposta (Figura 4C). Porque acetato de etilo provoca respostas de alta amplitude curtos enquanto que 2,3-butanodiona provoca respostas de menor amplitude, mas mais longa duração (Figuras 3B, 4D), estas observações são uma reminiscência de nosso achado anterior, que respostas em tempo-cursos para com misturas de chamarizes tendem a seguir um curso de tempo de resposta óptima criado a partir de mistura de resposta constituinte tempo-cursos 29. Neste conjunto de dados a óptima de todos os 4 atractivos podem ser construídas com base na resposta de tempo cursos no sentido de acetato de etilo e 2,3-butanodiona. Butirato de acetato e / ou acetato de isopentilo são necessários para além de atingir a velocidade máxima de andar observada nas respostas em relação à mistura total (Figura 4D). Assim, o aumento da complexidade mistura de 2 a 3 ou 4 componentes, aumenta a capacidade de atracção da mistura eVen mais longe do que o que seria esperado a partir da observação anterior, no sentido de que as respostas misturas de atractores representam um óptimo de respostas no sentido de os constituintes da mistura. No entanto, a conclusão geral de que a valência constituinte é conservado em misturas de odor permanece válida também para estas misturas mais complexas 29.
Figura 1. Princípio eo layout da configuração Flywalk. (A) Desenho esquemático do princípio. Quadrado amarelo: odor estímulo movendo-se através do tubo e resultando em um movimento contra o vento da mosca; preto objeto: câmera para controlar as respostas comportamentais. (B) Esquema de o fluxo de ar através da configuração com ar filtrado com carvão sendo humidificado e dividida em 8 canais, antes de entrar no sistema de entrega de odor 26,30. Blow-up Figura: um, de três vias passe válvula solenóide ing o fluxo de ar quer por meio de um frasco vazio (C; fluxo compensatório) ou através de um frasco que contém a fonte de odor (O; fluxo odor); 2, válvulas de retenção de bola para restringir o fluxo de ar em uma direção e para evitar a contaminação do sistema; câmara de mistura: caixa de custom-built, que recolhe o ar de todas as válvulas solenóides e transferências para dividir-up board, onde o ar é dividido por 15 tubos de vidro cheios de moscas individuais e um tubo equipados com sensores de temperatura e umidade. Nota: reguladores de fluxo e medidores de fluxo, após os tubos de vidro garantir fluxo idêntica em todos os tubos. Quadrado azul indica a região de interesse (ROI) do sistema de rastreamento. (C) esquemática do fluxo de informações entre a câmera de monitoramento, rastreamento de computador e sistema de entrega de odor. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 2. Processo de lógica por trás e análise de dados. (A) Pessoa moscas encontrando o odor em diferentes posições e, por conseguinte, diferentes tempos. Painel esquerdo: Esquema de posições possíveis mosca no momento da comutação da válvula odor. Painel da direita: Os dados em bruto das posições-x de cerca de 15 moscas a apresentação de um pulso de 500 ms de uma diluição de acetato de etilo a 10 -3. Nota barlavento anda de moscas individuais em momentos diferentes, dependendo de suas posições-x. Linha pontilhada à esquerda: o tempo de comutação válvula odor. Encontro odor das moscas individuais é deslocada por um atraso intrínseco pelo sistema para o odor para alcançar os tubos de vidro (d), e a velocidade do vento (W). Portanto, encontro odor é calculada individualmente para cada mosca com base na sua posição x. Canto inferior direito: alinhadas posições-x dos 15 moscas (cinza) e média de posição x (preto corajoso). (B) mesmos dados que em A, mas corrigida para o atraso e velocidade do vento. BottOM: alinhado x posições dos 15-moscas (cinza) e significam X-posição (vermelho corajoso) após a correção. (C) Comparação de progresso contra o vento média de 15 moscas desencadeados por um pulso de 500 ms de acetato de etilo com e sem correção para viagens odor. Note que o não corrigida (preto) de rastreio é corrigido pelo atraso, mas não para viagens odor. (D) Média upwind velocidade de 15 moscas desencadeados por um pulso de 500 ms de acetato de etilo com e sem correção para viagens odor. As linhas tracejadas indicam a velocidade calculada a partir de valores de progresso contra o vento mostradas em C, linhas arrojadas exibir a velocidade contra o vento após a suavização usando um 1 a ordem de 9 pontos filtro Savitzky-Golay. (E) Unfiltered velocidade média do barlavento com e sem correção para viagens odor por 30 moscas e 40 pulsos de acetato de etilo cada (ou seja, um conjunto de dados completo). Por favor clique aqui para ver uma versão maior destafigura.
. Figura 3. Exemplo respostas para 10 -3 diluições de 4 odores atraentes (A) com código de cores de resposta em tempo-cursos médios de 30 moscas individuais para 500 pulsos ms de 4 atractivos e o óleo mineral solvente (MOL; ETB: butirato de etila; IAA: acetato de isopentilo; ETA: acetato de etilo; Bedn: 2,3-butanodiona). Cada linha representa o curso de tempo-resposta média de uma mosca indivíduo. Cada mosca foi apresentado com cada odor por 40 vezes e - porque as moscas têm permissão para distribuir livremente e pode deixar a região de interesse do sistema de rastreamento - significa cursos de tempo de resposta são calculados a partir de todas as trajetórias completas por mosca (n = 7-39 trajetórias por mosca e odor). Barra amarela representa o pulso odor. (B) O tempo de resposta-cursos a 4 atractivos e o óleo mineral solvente (n = 30; moscas média+/- SEM). (C) o deslocamento de fluxo ascendente líquido dentro de 4 segundos após encontro odor mesmos dados (como em (A) e (B), n = 30 moscas). Caixas cheias indicam movimento contra o vento estatisticamente significativa em comparação com o óleo mineral controle negativo (p <0,05; teste de Wilcoxon). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. respostas no sentido de misturas ternárias e quaternário de atrativos. (A) contra o vento deslocamento Net para 4 atractivos e todas as misturas ternários e quaternários dos mesmos ordenados por sua resposta mediana. Letras diferentes indicam diferenças estatisticamente significativas entre as respostas (p <0,05; Kruskal-Wallis teste da soma de classificação e post hoc teste de Wilcoxon; n = 30moscas). Caixa preta abaixo indica as misturas que contêm acetato de etila e 2,3butanedione. (B) resposta de tempo cursos de misturas contendo acetato de etilo e 2,3-butanodiona (média +/- SEM; n = 30 moscas). Nota-cinética de resposta semelhantes. (C) Comparação da resposta de tempo de cursos sem misturas de acetato de etilo ou 2,3-butanodiona e cinética de resposta evocada por a mistura total (média +/- SEM, n = 30 moscas). Nota menor amplitude sem ETA e de resposta mais curto, sem Bedn. (D) Comparação de-curso momento ideal (tracejada) construído a partir de EtA (vermelho) e Bedn (verde) e a mistura completa. Sombreados indicam partes do curso em tempo explicada por diferentes componentes da mistura. Note-se que no estudo anterior demonstrou-se que as respostas em relação misturas binárias de atraentes pode ser previsto a partir de um curso de tempo óptimo criado na base de tempo de mistura de constituintes pratos 29. Este curso de tempo óptimo para a ETA e Bedn é mostrado como umlinha tracejada. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Embora o sistema Flywalk parece bastante sofisticado, à primeira vista, uma vez configurado e funcionando, é fácil de usar e produz resultados muito robustos. Para enfatizar a consistência dos resultados produzidos com o bioensaio pode-se dizer que os resultados representativos mostrados aqui foram obtidos quase 2 anos depois alguns dos resultados apresentados em estudo anterior 29 com uma configuração modificada usando um novo software de rastreamento e fonte de luz. No entanto, as respostas são atractivas - apesar amplitudes de resposta um pouco mais altas - muito semelhante à daqueles publicados anteriormente sobre as suas dinâmicas.
Existem alguns aspectos críticos que devem ser considerados, em particular, a fim de obter resultados de alta qualidade usando Flywalk. Importante, a humidade não deve cair abaixo de 60% durante o decurso de uma experiência. Uma sessão experimental típica tem a duração de cerca de 8 h. Razoavelmente porte femininos CS de tipo selvagem moscas fome de 24 horas antes da experiment facilmente sobreviver por pelo menos 12 horas na configuração fornecidas umidade experimental é alta o suficiente. Para evitar problemas relacionados à umidade, é aconselhável instalar um sensor de umidade em um tubo de vidro vazio (Figura 1B) e evitar colocar os reguladores de fluxo no fluxo de ar em qualquer lugar entre umidificadores e tubos de vidro. Também é absolutamente essencial para a qualidade dos dados que o sistema é hermeticamente fechado. Os fluxos de ar que saem do sistema após os tubos de vidro deve somar-se ao fluxo de ar que entra no sistema. A maioria das experiências com falha pode ser atribuída a fugas no sistema e um grande cuidado deve ser tomado antes do início da experiência para assegurar que o sistema é hermeticamente fechado. Finalmente, como acontece com qualquer configuração utilizada na pesquisa olfativa, uma das principais questões cotidianas é evitar a contaminação. A maioria das partes que entram em contacto com os odores são feitas de vidro, de aço, de Teflon ou PEEK e pode, portanto, ser aquecido até pelo menos 200 ° C, o que é suficiente para remover a maior óDors, exceto para aqueles com pontos particularmente elevado ponto de ebulição, tais como feromônios de cadeia longa. Porque as válvulas de verificação contém partes de borracha não podem ser aquecidos tão elevada e, portanto, são a principal fonte de contaminação, que é por isso um protocolo de limpeza especial foi concebido para eles. No entanto, é aconselhável manter o controle dos odores uma válvula de retenção em particular tem entram em contato com. Em caso de dúvida quanto à sua limpeza substituí-lo.
Como um compromisso entre os ensaios e experiências tethered coorte, Flywalk, claro, também tem algumas desvantagens em comparação com outros métodos. O paradigma é muito eficiente quando comportamento em relação a uma multiplicidade de diferentes estímulos tem de ser avaliados e comparados. Notavelmente, porque o curso de tempo de resposta de 15 pessoas para apenas um pulso de um determinado odor assemelha-se fortemente de resposta em tempo-cursos obtidos em um conjunto de dados completo (ou seja, 30 moscas e 40 apresentações cada; Figuras 2D, 2E por exemplo a valência hedônica de apenas um odor precisa ser examinado. Além disso, a resolução temporal de sistemas de rastreamento visuais é muitas vezes menor do que a dos bioensaios mais rápidos como o vôo presos ou esteira. Os menores atrasos na resposta relatados em comportamento guiado por odor Drosophila estão bem abaixo de 100 milissegundos após o encontro odor de paradigmas tethered 20,23 e, assim, cair dentro de uma janela de tempo que não pode ser resolvido quando se analisam os dados a 10 Hz. No entanto, as respostas atractivas em Flywalk normalmente começam no primeiro 100-300ms (Figura 3B), que é bem em linha com atrasos de onda barlavento observados em livre-vôo moscas 5. Resta, portanto, a ser determinado se esta diferença de atrasos na resposta de paradigmas amarrados em comparação com túnel de vento e Flywalk é causada por diferenças de resolução espacial e / ou temporal em paradigmas de acompanhamento visual ou por um estado de excitação mais elevada de moscas na situação tethered.
Em resumo, Flywalk é um bioensaio sem escolha, que combina a apresentação do estímulo altamente controlada de ensaios tethered com a eficácia de experiências de coorte utilizados regularmente em Drosophila Neuroetologia. Porque o mesmo conjunto de indivíduos pode ser contestada com uma infinidade de diferentes estímulos, sua força especial reside no poder estatístico quando se comparam respostas no sentido de diferentes estímulos. Além disso, ele explora o fato de que voa contra o vento onda em cima do encontro de um odor atraente e desta forma desacopla avaliação odorde localização da fonte de odor, sem a necessidade de um gradiente, como um taco direccional. Deve, portanto, ser ideal para explorar a caixa de ferramentas optogenetic disponível em Drosophila.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Agradecemos a Daniel Veit de assistência técnica e Pedro Gouveia no Electricidade em Pó (electricidadeempo.net) para customizar o software de rastreamento para nossas demandas. Agradecemos também a Tom Retzke para apoio durante o processo de filmagem. Este estudo foi apoiado pela Sociedade Max Planck.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flywalk setup | Custom | details available upon request | |
| stimulus device | Custom | details available upon request | |
| LED cluster | Custom | details available upon request | |
| HD Pro Webcam C920 | Logitech, Lausanne, Switzerland | ||
| 2 Computers | |||
| Flywalk Reloaded v1.0 software | Electricidade Em Pó (electricidadeempo.net) | ||
| Labview 11.0 software | National Instruments, Austin, TX | ||
| Standard fly food | Custom | ||
| Standard fly vials | Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Standard fly vials | Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| aspirator | Custom | ||
| mineral oil | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | ||
| odors | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | ||
| 200 µl PCR reaction tubes | Biozym Scientific GmbH, Oldendorf, Germany |
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