Summary
자동화 추적 시스템 Flywalk는 초파리에서 냄새 유도 행동 고해상도 정량화를 위해 사용된다.
Abstract
그들의 자연 환경에서, 이러한 식초와 같은 곤충은 화학적으로 서로 다른 냄새 물질의 거대한 양의 포격 초파리 melanogaster의 비행. 더욱 문제를 복잡하게하기 위해, 곤충 신경계에 의해 검출 된 냄새는 일반적 조성과 농도 비율 변화 단일 화합물 그러나 혼합물은 없습니다. 이는 신경계에 의해 평가되어야 할 다른 후각 자극의 거의 무한한 양 리드.
냄새 자극의 측면 플라이하여 평가를 결정하는 이해하기 위해서는 많은 효율적 취기 및 악취 냄새 혼합물 향해 유도 거동을 조사하는 것이 바람직하다. 직접 연결 활동에 행동의 상관 관계, 동작은 비교 기간과 신경 생리 학적 실험에서와 같이 동일한 자극 조건에서 정량화되어야한다. 그러나, 초파리 neuroethology 많은 현재 사용 후각 생물 검정은 특수 목적 오히려있다효율성으로 또는 해결을 향해하게 안정적.
Flywalk, 자동화 냄새 전달 및 추적 시스템은, 효율 및 분해능을 절충. 이는 악취 패킷이 자유롭게 걸어 플라이를 자극하고 animal's에게 동적 행동 반응을 정확하게 결정할 때의 판정을 허용한다.
Introduction
어떤 neuroethological 연구의 목표는 하나의 지배적 인 신경 또는 신경 회로의 활동 상태 및 유기체의 거동과 인과 관계를 확립하는 것이다. 이 목표의 연결 작업을 달성하기 위해 행동 동일한 자극 조건에서 모니터링해야하고 이러한 자극 조건이 이상적으로 사람들의 이해 진화 조사에서 신경계 비슷해야합니다. 이 행동 생물 검정에 관해서 특히 때, 이러한 요구 사항이 역사적으로 초파리에 매우 까다로운 입증은 후각 neuroethology을 melanogaster의.
소스에서 해제되면, 냄새 깃털이 빠르게 공기 이동이 냄새 분배 (1)의 주요 결정 요인 인에 의한 난류 확산으로 얇은 필라멘트로 헤어. 그 결과, 악취 소스를 향해 이동 곤충은 청정 공기의 가변 간격으로 산재 냄새 패키지 간헐적 자극을 경험한다. 양자 모두산책과 곤충 비행 - 초파리를 포함하는 - 5 - 냄새 2의 부재에서 크로스 바람 이동 주로 깃털 만남에 맞바람 급증에 의해 탐색이 간헐적 인 자극 정권을 악용 입증되었다. 이러한 트랩 분석 등의 초파리 neuroethology에 사용되는 11, 많은 행동 생물 검정 - 생리 학적 실험에서 자극 절차 반면 주로 곤충 깨끗한 공기 또는 동적 자극 서열 6의 장시간 산재 냄새 중 하나를 제공하는 단일 퍼프하여 자연 환경에서 발생할 수있는 그 모방 15 - 오픈 필드 경기장 또는 T-미로는 냄새 그라데이션 (12)에 의존하고있다. 정의에 의해 악취 구배가 냄새 공급원으로부터의 거리에 따라 농도 가변되기 때문에, 특별한 문제는 이러한 패러다임을 사용하여 정확한 악취 농도에 기인 할 수 없다. 또한, 기울기냄새 그라데이션 비판적 취제의 물리 화학적 특성에 따라 달라집니다. 잘못된 해석을 초래할 수있다 (20) - 높은 휘발성 화합물의 구배는 휘발성이 낮은 화합물에 의해 생성되므로 역시 어려워 항해 (16)의 유일한 수단으로서 공간에서 농도 차이의 측정에 의존 유기체에 대해 추적하는 것보다 얕은 것 특히 선택의 분석에 후각 환경 설정. 이 공간의 모든 단계에서 서로 다른 혼합 성분의 비율에 이르게하기 때문에 다시 생리학과 행동 사이에 명확한 상관 관계를 배제하기 때문에 냄새 혼합물을 향한 행동을 조사 할 때이 효과 또한 매우 해롭다.
식초 파리는 과일을 발효에 집계하는 경향이 있지만, 그들은 음식 소스와 산란 사이트에 대한 그들의 탐색에 독방 있습니다. 그럼에도 불구하고, 각각의 동물을 테스트하는 것이 아니라 많은 행동 패러다임은 초파리 neuroetholo에 사용GY는 파리의 코호트 냄새 유도 동작을 살펴 매력 제어 위에 자극 냄새를 선택하는 파리의 분획으로서 획득된다. 이 코호트 실험 비행 neuroethology의 이해에 크게 기여하고이를 사용하여 만든 관측의 대부분은 단일 비행 실험에서 확인할 수있다. 그러나, 각 other's 결정에 영향을 미칠 수있다 (21) 및 극단적 인 경우 악취 평가 인구 밀도 22에 따라 회피하기 위하여 무관심 전환 할 수 날아 관찰되었다. 또한, 실험의 이러한 종류의 결과는 종종 연결 활동과 동작을 상관 할 때 바람직 할 것이다 오히려 그 일 동안 플라이가 무엇을하고 있는지 관찰보다 행동 결정의 시퀀스의 엔드 포인트를 제공한다. 이 다소 낮은 해상도의 코호트 실험은 같은 수 닿는 비행 경기장과 디딜 방아와 같은 고해상도 단일 플라이 방법으로 대조된다당시 행동 반응의 직접적인 관찰 자극 20,23,24를 표시됩니다. 그들은 매우 효율적이고-간 개인 간 시험 변동성이 부분적으로 오랜 기간 동안 인구의 관찰에 평균화되기 때문에 강력한 심지어 상대적으로 결과 낮은 샘플 크기를 제공하기 때문에 그럼에도 불구하고, 코호트 실험은 여전히 인기 있습니다. 곁에 비행과 디딜 방아는 아마 자극 프레 젠 테이션 및 시간 해상도에 관한 황금 표준을 제공하지만, 사용되는 경기장은 하나의 동물을 위해 설계되었으며 따라서 시간이 많이 소요되는 샘플 통계 분석에 필요한 크기를 얻을 수 있도록하고 있습니다. 몇 개의 다른 접근이 최근에 잘 정의 자극 정권과 조합 고해상도 행동 데이터의 효율적인 획득을 허용 개발되었다. 이러한 냄새의 깃털 5의 정확한 3D 모델과 함께 풍동에서 여러 식초 파리의 자율 3D 추적을 포함 (25)와 Flywalk 패러다임 (26)로부터 공기 류와 함께 제공되는 선택 실에서 여러 개별 파리의 추적.
Flywalk에서, 15 개인 파리는 작은 유리 튜브에 위치하고 있습니다 지속적으로 붉은 빛이 상황에서 오버 헤드 카메라에 의해 감시. 냄새가 20cm / sec의 연속적인 기류에 첨가하고, 일정 속도로 유리관을 통해 이동된다. 기류는 악취 전달 시스템에 들어가기 전에 증류수 (가습기)를 함유하는 250ml의 병에 통과시켜 가습된다. flies' 위치는 파리 상기 상향 이동할 수 없거나 관심 (ROI)의 사각 영역 냄새 튜브의 길이의 대부분을 감싸는 (그러나 튜브 (각면에 약 5mm의 바깥 쪽 가장자리를 제외) 내에 기록된다 바람이 불어) 냄새 프리젠 테이션 (그림 1A, B)의시기에. 플라이 아이덴티티 추적 시스템 t 의해 일정하게 유지된다그들의-Y 위치 (즉, 그들의 유리관 제한)에 기초하여 실험 hroughout. 악취 자극은 최대 8 번의 악취 및 26,29 (도 1b) 그의 모든 가능한 혼합물의 프리젠 테이션을 가능하게하는 다 성분 자극 장치를 사용하여 달성된다. 실험 과정은 컴퓨터 냄새 전달 시스템을 조절하고 온도 및 습도 정보를 수집하는 (컴퓨터 (1),도 1C)에 의해 제어된다. 이 컴퓨터는 또한 지속적으로 초당 20 프레임 (컴퓨터 2)에서 비행 위치를 추적하는 두 번째 컴퓨터에 데이터 로거를 (촬영을 시작 / 정지) 제어합니다. 냄새 자극을주기 주위에 냄새 밸브 상태 (밸브 개방의 즉, 시간 점), 악취 ID, 온도와 습도를 위치를 비행 냄새에 컴퓨터 2.이 방법으로 정보를 기록하고, 위치는 .CSV-파일로 동기화 및 수출 비행하는 추가 처리 및 사용자가 작성한 분석 루틴을 사용하여 분석 될 수있다. 때문에전체 시스템은 컴퓨터 제어, 아니 인간의 개입은 실험 세션 동안 필요하지 않습니다.
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Protocol
Flywalk의 구성 및 기술 정보 (26)가 다른 장소 (MK로부터 획득 될 수 있으며,이 설정 정보를 설정하는 임의의 문제가있는 경우에) 기술되어있다. 여기에서 우리는 신뢰할 수있는 결과를 얻는 데 도움이 될 것입니다 패러다임의 취급에 대한 자세한 지침에 초점을 맞 춥니 다.
1. 플라이 처리
- 12 시간 빛 : 23 ~ 25 ° C와 70 %의 상대 습도에서 어두운 정권 후면 12 시간에서 음식 매체 (27)에 중간 밀도 문화에 저에 날아간 다. 이를 위해, 20 ~ 30, 새롭게 등장 성인 후, 1 주에 대한 큰 식품 유리 병에 재생 성인 파리를 버리고 등장하는 자식을 기다리는 날아 수 있습니다.
- 30-40 새롭게 등장 (나이 <24 시간) 성인 파리를 수집 3-5 일 동안 음식 매체 (27)를 포함하는 새로운 유리 병에서 그들을에 나이.
- 스물 네 시간 행동 실험을 시작하기 전에 : 이동 모든 30 ~ 40 이전에 수집 된 3-5 D 이전 (2.2 참조) 새 VI (으)로 운항하는 항공사Al을 촉촉한 고무 발포체 플러그 또는 흡입기를 사용하여 습윤 티슈를 포함.
참고 : CO 2를 사용하여 파리를 마취시키다하지 마십시오.
Flywalk 설치 2. 준비
- 가습기 250 ml의 병을 사용합니다. 100 ml의 증류수와 가습기를 입력합니다.
- 냄새 유리 병을 준비합니다.
- 순수한 냄새 에틸 아세테이트, 에틸 부티레이트, 이소 펜틸 아세테이트 및 용매 광유 2,3- 부탄의 500 μL 10-3 희석액을 준비한다.
- 냄새 유리 병 당 두 개의 볼 체크 밸브를 연결합니다. 밸브는 단방향 공기 흐름 만 허용하는지 확인합니다. 따라서, 공기가 한쪽 바이알을 입력하고, 다른 측에 둘 수있는 방식으로 체크 밸브를 연결한다.
- 200 ㎕의 PCR 반응 튜브의 뚜껑을 제거한다. 별도의 반응 관에 모든 악취 희석 100 μl를 피펫과 별도의 냄새 튜브에 튜브를 배치합니다. 또한 단지 용매 미네랄 오이를 포함하는 하나의 냄새 유리 병을 준비엘.
- 단단히 스테인리스 플러그와 고무 개스킷을 사용하여 폐쇄함으로써 악취 바이알을 밀봉.
- 악취 전달 시스템 (광유를 함유하는 4 함유 냄새 1) 5 냄새 튜브를 연결한다. 오른쪽 흐름 방향을 연결해야합니다. 잘못된 연결은 계획된 실험을 손상하지 않을뿐만 아니라 전달 시스템을 오염시킬 수있다.
- 자극 장치의 혼합 챔버의 출구를 밀봉하여 누출을 점검한다. 자극 장치 전에 모든 공기 흐름이 지금 점진적으로 제로로 떨어질 것을 확인합니다. 그렇지 않은 경우, 지금 시스템을 떠나 공기의 치찰음의 사운드로 식별 할 수 있습니다 누출을 확인합니다.
- 조심스럽게 대응하는 어댑터를 사용하여 양면에 흡입기와 가까운 유리 튜브를 사용하여 15 개별 유리 튜브에 15 개인 파리를 전송합니다.
참고 : 시스템이 밀폐 성공적인 실험을 위해 봉인해야하기 때문에, 어댑터가 단단히 유리 튜브에 맞게 보장유리 튜브는이 단계에서 중단 될 수 있습니다. 보호 장갑과 고글을 착용하여 부상을 방지하기 위해주의하십시오. - Flywalk 설정에 유리 튜브를 연결하고, 여기부터, 파리는 새로운 환경에 길들 수 있도록 실험을 시작하기 전에 적어도 15 분 동안 기다립니다.
- 유리 튜브를 부착 후 : 유리 튜브 후 16 기류가 시스템에 유입되는 공기를 추가 할 경우 컴퓨터 1 하류 디지털 유량계의 판독 값을 확인. 습도가 60 %와 80 % 사이 인 경우 또한, 컴퓨터 1에 확인합니다.
- 파리에 제출 냄새 자극의 순서와 타이밍을 제어 설계 자극 프로토콜. 40 회 동시에 기술 데이터, 현재 4 악취 및 단독 제어 (미네랄 오일)과 가능한 모든 원과 냄새의 4 급 혼합물 예를 들어 구하십시오. 90 초 interstimulus 간격으로 500 밀리 초에 펄스 지속 시간을 설정하고 자극 순서를 무작위로.
- 리튬에 스위치GHT 소스 (LED 클러스터, λ = 630). 유리관 내부의 온도를 증가시키지 않고 효율적으로 추적을위한 충분한 빛을 제공해야합니다.
- 모든 15 유리관가 포함되어있는 방법으로 모니터 할 및 튜브의 가장자리의 대략 5mm 제외 영역을 가로 질러 드래그하여 프레임 트래킹 시스템의 관심 영역을 설정한다.
- 개별 유지 해당 스크립트 자신-Y 위치를 변경하여 추적 시스템에서 개별 관 (14) 사이에 병렬로 분리 라인을 설정하여 실험을하는 동안 식별 날아간다. 하나의 플라이는 두 라인 사이의 임의의 집합 추적되기 때문에, 이러한 두 분리 라인 사이 하나 유리관이 항상 존재하는 방식으로 그것들의 위치를 확인.
- 확실하게 유리 튜브를 통해 추적 날아 방식으로 카메라 매개 변수를 설정해야합니다. 초파리는 관심 영역의 가장자리에서 손실되는 경우, 추적 (S)의 휘도를 증가 또는 이득oftware. 추적 시스템의 기계적 진동을 피하십시오. 제조 업체의 프로토콜에 따라 상용 소프트웨어를 사용하여 추적 할 수 있습니다.
- 자극 프로토콜을 시작하여 실험을 시작합니다. 기록은 20 FPS (초당 프레임)에서 XY 좌표를 flies' 및 텍스트 파일의 냄새 밸브 상태와 함께 로그인합니다.
3. 데이터 분석
참고 :이 단계는 분석이 그럼에도 불구하고 단계별 방식으로 표시됩니다 의미있는 결과를 얻을하는 것이 중요하기 때문에 데이터 분석의 다음 단계는 알에서 프로그램 사용자가 작성한 루틴을 사용하여 자동화되어 있습니다. 분석을위한 미가공 데이터는 하나의 냄새 자극주기위한 공통 시간축상의 cm에서 냄새 밸브 상태, 펄스 수 실험 15 플라이 X-위치에 동기 정보를 포함 .CSV-파일이다. 데이터 분석을위한 사용자 정의 코드는 요청에 따라 제공 할 수있다.
- 열기 .CSV 파일, 차에 의해 표시 밸브 개방 시간 점을 찾을 수밸브 상태를 나타내는 열에 NGE.
- 폼의 냄새 위치의 선형 함수를 계산할
F (t)는 S의 * (T)를 = I +
t는 자극 사이클 시간이고, S는 풍속 (여기서 20cm / 초) 내가 냄새가 위치 0 (밸브 개방 플러스 지연)에서 튜브 진입 시간 포인트를 사용하여 계산 될 수있는 절편이다. - 어떤 냄새 시점을 찾아 모든 비행과 0 주이 시간에 지점을 설정하기위한 X-위치가 교차 비행 : 비행 위치가 각 individual's에 정렬이 방법은 냄새 발생합니다.
- 관심 영역의 맨 가장자리에 앉아 파리를 제외합니다.
- 모든 자극을주기위한 시간 간격 (100 밀리 초) 반복 과정에 의해 상기 X 축 방향의 변위를 분할하여 X-위치로부터 속력을 계산한다.
- 그림 2E와 같이 모든 비행과 냄새과 특정 냄새에 대한 사람들의 평균 시간 코스에서 평균 속도 시간 코스를 계산 속도 시간 과정을 구하십시오.
- 그림 3C와 같이 순 변위를 얻기 위해 모든 추적 이벤트에 대한 냄새 펄스, 그 후 파리와 냄새 당 평균 순 변위 후 4 초 이내에 순 변위를 계산합니다.
4. 청소 절차
- 깨끗한 유리 튜브
- 유리 튜브에서 파리와 어댑터를 제거하고 세제를 유리 튜브를 흡수.
- 실행 증류수에서 유리 튜브를 씻어 압축 공기를 사용하여 건조.
- 8 시간 동안 200 ℃에서 가열 유리관.
- 청소 냄새 전달 시스템
- 중앙 혼합 실에서 모든 냄새 튜브 및 튜브를 제거합니다.
- 혼합 챔버에서 튜브 어댑터를 제거합니다.
- 실험실 세정 용액과 용매 (예 : 에탄올, 아세톤)로 세정하여 클린 혼합 챔버. 실험실 후드에서 다음 단계를 수행합니다.
- 건식 혼합 챔버 8 시간 동안 200 ° C에 그것을 가압 공기를 이용하여 가열한다.
- 청소 냄새 유리 병과 체크 밸브
- 스틸 플러그 (폐기 고무 가스켓)를 제거하고 냄새 유리 병에서 밸브를 확인하고 실험실 청소 솔루션의 모든 구성 요소를 흡수.
- 초음파 목욕 초음파 처리 구성 요소와 증류수를 씻어.
- 에탄올, 아세톤 체크 밸브를 제외한 모든 구성 요소를 청소합니다. 실험실 후드에서 다음 단계를 수행합니다.
- 및 압축 된 공기를 이용하여 건조 성분은 8 시간 동안 200 ℃에서 이들을 가열한다.
- 에탄올과 주사기를 사용하여 아세톤으로 세척하여이를 내부 청결 체크 밸브 (흐름 방향을 고려). 실험실 고글을 착용 실험실 후드 아래 다음 단계를 수행합니다. 아세톤은 압축 공기를 세척 즉시 고무 부품, 건조 체크 밸브를 공격하기 때문에.
- 며칠 동안 체크 밸브를 통해 공기를 펄스에 의해 잔여 냄새를 제거합니다. 이 세척 단계에 정권 온 / 오프 1 초 공기에 60 ° C에서 인큐베이터와 1 초 공기를 사용합니다.
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Representative Results
초파리는 일정 속도로 유리관을 통해 악취 펄스 및 냄새 펄스 이동간에 그들의 유리관 내에 자유롭게 분배 할 수 있기 때문에 파리 자극 시점의 x 방향의 위치에 따라 서로 다른 시간에 악취가 발생. 그 결과, 에틸 아세테이트 매력적인 10-3 희석액 500 밀리 초 펄스에 의해 유발 된 맞바람 궤적의 온셋은 가까이 앉아 파리에 비해 그들의 유리관의 풍하 끝에 파리 약 1 초 지연 20cm / sec로 20cm 유리 튜브 길이 (도 2a)의 풍속에서 등진 끝. 냄새 프리젠 테이션시의 X-위치에 따라 각 개인에 대한 악취 발생의 시간적 차이를 보정하기 에틸 아세테이트 대한 응답 지연이 개인 (그림 2B)에 걸쳐 일관성이 있음을 알 수있다.
O에 대한 보정없이 대응하여, 평균 맞바람 궤도DOR 여행은 보정 평균 궤적에 비해 약 0.5 초만큼 지연된다 (도 2C, 냄새 모두의 궤적을 행 하였다 유리관의 풍상 단부를 입력해야하는 시간 보정을 참고). 또한, 단일 펄스를위한 냄새 보정 평균 풍상 궤적은 또한 하나의 나안 (도 2D)보다 가파른 기울기 (즉, 더 높은 보행 속도)를 표시한다. 하나의 냄새 펄스에 대한 관찰과 유사하게, 냄새 여행에 대한 보정을 생략하면 냄새 펄스의 40 프리젠 테이션 두 실험 세션 (즉, 30 파리)로 구성된 완전한 데이터 집합의 증가 지연 및 낮은 응답 진폭 리드 각 (그림 2E) .
에틸 부티레이트 매력적인 10-3 희석액 500 msec의 펄스 (ETB), 이소 펜틸, 아세트산 (IAA), 에틸 아세테이트 (ETA) 및 2,3- 부탄 디온 (BEDN)에 반복적으로 자극 풍상 OD에 서지 이끌어또는 굶주린 여성 파리에서의 만남은, 용매 미네랄 오일 (MOL)을 자극하는 반면 없거나 약한 반응을 불러 일으킨다 없습니다. 단독으로는 이전의 기계적 자극 (28)과 유사한 패러다임 증가 운동을 유도하는 것으로 나타났다. Flywalk 패러다임의 냄새 자극이 전체 공기 흐름을 변경하지 않습니다 증가 운동이 노동부를 사용하여 제어 상황에서 대부분 결석 때문에, 이러한 맞바람 사실 냄새 응답을 반영 서지. 응답 시간 과정을 의미 - 개인 (도 3A) 및 악취 관련 레이턴시에 걸쳐 정형화되어, 진폭 및 지속 시간 (도 3A, B). 아세트산 에틸로 반응 날카로운 발병 높은 진폭과 짧은 지속 기간을 표시. 대조적으로, 2,3- 부탄에 대한 응답은 통상적으로 약간 나중에 개시, 낮은 진폭과 긴 지속 시간을 표시. 에틸 부티레이트 및 펜틸 아세테이트, 에틸 아세테이트 등의 유사한 시간적 역학을 유도하지만, 진폭 응답은 낮다. Correspondingly, 4 냄새 용매 및 음성 대조군 광유 (도 3c)을보다 악취의 발생 후 4 초 이내에 높은 맞바람 변위를 유발.
동일한 4 유인 제를 사용하면, 이전의 이진 유인 혼합물 적어도 매력적인 매력 혼합물 성분 (29) 것으로 도시되었다. 여기서, 이러한 관찰은 모든 가능한 혼합물 및 삼원 4 유인의 완전한 혼합을 테스트하여 연장된다. 이진 혼합물과 이전의 관찰과 마찬가지로,이보다 복잡한 블렌드의 모든 적어도 매력 가장 매력적인 단일 화합물 (그림 4A) 등이다. 가장 매력적인 혼합 에틸 아세테이트와 2,3 부탄 모두를 포함하는 것들이다. 이들 3 배합물에 대한 응답은 서로 크게 다르지 않는, 또한 반응 속도론은 매우 비슷 (도 4A, B)이다. 대조적으로, 전체 BLEN로부터 에틸 아세테이트를 생략2,3- 부탄 디온을 생략하는 응답 (도 4C)을 단축하면서 D는 풍상 최대 속도의 저하로 연결. 에틸 아세테이트는 2,3- 부탄 낮은 진폭하지만 더 이상 시간 (도 3B, 4D)의 응답을 유도하는 반면, 짧은 높은 진폭 반응을 이끌어 때문에 이러한 관측은 유인의 혼합으로 응답 시간 코스가 경향이있다, 우리의 이전 연구 결과의 연상 혼합 구성 응답 시간 코스 (29)에서 생성 된 최적의 응답 시간 코스를 따르십시오. 이 세트에서 4 유인의 최적의 에틸 아세테이트 및 2,3- 부탄 디온 향해 응답 시간 과정에 기초하여 구성 될 수있다. 에틸 부티레이트 및 / 또는 이소 펜틸 아세테이트 전체 블렌드 (도 4d)를 향한 반응에서 관찰되는 최대의 보행 속도에 도달하기 위해 또한 필요하다. 따라서, 2 내지 3 또는 4 성분 혼합물의 복잡성의 증가는 혼합물 (E)의 매력을 증가시킨다벤 더 이전의 관찰에서 예상되는 것보다, 유인의 혼합물 대한 응답은 혼합물의 구성 성분으로 반응의 최적을 나타내는 것이다. 그럼에도 불구하고, 구성 원자가 냄새 혼합물에서 보존하고있는 일반적인 결론이 더 복잡한 혼합물 29도 유효합니다.
그림 1. 원리 및 Flywalk 설정의 레이아웃입니다. (A) 원칙의 개략도. 노란색 사각형 : 냄새 자극 관을 통해 이동과 비행의 풍상 운동의 결과로; 블랙 개체 : 카메라는 행동 반응을 추적합니다. 숯 여과 된 공기와 설치를 통해 공기 흐름 (B)은 도식 냄새 전달체 26,30 들어가기 전에, 8 채널로 가습 및 분할된다. 블로우 업도 1의 3 웨이 솔레노이드 밸브 통과 빈 바이알을 통해 공기를 보내고 (C; 보상 흐름) 나 악취 소스 함유 바이알 내지 (O; 냄새 흐름); 2, 볼 체크 밸브를 한 방향으로 공기 흐름을 제한하고 시스템의 오염을 방지하는 단계; 혼합 챔버 : 맞춤형 상자, 모든 솔레노이드 밸브 및 전송의 공기를 수집 분할 최대 공기 온도 및 습도 센서가 장착 개별 파리 1 튜브로드 (15) 유리 튜브에 대한 분할 보드,. 참고 : 유리 튜브 후 유량 조절기 및 유량계 모든 튜브에 동일한 흐름을 보장합니다. 블루 스퀘어는 추적 시스템의 관심 영역 (ROI)의 영역을 나타낸다. 추적 카메라, 추적 시스템, 악취 전달 시스템 사이의 정보 흐름의 (C) 도식은. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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도 2의 절차와 데이터 분석 배후의 이론적 근거는. (A) 개인, 따라서 다른 시간을 상이한 위치에서 악취가 발생하고 파리. 왼쪽 패널 : 냄새 밸브 절환시 가능한 플라이 위치의 개략도. 오른쪽 패널 : 에틸 아세테이트 10-3 희석액 500 밀리 초 펄스의 프레젠테이션 약 15 파리의 X-위치 원시 데이터. 참고 바람을 안고 자신의 X-위치에 따라 서로 다른 시간에 개인 파리의 산책. 왼쪽 점선 : 냄새 밸브 전환의 시간. 냄새가 유리관 (d) 및 풍속 (w)에 도달하기 위해 각각의 파리의 악취 발생은 시스템 고유 지연에 의해 시프트된다. 따라서, 악취 발생은 자사의 X-위치에 따라 각각의 비행에 대해 개별적으로 계산됩니다. 오른쪽 아래 : (15) 파리의 정렬 된 X-위치 (회색)과 평균 X-위치 (굵은 검은 색). (B)에서와 같이 동일한 데이터 만, 지연 및 풍속 보정. 봇엄마 : (회색)과 보정 후 X-위치 (굵은 빨간색)를 의미 (15) 파리의 정렬 된 X-위치. 와 악취 여행을위한 보정없이 에틸 아세테이트 한 500 밀리 초 펄스에 의해 유도 (15) 파리의 평균 맞바람 진행 (C) 비교. 보정 (블랙) 추적이 아니라 악취 여행, 지연을 보정합니다. 와 악취 여행을위한 보정없이 에틸 아세테이트 한 500 밀리 초 펄스에 의해 유도 (15) 파리 (D) 평균 맞바람 속도. 점선은 C로 표시 맞바람 진행 값으로부터 계산 속도, 굵은 선이 1 차 순서 9 포인트 Savitzky - 골 레이 필터를 사용하여 부드럽게 한 후 맞바람 속도를 표시 나타냅니다. (E) 필터링되지 않은이와 (30) 파리 에틸 아세테이트 각 (즉 완전한 데이터 세트)의 40 펄스에 대한 악취 여행을위한 보정없이 맞바람 속도를 의미한다. 이의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오그림.
. ETB 4 매력적인 냄새 10-3 희석 그림 3. 예 응답 (A)는 500 밀리 초 4 유인의 펄스 용매 미네랄 오일 (MOL 30 개인 파리의 평균 응답 시간 과정을 색으로 구분 : 에틸 부티레이트; IAA : 이소 펜틸 아세테이트, ETA : 에틸 아세테이트; BEDN : 2,3- 부탄). 각 행은 한 개인 비행의 평균 응답 시간 코스를 나타냅니다. 각 비행은 40 시간과 각 냄새되게되었다 - 파리 자유롭게 배포 할 수 있습니다 및 추적 시스템의 관심 영역을 떠날 수 있기 때문에 - 응답 시간 과정은 (N = 7-39 궤도 비행 당 모든 완전한 궤도에서 계산 의미 ) 비행과 냄새 당. 노란색 바는 냄새 펄스를 나타냅니다. (B) 응답 4 유인 용매 미네랄 오일 (N = 30 파리에 시간 코스; 평균을+/- SEM). (C) 악취의 발생 후 4 초 이내에 순 변위 풍상 (A (데이터와 동일) 및 (B), N = 30 파리). 채워진 상자는 음성 대조군 미네랄 오일에 비해 통계적으로 유의 맞바람 움직임을 나타냅니다 (P <0.05, Wilcoxon signed rank test를). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
유인의 원과 4 급의 혼합물으로 그림 4. 응답. (A) 4 유인과 평균 응답으로 분류 이의 모든 원과 4 급 혼합물의 순 맞바람 변위. 서명 크루스 칼 - 월리스 순위 합 테스트 및 사후 윌 콕슨 순위 테스트; N = 30 다른 문자는 응답 (P <0.05 사이에 통계적으로 유의 한 차이를 나타냅니다) (으)로 운항하는 항공사. 블랙 박스는 다음 에틸 아세테이트와 2,3butanedione 함유 혼합물을 나타낸다. (B) 반응을 에틸 아세테이트 및 2,3- 부탄 - 함유 혼합물의 타임 코스 (평균 +/- SEM을, N = 30 파리). 비슷한 응답-역학을합니다. 전체 블렌드에 의해 유발 된 아세트산 에틸 또는 2,3- 부탄 디온과 반응 속도론없이 혼합물의 응답 시간 코스 (C) 비교 (평균 +/- SEM, N = 30 파리). ETA없이 낮은 진폭과 BEDN없이 짧은 응답을합니다. ETA (적색)과 BEDN (녹색)로 구성 최적의 시간 코스 (점선)과 전체 조화의 (D) 비교. 명암이 서로 다른 혼합 성분에 의해 설명하는 시간 코스의 일부를 나타냅니다. 이전의 연구는 유인 제의 혼합물로 향해 진 반응 혼합물 성분이 타임 코스 (29)에 기초하여 생성 된 최적의 시간 과정에서 예측 될 수 있음을 도시 되었음에 유의. ETA 및 BEDN이 최적의 시간 코스로 표시됩니다점선. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
Flywalk 시스템이 언뜻보기에 다소 복잡한 것처럼 보이지만, 한 번 설정하고 그것을 실행하는 사용하기 쉽고 매우 강력한 결과를 얻을 수 있습니다. 생물 분석으로 산출 된 결과의 일관성을 강조하는 것이 여기에 도시 된 대표적인 결과는 약 2 년 새 추적 소프트웨어와 광원을 사용하여 변형 된 설치와 이전 연구 29에 도시 된 결과의 일부 후의 있다고 말할 수있다. 그럼에도 불구하고, 유인 응답은 - 이전에 자신의 역학에 관한 출판과 매우 유사 - 약간 높은 응답 진폭에도 불구하고.
Flywalk를 이용하여 높은 품질의 결과를 얻기 위해서는, 특히 고려해야 할 중요한 몇 가지 측면이있다. 중요한 것은, 습도는 실험 과정에서 60 % 이하로 떨어지면 안된다. 전형적인 실험 세션은 약 8 시간 동안 지속됩니다. 합리적인 크기의 여성 CS 야생형 파리는 전 전 24 시간 절식쉽게 실험 장치 제공 습도에서 최소 12 시간 동안 생존 periment 충분히 높다. 그것은 빈 유리 튜브 (그림 1B)에 습도 센서를 설치하고 가습기 및 유리 튜브 사이의 아무 곳이나 공기에 흐름 조절기를 배치하지 않도록하는 것이 좋습니다 습도 관련 문제를 방지합니다. 그것은 또한 시스템이 밀봉되고 데이터 품질에 대한 절대적으로 필수적이다. 유리관 후 시스템을 떠나는 기류가 시스템에 유입 공기를 요약한다. 대부분 실패 실험 실험 개시 시스템이 기밀임을 보증하기 전에 이동해야 시스템 및 큰 관심의 누출에 기인 할 수있다. 마지막으로, 후각 연구에 사용 된 설치와 같은 일상의 주요 이슈 중 하나는 오염을 방지하기위한 것이다. 악취와 접촉하는 부분의 대부분은 유리, 강철, 테플론 또는 PEEK 이루어지는 따라서 가장 O를 제거 할 수있는 적어도 200 ℃로 가열 될 수있다이러한 긴 체인 페로몬로서 특히 고비 점을 가진 사람을 제외하고 DORS. 체크 밸브 고무 부품을 포함하기 때문에 그들은 높은 가열하기 때문에 특정 청소 프로토콜이 그들을 위해 고안된 이유는 오염의 주요 원인입니다 수 없습니다. 그럼에도 불구하고, 특히, 체크 밸브가 접촉 한 냄새를 추적하는 것이 바람직하다. 청결에 대한 의심스러운 경우 교체하십시오.
곁에 분석 및 코호트 실험 사이의 타협으로, 물론 Flywalk은 다른 방법에 비해 몇 가지 단점이 있습니다. 패러다임 상이한 자극의 다수 향해 행동 평가와 비교 될 때 매우 효율적이다. 특히, 15 개인에게 주어진 냄새의 한 펄스의 응답 시간 코스 강하게 전체 데이터 세트에서 얻어진 응답 시간 과정과 유사하기 때문에 (즉, 30 파리 40 프리젠 테이션 각,도 2D, 2E 예 검토 될 필요가있을 때 더 효율적이다. 또한, 시각 추적 시스템의 시간 해상도는 테더 또는 비행 디딜 같은 빠른 생물 검정보다 종종 낮다. 초파리 냄새 유도 행동보고 최단 응답 지연이 닿는 패러다임 20,23 잘 악취의 발생 후 100 밀리 초 이하이며, 따라서 10 Hz에서 데이터를 분석 할 때 해결할 수없는 시간 윈도우 내에. 그러나 Flywalk에 유인 반응은 통상적 제 100-300 내에 시작할물론 무료로 비행 파리 5에서 관찰 맞바람 서지 지연과 라인에 밀리 초 (그림 3B). 따라서 닿는 패러다임의 응답 지연의 차이는 풍동에 비교 Flywalk이 시각 추적 패러다임이나 닿는 상황에서 파리의 높은 각성 상태로 공간 및 / 또는 시간적 해상도의 차이로 인해 발생 여부를 판단 할 수 남아있다.
요약하면, Flywalk 정기적으로 초파리 neuroethology에 사용 코호트 실험의 효율성과 닿는 분석의 높은 제어 자극 프레 젠 테이션을 결합한없는 선택 생물 분석이다. 개인의 동일한 세트가 다른 자극의 다수에 도전 할 수 있기 때문에 다른 자극에 대한 반응을 비교했을 때, 그 특정 강도는 통계적인 힘에있다. 또한, 매력적인 냄새의 만남에 맞바람 서지 파리는 사실을 악용,이 방법은 냄새 평가를 분리됩니다방향 큐로 그라데이션 필요없이 냄새 소스 지역화에서. 그것은 따라서 이상적으로 초파리에서 사용할 수있는 optogenetic 도구 상자를 이용하기에 적합해야한다.
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Disclosures
저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
Acknowledgments
우리는 우리의 요구에 대한 추적 소프트웨어를 사용자 정의하는 Electricidade 엠 포 (electricidadeempo.net)에서 기술 지원을 다니엘 베이트와 페드로 Gouveia의 감사합니다. 우리는 또한 촬영 과정에서 지원 톰 Retzke 감사합니다. 본 연구는 막스 플랑크 협회에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flywalk setup | Custom | details available upon request | |
| stimulus device | Custom | details available upon request | |
| LED cluster | Custom | details available upon request | |
| HD Pro Webcam C920 | Logitech, Lausanne, Switzerland | ||
| 2 Computers | |||
| Flywalk Reloaded v1.0 software | Electricidade Em Pó (electricidadeempo.net) | ||
| Labview 11.0 software | National Instruments, Austin, TX | ||
| Standard fly food | Custom | ||
| Standard fly vials | Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Standard fly vials | Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| aspirator | Custom | ||
| mineral oil | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | ||
| odors | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | ||
| 200 µl PCR reaction tubes | Biozym Scientific GmbH, Oldendorf, Germany |
References
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