Summary
Автоматизированная система отслеживания Flywalk используется для высокого разрешения количественного запаха руководствоваться поведения в дрозофилы.
Abstract
В их естественной среде, насекомые, такие как уксус летать дрозофилы были засыпаны огромным количеством химически различных пахучих веществ. Чтобы усложнить ситуацию еще дальше, запахи, обнаруженные нервной системе насекомых, как правило, не одиночные соединения, но смеси, состав и коэффициенты концентрации меняться. Это приводит к почти бесконечное количество различных стимулов обонятельные, которые должны быть оценены нервной системы.
Чтобы понять, какие аспекты запах стимул определить свою оценку по лету, поэтому желательно, чтобы эффективно изучить запах наведением поведение по отношению к многим пахучих веществ и запахов смесей. Для непосредственно коррелируют поведение на нейронной активности, поведение должно быть количественно в сопоставимой времени и в одинаковых условиях стимулирования, как и в нейрофизиологических экспериментах. Тем не менее, многие используемые в настоящее время обонятельные биопробы в Drosophila neuroethology довольно специальванный либо в сторону эффективности или к резолюции.
Flywalk, автоматизированная доставка запах и система слежения, устраняет разрыв между эффективностью и разрешения. Это позволяет определить, когда именно запах пакет стимулировал свободно ходить муху, и определить динамическое animal's реакцию поведения.
Introduction
Главная цель любого neuroethological исследования, чтобы установить причинно-следственную связь между активностью состояний отдельных нейронов или нервных цепей и поведения организма. Для достижения этой цели нейронную активность и поведение должны быть проверены в одинаковых условиях стимулирования и эти условия стимулирования в идеале должны быть аналогичны тем, нервная система под пристальным превратилась в смысл. Особенно, когда дело доходит до поведенческих биопроб, эти требования исторически оказались весьма требовательны в дрозофилы обонятельный neuroethology.
После освобождения от источника, запах перья быстро распадаются на тонких нитях с турбулентной диффузии, вызванной движение воздуха является основным фактором, определяющим распределение запах 1. В результате насекомое навигацию к источнику запаха испытывает периодическую стимуляцию с запахом пакетов перемежаются с переменными интервалами чистым воздухом. И то и другоеходьба и летающих насекомых - в том числе у дрозофилы - были продемонстрированы использовать эту прерывистый режим стимуляции для навигации по растущие с наветренной стороны от факела встречи и преимущественно движется боковой ветер в отсутствие запахов 2 - 5. В то время как процедуры стимуляции физиологических экспериментов в значительной степени сходны насекомое может испытать в своей природной среде либо для обеспечения единого клубами запахов, вкрапленных длительных периодов чистого воздуха или динамических последовательностей стимуляции 6 - 11, многие поведенческие биопроб, используемых в Drosophila neuroethology, таких как ловушки анализа , открытое поле арены или Т-лабиринт полагаться на запах градиентов 12 - 15. Тем не менее, из-за запаха градиенты по определению являются переменными в концентрации в зависимости от расстояния от источника запаха, конкретное поведение не может быть отнесена к точной концентрации запаха, используя эти парадигмы. Кроме того, наклонзапах градиент критически зависит от физико-химических свойств одоранта. Градиент очень летучего соединения будет мельче, чем созданная менее летучего соединения и, следовательно, труднее отслеживать для организма, опираясь на измерения разности концентрации в пространстве в качестве единственного средства навигации 16 - 20, которые могут привести к неправильному толкованию обонятельных предпочтений в частности в выборе анализов. Этот эффект также весьма вредно при расследовании поведение по отношению к запах смеси, потому что это приводит к различным соотношением компонентов смеси в каждой точке в пространстве и, следовательно, снова исключает четкую корреляцию между физиологией и поведением.
В то время как уксус мух, как правило, объединять в брожения фруктов, они одиночные в их навигации к источникам питания и яйцекладки сайтов. Тем не менее, вместо того, тестирование отдельных животных многих поведенческих парадигмы используется в Drosophila neuroetholoгы изучить запах наведением поведение когорт мух и привлекательность оценивается как доля мух, выбирающих аромат по контрольной стимула. Эти когорты эксперименты внесли большой вклад в понимание летучей neuroethology и многие из наблюдений, сделанных с их помощью может быть подтвержден в одной мухи экспериментов. Тем не менее, было отмечено, что летит могут влиять друг на other's решение 21, а в крайних случаях оценка запаха может перейти от безразличия к расторжению в зависимости от плотности населения 22. Кроме того, результаты этих видов экспериментов часто предоставляют только конечную последовательность поведенческих решений, а не наблюдая, что муха делает в то время как это делает, что бы желательно при попытке соотнести поведение с нейронной активности. Эти когорты эксперименты довольно низким разрешением контрастируют с высоким разрешением методов одного мух, таких, как привязанные арен летных и беговыми дорожками, которые позволяютдля прямого наблюдения поведенческих реакций во время стимул представлен 20,23,24. Тем не менее, эксперименты когорты по-прежнему популярны, потому что они очень эффективны и обеспечивают надежные результаты даже при сравнительно низкой размеров образца, потому что межиндивидуальную и между проб изменчивости частично в среднем из-за наблюдения за популяциями длительных периодов времени. В то время как на привязи полета и беговая дорожка, вероятно, предоставить золотой стандарт в отношении стимулов презентации и временное разрешение, арены, используемые предназначены для одиночных животных, и поэтому много времени, чтобы получить размеры образца необходимо для статистического анализа. Несколько иные подходы недавно были разработаны, которые позволяют эффективное приобретение поведенческих данных высокого разрешения в сочетании с четкой режима стимула. Они включают в себя без присмотра 3D-слежение нескольких мух уксуса в аэродинамической трубе в сочетании с точной 3D-модели запах шлейфа 5 25 и парадигмы Flywalk 26.
В Flywalk, 15 отдельных мухи расположены в небольших стеклянных трубок и постоянно контролируется с помощью накладных камеры под красных фонарей условиях. Запахи добавляются к непрерывному воздушного потока 20 см / сек, и проходить через стеклянных трубок с постоянной скоростью. Воздушный поток увлажняется, пропуская его через 250 мл флаконах, содержащих по дистиллированную воду (увлажнителей) перед входом в систему доставки запаха. В flies' позиции отражаются в квадратной области интереса (ROI), охватывающей большую часть длины труб запах (но не включая внешние края труб (примерно 5 мм с каждой стороны), где мухи не может двигаться дальше вверх или ветру) вокруг времени презентации запаха (фиг.1А, Б). Fly тождества поддерживается постоянным с помощью системы слежения тhroughout эксперимент на основе их Y-позиции (т.е. их пределы стеклянной трубки). Запах стимуляция достигается с помощью многокомпонентного стимул устройство, которое позволяет в презентации до 8 одноместных запахов и всевозможных смесей 26,29 (рис 1B). Курс эксперимента управляется с помощью компьютера, регулирующей систему доставки и сбора запаха температуры и влажности информацию (компьютер 1, рис 1С). Этот компьютер также контролирует регистратора (начала / остановки записи) на втором компьютере, который непрерывно отслеживает лету позиции на 20 кадров в секунду (компьютерные 2). Fly позиции, статус запах клапана (т.е. временной точки открытия клапана), запах ID, температуру и влажность вокруг циклов запах стимуляции вошли на компьютере 2. Таким образом информация о запахом и летать позиции синхронизированы и экспортировать как .csv-файлов, которые могут быть дополнительно обработаны и проанализированы с помощью пользовательских написаны процедуры анализа. Потому каквся система управляется компьютером, без вмешательства человека не требуется во время экспериментальной сессии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Строительные и технические детали Flywalk были описаны в другом месте 26 (в случае каких-либо проблем установления этого созданы, дополнительную информацию можно получить из МК). Здесь мы сосредоточимся на подробные инструкции по обращению парадигмы, которая поможет получить достоверные результаты.
1. Обращение Fly
- Задняя летит в странах с низким культур средней плотности по пищевой среды 27 при 12 ч: 12 ч света: темно режиме при 23-25 ° С и относительной влажности 70%. Для этого, позволяют 20-30 недавно появились взрослых мух, чтобы воспроизвести в большом флаконе пищевой в течение 1 недели, затем удалите взрослых мух и ждать потомства, чтобы появиться.
- Соберите 30-40 недавно появились (возраст <24 ч) для взрослых мух и возраст их в новом флакон пищевой среду 27 в течение 3-5 дней.
- Двадцать четыре часа до начала поведенческого эксперимента: Перевести все 30-40, собранных ранее 3-5 г старый (см 2.2) летит к новому VIаль содержащий влажную вилку поролона или тонкой бумаги, используя влажную аспиратор.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не обезболивания мух, используя CO 2.
2. Подготовка установки Flywalk
- Используйте 250 мл бутылки как увлажнители. Заполните увлажнители с 100 мл дистиллированной воды.
- Подготовка запах флаконов.
- Подготовьте 500 мкл 10 -3 разведений чистого запахов этилацетат, бутират ацетата, изопентил и 2,3-бутандион в минеральном масле растворителем.
- Прикрепите две шаровые клапаны за запаха флаконе. Обратите внимание, что проверку клапанов позволяет только однонаправленной воздуха. Таким образом, подключить обратные клапаны таким образом, что воздух может войти в пузырек с одной стороны и оставить его на другой стороне.
- Удалить крышку 200 мкл ПЦР реакционную трубку. Пипетировать 100 мкл каждого разбавления запаха в отдельную пробирку и реакционный поместить пробирки в отдельные пробирки запах. Также подготовить один запах флакон, содержащий только растворитель минеральной OIл.
- Плотно запечатать запах флаконов, закрыв их с помощью вилки из нержавеющей стали и резиновые прокладки.
- Подключите 5 флаконов запах (4, содержащие запахи и 1, содержащие минеральное масло) в системе доставки запах. Убедитесь, что для подключения их в правильном направлении потока. Неправильное подключение не только угрозу запланированный эксперимент, но он также может загрязнять систему доставки.
- Проверка на наличие утечек путем герметизации выпускное отверстие смесительной камеры стимула устройства. Убедитесь, что все воздушные потоки до стимула устройства в настоящее время постепенно падает до нуля. Если нет, проверьте на наличие утечек, которые сейчас могут быть идентифицированы по шипящим звуком воздуха, выходящего из системы.
- Тщательно передачи 15 индивидуальных мух до 15 отдельных стеклянных трубок, используя аспиратор и тесные стеклянные трубки с обеих сторон с использованием соответствующих адаптеров.
Примечание: Поскольку система должна герметично закрываться для успешных экспериментов, убедитесь, что адаптеры подходят стеклянные трубки плотнои обратите внимание, что стеклянные трубки может нарушить во время этого шага. Позаботьтесь, чтобы избежать травм, нося защитные перчатки и защитные очки. - Подключите стеклянных трубок для установки Flywalk и, отсюда, подождите, по крайней мере, за 15 минут до начала эксперимента, чтобы мухи приучить к новой среде.
- После установки стеклянных трубок: проверить считывания вниз по течению метров цифровых потоков на компьютере 1 Если 16 воздушные потоки после стеклянных трубок добавить до воздушного потока, поступающего в систему. Кроме того, проверьте на компьютере 1, если влажность составляет от 60% до 80%.
- Дизайн протокол стимулом управления последовательность и сроки запах стимулов, представленных мух. Чтобы получить, например, описанным данных, присутствующих 4 запахов и управления (минеральное масло), отдельно и все возможные тройных и четвертичные смесей запахов одновременно в 40 раз каждый. Установите длительность импульса до 500 мс при межстимульный интервале 90 сек и случайный стимул последовательность.
- Включите LiИсточник GHT (LED-кластер; λ = 630). Убедитесь, что для обеспечения достаточного света для эффективного отслеживания без повышения температуры внутри стеклянных трубок.
- Настройка область интереса следящей системы путем перетаскивания кадр по области, которая будет контролироваться таким образом, что все 15 стеклянные трубки включены и примерно 5 мм из торцы трубок исключены.
- Настройка 14 параллельных линий разделения между отдельными трубками в системе отслеживания путем изменения их Y-позиции в соответствующем сценарии, чтобы сохранить лицо летит идентифицировать в течение всего эксперимента. Убедитесь, что положение их таким образом, что всегда есть одна стеклянная трубка между двумя такими разделительной линии, так как только один муха будет отслеживаться между любым набором двух линий.
- Убедитесь, что для установки параметров камеры таким образом, что летит надежно отслеживаться на протяжении стеклянных трубок. Если мухи теряются по краям области, представляющей интерес, увеличить яркость или коэффициент усиления трекинга сoftware. Избегайте механических вибраций системы слежения. Трек с использованием коммерческого программного обеспечения в соответствии с протоколом производителя.
- Начните эксперимент, начиная протокол стимул. Запись flies' XY-координаты в 20 кадров в секунду (кадров в сек) и войти сочетании со статусом запах клапана в текстовых файлах.
Анализ данных 3.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги в анализе данных автоматизированы с помощью пользовательских написан подпрограмм в R. Поскольку эти шаги имеют решающее значение для получения значимых результатов анализа, тем не менее быть представлены в шаг за шагом образом. Исходные данные для анализа являются .csv-файлы, содержащие синхронизированной информации о статусе запах клапана, номер импульса в эксперименте и 15 полетов рентгеновских позиций в см на общей оси времени в течение одного запаха стимуляции цикла. Пользовательский код для анализа данных могут быть предоставлены по запросу.
- Открыть CSV-файл, найти временную точку открытия клапана означало по чаNGE в колонке, представляющей состояние клапана.
- Рассчитать линейную функцию запаха положении виде
F (T) = S * T + I
где т время в цикле стимуляции, с скорость ветра (здесь 20 см / сек) и перехват я может быть рассчитана с использованием временной точкой запах входит трубы в положении 0 (открытия клапана плюс задержки). - Найти временную точку, в которой запах и летать X-позиция пересекаются для каждого летать и установить на этот раз точку в 0. Примечание: Таким образом муха позиции выровнены друг individual's столкнуться с запахом.
- Исключить мух, сидящих на самых краях области интереса.
- Рассчитать скорость от X-позиции путем деления смещение вдоль оси х на интервале времени (100 мс) и порядок повторного цикла для каждого стимуляции.
- Чтобы получить сократить время обучения, как показано на рисунке 2Е расчета средней скорости тайм-курс для каждого лету и запаха и от тех, среднее время курс для данного запаха.
- Чтобы получить чистую смещение, как показано на фиг.3С расчета чистой смещение в течение 4 с после запаха импульса для каждого события отслеживания и впоследствии средней чистой перемещения в лету и запаха.
4. Процедура очистки
- Clean Glass трубы
- Удалить мух и адаптеры от стеклянных трубок и замочить стеклянные трубки в производстве моющих средств.
- Промыть стеклянные трубки под проточной дистиллированной воде и высушить их с помощью сжатого воздуха.
- Тепло стеклянные трубки при 200 ° С в течение 8 час.
- Чистый Запах Система доставки
- Удалить все запахи флаконы и трубки из центральной камеры смешивания.
- Удалить трубок адаптеры из смесительной камеры.
- Чистый смесительная камера путем промывки его с моющим раствором и лабораторного растворителей (например, этанол, ацетон). Выполните следующие действия в лабораторных капотом.
- Сухой смесительной камере при использовании сжатого воздуха и нагревают его при 200 ° С в течение 8 ч.
- Чистый Запах Флаконы и обратные клапаны
- Удалить стали пробку (отбрасывание резиновая прокладка) и обратные клапаны с запахом флаконах и замочить всех компонентов очистки лаборатория решения.
- Соникатные компоненты в ультразвуковой ванне и промыть их дистиллированной водой.
- Очистите все компоненты, за исключением обратных клапанов с этанолом и ацетоном. Выполните следующие действия в лабораторных капотом.
- Сухих компонентов при использовании сжатого воздуха и нагревают их при 200 ° С в течение 8 ч.
- Чистые клапаны с внутренней стороны промывки их этанолом и ацетоном с помощью шприца (рассмотреть направление потока). Выполните следующие действия в лабораторных капотом носить лабораторные очки. Потому что ацетон нападает резиновые детали, немедленно сухие обратные клапаны путем промывки их сжатым воздухом.
- Удалить остатки запахов пульсирующим воздухом через обратные клапаны в течение нескольких дней. Используйте инкубатор на 60 ° С и 1 сек воздух на / 1 сек воздуха от режима для этого операции очистки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Из мухи могут свободно распределить их в стеклянных трубках между запах импульсов и импульс запаха проходит через стеклянные трубки с постоянной скоростью мухи столкнулись запах в различные моменты времени в зависимости от их положения х в момент стимуляции. В результате, приступы противопотоковой траекторий вызываемых 500 мсек импульса привлекательной 10 -3 разбавления этилацетата с задержкой примерно на 1 сек для мух на ветру конца своих стеклянных трубок по сравнению с теми, мух, сидящих ближе к против ветра конец со скоростью ветра 20 см / сек и длиной 20 см стеклянной трубки (рис 2А). Поправка на временной разницы в запаха встречи для каждого человека на основании его х-м положении в момент запаха презентации показывает, что задержки реакции к этилацетата последовательно через лиц (Фигура 2В).
Соответственно, средняя против ветра траектория без коррекции для Oдор путешествия задерживается примерно на 0,5 сек по сравнению со средней траектории с коррекцией (рис 2С; обратите внимание, что коррекция на время запах должен ввести против ветра конец стеклянных трубок была выполнена для обоих траекторий). Кроме того, исправлены среднее наветренной траектория одного импульса запаха также отображает более крутой наклон (т.е. с более высокой скоростью, чем ходьба) неисправленным одного (рис 2D). Подобно наблюдений для одного импульса запаха, опуская поправку на запах поездок приводит к увеличению задержки и амплитуды нижней отклика в полном перечне данных, состоящей из двух экспериментальных сессий (т.е. 30 мух) с 40 презентаций импульсов запах друг (рис 2E) ,
Повторной стимуляции с 500 мс импульсов привлекательных 10 -3 разведений этилового бутират (ETB), изопентил ацетата (МАА), этилацетата (ETA) и 2,3-бутандион (BEDN) вызывает наветренной скачков при ODне или встреча в голодных женщин мух, тогда как стимуляция с минеральной растворитель масла (MOL) вызывает не только слабые или ответов. Одна механическое раздражение Ранее было показано, чтобы вызвать повышенное движение в том же парадигмы 28. Тем не менее, из-за запаха стимуляция в парадигме Flywalk не изменяет общую воздуха и увеличение движения в основном отсутствуют в ситуации управления с помощью MOL, это против ветра скачков отражают истинные ответы запах. Среднее время отклика, курсы стереотипны по особей (рис 3а) и запаха конкретным латентности, амплитуда и длительность (3А, Б). Ответы на этилацетатом отображения резкое начало, высокую амплитуду и короткую продолжительность. В отличие от этого, ответы на 2,3-бутандионом обычно отображают несколько позже начало, более низкую амплитуду и более длительный срок. Этиловый бутират ацетата и изопентил вызвать подобные временной динамики как этилацетат, но ответы ниже по амплитуде. Корреспондентскихнадувная лодка, все 4 запахи вызывают высокий против ветра смещение в 4 сек после встречи запах, чем делает растворителя и отрицательного контроля минерального масла (рис 3C).
Используя те же 4 аттрактанты, ранее было показано, что бинарные смеси аттрактантов, по крайней мере, как привлекательной как более привлекательным компонента смеси 29. Вот это наблюдение продлевается на тестирование всех возможных тройных смесей и полный смесь всех 4 аттрактантов. Как и в предыдущем наблюдении с бинарных смесей, все эти более сложных смесей, по меньшей мере столь привлекательны, как наиболее привлекательного одного соединения (фиг.4А). Наиболее привлекательными смесями являются те, которые содержат как этилацетат и 2,3-бутандион. Ответы на эти 3 смесей существенно не отличаются друг от друга, а также кинетика отклика поразительно схожи (4А, В). В противоположность этому, опуская этилацетат от полной Бленd приводит к уменьшению максимальной скорости против ветра, опуская 2,3-бутандион сокращает реакцию (фиг.4С). Потому этилацетат вызывает короткие ответы высокой амплитуды, тогда как 2,3-бутандион вызывает отклики меньшей амплитудой, но более длительный срок (фиг.3В, 4D), эти наблюдения напоминают нашего предыдущего нахождения, что ответы временные курсы по отношению к смеси аттрактантов, как правило, следовать оптимальным время отклика-курс, созданный из ответных смесь составной временных курсов 29. В этом наборе оптимальной всех 4 аттрактантов может быть построена на основе реагирования временных курсов по отношению к этилацетата и 2,3-бутандионом. Этиловый бутират и / или изопентил ацетат необходимы в дополнение к достичь максимальной скорости ходьбы наблюдается в ответах по отношению к полной смеси (рис 4D). Следовательно, увеличение сложности смеси от 2 до 3 или 4 компонентов увеличивает привлекательность смеси еVEN дальше, чем можно было бы ожидать от предыдущего наблюдения, что ответы в направлении смесей аттрактантов представляют оптимум ответов по отношению к смеси компонентов. Тем не менее, общий вывод, что учредительный валентность сохраняется в запах смеси остается в силе и для этих более сложных смесей 29.
Рисунок 1. Принцип и схема установки Flywalk. (А) Схематическое изображение принципа. Желтый квадрат: запах стимул движется через трубки и в результате наветренной движения лету; черный предмет: камера для отслеживания поведенческих реакций. (Б) Схема потока воздуха через настройки с активированным углем воздуха, увлажняют и раскол в 8 каналов, перед входом в систему доставки запах 26,30. Blow-вверх Рисунок: 1, трехходовой электромагнитный клапан проход ING поток воздуха либо через пустой флакон (с; компенсирующий поток) или через пробирку, содержащую источник запаха (а; запах потока); 2, шаровые клапаны, чтобы ограничить поток воздуха в одном направлении и во избежание загрязнения системы; смесительная камера: заказ построен коробка, которая собирает воздух из всех электромагнитных клапанов и передач, чтобы разделить вверх доска, где воздух разделяется на 15 стеклянных трубок, нагруженных индивидуальных мух и 1 трубки, оснащенных датчиками температуры и влажности. Примечание: Регуляторы расхода и расходомеры после стеклянных трубок гарантировать одинаковую поток во всех трубах. Синий квадрат обозначает область интереса (ROI) системы слежения. (С) Схема потока информации между камерой слежения, отслеживания компьютера, и системы доставки запах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
OAD / 53394 / 53394fig2.jpg "/>
Рисунок 2. Процедура и обоснование анализа данных. (А) Индивидуальный мухи столкновения запах в разных положениях и, следовательно, различные времена. Левая панель: Схема возможных позиций летать на момент переключения запах клапана. Правая панель: Исходные данные рентгеновских позиций 15 мух вокруг презентации 500 мсек импульса 10 -3 разбавления этилацетата в. Примечание наветренной прогулки отдельных мух в разные времена в зависимости от их рентгеновских позиций. Слева пунктирная линия: время переключения запах клапана. Запах встреча отдельных мух смещается задержкой системного внутренняя для запаха, чтобы достичь стеклянные трубки (D) и скорость ветра (W). Таким образом, запах столкновение рассчитывается индивидуально для каждого лету на основе его х-положении. Внизу справа: выровненные х-позиции 15 мух (серые) и означает х-позиции (жирный черный). (Б) те же данные, в А, но с поправкой на задержку и скорости ветра. БоттOM: выровнены х-позиции 15 мух (серых) и означают X-позицию (жирный красный) после коррекции. (С) Сравнение среднего наветренной прогресса 15 мух, вызываемых одним 500 мсек импульса этилацетата с и без коррекции для запаха путешествия. Обратите внимание, что нескорректированное (черный) след исправляется за задержку, но не для запаха путешествия. (D), среднее наветренной скорость 15 мух, вызываемых одним 500 мсек импульса этилацетата с и без коррекции для запаха путешествия. Пунктирные линии показывают скорость, рассчитанная с наветренной стороны значений, показанных в ходе C, смелые линии отображения против ветра скорость после сглаживания с использованием 1-й порядок 9-точечная Савицкого-Голея фильтр. (Е) нефильтрованное значит против ветра скорость с и без коррекции для запаха поездок 30 мух и 40 импульсов этилацетата (т.е. полный набор данных). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этогофигура.
. Рисунок 3. Пример ответы для 10 -3 разведения 4 привлекательных запахов (A) с цветовой кодировкой средние реагирования временные курсы 30 отдельных мух до 500 мс импульсов 4 аттрактантов и минерального растворителя масла (моль; ETB: этилбутират; МАА: изопентил ацетат; EtA: этилацетат; BEDN: 2,3-бутандион). Каждая строка представляет собой среднее время отклика-курс одной отдельной лету. Каждый муха был представлен с каждым запахом для 40 раз и - из-за мухи могут свободно распространять и может оставить область интереса системы слежения - среднее время отклика курсы рассчитаны из всех полных траекторий в лету (п = 7-39 траектории за лету и запаха). Желтая полоса представляет собой импульс запаха. (Б) Время ответа-курсы для 4 аттрактантов и минерального масла растворителем (п = 30, средний мух+/- SEM). (С) Чистый объем наветренной течение 4 сек после запаха сталкиваются (и тех же данных, что и в (А) и (В), п = 30 мух). Заполненные указывают статистически значимое против ветра движение по сравнению с отрицательным контролем минерального масла (р <0,05; Уилкоксона ранг тест). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Ответы по отношению к тройных и четвертичных смесей аттрактантов. (А) чистый объем наветренной 4 аттрактантов и всех тройных и четвертичных смесей, отсортированных по их средней ответ. Различные буквы указывают статистически значимые различия между ответами (р <0,05; Крускала-Уоллиса суммы рангов и постфактум тест Уилкоксона ранг, N = 30летит). Черный ящик ниже показывает смесей, содержащих этилацетат и 2,3butanedione. (B), время отклика-курсы смесей, содержащих этилацетат и 2,3-бутандион (среднее +/- SEM, N = 30 мух). Примечание подобные отклика кинетики. (С) Сравнение реагирования временных курсах смесей без этилацетат или 2,3-бутандионом и кинетики реагирования вызванной полной смеси (среднее +/- SEM, п = 30 мух). Примечание меньшую амплитуду без ETA и короткий ответ без BEDN. (D) Сравнение оптимальной времени, конечно (пунктирная), построенного из ETA (красный) и BEDN (зеленый) и полной смеси. Затенение указывают части времени, конечно объясняется различных компонентов смеси. Обратите внимание, что в предыдущем исследовании было показано, что ответы по отношению к бинарных смесей аттрактантов может быть предсказано с оптимальной времени, конечно, созданной на основе смеси учредительных временных курсов 29. Это оптимальное время курс для ETA и BEDN показано, какпунктирная линия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Хотя система Flywalk оказывается весьма сложной, на первый взгляд, как только установлен и запущен его легко использовать и производит очень надежные результаты. Чтобы подчеркнуть состоятельность результатов, полученных с биопроб, можно сказать, что представительные результаты, показанные здесь, были получены почти 2 года после некоторых результатов, показанных в предыдущем исследовании 29 с модифицированной установке с использованием нового программного обеспечения отслеживания и источник света. Тем не менее, ответы аттрактантов являются - несмотря на несколько более высокие амплитуды отклика - очень похожих на ранее опубликованных в отношении их динамику.
Есть некоторые критические аспекты, которые следует учитывать, в частности, для того, чтобы получить качественные результаты, используя Flywalk. Важно отметить, что влажность не должна быть ниже 60% в течение эксперимента. Типичный экспериментальный сеанс длится примерно 8 часов. Разумно размера женские CS мухи дикого типа голодали в течение 24 часов, прежде чем эксримента легко выжить, по крайней мере 12 часов в экспериментальной установки при условии, влажности достаточно высок. Чтобы избежать проблем, связанных с Влажность целесообразно установить датчик влажности в пустой стеклянной трубки (рис 1B) и, чтобы избежать размещения регуляторы потока в воздушном потоке в любом месте между увлажнителями и стеклянных трубок. Это также абсолютно необходимым для качества данных, что система герметичного. Воздушные потоки, выходящие из системы после стеклянных трубок должны подвести до воздушного потока, поступающего в систему. Большинство неудачных экспериментов можно отнести к утечкам в системе и большой осторожностью должны быть приняты до начала эксперимента, чтобы гарантировать, что система герметична. Наконец, как и в любом установке, используемой в обонятельной исследований, одна из главных проблем является повседневной, чтобы избежать загрязнения. Большинство деталей, соприкасающихся с запахом изготовлены из стекла, стали, тефлона или PEEK и, следовательно, можно нагревать по меньшей мере до 200 ° С, что является достаточным для удаления большей ODORS для тех, кто особенно высоких точек кипения, такие как длинные цепью феромонов кроме. Потому что клапаны содержат резиновые детали, они не могут быть нагреты выше и, следовательно, являются основным источником загрязнения, поэтому конкретный протокол очистки был разработан для них. Тем не менее, желательно, чтобы отслеживать запахов конкретный клапан вступает в контакт с. В случае сомнений относительно своей чистотой заменить его.
В качестве компромисса между привязных анализов и групповых экспериментах, Flywalk, конечно, также имеет некоторые недостатки по сравнению с другими методами. Парадигма очень эффективным, когда поведение по отношению к множеству различных стимулов должна быть оценена и по сравнению. Примечательно, потому что время отклика курс из 15 лиц в только один импульс заданной запах сильно напоминает реагирования временные курсы, полученные в наборе данных полный (т.е. 30 мух и 40 презентации каждый; Цифры 2D, 2E эффективными, когда, например гедонистического валентности только один запах должен быть рассмотрен. Кроме того, временное разрешение визуальных систем слежения зачастую ниже, чем у самых быстрых биопроб, таких как привязной полет или беговой дорожке. Кратчайшие задержки реагирования сообщили в Drosophila запаха руководствоваться поведения значительно ниже 100 мс после встречи запах в привязных парадигм 20,23 и таким образом попадают в временном окне, которое не может быть решена при анализе данных на частоте 10 Гц. Тем не менее, аттрактантов ответы в Flywalk обычно начинаются в течение первого 100-300мс (3В), который хорошо в соответствии с наветренной задержек перенапряжений, наблюдаемых в свободно летающих мух 5. Поэтому остается определить, является ли эта разница в задержках реагирования в привязных парадигм по сравнению с аэродинамической трубе и Flywalk вызвано различиями в пространственном и / или временным разрешением в визуальных парадигмах слежения или по более высокой возбуждения состояния мух в привязанном ситуации.
В целом, Flywalk является не-выбор биопроб, который сочетает в себе высокую управляемый стимул презентация привязных анализов с эффективностью экспериментов когорты регулярно используемых в Drosophila neuroethology. Потому что тот же набор лиц может быть оспорено с множеством различных стимулов, его особая сила заключается в статистической мощности при сравнении ответов к различным стимулам. Кроме того, она использует тот факт, что летит против ветра всплеск на встрече привлекательной запахом и таким образом разобщает оценку запахомот запаха локализации источника без необходимости градиентом как направленный кий. Поэтому он должен быть идеально подходит для использования в optogenetic инструментов, доступных в дрозофилы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим Даниэль Файт технической помощи и Педро Gouveia на Electricidade Em PO (electricidadeempo.net) для настройки программного обеспечения отслеживания для наших требований. Мы также благодарим Тома Retzke за поддержку во время съемочный процесс. Это исследование было поддержано Общества Макса Планка.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flywalk setup | Custom | details available upon request | |
| stimulus device | Custom | details available upon request | |
| LED cluster | Custom | details available upon request | |
| HD Pro Webcam C920 | Logitech, Lausanne, Switzerland | ||
| 2 Computers | |||
| Flywalk Reloaded v1.0 software | Electricidade Em Pó (electricidadeempo.net) | ||
| Labview 11.0 software | National Instruments, Austin, TX | ||
| Standard fly food | Custom | ||
| Standard fly vials | Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Standard fly vials | Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| aspirator | Custom | ||
| mineral oil | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | ||
| odors | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | ||
| 200 µl PCR reaction tubes | Biozym Scientific GmbH, Oldendorf, Germany |
References
- Murlis, J., Elkinton, J. S., Cardé, R. T. Odor plumes and how insects use them. Annu. Rev. Entomol. 37, 505-532 (1992).
- Kennedy, J. S., Marsh, D.
- Budick, S. A., Dickinson, M. H. Free-flight responses of Drosophila melanogaster to attractive odors. J. Exp. Biol. 209 (15), 3001-3017 (2006).
- Buehlmann, C., Graham, P., Hansson, B. S., Knaden, M. Desert ants locate food by combining high sensitivity to food odors with extensive crosswind runs. Curr. Biol. 24 (9), 960-964 (2014).
- Van Breugel, F., Dickinson, M. H. Plume-tracking behavior of flying Drosophila emerges from a set of distinct sensory-motor reflexes. Curr. Biol. 24 (3), 274-286 (2014).
- Schuckel, J., Meisner, S., Torkkeli, P. H., French, A. S. Dynamic properties of Drosophila olfactory electroantennograms. J. Comp. Physiol. A. 194 (5), 483-489 (2008).
- Geffen, M. N., Broome, B. M., Laurent, G., Meister, M. Neural encoding of rapidly fluctuating odors. Neuron. 61 (4), 570-586 (2009).
- Nagel, K. I., Wilson, R. I. Biophysical mechanisms underlying olfactory receptor neuron dynamics. Nat. Neurosci. 14 (2), 208-216 (2011).
- Martelli, C., Carlson, J. R., Emonet, T. Intensity invariant dynamics and odor-specific latencies in olfactory receptor neuron response. J. Neurosci. 33 (15), 6285-6297 (2013).
- Szyszka, P., Gerkin, R. C., Galizia, C. G., Smith, B. H. High-speed odor transduction and pulse tracking by insect olfactory receptor neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 111 (47), 16925-16930 (2014).
- Nagel, K. I., Hong, E. J., Wilson, R. I. Synaptic and circuit mechanisms promoting broadband transmission of olfactory stimulus dynamics. Nat. Neurosci. 18 (1), 56-65 (2014).
- Larsson, M. C., Domingos, A. I., Jones, W. D., Chiappe, M. E., Amrein, H., Vosshall, L. B. Or83b encodes a broadly expressed odorant receptor essential for Drosophila olfaction. Neuron. 43 (5), 703-714 (2004).
- Knaden, M., Strutz, A., Ahsan, J., Sachse, S., Hansson, B. S. Spatial representation of odorant valence in an insect brain. Cell Rep. 1 (4), 392-399 (2012).
- Zaninovich, O. A., Kim, S. M., Root, C. R., Green, D. S., Ko, K. I., Wang, J. W. A single-fly assay for foraging behavior in Drosophila. J. Vis. Exp. (81), e50801 (2013).
- Farhan, A., Gulati, J., Groβe-Wilde, E., Vogel, H., Hansson, B. S., Knaden, M. The CCHamide 1 receptor modulates sensory perception and olfactory behavior in starved Drosophila. Sci. Rep. 3 (2765), 1-6 (2013).
- Flügge, C. Geruchliche Raumorientierung von Drosophila melanogaster. Z. Vgl. Physiol. 20 (4), 462-500 (1934).
- Borst, A., Heisenberg, M.
- Louis, M., Huber, T., Benton, R., Sakmar, T. P., Vosshall, L. B. Bilateral olfactory sensory input enhances chemotaxis behavior. Nat. Neurosci. 11 (2), 187-199 (2008).
- Gomez-Marin, A., Stephens, G. J., Louis, M. Active sampling and decision making in Drosophila chemotaxis. Nat. Commun. 2 (441), 1-10 (2011).
- Gaudry, Q., Hong, E. J., Kain, J., de Bivort, B. L., Wilson, R. I. Asymmetric neurotransmitter release enables rapid odour lateralization in Drosophila. Nature. 493 (7432), 42442-42448 (2013).
- Quinn, W. G., Harris, W. A., Benzer, S.
- Ramdya, P., Lichocki, P., et al. Mechanosensory interactions drive collective behaviour in Drosophila. Nature. 519 (7542), 233-236 (2014).
- Bhandawat, V., Maimon, G., Dickinson, M. H., Wilson, R. I. Olfactory modulation of flight in Drosophila is sensitive, selective and rapid. J. Exp. Biol. 213 (21), 3625-3635 (2010).
- Duistermars, B. J., Chow, D. M., Frye, M. A. Flies require bilateral sensory input to track odor gradients in flight. Curr. Biol. 19 (15), 1301-1307 (2009).
- Claridge-Chang, A., Roorda, R. D., et al. Writing memories with light-addressable reinforcement circuitry. Cell. 139 (2), 405-415 (2009).
- Steck, K., Veit, D., et al. A high-throughput behavioral paradigm for Drosophila olfaction - The Flywalk. Sci. Rep. 2 (361), 1-9 (2012).
- Lewis, E. B. A new standard food medium. Drosoph. Inf. Serv. 34, 117-118 (1960).
- Lebestky, T., Chang, J. S. C., et al. Two different forms of arousal in Drosophila are oppositely regulated by the dopamine D1 receptor ortholog DopR via distinct neural circuits. Neuron. 64, 522-536 (2009).
- Thoma, M., Hansson, B. S., Knaden, M. Compound valence is conserved in binary odor mixtures in Drosophila melanogaster. J. Exp. Biol. 217 (20), 3645-3655 (2014).
- Olsson, S. B., Kuebler, L. S., et al. A novel multicomponent stimulus device for use in olfactory experiments. J. Neurosci. Meth. 195 (1), 1-9 (2011).
