Summary
Otomatik izleme sistemi Flywalk Drosophila melanogaster koku güdümlü davranış yüksek çözünürlüklü ölçümü için kullanılır.
Abstract
Kendi doğal ortamında, sirke gibi böcekler kimyasal olarak farklı koku büyük miktarda ile bombardıman edilir Drosophila melanogaster uçmak. Hatta daha da karmaşıklaştıran, böcek sinir sistemi tarafından tespit edilen kokular genellikle kimin kompozisyon ve konsantrasyon oranları değişebilir tek bileşikler ancak bunların karışımları değildir. Bu sinir sistemi tarafından değerlendirilmesi gerekir farklı koku uyaranlara neredeyse sonsuz miktarda yol açar.
Bir koku uyarıcı yönleri sinek tarafından değerlendirmesini belirleyen anlamak için, verimli birçok koku ve koku karışımları doğru koku güdümlü davranışlarını incelemek için arzu edilen bir durumdur. Doğrudan nöronal aktivitenin davranışı ilişkilendirmek için, davranış karşılaştırılabilir bir zaman dilimi içinde ve nörofizyolojik deneylerde olduğu gibi aynı uyarıcı koşullarında sayısal olmalıdır. Bununla birlikte, Drosophila neuroethology çok anda kullanılan koku biyo-specia yerine vardırverimlilik doğru veya çözünürlük doğru ya lized.
Flywalk, otomatik koku teslimat ve izleme sistemi, verimlilik ve çözünürlük arasında köprüdür. Bu koku, paket serbest yürüme sinek uyarılmış ve Hayvanların dinamik davranış etkilerini belirlemek için tam olarak ne zaman belirlenmesini sağlar.
Introduction
Herhangi neuroethological araştırmanın herkesin ortak hedefi tek nöronlar veya nöronal devrelerin faaliyet devletler ve bir organizmanın davranışı arasında nedensel bir ilişki kurmaktır. Bu amaç nöronal aktivitenin elde etmek ve davranışları aynı uyarıcı koşullarında izlenmeli ve bu uyarıcı koşulları ideal olanların mantıklı gelişti inceleme altına sinir sistemi benzer olmalıdır. Davranışsal biyoanalizlere gelince, özellikle bu gereklilikler tarihsel Drosophila oldukça zorlu kanıtlanmıştır koku neuroethology melanogaster.
Kaynağından çıkan kez koku tüyleri hızla hava hareketi koku dağılımı 1 temel belirleyicisi olmaktan kaynaklanan çalkantılı difüzyon ince filamentler içine break up. Bunun bir sonucu olarak, bir koku kaynağına doğru seyreden bir böcek temiz hava değişken aralıklarla serpiştirilmiş koku paketleri ile kesikli uyarımı karşılaşır. Her ikisiyürüyüş ve böcekler uçan - Drosophila dahil - 5 - kokuların 2 yokluğunda çapraz rüzgar hareketli ağırlıklı tüy karşılaşma üzerine rüzgâra karşı kabaran tarafından navigasyon için bu aralıklı stimülasyon rejimi yararlanmaya gösterilmiştir. Bu tuzak analizi olarak Drosophila neuroethology kullanılan 11, birçok davranış biyoanalizlerin - ve fizyolojik deneyler için stimülasyon prosedürleri ise, büyük ölçüde, bir böcek, temiz hava veya dinamik stimülasyon dizilerinin 6 uzun süre serpiştirilmiş kokuların da sağlayarak, tek nefes çekme tarafından doğal ortamda yaşayabilir taklit 15 - açık alan arenalar veya T-labirent koku geçişlerini 12 güveniyor. Tanımı gereği koku geçişlerini koku kaynağından mesafeye bağlı konsantrasyonda değişken olduğundan, ancak belli bir davranış, bu paradigmalar kullanarak kesin bir koku konsantrasyonu isnat edilemez. Buna ek olarak, eğimiBir koku degrade eleştirel odorant fizikokimyasal özelliklerine bağlıdır. Bir zorluğa yol açabilir 20 - Bir çok uçucu bileşiğin bir degrade daha az uçucu bileşiğin tarafından oluşturulan ve bu nedenle de zor navigasyon 16 tek yolu olarak uzayda konsantrasyon farklılıkları ölçmek güvenerek bir organizma için izlemek için daha sığ olacaktır Özellikle seçim analizlerde koku tercihler. Uzayda her noktada farklı karışım bileşeni oranlarına yol açar ve bu nedenle tekrar fizyoloji ve davranış arasında açık bir ilişki engellemektedir, çünkü koku karışımları yönelik davranışlarını araştıran Bu etki aynı zamanda son derece zararlıdır.
Sirke sinekleri meyve fermente üzerine agrega eğiliminde olsa da, gıda kaynakları ve ovipozisyon siteleri karşı navigasyon yalnız vardır. Bununla birlikte, bireysel hayvanları test ziyade birçok davranışsal paradigmalar Drosophila neuroetholo kullanılangy sineklerin kohortlarda kokusu eşliğinde davranışları incelemek ve cazibe bir kontrol uyaran üzerinde koku seçiminde sinekler kesir olarak puanlanır. Bu kohort deneyleri sinek neuroethology anlaşılmasına büyük katkıları olmuştur ve bunları kullanarak yapılan gözlemlerin birçoğu tek sinek deneylerinde teyit edilebilir. Ancak, her other's kararını 21 etkileyebilir ve aşırı durumlarda bir koku değerlendirilmesi nüfus yoğunluğuna bağlı olarak 22 kaçınmaya ilgisizlik geçebilirsiniz uçar olduğu gözlenmiştir. Ayrıca, deney bu türlü sonuçlar genellikle nöronal aktivite ile davranış arasında ilişki çalışırken arzu olurdu doğrusu bunu yapıyor iken sinek ne yaptığını gözlemleyerek daha davranışsal kararlar, bir dizinin sadece son nokta sağlamaktadır. Bunlar oldukça düşük çözünürlüklü kohort deneyleri gibi izin gergin uçuş arenalar ve koşu bandı gibi yüksek çözünürlüklü tek sinek yöntemleri ile tezatzaman davranışsal tepkilerin doğrudan gözlem için uyaran 20,23,24 sunulmuştur. Onlar çok verimli ve-arası bireysel ve inter-deneme değişkenlik kısmen uzun süre boyunca nüfusun gözlem ortalaması alınır çünkü sağlam hatta nispeten sonuçları düşük örnek boyutları sağlar, çünkü Ancak, kohort deneyleri, hala popüler. Gergin uçuş ve koşu bandı muhtemelen uyaran sunum ve temporal çözünürlük konusunda altın standart sağlarken, kullanılan arenalar tek hayvanlar için tasarlanmış ve bu nedenle zaman alıcı örnek bir istatistiksel analiz için gerekli boyutları elde etmektir edilir. Çeşitli diğer yaklaşımlar son iyi tanımlanmış bir teşvik rejimi ile kombinasyon halinde, yüksek çözünürlüklü davranış verilerinin etkin bir şekilde alınmasını sağlayacak geliştirilmiştir. Bu koku tüy 5 doğru bir 3D-model ile kombinasyon halinde bir Projede, rüzgar tünelinde birden sirke sineklerinin denetimsiz 3D-izleme dahil 25 ve Flywalk paradigma 26'dan airstreams ile birlikte seçim odalarında çoklu bireysel sineklerin izleme.
Flywalk olarak, 15 ayrı sinekler, küçük cam tüplerde bulunmaktadır ve sürekli kırmızı ışık koşulları altında bir havai kamera tarafından izlenen. Kokular 20 cm / sn arasında sürekli bir hava akımı, bir ilave edildi ve sabit bir hızda cam tüpler boyunca yol. Hava akımı koku teslim sistemine girmeden önce distile su (nemlendiriciler) ihtiva eden 250 ml'lik şişeler içinden geçirilerek nemlendirilir. Flies' pozisyonları sinekler daha yukarı taşımak veya edemez ilgi (ROI) bir kare bölge koku tüplerin uzunluğu en kapsayan (ancak tüpleri (her tarafı yaklaşık 5 mm dış kenarlarını hariç) içinde kaydedilir downwind) koku sunumu (Şekil 1A, B) sefer. Fly kimlikleri izleme sistemi t sabit tutulmasıonların Y-pozisyonlarına (yani kendi cam tüp limitleri) bazında deney hroughout. Koku uyarılması kadar 8 tek koku ve 26,29 (Şekil 1B), bunun bütün olası karışımları sunum sağlar çok bileşenli bir uyarıcı cihaz kullanılarak elde edilir. Bir deney ders bilgisayar koku verme sistemini düzenleyen ve sıcaklık ve nem bilgi toplama (bilgisayar 1, Şekil 1C) tarafından kontrol edilir. Bu bilgisayar, aynı zamanda sürekli olarak saniyede 20 kare (bilgisayar 2) sinek pozisyonlarını izler ikinci bir bilgisayara bir datalogger (kayıt başlat / durdur) kontrol eder. Koku stimülasyon döngüleri etrafında, koku vana durumunu (vana açıklığının yani zaman-noktası), koku kimliğini, sıcaklık ve nem pozisyonları Fly koku bilgisayara 2. Bu şekilde bilgileri kaydedilir ve pozisyonları .csv dosyaları olarak eşitlenir ve ihraç uçmak hangi daha da işlenir ve özel olarak yazılmış analiz rutinleri kullanarak analiz edilebilir. ÇünküTüm sistem bilgisayar kontrollü, hiçbir insan müdahalesi deneysel oturumu sırasında gereklidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Flywalk inşaat ve teknik detaylar yerde 26 (MK elde edilebilir, bu kurmak daha fazla bilgi kurulması herhangi bir sorun durumunda) tarif edilmiştir. Burada güvenilir sonuçlar elde etmek için yardımcı olacak paradigmanın işleme hakkında ayrıntılı talimatlar odaklanmak.
1. Fly Taşıma
- 12 saat ışık: 23-25 ° C ve% 70 bağıl nemde karanlık rejim Arka 12 saat altında gıda ortamı 27 orta yoğunluklu kültürlerde düşük uçar. Bu amaçla, 20-30 yeni ortaya çıkan yetişkin, daha sonra 1 hafta boyunca büyük bir gıda flakon yeniden yetişkin sinekler atmak ve ortaya yavrular için beklemek uçar izin verir.
- 30-40 yeni ortaya çıkan (yaş <24 saat), yetişkin sinekler toplayın ve 3-5 gün yemek ortamı 27 içeren yeni bir şişede onları yaş.
- Yirmi dört saat davranışsal deney başlamadan önce: Transferi Tüm 30-40 önceden toplanmış 3-5 d eski (2.2 bakınız) yeni bir vi uçarEl nemli kauçuk köpüğü fişi veya bir aspiratör kullanılarak nemli doku kağıt içeren.
Not: CO 2 kullanarak sinek uyuşturan etmeyin.
Flywalk Kur'un 2. Hazırlık
- Nemlendiriciler olarak 250 ml'lik şişe kullanın. Damıtılmış su 100 ml nemlendiriciler doldurun.
- Koku şişeleri hazırlayın.
- Saf kokular, etil asetat, etil bütirat, izopentil asetat ve çözücü, madeni yağ içinde 2,3-bütandion 500 ul 10 -3 dilüsyonları hazırlayın.
- Koku şişe başına iki toplu çek valfleri takın. Vanalar tek yönlü hava akımı sadece izin verdiği çek unutmayın. Bu nedenle, hava, bir tarafta şişeye girmesini ve diğer tarafta bırakın şekilde çek valfleri bağlayın.
- 200 ul PCR reaksiyonu, tüpün kapağını çıkarın. Ayrı bir reaksiyon tüpüne, her koku seyreltme 100 ul pipet ve ayrı bir koku viyaller içinde tüpleri. Ayrıca sadece çözücü mineral OI içeren tek koku şişe hazırlamakl.
- Sıkıca paslanmaz çelik fişleri ve lastik contalar kullanarak onları kapatarak koku şişeleri mühür.
- Koku verme sistemi (madeni yağ ihtiva eden 4 ihtiva eden kokular ve 1) 5 koku şişeleri bağlayın. Doğru akım yönünde onları bağlamak için emin olun. Yanlış bağlantı sadece planlanmış deney taviz vermeyecek, aynı zamanda dağıtım sistemi kirletebilir.
- Uyarıcı cihazın karıştırma odasının çıkışını mühürleme suretiyle sızıntı olup olmadığını kontrol edin. Uyarıcı cihazına önce tüm hava akımları artık giderek sıfıra düşmesi ki emin olun. Değilse, şimdi sistemin çıkan havanın tıslama sesi ile tespit edilebilir sızıntı olup olmadığını kontrol edin.
- Dikkatle gelen adaptörleri kullanarak her iki taraftan bir aspiratör ve yakın cam tüpler kullanılarak 15 ayrı cam tüpler 15 ayrı sinekler aktarın.
Not: Sistem hermetik başarılı deneyler için mühürlü gerektiğinden, adaptörler sıkıca cam tüpler uygun olmasını sağlamakve cam tüpler bu adımı sırasında kırılabilir unutmayın. Koruyucu eldiven ve gözlük takarak yaralanmaları önlemek için dikkat edin. - Flywalk kurulum cam tüpler bağlayın ve burada andan itibaren, sinekler yeni ortama alışmakta izin deney başlamadan önce en az 15 dakika bekleyin.
- Cam tüpler taktıktan sonra: cam tüpler sonra 16 hava akımları sistemine girmeden hava akımı kadar eklerseniz bilgisayarda 1 aşağı dijital akış metre okuma kontrol edin. Nem% 60 ile% 80 arasında ise Ayrıca, bilgisayarda 1 kontrol edin.
- Sinekler sunulan koku uyaranlara sırasını ve zamanlamasını kontrol Tasarım uyaran protokolü. 40 kez her anda açıklanan veriler, mevcut 4 koku ve tek başına kontrol (madeni yağ) ve tüm olası üçlü ve dörtlü kokular karışımları gibi edinin. 90 saniyelik bir interstimulus aralıklarla 500 msn darbe süresi ayarlayın ve uyarıcı dizisi rastgele.
- Li açınght kaynağı (LED-küme, λ = 630). Cam tüpler içindeki sıcaklığı artırmadan verimli izleme için yeterli ışık sağlamak için emin olun.
- 15 cam tüpler dahil bir şekilde izlenecek ve tüplerin kenarlarından yaklaşık 5 mm dışlanan alan boyunca bir çerçeve sürükleyerek izleme sisteminin ilgi bir bölge ayarlayın.
- Bireyi korumak için gelen komut kendi Y-pozisyonlarını değiştirerek izleme sistemi bireysel tüpler arasındaki 14 paralel ayırma çizgileri kurmak deney boyunca tanımlanabilir uçar. Sadece bir sinek iki satır herhangi bir set arasında takip edilecektir, çünkü böyle iki ayırıcı hatları arasında tek cam tüp orada her zaman böyle bir şekilde onları konumlandırmak için emin olun.
- Güvenilir cam tüpler boyunca izlenir sinekler şekilde kamera parametrelerini ayarlamak için emin olun. Sinekler ilgi bölgenin kenarlarında kayıp ise, izleme s parlaklığını veya kazancı artırmakoftware. Takip sistemi mekanik titreşimleri kaçının. Üreticinin protokolüne göre, ticari bir yazılım kullanılarak takip edin.
- Uyarıcı protokolü başlayarak deney başlayın. Tutanak 20 fps (saniyede kare) de XY koordinatları flies' ve metin dosyaları koku valf durumu ile birlikte oturum açın.
3. Veri Analizi
NOT: Bu adımlar analizi yine de bir adım-adım bir şekilde sunulacaktır anlamlı sonuçlar elde etmek için çok önemli olduğu için veri analizi aşağıdaki adımlar R. programlanmış özel olarak yazılmış rutinleri kullanılarak otomatize edilir. Analiz için ham veriler, bir koku stimülasyon döngüsü için ortak bir zaman ekseni üzerinde cm koku vana durumu, nabız sayısında deneyde 15 sinek x pozisyonları senkronize bilgileri içeren .csv-dosyalarıdır. Veri analizi için özel kod istek üzerine temin edilebilir.
- Açık .csv dosyası, bir cha tarafından anlamına valf açılma zamanı noktasını bulmakValf durumunu temsil eden sütun nge.
- Formun koku pozisyonunun doğrusal fonksiyonunu hesaplayın
f (t) s * t = i +
t stimülasyon döngüsü zaman olduğu, s rüzgar hızı (burada 20 cm / sn) ve ben koku pozisyonu 0 (vana açma artı gecikme) tüpler girdiği zaman noktası kullanılarak hesaplanabilir kesmek olduğunu. - Bu koku da zaman noktasını bulun ve her sinek ve 0 Not bu zaman noktası ayarlayın x-pozisyon kesiştiği noktaları: sinek pozisyonları her individual's hizalanmış Bu şekilde koku ile karşılaşıyoruz.
- Ilgi bölgenin çok kenarlarında oturan sinekler hariç.
- Her stimülasyon çevrimi için bir zaman aralığı (100 milisaniye) ve yineleme prosedürü ile X ekseni boyunca yer değiştirme bölünmesiyle X-pozisyonlarından hız hesaplayın.
- Şekil 2E'de gösterildiği gibi her sinek ve koku için ve belirli bir koku için bu süre ortalama ders itibaren ortalama hızı zaman kurs hesaplamak hız zaman kurslar elde etmek.
- Şekil 3C gösterildiği gibi net deplasman elde etmek için her izleme olay için koku darbe ve sonrasında sinek ve koku başına ortalama net deplasman sonra 4 saniye içinde net deplasman hesaplamak.
4. Temizleme Prosedürü
- Temiz Cam Tüpler
- Cam tüpler gelen sinek ve adaptörleri çıkarın ve deterjan, cam tüpler ıslatın.
- Çalışan damıtılmış su altında cam tüpler durulayın ve basınçlı hava ile kurutun.
- 8 saat boyunca 200 ° C'de ısı cam borular.
- Temiz Koku Dağıtım Sistemi
- Merkezi karıştırma odasından tüm koku şişeleri ve tüpünü çıkarın.
- Karıştırma odasından boru bağdaştırıcıları çıkarın.
- Laboratuar temizleme solüsyonu ve çözücüler (örneğin, etanol, aseton) ile durulayarak temizleyin karıştırma odası. Laboratuar kaputun altında bu adımları uygulayın.
- Kuru karıştırma odası 8 saat 200 ° C 'de bu basınçlı hava ile ve ısıtın.
- Temiz Koku Şişeler ve Çek Vanalar
- Çelik fişini (ıskarta kauçuk conta) çıkartın ve koku şişeleri gelen çek valfler ve laboratuvar temizleme solüsyonu tüm bileşenleri ıslatın.
- Bir ultrason banyosunda sonikasyon bileşenler ve damıtılmış su ile yıkayın.
- Etanol ve aseton ile kontrol valfleri dışındaki tüm bileşenleri temizleyin. Laboratuar kaputun altında bu adımları uygulayın.
- Ve basınçlı hava ile kuru bileşenler 8 saat süreyle 200 ° C sıcaklıkta tekrar ısıtın.
- Etanol ve bir şırınga kullanarak aseton ile yıkanarak iç temizliğini valfler (akış yönünü düşünün). Laboratuvar gözlüğü takan laboratuar başlık altında şu adımları uygulayın. Aseton basınçlı hava ile yıkama hemen lastik parçaları, kuru çek valfleri saldırır çünkü.
- Birkaç gün onay valfler havayı darbe ile kalıntı kokuları çıkarın. Bu temizleme adım için rejim kapalı / 1 sn hava 60 ° C'de bir inkübatör ve 1 sn hava kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sinekler sabit bir hızda cam tüpler yoluyla koku bakliyat ve koku darbe seyahatleri arasında kendi cam tüpler içinde serbestçe dağıtmak için izin Çünkü sinekler stimülasyon sırasında x-pozisyonuna bağlı farklı zamanlarda koku karşılaşıyoruz. Bunun bir sonucu olarak, etil asetat çekici 10 -3 seyreltme 500 milisaniye darbe uyandırdığı rüzgara karşı yörüngelerin başlangıç ve bitiş noktalarının yakın oturmuş sinekler kişilerce kıyasla cam tüpler rüzgaraltı ucunda sinekler için yaklaşık 1 saniye gecikme bulunmaktadır 20 cm / sn ve 20 cm cam tüp uzunluğu (Şekil 2A) bir rüzgar hızında rüzgâra karşı son. Koku sunum tarihte x pozisyonuna dayalı her birey için koku karşılaşma temporal farkı Düzeltme etil asetat doğru yanıt gecikmeler bireylerin (Şekil 2B) tutarlı olduğunu ortaya koymaktadır.
Için o düzeltme olmadan Buna bağlı olarak, ortalama rüzgâra karşı yörüngedor seyahat düzeltme ile ortalama yörünge göre yaklaşık 0.5 saniye geciktirilir (Şekil 2C; koku, hem yörüngeleri uygulandı cam tüpler rüzgâra karşı ucunu girmek için gereken süre o düzeltme dikkat edin). Buna ek olarak, tek bir koku darbe için düzeltilmiş ortalama rüzgara karşı yörünge de düzeltilmemiş bir (Şekil 2B) daha dik bir eğime (yani daha yüksek bir yürüyüş hızı) gösterir. Tek bir koku darbe için gözlemler benzer koku seyahat için düzeltme ihmal koku bakliyat 40 sunumları ile iki deneysel oturumları (yani 30 sinekler) oluşan eksiksiz bir veri kümesi artan bir gecikme ve daha düşük tepki genliği yol açan her (Şekil 2E) .
Etil bütirat çekici 10 -3 dilüsyonları 500 milisaniye darbe (ETB), izopentil asetat (IAA), etil asetat (EtA) ve 2,3-bütandion (BEDN) ile tekrarlı uyarım rüzgara karşı od üzerine dalgalanmaları ortaya çıkarırya hasret kadın sinekler karşılaşma, solvent mineral yağı (MOL) ile uyarılması ise hiç ya da sadece zayıf tepkiler çağrıştırıyor. Tek başına mekanik uyarımı daha önce benzer bir paradigma 28 artan hareketinin endüklenmesi için gösterilmiştir. Flywalk paradigma koku stimülasyon toplam hava akışını değiştirmez ve artan hareket MOL kullanarak kontrol durumda çoğunlukla yoktur Ancak, bu rüzgâra karşı gerçek koku yanıtları yansıtır dalgalanmaları. Yanıt süresi kursları ortalama birey (Şekil 3A) ve koku özgü gecikme karşısında kalıplaşmış olan, genlik ve süresi (Şekil 3A, B). Etil asetat yanıtlar keskin başlangıcı, yüksek genlik ve kısa bir süre gösterilecek. Bunun aksine, 2,3-bütandion tepkileri genellikle biraz daha sonra başlangıcı, bir alt amplitüd ve daha uzun süreli gösterir. Etil bütirat ve izopentildir asetat, etil asetat gibi benzer zamansal dinamiklerini ortaya çıkarmak, ancak yanıtları genlik düşüktür. Correspondingly her 4 kokuları solvent ve negatif kontrol mineral yağ (Şekil 3C) göre daha koku karşılaşma sonrasında 4 saniye içinde daha yüksek bir rüzgara karşı yer değiştirmesini ortaya çıkarmak.
Aynı 4 cezbedici kullanılarak, bir önceki Cezbedici ikili karışımları ağırlıkça en az çekici daha çekici kanşım bileşen 29 gibi olduğu gösterilmiştir. İşte, bu gözlem tüm olası üçlü karışımlar ve 4 cezbedici tam karışımı test tarafından uzatıldı. Ikili karışımlar önceki gözlemlere benzer olarak, bu daha karmaşık karışımların her biri en az çekici en çekici tek bir bileşik (Şekil 4A) gibidir. En cazip karışımları etil asetat ve 2,3-bütandion, hem içerenlerdir. Bu 3 harmanlar verilen yanıtlar birbirinden anlamlı farklılık yoktur ve ayrıca tepki kinetik çarpıcı benzer (Şekil 4A, B). Bunun aksine, tam blen etil asetat atlama2,3-bütandion atlama tepki (Şekil 4C) kısaltır d değeri maksimum rüzgara karşı bir hız azalmasına yol açar. Etil asetat 2,3-bütandion düşük genlikli ancak uzun süreli (Şekil 3B, 4D) tepkilerini ortaya çıkarır ise kısa yüksek genlik tepkileri ortaya çıkarır, çünkü bu gözlemler Cezbedici harmanları yönelik tepkiler zaman kurslar eğiliminde olduğu, önceki bulgunun anımsatan harman kurucu tepki süresi-kurslar 29 oluşturulan optimum tepki süresi-ders izleyin. Bu veri seti olarak her 4 Cezbedici optimum etil asetat ve 2,3-bütandion doğru yanıt zaman ders bazında yapılabilir. Etil butirat ve / veya izopentildir asetat tam harman (Şekil 4D) doğru yanıtları gözlenen maksimum yürüyüş hızına ulaşmak için ek gereklidir. Bu nedenle, 2, 3 veya 4 bileşenlerine kanşım karmaşıklığı artış karışımı e çekiciliğini arttırırven daha önceki gözlemden ne beklenir daha cezbedici karışımları yönelik tepkiler karışım bileşenlerinin doğru yanıtların bir optimum temsil ettiği. Bununla birlikte, kurucu valans koku karışımlarından konserve edildiğini genel sonuç, bu daha karmaşık karışımların 29 için de geçerlidir kalır.
Şekil 1. İlke ve Flywalk kurulum düzeni. (A) ilkesinin şematik çizimi. Sarı kare: koku uyaran tüp aracılığıyla hareketli ve sinek rüzgâra karşı hareket içinde ortaya çıkan; Siyah nesne: Kamera davranışsal tepkileri izlemek için. Kömür filtreli hava ile kurulum sayesinde hava akımının (B) şematik koku verme sistemini 26,30 girmeden önce, 8 kanala nemlendirilmiş ve split edilir. Blow-up Şekil: 1, üç yönlü selenoid vana geçiş Boş bir şişeye hava akışını ya ing (c, telafi edici akış) ya da koku kaynağı içeren bir şişe ile (o; koku akışı); 2, bilyalı çek valfler tek yönde hava akışını kısıtlamak ve sistem kirlenmeyi önlemek için; Karıştırma odası: özel yapım kutu, tüm selenoid vana ve transferlerden havayı toplayan bölmek-up hava sıcaklığı ve nem sensörleri ile donatılmış bireysel sinekler ve 1 tüp yüklü 15 cam tüpler için bölünür kurulu. Not: cam tüpler sonra akış düzenleyiciler ve akış ölçerler tüm tüplerde aynı akışını garanti eder. Mavi kare izleme sisteminin ilgi (ROI) bölgesini gösterir. Izleme kamera, izleme bilgisayar ve koku verme sisteminin arasındaki bilgi akışının (C) şematik. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
OAD / 53394 / 53394fig2.jpg "/>
Şekil 2. Usul ve veri analizi arkasındaki mantık. (A) Bağımsız, bu nedenle, farklı zamanlarda, farklı pozisyonlarda koku karşılaşma ve sinekler. Sol panel: Koku valf anahtarlama sırasında olası sinek pozisyonların şematik. Sağ panel: etil asetat 10 -3 seyreltme 500 msan pals sunumu yaklaşık 15 sinekler x pozisyonların Ham veri. Not upwind x-pozisyonlarına bağlı olarak farklı zamanlarda ayrı ayrı sinekler yürüyor. Sol kesik çizgi: Koku valf anahtarlama zamanı. Koku cam tüpler (d) ve rüzgar hızı (w) ulaşmak için bireysel sineklerin koku karşılaşma sistem içsel gecikme kaydırılır. Bu nedenle, koku karşılaşma onun x pozisyonuna göre her sinek için ayrı ayrı hesaplanır. Alt sağ: 15 sinekler hizalanmış x pozisyonları (gri) ve ortalama x konumu (koyu siyah). (B) A ile aynı veriler, ama gecikme ve rüzgar hızı için düzeltildi. Bottom: (gri) ve düzeltme sonrası X-pozisyonu (kalın kırmızı) ortalama 15 sinekler hizalanmış x pozisyonları. Ve koku seyahat için düzeltme olmadan etil asetat biri 500 msn darbe ile ortaya 15 sineklerin ortalama rüzgara karşı ilerlemenin (C) Karşılaştırma. Düzeltilmemiş (siyah) iz değil koku seyahat için, gecikme için düzeltilmiş olduğunu unutmayın. Ve koku seyahat için düzeltme olmadan etil asetat biri 500 msn darbe ile ortaya 15 sinekler (D) Ortalama rüzgara karşı hız. Kesik çizgiler C gösterilen rüzgara karşı ilerleme değerlerinden hesaplanan hız, cesur hatları 1. sırası 9 noktalı Savitzky-Golay filtre kullanılarak yumuşatma sonra rüzgâra karşı hızını görüntüler gösterir. (E) Filtresiz ve 30 sinekler ve etil asetat her (yani tam bir veri seti) 40 darbe için koku seyahat için düzeltme olmadan rüzgâra karşı hızı demektir. Bu büyük halini görmek için tıklayınızrakam.
. EtB, 4 çekici kokular 10 -3 dilüsyonları için Şekil 3. Örnek tepkiler (A) 500 msn 4 cezbedici darbeleri ve solvent mineral yağı (MOL 30 ayrı sineklerin ortalama yanıt süresi-kurslar Renk kodlu: etil bütirat; IAA: izopentil asetat; EtA: etil asetat; BEDN: 2,3-bütandion). Her satır tek bir kişi anında ortalama yanıt süresi-ders temsil eder. Her sinek 40 kez ve her koku ile sunuldu - sinekler serbestçe dağıtmak için izin verilir ve izleme sistemi ilgi bölgeyi terk çünkü - tepki süresi kursları (n = 7-39 yörüngeleri sinek başına tüm tam yörüngeleri hesaplanır demek ) sinek ve koku başına. Sarı bar koku darbe temsil eder. (B) Tepki 4 Cezbedici ve çözücü mineral yağ (n = 30 sinekler zaman içerisinde, ortalama+/- Sem). (C) koku karşılaşma sonrası 4 saniye içinde net rüzgara karşı deplasman (A (aynı verilerin) ve (B), n = 30 sinekler). Dolgulu kutular negatif kontrol madeni yağ ile karşılaştırıldığında istatistiksel olarak anlamlı rüzgara karşı hareket gösterir (p <0.05; Wilcoxon işaretli sıra testi). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Cezbedici üçlü ve dörtlü karışımları doğru Şekil 4. Cevapları. (A) 4 cezbedicilerde ve medyan yanıt sıralama kriteri bunların hepsi üçlü ve dörtlü karışımlar için net rüzgâra karşı deplasman. Imzalanan Kruskal-Wallis rank sum testi ve post hoc Wilcoxon'un rank testi; n = 30 farklı harfler yanıtların (p <0.05 arasında anlamlı farklılık göstermektedir) uçar. Kara kutu aşağıda etil asetat ve 2,3butanedione içeren karışımlar gösterir. (B) Yanıt etil asetat ve 2,3-bütandion içeren karışımların zaman içerisinde (ortalama +/- SEM; n = 30 sinek). Benzer tepkisi-kinetik unutmayın. Tam harman tarafından uyarılmış, etil asetat veya 2,3-bütandiyon ve tepki kinetikleri olmadan karışımların tepki süresi-kurslar (C) Karşılaştırma (+/- ortalama sem, n = 30 sinekler). ETA olmadan düşük genlik ve BEDN olmadan kısa yanıtı unutmayın. ETA (kırmızı) ve BEDN (yeşil) yapılmış uygun zaman-rota (kesik) ve tam harmanın (D) karşılaştırması. Gölgelendirme Farklı karışım bileşenleri ile açıklanabilir zaman-rota kısımları göstermektedir. Bir önceki çalışmada da Cezbedici ikili karışımların yönelik tepkiler karışım kurucu zaman kurslar 29 temelinde oluşturulan optimum zaman dersten tahmin edilebileceği gösterilmiştir unutmayın. ETA ve BEDN için bu optimum zaman ders olarak gösterilirkesik çizgi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flywalk sistemi ilk bakışta oldukça sofistike görünse de, bir kez kurmak ve onu çalıştıran kullanımı kolay ve çok sağlam sonuçlar üretir. Biyo-deney ile üretilen sonuçların tutarlılığını stres için burada gösterilen temsili sonuçlar neredeyse 2 yıl, yeni bir takip yazılımı ve ışık kaynağı kullanılarak modifiye kurulum ile bir önceki çalışmada 29 de gösterilen bazı sonuçları sonra elde edildi söylenebilir. Bununla birlikte, çekici cevaplardır - Daha önce kendi dinamiği ile ilgili yayınlanan çok benzer - biraz daha yüksek tepki genlikleri rağmen.
Flywalk kullanarak yüksek kaliteli sonuçlar elde etmek için, özellikle dikkat edilmesi gereken kritik yönleri vardır. Daha da önemlisi, nem, bir deney sırasında 60% altına düşmemelidir. Tipik bir deney seans yaklaşık 8 saat boyunca devam eder. Makul büyüklükte kadın CS yabani tip sinekler ex önce 24 saat boyunca hasretKolayca deney düzeneği sağlanan nem en az 12 saat süreyle hayatta periment yeterince yüksektir. Boş bir cam tüp (Şekil 1B) bir nem sensörü yüklemek ve nemlendirici ile cam tüpler arasında herhangi bir hava akımı akış düzenleyiciler yerleştirerek önlemek için tavsiye edilir nem ile ilgili sorunları önlemek için. Aynı zamanda sistem hermetik veri kalitesi için kesinlikle gereklidir. Cam tüpler sonra sistemini terk hava akımları sistemine girmeden hava akımı özetlemek gerekir. En başarısız deneyler deney start sistemi hava sızdırmaz olduğundan emin olmak için önce alınmalıdır sistemi ve büyük bir özenle sızıntılar isnat edilebilir. Son olarak, koku araştırmalarında kullanılan herhangi bir kurulum ile olduğu gibi, en büyük sorunlardan biri, günlük kirlenmesini önlemek içindir. Kokuları ile temas eden parçaların çoğu cam, çelik, teflon veya PEEK yapılır ve bu nedenle çoğu o çıkarmak için yeterli olan en az 200 ° C, kadar ısıtılabilirBu tür uzun zincirli feromonlar gibi özellikle yüksek kaynama noktasına sahip olanlar hariç dors. Çek valfler kauçuk parçalar içerdiğinden bunlar yüksek ısıtıldı ve bu nedenle özel bir temizlik protokolü onlar için icat edildi yüzden kontaminasyon önemli bir kaynak vardır edilemez. Bununla birlikte, belirli bir çek valf ile temas durumuna gelmiştir kokuların takip etmek için tavsiye edilir. Onun temizliği ile ilgili Şüphe durumunda değiştirin.
Gergin tahliller ve kohort deneyler arasında bir uzlaşma olarak, elbette Flywalk diğer yöntemlere göre bazı dezavantajları vardır. Kip Farklı uyaranların çok sayıda doğru davranış değerlendirilir ve karşılaştırılmasını zaman çok etkilidir. Özellikle, 15 kişiye verilen bir koku sadece bir darbe tepki süresi ders kuvvetle tam veri seti elde edilen tepki süresi-kurslar benzer çünkü (yani 30 sinekler ve 40 sunum, her, Şekil 2D, 2E örneğin incelenmesi gereken zaman daha etkilidir. Ayrıca, görsel izleme sistemleri zamansal çözünürlük gibi gergin uçuş veya koşu bandı olarak hızlı biyoanalizlerin genellikle daha düşük olduğunu. Drosophila koku eşliğinde davranış bildirilen kısa tepki gecikmeleri gergin paradigmalar 20,23 iyi koku karşılaşma sonrasında 100 milisaniye altında ve böylece 10 Hz'de verileri analiz sırasında çözülemeyen bir zaman penceresi içinde kalmaktadır. Bununla birlikte, Flywalk bölgesindeki çekici yanıtlar genellikle ilk 100-300 içinde başlariyi serbest uçan sinekler 5 gözlenen rüzgara karşı dalgalanma gecikmeler ile uyumludur msn (Şekil 3B). Bu nedenle gergin paradigmalar yanıt gecikmelere bu farkın rüzgar tünelinde göre ve Flywalk görsel izleme paradigmaları ya da gergin durumda sinekler daha yüksek uyarılma devlet tarafından mekansal ve / veya zamansal çözünürlükte farklılıkların neden olup olmadığını tespit edilecek kalır.
Özetle, Flywalk düzenli Drosophila neuroethology kullanılan kohort deneylerin verimliliği ile gergin testlerin yüksek kontrollü uyaran sunum birleştiren bir hayır tercihi biyoassay vardır. Bireylerin aynı seti farklı uyaranların çok sayıda itiraz edilebilir Çünkü farklı uyaranlara karşı tepkiler karşılaştırırken, kendine özgü gücü istatistiksel gücü yatıyor. Ayrıca, çekici bir koku karşılaşma üzerine rüzgara karşı dalgalanma uçar gerçeği patlatır ve bu şekilde koku değerlendirmeyi koparanyönlü işaret olarak bir degrade gerek kalmadan koku kaynak lokalizasyonu dan. Bu nedenle, ideal Drosophila uygun Optogenetic araç kutusunu yararlanmak için uygun olmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını var olduğunu beyan ederiz.
Acknowledgments
Biz talepleri için izleme yazılımı özelleştirmek için Electricidade Em po (electricidadeempo.net) teknik yardım için Daniel Veit ve Pedro Gouveia teşekkür ederiz. Biz de filme sürecinde destek için Tom Retzke teşekkür ederiz. Bu çalışma Max Planck Kurumu tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flywalk setup | Custom | details available upon request | |
| stimulus device | Custom | details available upon request | |
| LED cluster | Custom | details available upon request | |
| HD Pro Webcam C920 | Logitech, Lausanne, Switzerland | ||
| 2 Computers | |||
| Flywalk Reloaded v1.0 software | Electricidade Em Pó (electricidadeempo.net) | ||
| Labview 11.0 software | National Instruments, Austin, TX | ||
| Standard fly food | Custom | ||
| Standard fly vials | Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Standard fly vials | Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| aspirator | Custom | ||
| mineral oil | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | ||
| odors | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | ||
| 200 µl PCR reaction tubes | Biozym Scientific GmbH, Oldendorf, Germany |
References
- Murlis, J., Elkinton, J. S., Cardé, R. T. Odor plumes and how insects use them. Annu. Rev. Entomol. 37, 505-532 (1992).
- Kennedy, J. S., Marsh, D.
- Budick, S. A., Dickinson, M. H. Free-flight responses of Drosophila melanogaster to attractive odors. J. Exp. Biol. 209 (15), 3001-3017 (2006).
- Buehlmann, C., Graham, P., Hansson, B. S., Knaden, M. Desert ants locate food by combining high sensitivity to food odors with extensive crosswind runs. Curr. Biol. 24 (9), 960-964 (2014).
- Van Breugel, F., Dickinson, M. H. Plume-tracking behavior of flying Drosophila emerges from a set of distinct sensory-motor reflexes. Curr. Biol. 24 (3), 274-286 (2014).
- Schuckel, J., Meisner, S., Torkkeli, P. H., French, A. S. Dynamic properties of Drosophila olfactory electroantennograms. J. Comp. Physiol. A. 194 (5), 483-489 (2008).
- Geffen, M. N., Broome, B. M., Laurent, G., Meister, M. Neural encoding of rapidly fluctuating odors. Neuron. 61 (4), 570-586 (2009).
- Nagel, K. I., Wilson, R. I. Biophysical mechanisms underlying olfactory receptor neuron dynamics. Nat. Neurosci. 14 (2), 208-216 (2011).
- Martelli, C., Carlson, J. R., Emonet, T. Intensity invariant dynamics and odor-specific latencies in olfactory receptor neuron response. J. Neurosci. 33 (15), 6285-6297 (2013).
- Szyszka, P., Gerkin, R. C., Galizia, C. G., Smith, B. H. High-speed odor transduction and pulse tracking by insect olfactory receptor neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 111 (47), 16925-16930 (2014).
- Nagel, K. I., Hong, E. J., Wilson, R. I. Synaptic and circuit mechanisms promoting broadband transmission of olfactory stimulus dynamics. Nat. Neurosci. 18 (1), 56-65 (2014).
- Larsson, M. C., Domingos, A. I., Jones, W. D., Chiappe, M. E., Amrein, H., Vosshall, L. B. Or83b encodes a broadly expressed odorant receptor essential for Drosophila olfaction. Neuron. 43 (5), 703-714 (2004).
- Knaden, M., Strutz, A., Ahsan, J., Sachse, S., Hansson, B. S. Spatial representation of odorant valence in an insect brain. Cell Rep. 1 (4), 392-399 (2012).
- Zaninovich, O. A., Kim, S. M., Root, C. R., Green, D. S., Ko, K. I., Wang, J. W. A single-fly assay for foraging behavior in Drosophila. J. Vis. Exp. (81), e50801 (2013).
- Farhan, A., Gulati, J., Groβe-Wilde, E., Vogel, H., Hansson, B. S., Knaden, M. The CCHamide 1 receptor modulates sensory perception and olfactory behavior in starved Drosophila. Sci. Rep. 3 (2765), 1-6 (2013).
- Flügge, C. Geruchliche Raumorientierung von Drosophila melanogaster. Z. Vgl. Physiol. 20 (4), 462-500 (1934).
- Borst, A., Heisenberg, M.
- Louis, M., Huber, T., Benton, R., Sakmar, T. P., Vosshall, L. B. Bilateral olfactory sensory input enhances chemotaxis behavior. Nat. Neurosci. 11 (2), 187-199 (2008).
- Gomez-Marin, A., Stephens, G. J., Louis, M. Active sampling and decision making in Drosophila chemotaxis. Nat. Commun. 2 (441), 1-10 (2011).
- Gaudry, Q., Hong, E. J., Kain, J., de Bivort, B. L., Wilson, R. I. Asymmetric neurotransmitter release enables rapid odour lateralization in Drosophila. Nature. 493 (7432), 42442-42448 (2013).
- Quinn, W. G., Harris, W. A., Benzer, S.
- Ramdya, P., Lichocki, P., et al. Mechanosensory interactions drive collective behaviour in Drosophila. Nature. 519 (7542), 233-236 (2014).
- Bhandawat, V., Maimon, G., Dickinson, M. H., Wilson, R. I. Olfactory modulation of flight in Drosophila is sensitive, selective and rapid. J. Exp. Biol. 213 (21), 3625-3635 (2010).
- Duistermars, B. J., Chow, D. M., Frye, M. A. Flies require bilateral sensory input to track odor gradients in flight. Curr. Biol. 19 (15), 1301-1307 (2009).
- Claridge-Chang, A., Roorda, R. D., et al. Writing memories with light-addressable reinforcement circuitry. Cell. 139 (2), 405-415 (2009).
- Steck, K., Veit, D., et al. A high-throughput behavioral paradigm for Drosophila olfaction - The Flywalk. Sci. Rep. 2 (361), 1-9 (2012).
- Lewis, E. B. A new standard food medium. Drosoph. Inf. Serv. 34, 117-118 (1960).
- Lebestky, T., Chang, J. S. C., et al. Two different forms of arousal in Drosophila are oppositely regulated by the dopamine D1 receptor ortholog DopR via distinct neural circuits. Neuron. 64, 522-536 (2009).
- Thoma, M., Hansson, B. S., Knaden, M. Compound valence is conserved in binary odor mixtures in Drosophila melanogaster. J. Exp. Biol. 217 (20), 3645-3655 (2014).
- Olsson, S. B., Kuebler, L. S., et al. A novel multicomponent stimulus device for use in olfactory experiments. J. Neurosci. Meth. 195 (1), 1-9 (2011).
