Summary
Se presenta un protocolo sobre cómo utilizar la crio-tomografía electrónica de alto rendimiento para determinar alta resolución en las estructuras in situ de máquinas moleculares. El protocolo permite que grandes cantidades de datos a procesar, evita los cuellos de botella comunes y reduce el tiempo de inactividad de los recursos, lo que permite al usuario centrarse en cuestiones biológicas importantes.
Introduction
Tipo III sistemas de secreción (T3SS) son determinantes de virulencia esenciales para muchos patógenos Gram-negativas. El injectisome, también conocido como el complejo de la aguja, es la máquina T3SS centro requerida para la translocación directa de proteínas efectoras de la bacteria en las células huésped eucariotas 1, 2. El injectisome comprende una aguja extracelular, un cuerpo basal, y un complejo citoplásmico también conocida como el complejo de clasificación 3. Estudios previos han dilucidado estructuras 3-D de injectisomes purificados de Salmonella y Shigella, junto con las estructuras atómicas de las principales proteínas del cuerpo basal de 4, 5. Recientes en las estructuras in situ de injectisomes de Salmonella, Shigella y Yersinia fueron revelados por crio-ET 6 , 7. Sin embargo, el complejo citoplasmático, esencial para la selección efector y conjunto de la aguja, no se ha visualizado en esas estructuras.
Cryo-ET es los mesest técnica adecuada para obtener imágenes de la maquinaria molecular a una resolución de nanómetros dentro de su contexto celular nativo (in situ). Sin embargo, la resolución alcanzable por crio-ET está limitada por espesor de la probeta. Para superar el inconveniente, hemos fotografiado injectisomes intactas en una cepa de Shigella flexneri virulenta que fue modificada genéticamente para producir minicélulas lo suficientemente delgadas para crio-ET. Otra limitación de la crio-ET es la sensibilidad de la muestra a la radiación inducida por el haz de electrones, que destruye muy rápidamente la información de alta resolución en la muestra. Como resultado, las dosis extremadamente bajas se utilizan para Tilt-imágenes individuales de manera que una dosis adecuada puede ser distribuido entre la inclinación de la serie completa. Esto reduce en gran medida la relación señal-ruido (SNR) en la reconstrucción final, lo que hace difícil diferenciar las características estructurales de la materia a partir de la gran cantidad de ruido en la tomografía y limita la resolución que se puede lograr por crio ET. Conventional de procesamiento de imágenes tales como Fourier y los filtros del espacio real así como hacia abajo de muestreo se puede utilizar para aumentar el contraste, pero a expensas de filtrar gran parte de la información de alta resolución. Recientemente, sub-tomografía promedio ha permitido aumentar enormemente la SNR y, posteriormente, la resolución final en algunos casos a niveles sub-nanómetros 8, 9. Un análisis más detallado de los complejos es posible gracias computacionalmente extraer miles de sub-tomografías contienen las áreas de interés de las tomografías originales y luego alinear y promedio de las sub-tomografías para determinar en estructuras complejas situ con mayor SNR y mayor resolución. Estos métodos se pueden integrar con enfoques genéticos para ofrecer aún mayores conocimientos sobre las asambleas macromoleculares y sus conformaciones dinámicas en el contexto celular nativo.
En general, decenas o incluso cientos de miles de sub-tomografías deben ser promediados para determinar altaestructuras -Resolución in situ. La adquisición de un número suficiente de inclinación de la serie necesaria para producir este gran número de sub-tomografías rápidamente se convierte en un cuello de botella. La inclinación de la serie resultantes son a menudo afectada por el cambio inducido por haz de, etapa reacción, así como la ampliación, la rotación y defectos de inclinación, que debe resolverse para que la inclinación de la serie en alineación antes de la reconstrucción. La serie de inclinación está normalmente alineado por el seguimiento de marcadores de referencia de oro, que son seleccionados tradicionalmente manualmente a través de la inspección de la serie de inclinación, causando otro cuello de botella. Muchos paquetes de software se han desarrollado para la adquisición de la inclinación de la serie automatizada a través de microscopios electrónicos controlados por el ordenador 10, 11, 12, la alineación de inclinación de la serie y la reconstrucción de 13, 14 y sub-tomografía promedio de 15 a 18. Como estos paquetes manejan operaciones discretas en el flujo de trabajo de la crio-ET, se hace deseable construir un mayor nivel de abstracción en el proceso para systematicamente agilizar todo el esquema en una sola tubería. Por lo tanto, hemos desarrollado una biblioteca envoltorio software "tomoauto" diseñado para organizar una serie de estos paquetes en una sola unidad semi-automatizado, permitiendo una operación de usuario simple, mientras que el mantenimiento de la configuración completa de cada componente de forma centralizada. La biblioteca es de código abierto, bien documentado, desarrollado continuamente y libremente disponibles para su uso, desarrollo a medida o una mayor integración por medio de un código fuente remota repositorio en línea (http://github.com/DustinMorado/tomoauto).
Este crio-ET tubería de alto rendimiento se ha utilizado para visualizar injectisomes intactos en S. minicélulas flexneri. Un total de 1.917 tomografías fueron generados usando este método, revelando una alta resolución en la estructura in situ de la máquina intacta incluyendo la plataforma de clasificación citoplasmática determinado por sub-tomografía promediando 19. Junto con el modelado molecular de tipo salvaje y mmáquinas utant, nuestra línea de alto rendimiento proporciona una nueva vía para entender la estructura y la función del injectisome intacto en el contexto celular nativo.
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Protocol
1. Preparación Minicell
- Para hacer S. minicélulas flexneri, transforman 1 l de plásmido pBS58, que expresa constitutivamente genes de división celular de Escherichia coli ftsQ, FtsA y FtsZ desde un mínimo de copias espectinomicina resistentes plásmido en 5 l electrocompetente estreptomicina resistentes serotipo 5 bis (M90T-Sm) células por electroporación a 2,5 kV durante 5 ms en 1 cubetas mm.
- Almacene las muestras minicélula a -80 ° C en glicerol al 15% en un 1,5 ml microtubo criogénico. Cuando esté listo para su uso, raspar aproximadamente 5 l de células de la microtubo unthawed utilizando una punta de pipeta y suspender las células en 4 ml de caldo de soja tríptico con espectinomicina añadió a 100 g / ml de concentración. Crecer O / N a 37 ° C.
- Pipetear 2 ml del cultivo de caldo de soja 1,2 en 200 ml tríptico con espectinomicina nuevo añadido a concentraciones de 100 mg / ml. Crece a 37 ° C a la fase logarítmica tardía.
- Para enriquecer minicélulas, centrífuga200 ml del cultivo a partir de 1,3 a 1.000 xg durante 5 min. Vierta cuidadosamente la fracción sobrenadante a un nuevo tubo de centrífuga y centrifugar a 20.000 xg durante 10 min. Vierta cuidadosamente y deseche la fracción sobrenadante, y mezclar suavemente el pellet con el líquido restante con una punta de pipeta y transferir aproximadamente 100 l de la mezcla de pellets a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
2. EM preparación de la cuadrícula
- Coloque un lado de la película de carbono de malla 200 de carbono rejilla de cobre R2 / 2 holey sobre un portaobjetos de vidrio.
NOTA: A / 2 rejilla de malla 200 R2 se selecciona para maximizar el número de inclinación de la serie que se puede configurar para adquirir en una sola cuadrícula mientras que todavía el apoyo a la muestra y colocando el borde de la película de carbono en el campo de la cámara en la ampliación deseada. Rejillas de malla más fino y películas más pequeñas holey de carbono tales como R1.2 / 1.3 400 de malla se puede utilizar para muestras fotografiadas a mayor aumento; películas más grandes holey carbono, tales como R3.5 / 1 200 de malla puede ser usod para las muestras proyectado en aumento menor o si la micrografía no debe contener el borde carbono y películas de carbono holey con un espaciado más grande tal como R1 / 4 de malla 200 puede ser utilizado para ayudar con la alineación de la etapa a la zona de interés y la protección de áreas de sobreexposición en el enfoque y el seguimiento de rutinas. - Colocar el portaobjetos en la plataforma en un dispositivo de descarga luminiscente.
NOTA: Utilizamos un dispositivo de la casa en la que un ánodo y la plataforma se ha mecanizado en un desecador de vacío y es alimentado por un generador de alta frecuencia. Después de crear un vacío, conecte la sonda generador de alta frecuencia para el ánodo y el poder en la sonda durante 1 min a brillar descargue la red. El tiempo necesario para brillar descarga la red puede variar desde unos pocos segundos a un minuto. Variando el tiempo de descarga luminiscente se puede utilizar para diagnosticar problemas de concentración de muestras y las redes que aparecen en seco sin hielo vítreo. - Retire la rejilla con un juego de pinzas, y bloquear las pinzas cerradas con un b elásticay.
- Añadir 100 l de 10 solución de oro coloidal nm al tubo de microcentrífuga con las minicélulas preparados en 1.4 y mezclar agitando suavemente el tubo con un dedo. Con un nuevo lugar pipeta de 4 l de la mezcla en la parrilla preparado en 2.2.
NOTA: El oro coloidal está disponible en una variedad de tamaños y se debe tener cuidado de que el tamaño del oro es mayor que 5 píxeles dado el tamaño de píxel de las micrografías de ser procesados en la ampliación adquirida, si bien no es demasiado grande para las características oscuros de interés. - Preparar el aparato de inmersión congelación; llenar el recipiente de congelación exterior con nitrógeno líquido y luego rellenar la cámara interior con etano líquido. Una los fórceps con la rejilla a la varilla de émbolo y bloquear el vástago del émbolo en la posición elevada.
NOTA: Ver Iancu et al 20 para un protocolo que describe el uso de un aparato de inmersión congelación comercial.. - Seque la red tocando cuidadosamente un trozo de papel de filtro en tque caiga de la muestra hasta que el menisco entre las separa de la red y de papel de filtro y la mecha en el papel de filtro se detiene, luego suelte inmediatamente el émbolo, la congelación de la cuadrícula. Retire con cuidado las pinzas de la varilla del émbolo y coloque la rejilla en un soporte de rejilla.
- Prepare la estación de transferencia de la crio-ME llenando el contenedor de la bomba zona de carga y la absorción de nitrógeno líquido. Una vez que el área de carga está en lugar temperatura del nitrógeno líquido el soporte de rejilla y un cartucho de muestra de microscopio en la zona de carga.
- Retire con cuidado el anillo de bloqueo, que es ya sea un pequeño anillo de bloqueo roscado en microscopios Polara anteriores o un anillo de clip-estilo C en modelos posteriores; colocar la rejilla de EM en el cartucho con unas pinzas y luego vuelva a colocar suavemente el anillo de seguridad de nuevo en el cartucho de asegurar la red.
- Retire el soporte de la muestra múltiple del microscopio y adjuntarlo a la estación de transferencia. Coloque el cartucho de muestra en el soporte utilizando pinzas de cartucho und retraer el soporte de la zona de carga y transferir el portamuestras múltiple de vuelta al microscopio.
NOTA: Ver Chen et al 21 para un protocolo que detalla 02.01 a 02.09..
3. Alto rendimiento de inclinación de la serie automatizada Colección
- Colección de baja magnificación Mapas
- Abra una nueva ventana del navegador, haga clic en "Abrir" en el menú 'Navigator' de SerialEM 10 (http://bio3d.colorado.edu/SerialEM)
- Encuentra cuadrículas que contienen las condiciones de imagen aceptables (es decir, el hielo fino, sin contaminación, tema de interés) mediante la pantalla fluorescente a bajo aumento (~ 2,300X para la muestra de minicélulas).
NOTA: [Opcional:. Este paso puede automatizarse con SerialEM montaging por toda la red, sin embargo, puede ser más rápido que sólo tiene que seleccionar unas pocas áreas manualmente] - Ajuste el escenario a la altura eucéntrica por la inclinación del portamuestras de 50 ° y luego ajustarel z-altura hasta la traducción xy de la etapa es mínima entre los puntos de vista inclinados y no inclinada.
- Mover al centro de la plaza de la red y haga clic en el botón 'Añadir Etapa Pos' en la ventana del navegador para guardar la posición actual etapa.
- Continúe con los pasos 3.1.1-4 anterior hasta que se han guardado todas las posiciones cuadrículas etapa aceptables.
- Abra un nuevo archivo MRC montaje haciendo clic en "Nuevo montaje" en el menú "Archivo". En el programa de instalación Montaje de diálogo que se abre, seleccione un número de piezas en X e Y que adquirirán toda la cuadrícula (por ejemplo, 10 x 10 para una rejilla de malla 200 estándar). Use un binning alta como 8 y seleccione la opción 'Mover Etapa En lugar de desplazamiento de la imagen "y" Saltar correlaciones utilizadas para alinear piezas' botones de radio.
- En la ventana del navegador, haga clic en la primera posición de la etapa y la puso a adquirir marcando la casilla 'Acquire'. Repita este procedimiento para cada posición de la etapa en la ventana del navegador.
- Abra el navegador Adquirir diálogo haciendo clic en "Adquirir en los puntos 'en el menú' Navigator '. Compruebe el 'mapa de imagen Acquire "y casilla' eucentricity Rough 'y asegúrese de que todas las demás casillas de verificación están desactivadas. Haga clic en 'Continuar' para recoger un montaje en cada posición de la etapa.
- Adquisición de inclinación de la serie
- En la ventana del navegador, seleccione uno de los mapas adquiridos y haga clic en el botón "Cargar mapa '.
- En la ventana del navegador, haga clic en "Añadir Puntos 'botón y seleccionar puntos en el mapa en el que adquirir una serie de inclinación. Luego haga clic en el 'dejar de añadir puntos' botón. Repita el procedimiento para cada mapa recogido.
- En el menú de la cámara seleccione 'Parámetros' y definir los parámetros para los modos de enfoque, el juicio, y Record. [Opcional:. Dosis fracciona-datos se pueden especificar en los parámetros para el modo de grabación]
- Seleccione un punto en la ventana del navegador y comprobar la 'Serie de inclinación9; casilla de verificación. En la ventana de diálogo Configuración de inclinación de la serie que se abre, seleccione los parámetros que desee para la recogida de la inclinación de la serie. Repita el procedimiento para el resto de los puntos seleccionados en la ventana del navegador, pero no seleccione los mapas.
- En el menú del navegador de nuevo seleccionar el 'Adquirir en los puntos'. En el Navigator Adquirir diálogo elija 'Vuelva a alinear con el tema', enfoque automático 'y' eucentricity Rough 'como tareas preliminares, y seleccione "Adquirir serie de inclinación' como la tarea primaria, y seleccione" Cerrar las válvulas de columna en el extremo 'para cerrar la columna cuando todo de los puntos se han recogido. Al proceder de una serie de inclinación serán recogidos en cada punto en cada mapa.
4. Alto rendimiento de procesamiento de la inclinación de la serie automatizada y Reconstrucción Usando Tomoauto
- Corrección de movimiento inducido por la viga en los datos de dosis fraccionadas [opcional]
NOTA: Tomoauto utiliza MOTIONCORR 22 (http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.html) para eliminar el movimiento inducido por haz de a partir de micrografías de dosis fraccionada. NOTIONCORR 16 debe estar instalado en el sistema.- Con la serie de inclinación original, el registro de salida de SerialEM 10 y las imágenes fraccionada en dosis individuales de todo en el directorio de trabajo actual, en un terminal ejecutar el comando:
dose_fractioned_to_stack <filename.st>
<Filename.st> es el nombre de la serie de inclinación para procesar.
- Con la serie de inclinación original, el registro de salida de SerialEM 10 y las imágenes fraccionada en dosis individuales de todo en el directorio de trabajo actual, en un terminal ejecutar el comando:
- Alineación y Reconstrucción de la inclinación de la serie
NOTA: Tomoauto por defecto usa IMOD 13 (http://bio3d.colorado.edu/imod/) para manejar la inclinación de la serie automatizado generación de modelos fiducial, la alineación, la determinación de la función de transferencia de contraste (CTF), CTF-corrección de 23, y reconstrucción. Alternativamente los usuarios tienen la opción de tomoauto utilizar RAPTOR 24 (incluido en IMOD) para la generación automatizada modelo fiducial, CTFFIND4 25 (http://grigoriefflab.janelia.org/ctf) para determinar la CTF, y tomo3d 26 (https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d) para la reconstrucción o en cualquier combinación de paquetes de software por configuración. Esta configuración, así como los parámetros disponibles en cada paquete está a cargo de un archivo de configuración global que se puede editar para adaptarse a los valores más utilizados en un laboratorio mientras que los archivos de configuración local también se pueden crear a los parámetros de detalles utilizados para una muestra específica, colección establecer o inclinación de la serie individual. Todos los paquetes que deseen utilizar debe estar instalado en el sistema.- Con la inclinación de la serie en el directorio de trabajo actual, en un terminal ejecutar el comando
tomoauto --CTF --mode = align <filename.st> <fid_diam>
<Filename.st> es la serie de inclinación para ser procesado y <fid_diam> es el Diameter de los marcadores de referencia en nanómetros. Este comando alinear y estimar el CTF de la serie de inclinación automáticamente. Es posible omitir el procesamiento de CTF mediante la eliminación de la opción --CTF desde el comando. - Inspeccione el tilt-series alineadas visualmente de los errores evidentes en el procesamiento de la alineación e inspeccionar el FTL estimado mediante la ejecución de los comandos:
3dmod <archivo> .ali
submfg <archivo> _ctfplotter.com
respectivamente, donde <nombre> es el nombre de la inclinación de la serie sin sufijo. También comprobar la salida del comando tomoauto para ver el error residual media generada por la alineación, que es una estadística cuantitativa de la calidad de alineación. - Dada una alineación aceptable proceder procesamiento ejecutando el comando:
tomoaua --CTF --mode = reconstruir <filename.st> <fid_diam>
con las mismas sustituciones de usuario como en 4.2.1. Este comando corregirá el CTF, borrar los marcadores de referencia de la serie de inclinación y calcular la reconstrucción. De nuevo procesamiento CTF se puede omitir como en 4.2.1. - [opcional] Para saltar el paso de la inspección visual y automatizar completamente el procesamiento y la reconstrucción ejecutar el comando
tomoauto --CTF <filename.st> <fid_diam> - [opcional] Para utilizar una configuración local específica, consulte la documentación tomoauto sobre cómo generar un archivo de configuración local y, a continuación, ejecutar el comando
tomoauto [opciones] -L <local_config> <filename.st> <fid_diam>
donde <local_config> es el nombre de la conf localesarchivo iguration.
- Con la inclinación de la serie en el directorio de trabajo actual, en un terminal ejecutar el comando
Averaging 5. Sub-tomografía
NOTA: Utilizamos el paquete i3 15 (http://www.electrontomography.org/) para procesar los experimentos de promedio sub-tomograma, sin embargo, el protocolo descrito se aplica en general a la mayoría de los disponibles sub-tomograma experimentos proceso packages16to software promedio sub-tomografía de promedio, sin embargo, el protocolo descrito se aplica en general a la mayoría de los disponibles sub-tomograma paquetes de software de promedio 16-18.
- Con la tomografía reconstruida en el directorio de trabajo actual abrir la tomografía de recolección de partículas mediante la ejecución del comando:
tomopick <archivo> .rec
donde <nombre de archivo> es como en 4.2.2. En la ventana que se abre utilizar el botón izquierdo del ratón para hacer clic en el primero el cuerpo basal y luego la punta de la aguja para seleccionar una injectisome y utilizar las teclas de flecha arriba y abajo para riff a través de las rebanadas de la tomogrametro. Seleccionar todos injectisomes visibles en esta manera. Esto almacena las coordenadas en un archivo de texto que definen el eje largo de la estructura, así como la estimación de dos de los tres ángulos de Euler que describe la orientación de la estructura. - Extracto Computacionalmente 400 3 cubos voxel de la tomografía con centro en el punto medio del eje longitudinal definido por la ejecución del comando:
recortar redimensionamiento -CX <x> -cy <y> -CZ <z> -ix 400 -iy 400 -iz 400
<filename> .rec <archivo> _001.mrc
donde <x>, <y>, <z> son las coordenadas del punto medio de la estructura y <archivo> es como en 4.2.2. El tamaño del cubo extraída debe variar por la estructura y la ampliación usado, y debe ser lo suficientemente grande para encerrar adecuadamente la estructura de interés, que para esta muestra es de 400 3 voxels. - Abajo-muestra (bin) la sub-tomografía por un factor de cuatro a reducir el tiempo de cálculo para la alineación inicial ejecutando el comando:
binvol -b 4 <archivo> _001.mrc <archivo> _001.bin4.mrc
donde <nombre de archivo> es como en 5.2. - Aplicar el determinado ángulos de Euler para sub-tomografías y calcular el promedio global para producir la plantilla inicial mediante la ejecución del comando.
I3totsum.sh - Alinear y clasificar sub-tomografías abajo muestra que utilizan una máscara de clasificación binaria de la zona citoplasmática. Realizar sub-tomografía promediado en el espacio de Fourier para minimizar los artefactos de cuña que faltan característicos de la tomografía. Para binning 4 de datos, por favor, utilice SAMPFACT = "4 4 4".
i3mramsacls.sh - Repita el paso 5.5 utilizando sub-tomografías abajo-muestreados por un factor de dos (SAMPFACT = &# 34; 2 2 2 ") y una vez más con los datos originales (SAMPFACT =" 1 1 1 ").
i3mramsacls.sh
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Representative Results
Las muestras de minicélulas S. flexneri fueron recogidos y tratados como se muestra en la figura esquemática 1 utilizando tomoauto siguiendo la tubería se detalla en la figura 2. Inclinación de la serie se recogieron usando SerialEM 10, que permite la adquisición de inclinación de la serie de alto rendimiento en los puntos designados por el usuario en los mapas de montaje de baja magnificación (Figura 3). Micrografías se recogieron usando el modo dosis-fraccionamiento en una cámara de dispositivo de detección directa para reducir inducida por haz de movimiento 22 (Figura 4). Tomoauto coordina corrección de movimiento teniendo una colección de micrografías fraccionada en dosis de procesamiento de cada uno con MOTIONCORR 22 y el montaje de los resultados en una serie de inclinación para ser procesados (Película 1).
La aplicación más general de tomoauto es los automátic alineación de una serie de inclinación inicial. Tomoauto compone ejecución secuencial de los comandos necesarios en IMOD 13 para alinear el grueso de la serie de inclinación y generar un modelo fiducial inicial de seguimiento de las partículas de oro coloidal en la muestra, que son a su vez se utiliza para generar la alineación final. La precisión de este modelo fiducial es esencial para la calidad de la tomografía reconstruida, y por lo que el usuario es capaz de inspeccionar visualmente el modelo fiducial calculados automáticamente antes de proceder con la reconstrucción o posteriormente para identificar tilt-series que deben ser procesados manualmente. La Figura 5 muestra de dos tilt-serie-alineado grueso y el modelo fiducial determinado como generada por tomoauto. Figuras 5A, C muestran las imágenes Untilted y tanto en el modelo fiducial es correcta, con puntos de modelo centrado en los marcadores de referencia. Figuras 5B, D muestran la correspondiente Inclinación serie a 50 grados y mientras que el modelo en la Figura 5B la figura 5D se han desviado de sus marcadores de oro correspondientes y el modelo no es adecuado para la alineación fina. Este error puede ser medida cuantitativamente como el error residual medio entre el centro del punto de modelo y el centro probable del marcador de oro, y tomoauto puede ser configurado para alertar al usuario cuando el error medido excede un umbral definido por el usuario para agilizar la inspección. Inclinación de la serie que están insuficientemente alineado de forma automática puede ser alineado de forma manual. Encontramos que tomoauto alinea con éxito alrededor del 80% -90% de nuestra recogida de inclinación de la serie (Película 2).
Después de una serie de inclinación se ha alineado con éxito, tiene que ser reconstruido en la tomografía final. Tomoauto ha sido diseñado de modo que el usuario puede utilizar IMOD 13 o tomo3d 26 para generar la reconstrucción final. Actualmente usamos tomo3d para tomar ventaja de varias características en unidades de procesamiento de ordenador de múltiples núcleos modernos (CPU) para reducir considerablemente el tiempo de reconstrucción. La tomografía final como se muestra en la Figura 6 y la película 3 es un volumen 3-D de la muestra fotografiado que luego puede ser utilizado para la anotación celular mediante la segmentación, o sub-tomogram un promedio para obtener mayor información de resolución de la maquinaria molecular dentro de la muestra. Sub-tomografía aumentos de promedio tanto el SNR y disminuye los artefactos producidos por la cuña falta promediando los altos niveles de ruido en las tomografías individuales y la utilización de los números grandes sub-tomografías en un conjunto bien distribuida de orientaciones al azar con respecto a la falta de cuña para limitar los artefactos y mejorar la resolución final. El promedio 2.7nm sub-tomografía del S. intacta flexneri T3SS se muestra en la Figura 7 como depositado en la EMDB (EMD-2667), que muestra la gran mejora capaces con esta técnica compared al injectisome muestra en una sola tomografía en la figura 6B.
Figura 1. Visión general esquemática de la tomografía de alto rendimiento crio-electrón. Una suspensión líquida se congela rápidamente en una rejilla EM y un conjunto de inclinación de la serie se recoge mediante un microscopio electrónico controlado por ordenador automatizado. Las micrografías resultantes se procesan automáticamente utilizando tomoauto para generar la tomografía. El último paso que aquí hay una S. segmentado minicélula flexneri de una tomografía generada por este protocolo de Hu et al. 2015 15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Diagrama de flujo del proceso de tomoauto. Un desglose del flujo de trabajo tomoauto muestra cómo se procesan los datos a partir de una colección de micrografías fraccionada en dosis hasta llegar a un promedio final sub-tomografía. Símbolos Sub-proceso detalle las tareas que tomoauto coordenadas para procesar la entrada ejecutando el software apropiado configurado. Símbolos de datos muestran la producción en general, no utilizado por el usuario, mientras que los documentos y de múltiples documentos símbolos muestran la salida realidad manejada por el usuario. Por último se muestran los símbolos muestran dónde se produce la intervención del usuario en el flujo de trabajo. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. adquisición de lotes de inclinación serie con SerialEM Navigator. Posiciones de montaje mapas se almacenan como posiciones de la etapa (que se muestra selectisucesivamente) en la lista de la ventana del navegador se muestra en el lado izquierdo de la pantalla, y el mapa actual se muestra en la ventana de amortiguación junto con los puntos seleccionados etiquetados numéricamente con una cruz roja añadido al mapa de adquisición. Puntos de adquisición se muestran por la etiqueta de la ventana del navegador y se puede configurar para adquirir el uso de la casilla "serie de inclinación". Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Efecto de movimiento de corrección en los datos fraccionada de la dosis. (A) muestra una micrografía no inclinada y sin corregir, y el movimiento de la imagen corregida (procesado por MOTIONCORR) se muestra en (B), el contraste se mejoró ligeramente después de la corrección. Mejora se puede ver más, aparentemente mirando el transf FourierORM de la micrografía antes de (C) y después (D) de corrección de movimiento. Imágenes EH muestran la misma información pero con una micrografía inclinada a 60 grados, en contraste disminuye y anillos Thon visibles en C y D ya no son visibles a gran inclinación. Barra de escala de 250 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. Resultados buenos y malos de tomoauto automatizado alineación de inclinación de la serie. (A) Una micrografía más o menos alineados no inclinada y el modelo fiducial producido automáticamente tomoauto. (B) El modelo fiducial determinado a 50 grados de inclinación. El modelo todavía le queda bien y se centra en los marcadores de referencia apropiados. (C, D) en (A, B), respectivamente, el zoom en el área de caja. Esta serie de inclinación se alineó con un error residual media de 1,06 píxeles. (E) Una micrografía no inclinada y el modelo fiducial de otra serie de inclinación y (F) la serie a 50 grados de inclinación. Aquí vemos que el modelo ha perdido el rastro de varios marcadores de referencia (en rojo) y esto es representativo de un mal seguimiento automatizado. (G, H) Muestra el modelo de (E, F), respectivamente, el zoom en el área de caja. Esta serie de inclinación se alinea con un error residual media de 3,51 píxeles y tuvo que ser procesado por alineación manual de la serie. Bar (A) Escala 500 nm (C) Barra de escala 50 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
![Figura 6]("/files/ftp_upload/53608/53608fig6.jpg")
Figura 6. Tomograma generado automáticamente por tomoauto. (A) Esto muestra una proyección de siete rebanadas del centro de la reconstrucción de la serie de inclinación que se muestra en la Figura 4A. Barra de escala de 250 nm. (B) Un zoom a la vista del área de caja en (A) que muestra una injectisome intacta. Barra de escala 100 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7. Sub-tomografía promedio de S. intacta sistema de secreción tipo III flexneri. (A) rebanada central de la sub-tomografía promedio de 2,7 nm de la S. intacta flexneri SST3 de EMDB (EMD-2667). (B) de proyección completa a lo largo deel eje X del volumen. (C) Isosuperficie prestación del volumen visto en un umbral contorno de 130 en IMOD. Barra de escala 5 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Película 1: Animación de la inclinación de la serie no alineado (clic derecho para descargar). Esta animación se ejecuta a través de la serie de inclinación recogidos inicialmente por SerialEM. Turnos Traslacional se identifican fácilmente por el camino errático de marcadores individuales fiduciales de imagen a imagen, y estos cambios junto con los defectos menos perceptibles deben ser corregidas antes de la serie de inclinación puede ser reconstruido.
![Película 2]("/files/ftp_upload/53608/53608Movie2.jpg")
Película 2: Animación del tilt-series alineadas (clic derecho para descargar). Esta animación corre a través de los mismos micrografías mostradas en Movie 1 después de la alineación automática por tomoauto. Los caminos erráticos de marcadores de referencia ahora siguen una trayectoria suave a través de la serie de inclinación, y el eje de inclinación se alinea verticalmente con respecto al espectador.
Movie 3:. Animación de la inclinación de la serie reconstruida (clic derecho para descargar) Esta animación se ejecuta a través de la tomografía muestra en la Figura 6 generada reconstrucción tras automatizado de la serie de inclinación que se muestra en la película 2 btomoauto y.
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Discussion
El alto rendimiento método descrito aquí nos permitió procesar 1,917 crio tilt-serie y producir más de 4.500 sub-tomografías del S. intacta flexneri injectisome 19. Los datos obtenidos llevaron a la caracterización detallada de en injectisome situ, incluyendo el citoplasmática de clasificación compleja. El método también se utilizó para visualizar varias células mutantes con deleción específica de los componentes de proteína putativa, que ayudó a dilucidar la composición de la plataforma de clasificación del injectisome. Nuestro método proporciona nuevas vías para investigar la relación estructura-función de la injectisome. Como resultado, el nuevo escenario estaba listo para su posterior disección de los mecanismos subyacentes a la secreción y la patogénesis T3SS mediada.
El protocolo que aquí se presenta describe alto rendimiento crio-ET de S. intacta flexneri, sino que es aplicable a cualquier proyecto adecuado para la crio-ET. Este método ha sido utilizado en la structucaracterización ral del motor flagelar de Borrelia burgdorferi 27, la infección de E. minicélulas coli por bacteriófago T7 28 y matrices quimiorreceptoras en E. coli 29. Al facilitar la colección de conjuntos de datos masivos, es posible cribar mutantes múltiples, así como una imagen de gran número de condiciones que permiten inferencias de procesos dinámicos tales como montaje de la máquina 27 y el progreso de la infección por fagos 28. Mediante la recopilación de múltiples paquetes de software y permite un control total sobre la ejecución de proceso, los usuarios son capaces de personalizar diferentes combinaciones de paquetes para obtener resultados óptimos. Chen et al. 21 publicó anteriormente con un protocolo similar que describe la recogida de datos mediante el paquete de software Leginon 12 y la automatización de procesamiento de inclinación de la serie usando IMOD 13 y 24 RAPTOR. El protocolo actual complementa este método que detalla un método alternativo para codatos llecting y procesamiento a la vez que muestra lo mucho que la tecnología y el procedimiento ha avanzado, impulsado por el mayor enfoque en alta resolución a través de sub-tomografía de promedio, con los datos fraccionada de dosis, estimación CTF automatizado y corrección, y rutinas de alineación automáticos más sólidos dentro IMOD 13. Mientras que el protocolo anterior entra en detalles visuales con énfasis en la recopilación de datos, este método se centra en los detalles del tratamiento de los datos recogidos.
Métodos de alto rendimiento permiten la recolección de datos masiva que maximizar el uso de los recursos del microscopio y el ordenador, al tiempo que limita la cantidad de intervenciones manuales de usuario tediosas que retrasar el proyecto y actuar como un importante cuello de botella. El tomoauto biblioteca envoltorio ha sido diseñado para permitir la configuración completa de todos los parámetros utilizados en cada paquete de software de una manera simple y centralizada. Una vez que una configuración adecuada se ha determinado, entonces es fácil de aplicar los ajustes a la totalidad dataset. Una mayoría de la serie de inclinación puede ser procesada con resultados aceptables (figura 4A), mientras que se requiere un subconjunto de menor importancia para ser procesados manualmente. Estos tilt-series son generalmente adquisiciones menos ideales plagados de desplazamiento excesivo de imagen, contraste pobre, o la falta de suficientes marcadores de referencia que provoca la rutina automatizada de seguimiento fiducial a fallar (Figura 4B). Para obtener los mejores tomografías posibles, extensa se debe tener cuidado en cada paso crucial de la preparación de la muestra, la adquisición de imágenes, al procesamiento de imagen.
Otros desarrollos en alto rendimiento de la crio-ET tales como la extracción automatizada de sub-tomografía por comparación de plantillas y la integración de paquetes de software de promedio sub-tomograma modernas como Dynamo en tuberías de flujo de trabajo existentes como tomoauto ahora están siendo investigados. La reciente llegada de la detección directa de cámaras de dispositivos de nueva generación ha hecho importantes mejoras en el aumento de SNR tilt-series y permitiendo more determinación CTF consistente debido a la mayor eficiencia del detector. El uso de las nuevas de oro llena de cuadrícula de tipo puede disminuir defectos de recolección de inclinación de la serie, la mejora de la tasa de éxito para el procesamiento de la inclinación de la serie automatizada y la reconstrucción con una menor necesidad de intervención manual 30. Finalmente con el uso ahora ubicua de clusters de ordenadores y unidades de procesamiento de gráficos (GPU) para paralelizar y acelerar grande de procesamiento de datos, el desarrollo de las tuberías que se utilizan estos sistemas pronto espero ser capaz de reducir el tiempo de ejecución de días a horas, proporcionando a los usuarios siendo incluso menos tiempo de inactividad entre diseño de experimentos y análisis de datos significativos al mismo tiempo aumentar el tamaño del conjunto de datos y lograr una mayor resolución.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Agradecemos al Dr. William Margolin para comentarios. Estamos muy agradecidos por el apoyo de SerialEM de los Dres. David Mastronarde y Chen Xu. DM, BH y JL fueron apoyados por Grant R01AI087946 del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas, Becas R01GM110243 y R01GM107629 del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales (NIGMS), y Grant AU-1714 de la Fundación Welch. El detector de electrones directa fue financiado por los Institutos Nacionales de la Salud Premio S10OD016279.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Tyrptic Soy Broth | Sigma-Aldrich | 22092 | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S0692 | |
| Electroporation Apparatus | Bio-rad | 165-2100 | |
| 1 mm Cuvette | BTX | 45-0124 | |
| 1.5 ml Cryogenic Tube | Thermoscientific | 5000-1020 | |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tube | Sigma-Aldrich | Z336769 | |
| Holey Carbon Grids | Quantifoil (Electron Microscopy Sciences) |
Q2100CR2 | R2/2 200 Cu |
| Glow Discharge Device | In-House | Commercial Alternative Available | |
| Vacuum Desiccator | Sigma-Aldrich | Z119016 | Used in In-House Glow Discharge Device |
| High-Frequency Generator | Electro-Technic Products | BD-10A | Used in In-House Glow Discharge Device. CAUTION: This device generates high voltages. |
| Centrifuge | |||
| Forceps | Dumont (Electron Microscopy Sciences) |
72705-D | Style 5 Anti-magnetic |
| Colliodal Gold | Aurion | BSA 10nm | |
| Filter Paper | Whatman | #2 | |
| Ethane | Matheson Tri-Gas | UN1035 | |
| Nitrogen | Matheson Tri-Gas | UN1977 | |
| Plunger Device | In-House | Commercial Alternative Available | |
| Cryogenic Grid Storage Box | Electron Microscopy Sciences | 71166-30 | |
| Transmission Electron Microscope | FEI | Tecnai Polara F30 (300 KeV) |
|
| Direct Detection Device Camera | Gatan | K2 Summit | |
| Tomogram Acquisiton Software | SerialEM | http://bio3d.colorado.eud/SerialEM Alternatives: UCSF Tomography, Leginon, FEI Batch Tomography | |
| Beam-induced Motion Correction Software | MOTIONCORR | http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.html Requires >2GB Nvidia GPU | |
| Tilt-Series Alignment Software | IMOD | http://bio3d.colorado.edu/IMOD Alternatives: XMIPP, Protomo | |
| Automatic Fiducial Marker Modelling Software | IMOD | Alternatives: RAPTOR (Included in IMOD0 (Usable in tomoauto) |
|
| CTF Determination Software | IMOD | Alternatives: CTFFIND http://grigoriefflab.janelia.org/ctf (Usable in tomoauto) |
|
| Tilt-Series Reconstruction Software | tomo3d | https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d Alternatives: IMOD, XMIPP http://xmipp.cnb.csic.es , Protomo | |
| Tilt-Series Automated Processing Software | tomoauto | https://github.com/DustinMorado/tomoauto | |
| Particle Picking Software | i3 | http://www.electrontomography.org Alternatives: IMOD | |
| Subvolume Averaging Software | i3 | Alternatives: PEET http://bio3d.colorado.edu/PEET, Dynamo https://dynamo.bioz.unibas.ch , PyTom http://pytom.org |
References
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