Abstract
Wij vestigden een endodermale epitheliale celcultuur model (EEG) voor het bestuderen van de functie van bepaalde enzymen en eiwitten in het bemiddelen nutriëntenbenutting door aviaire embryo's tijdens de ontwikkeling. Bevruchte Japanse kwartel eieren werden bij 37 ° C gedurende 5 dagen en dan dooierzak membranen (YSM) werden verzameld om de EEG-cultuur op te zetten. We isoleerden embryonale endoderm laag uit YSM, en gesneden het membraan in 2-3 mm gesneden en gedeeltelijk gedigereerd met collagenase voor het zaaien in 24-well kweekplaten. De EECS vermenigvuldigen uit het weefsel en zijn klaar voor celcultuur studies. We vonden dat de EECS had typische kenmerken van YSM in vivo, bijvoorbeeld, accumulatie van lipide druppeltjes, expressie van sterol O-acyltransferase en lipoproteïne lipase. De gedeeltelijke spijsvertering behandeling aanzienlijk toegenomen de succesvolle tarief van EEG-cultuur. Gebruik makend van de EECS, hebben we aangetoond dat de expressie van SOAT1 werd gereguleerd door de cAMP dependent proteïne kinase A gerelateerde route. Deze primaire Japanse kwartel EEG kweeksysteem is een nuttig instrument om embryonale lipide transport te bestuderen en om de rol van genen die betrokken zijn bij de bemiddeling nutriëntenbenutting in YSM tijdens aviaire embryonale ontwikkeling te verduidelijken.
Introduction
De grotere voedingswaarde bron van het aviaire embryo dooier, bestaande uit 33% lipiden, 17% eiwit en 1% as. 1 tijdens de embryonale ontwikkeling, de dooierzak membraan (YSM) groeit vanuit de embryonale buikholte en geleidelijk omvat de dooier oppervlak. Beginnend bij de embryonale dag 2, wordt genexpressie geassocieerd met de vetstofwisseling en angiogenese geleidelijk verhoogd in YSM, en de YSM ontwikkelt zich langzaam villus-achtige projecties. 8,9 Deze projecties te verhogen absorptie van dooier voedingsstoffen naar de embryonale ontwikkeling te ondersteunen. De YSM is een extra-embryonale weefsel dat drie kiem lagen, endoderm, mesoderm en ectoderm bevat. 14 De dooierzak ectoderm kijkt uit op het eiwit en banden met de vitelline membraan om voorzichtig te dekken de dooierzak. De endodermale epitheelcellen worden direct geconfronteerd met de richting van de eidooier en dienen als nutriëntenbenutting portals. 6 Zoals de YSM uitbreidt, endodermale epitheliale cellen (EECS) kan worden gedeeld door shape en functionaliteit in twee groepen, het gebied vitelline en omgeving vasculosa. 7
Area vitelline bestaat uit endodermale cellen en is ver van het embryo; gebied vasculosa bestaat uit mesodermale cellen en dekt gedifferentieerde EECS met bloedvaten en bindweefsel. Door embryonale dag 5 wordt de dooier volledig onder ectoderm en endoderm van YSM en de vasculaire gebied snel gegroeid. De YSM absorbeert, opnieuw samenstelt en releases lipiden (als-dooier afgeleid zeer low density lipoprotein) en eiwitten in de embryonale bloedsomloop. 9, 2 Daarom is een primaire Japanse kwartel embryonale endodermale epitheelcel kweeksysteem opgericht we, om de mechanismen van lipide bestuderen gebruik in YSM tijdens aviaire embryonale ontwikkeling.
Lipiden zoals triglyceriden, lecithine, fosfolipiden en cholesterol ester (CE) zijn de primaire energiebronnen voor aviaire embryo's. In de vroege stadia van ontwikkeling, dooier lipiden composed van slechts 1,3% CE en het stijgt tot 10-15% op de middellange termijn van aviaire embryonale ontwikkeling 3, is 11. Cholesterol ester gesynthetiseerd uit cholesterol door sterol O-acyltransferase 1 (SOAT1) in aviaire embryo YSM. 4
De opslag vorm van cholesterol is CE, wordt CE uitgevoerd in lipoproteïnen, en lipoproteïnen worden door het verkeer getransporteerd naar weefsels. 13 Een week voor luik is er een snelle groei van aviaire embryo's. Ongeveer 68% van de resterende inhoud lipide in de dooier wordt geabsorbeerd tijdens deze fase. 10 Het mechanisme waarmee lipiden dooier gebruikt kan worden verduidelijkt door EEG onderzoeksmodel. Een kip EEG cultuurprotocol opgericht om dit onderzoek doel te bereiken. 2, 9 Vanwege de lage slagingspercentage weefsel explantaten een verbeterde celcultuur procedure EEG nodig is om de functie van bepaalde enzymen en eiwitten te bestuderen in het mediëren nutriëntenbenutting door aviaire embryo tijdens de ontwikkeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Deze procedure is een modificatie van een kip model cultuur protocol ontwikkeld door Bauer et al 2013 en Nakazawa et al, 2011 2,9..
1. Bereid Gezonde embryonale Dag 5 embryo's uit de Japanse kwartel
- Plaats 1 mannelijke en 3 vrouwelijke geslachtsrijp Japanse kwartel samen in dezelfde kooi. Supply voer en water ad libitum. Pas het licht in het dier kamer 14 uur licht en 10 uur duisternis.
- Verzamel bevruchte eieren in plastic zakken elke dag in de middag en bewaar ze in een 16 ° C koelkast om de groei van de embryo's te vertragen.
- Na een voldoende aantal eieren te verzamelen binnen een periode van twee weken, broeden de bevruchte eieren in een 37 ° C incubator met goede ventilatie voor vijf dagen.
2. Bereid Basale Medium en Wash Solutions
- Gebruik DMEM / F-12 medium (pH 7,2) als groeimedium en aanvullenmet 10% pasgeboren kalf serum (NBCS) en 1% Pen-Strep Ampho. Oplossing (PSA, penicilline, 10 5 eenheden / l, streptomycine 100 mg / l; Amfotericine B, 0,25 mg / l).
- Bereid oplossing fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) bij een 10x concentratie voor opslag; Gebruik 1x PBS-oplossing (bevattende NaCl, 137,93 mM, KCl, 2,667 mM; KH 2PO 4, 1,471 mM; Na 2 HPO 4 -7H 2 O, 8,06 mM, op pH 7,2) te wassen en bevochtigen dooierzak membraan terwijl scheiden van het endoderm uit eidooier en albumine.
- Gebruik DMEM medium (pH 7,2) te resuspenderen endoderm pellets.
3. Inning van Primary EECS van de Japanse kwartel YSMs
- Incubeer de verzamelde eieren voor 5 dagen (stap 1,3). Onderzoek de eieren met een ei candler de normale embryonale ontwikkeling te bevestigen.
OPMERKING: Op embryonale dag 5 de grens van YSM mesoderm is duidelijk en 3 embryonale lagen minder strak tegen elkaar verbonden, zodat het gemakkelijk te obTain endoderm. Gebruik alleen de eieren met normale capillaire circulatie ontwikkeling YSM collecties. - Maak de eierschaal voorzichtig met vers water en 75% ethanol. Open de eierschaal uit de lucht cel positie door een schaar, zachtjes schil uit en verzamel de gehele YSM door pincet en plaats in een 10 cm cultuur schotel gevuld met 37 ° C 1x PBS.
- Met behulp van een schaar verwijder het embryo, dooier en eiwit, en voorzichtig wassen YSM met 1x PBS en driemaal plaats YSM in PBS oplossing in een 10 cm kweekschaal.
- Gebruik pincet en een schaar om het ectoderm van YSM verwijderen. Gebruik 2 tang, een om stevig vast te houden de endodermale cellaag, en de andere naar de capillaire mesoderm te houden.
- Onder een microscoop ontleden, uit elkaar trekken en scheiden de endoderm van de rand van het mesoderm in de richting van het embryo. Verzamel de lichtgele endoderm in 50 ml centrifugebuizen behulp van een druppelaar en plaats in 15 ml kweekmedium in een 37 ° C water bad totdat alle weefsel collecties zijn voltooid.
4. Digestie van de Endoderm Slices door Collagenase Spijsvertering
- Vers ontbinden 6,5 eenheden van type IV collagenase in 10 ml DMEM.
- Centrifugeer de 50 ml buizen (3,4) en 130 g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur. Zuig het medium en leg alle endoderm in een 6 cm cultuur schotel met een pipet. Voeg 1 ml collagenase oplossing hiervoor kweekschaal.
- Snijd de vanuit 2 kwartel embryo's met een paar gebogen schaar tot de grootte van elk segment endoderm ongeveer 2 tot 3 mm. Gebruik een pipet, verzamel alle segmenten in een 50 ml centrifugebuis met 9 ml verse collagenaseoplossing.
- Digereer het weefsel met collagenase gedurende 30 min in een 37 ° C schuddend waterbad bij 175 rpm. Deze gedeeltelijke digestie met collagenase wordt gebruikt om de proliferatie explantatie cel verbeteren.
- Centrifugeren bij 130 g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur en verwijder voorzichtig de bovenstaande fractie met een pipet. Was de pellet door de suspensie in 20 ml DMEM en verwijder de bovenstaande fractie na 130 xg centrifugeren gedurende 3 minuten.
- Resuspendeer de pellet met 12 ml groeimedium (DMEM / F12 met 10% NBCS en 1% PSA) en zaden voorzichtig en gelijkmatig in een 24-well plaat (elk putje met 500 pi celoplossing).
- Incubeer weefselexplantaten bij 37 ° C in 5% CO2 in lucht gedurende 2 dagen om cellen te laten groeien uit de weefsels.
- Incubeer cellen gedurende nog 2 dagen en karakteriseren van cellevensvatbaarheid door cellevensvatbaarheid testprotocol. 15
LET OP: Levende cellen handhaven van een reducerende omgeving in de cytosol. Resazurin, het actieve bestanddeel, is een niet-toxisch, celpermeabel verbinding die blauw van kleur en vrijwel niet-fluorescerend. Wanneer toegevoegd aan celculturen resazurin wordt gereduceerd tot Resorufin in het cytoplasma van mitochondriale enzymen. Resorufin is rood van kleur en zeer fluorescent. Levensvatbare cellen continu zetten resazurin om resorufin, Incremend de totale fluorescentie en kleur van het kweekmedium omringende cellen. - Voer endoderm epitheelcellen totale RNA-isolatie, reverse transcriptie en kwantitatieve real-time PCR van merkergen mRNA-expressie zoals beschreven. 16,17
- Gebruik reverse transcriptase PCR om mRNA te detecteren SOAT1 (sense: 5'- GAAGGGGCCTATCTGGAACG-3 '; antisense: 5'-ATCTGCACGTGACATGACCA-3'; PCR-product = 168 bp) als een specifieke marker voor EEG-cellen. Gebruik β-actine-mRNA (sense: 5'TGGTGAAGCTGTAGCCTCTC-3 '; antisense: 5'GTGATGGACTCTGGTGATGG-3'; PCR-product = 151 bp) als een housekeeping gen en interne controle.
- Gebruik gelelektroforese om de productgrootte van RT-qPCR detecteren. Bereid 1% agarose gel en meng 10 pl qPCR product met 2 pl ladingskleurstof. Load 10 pi mengsel in elk putje in de 1% agarosegel, en uitvoeren van de gel door 100V gedurende 30 minuten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met het oog op het doel van de oprichting van een consistente en bruikbare cel model te bereiken, moeten we uit te breiden en het stabiliseren van de proliferatie snelheid en prestaties van aviaire EECS. We vergeleken directe incubatie van het endoderm zonder enzymdigestie met endoderm gedeeltelijk gedigereerd met proteolytische enzymen, zoals collagenase of collagenase plus 0,6 U Dispase. Dispase een amino-endopeptidase dat het N-terminale peptide bindingen van niet-polaire aminozuurresiduen hydrolyseert. Dat protease digestie behandelingen verhoogde celproliferatie vergeleken met geen digestie (Figuur 1), celgroei was niet wezenlijk tussen de twee enzymbehandelingen na vijf dagen incubatie (Figuur 2). De collagenase behandeling resulteerde in een betere groeicurve en toonde dat EECS verspreid gestaag 6-9 dagen (figuur 2). Aldus gedeeltelijke collagenase digestie verbeterde groei van de EECSex-vivo explantaten en wordt aangeraden om voldoende en functionele EEG van de Raad te verkrijgen.
Na 4 dagen incubatie eeCS had een adipocyt-achtige verschijning waargenomen na formaline fixatie en Oil Red O-kleuring (figuur 3), wat suggereert correcte fysiologische eigenschappen van de gekweekte cellen.
Onze hypothese was dat cyclisch adenosine monofosfaat (cAMP) is een transcriptie regulerende middel, de cAMP fosfodiesterase inhibitor, 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX, om afbraak van cAMP verlagen) en de adenylcyclase activator, forskoline (synthese van cAMP verhogen) stimuleerde SOAT1 mRNA expressie na 24 uur behandeling (figuur 4). Deze behandelingen verhoogde ook de expressie van SREBP2, een cholesterolsynthese-regulerende transcriptiefactor en forskoline verhoogde de expressie van perilipin-2 (PLIN2), het oppervlakte-eiwit marker of vetdruppels (Figuur 5). EEG-mRNA profielen lipogene genen gekwantificeerd door real-time PCR lijken op adipocyten (figuur 5).
Figuur 1. Effect van partiële collagenase op endodermale epitheelcellen. Weefsel explantaten werden gedurende 2 dagen om cellen te laten groeien uit het weefsel. We waargenomen en berekende de nummers van de succes uitgegroeid EECS. Aantallen werden berekend op cellen zonder vertering en cellen gedeeltelijk gedigereerd met collagenase; beide werden gekweekt in 24-wells platen. De Y-as staat het aantal succesvol verspreid EECS in celcultuur plaat van 24 putjes. De gegevens werden weergegeven als gemiddelde ± SEM. Analyse werden bepaald door gepaarde t-test. P <0,0001. Klik hiervoor een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. De Cell Groei Prestaties van EECS na gedeeltelijke enzymdigestie. De proliferatie tarief werd gedetecteerd door de levensvatbaarheid van de cel assay. De assay bevatte Resazurin, een blauwe verbinding die een zwakke fluorescentie en resazurin is gereduceerd tot resorufine bij binnenkomst cellen. Levensvatbare cellen continu resazurin omzetten Resorufin, waardoor de totale fluorescentie en kleur van de media omringende cellen. Levensvatbare cellen werden gedetecteerd door absorptie bij 570 nm met een genormaliseerde 600 nm. De gegevens werden weergegeven als gemiddelde ± SEM. Analyse werden bepaald door twee-weg ANOVA met Bonferroni post-test (collagenase groep n = 10; collagenase + dispase groep n = 11). * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001. Gelieve click hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. De morfologie van gekweekte EECS. Na 4 dagen incubatie EECS had een adipocyte-achtige verschijning waargenomen na formaline fixatie en Oil-Rood O kleuring. Van links naar rechts: EEG's in heldere veld met 100X vergroting, in heldere veld met 200X vergroting en in 200X vergroting na kleuren met Oil-rode O en hematoxyline. De donkere vlek op de linkerkant van de uiterst linkse cijfer is het gedeeltelijk verteerde endoderm (membraan). Schaal bar vertegenwoordigt 200 urn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. De SOAT1 Transving van EECS Behandeld met cAMP Activators. We behandeld EECS met toenemende concentraties van IBMX of forskoline op dag 5 voor 24 uur. We hebben opgehaald mRNAs van behandelde cellen en het RNA omgezet in cDNA door reverse transcriptie PCR. We analyseerden transcriptieniveaus door real-time kwantitatieve PCR. β-actine werd gebruikt als huishoudgen. De gegevens werden weergegeven als gemiddelde ± SEM. Analyses waren door one-way ANOVA met Tukey's post-test (n = 6) (* p≤ 0,05, ** p≤ 0,01). IBMX is een competitieve niet-selectieve fosfodiesterase remmer die intracellulaire cAMP verhoogt, activeert PKA, remt TNF-alfa en leukotrieen synthese, vermindert de ontsteking en aangeboren immuniteit en is een niet-selectieve adenosine receptor antagonist. Forskolin is een alomtegenwoordige activator van eukaryote adenylylcyclase, vaak gebruikt om het niveau van cAMP te verhogen. Klik hier om een grotere versie van deze Figu bekijkenopnieuw.
Figuur 5. De mRNA blijken van Grown EEG voor vijf dagen, vervolgens met cAMP activators voor 24 uur. Het cDNA in figuur 4 werden gebruikt om genexpressie te analyseren door real-time kwantitatieve PCR. β-actine werd gebruikt als het huishoud-gen en diende als interne controle. De gegevens werden weergegeven als gemiddelde ± SEM. Analyses werden door eenzijdige ANOVA met Tukey's post-test (n≤ 6) behandelingen vergelijken met de controle. SREBP2, sterol regulerend element-bindend eiwit 2; LPL, lipoproteïne lipase; PLIN2, perilipin-2. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Omdat de vorige cultuur systeem slechts beperkt succes, is een betere kweeksysteem nodig. De Japanse kwartel YSM endoderm vereist een behandeling met proteolytische enzymen zoals collagenase aan de cel-cel verbindingen los te maken om betere groei in de ex-vivo explantaten te bereiken. Onze gegevens tonen aan dat het aantal cellen van gedeeltelijke digestie behandeling na zaaien gedurende 2 dagen (figuur 1) groter is dan de onverteerde weefselkweek waren. Daarom is de gedeeltelijke proteolytische digestie is een cruciale stap naar cel opbrengst van de YSM verbeteren.
De kritische wijziging in de huidige cultuur protocol is de gedeeltelijke proteolytische spijsvertering. Deze behandeling sterk verbeterde de cel opbrengst en de succesvolle koers van het verkrijgen van live-EECS. De spijsvertering tijd is zeer kritisch, omdat over-vergisting cellen uit het weefsel zal scheiden en de cellen zullen niet hechten aan de plaat, terwijl onder-vergisting resulteerde in minder cel opbrengst van deweefselexplantaten. Wij vonden dat 30 tot 40 minuten digestie toepassing van de hierboven beschreven omstandigheden optimaal.
Het huidige protocol vereist hoge technische opleiding te EECS te verkrijgen. Het tijdstip van het verzamelen van EECS is beperkt, bijvoorbeeld, we verzamelen alleen EECS op embryonale dag 5. De reden is dat als aviaire embryo's groeien, de verbindingen tussen lagen in de dooierzak membraan zijn complexer en het vermindert de succesvolle koers van het verzamelen EECS. Het protocol kan worden gebruikt om EECS vroege embryo's maar niet laat stadium embryo's te verkrijgen. Het beperkt de mogelijkheid van rechtstreekse onderzoek naar de late fase EECS.
De expressie van SOAT1 en lipoproteïne lipase, en lipide-accumulatie zijn essentiële kenmerken van de YSM 4,5,11, vooral de EECS. In de huidige studie, SOAT1, LPL en perilipin 2 (PLN2) mRNA waren sterk tot uiting in de EECS, wat suggereert dat de cultuur systeem kunnen cellen met de juiste fysiologische charact generereneristics. De huidige techniek produceerde een grote hoeveelheid primaire EECS. Toen we de vorige beschreven procedure 9 gebruikt, het slagingspercentage van EEG-cultuur was ongeveer 60% in celcultuur platen van 24-wells, terwijl het huidige protocol gegenereerd EECS op bijna 100% slagingspercentage.
Dooierzak membraan het belangrijkste weefsel eiwitten, lipiden en cholesterol uit dooier te absorberen, waardoor het functioneren voedingsstoffen brengen van dooier tot embryo tijdens de ontwikkeling. De belangrijkste enzym voor cholesterol ester vorming SOAT1. 11 Omdat SOAT1 drastisch verhoogt in de late stadia van aviaire embryonale ontwikkeling bij massale cholesterol verestering treedt op 4, gebruikten we SOAT1 mRNA expressie als marker gen voor het evalueren van de kenmerken van gekweekte EECS. We toonden aan dat deze primaire EEG kweeksysteem geproduceerd verwacht fysiologische kenmerken. Daarom kan het EEG-cultuur systeem een waardevol instrument om embryon bestuderenic lipide transport en verduidelijking van de rol van genen betrokken bij de bemiddeling nutriëntenbenutting in YSM tijdens aviaire embryonale ontwikkeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
De financiering voor de ontwikkeling van het huidige protocol is vooral gesteund door "Doel voor de Top Universiteit Plan 'van de National Taiwan University, Taiwan (subsidie ID-104R350144), evenals het ministerie van Wetenschap en Technologie van Taiwan (subsidie ID: MOST 104 -2313-B-002-039-my3). We hebben vooral dank de Center for Biotechnology van de National Taiwan University voor het verstrekken van een dier kamer en laboratoriumruimte voor de huidige studie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco by Life technologies | 12800-017 10 X 1 L | For wash the EECs pellets |
| D-MEM/F-12 | Gibco by Life technologies | 12400-024 10 X 1 L | As the basal medium in culturing EECs |
| NBCS | Gibco by Life technologies | 16010-159 | As the supplyment serum in culturing EECs |
| Pen-Strep Ampho. Solution | BI (Biological Industries) | 03-033-1B 100 ml | For attenuating the possible infection |
| Collagenase Type IV | Gibco by Life technologies | 17104-019 1 g | Collagenase is a protease with specificity for the bond between a neutral amino acid (X) and glycine in the sequence Pro-XGly-Pro. As the protease for dissociation of cells from primary tissue. |
| 24-well plate | FALCON® | REF-353047 | For EECs to attach and extension |
| 50 ml PP centrifuge tubes | Corning® CentriStarTM | 430829 | For transportion of membranes and enzyme digestion |
| 50 ml Conical bottomed Tube with Cap | PRO TECH | CT-50-PL-TW | For transportion of membranes and enzyme digestion |
| Reciprocal shaking bath | DEAGLE | SB302 | For better enzymatic digestion on membranes |
References
- Abeyrathne, E. D., Lee, H. Y., Ahn, D. U. Egg white proteins and their potential use in food processing or as nutraceutical and pharmaceutical agents--a review. Poult Sci. 92 (12), 3292-3299 (2013).
- Bauer, R., Plieschnig, J. A., Finkes, T., Riegler, B., Hermann, M., Schneider, W. J. The developing chicken yolk sac acquires nutrient transport competence by an orchestrated differentiation process of its endodermal epithelial cells. J Biol Chem. 288 (2), 1088-1098 (2013).
- Ding, S. T., Nestor, K. E., Lilburn, M. S. The concentration of different lipid classes during late embryonic development in a randombred turkey population and a subline selected for increased body weight at sixteen weeks of age. Poult Sci. 74 (2), 374-382 (1995).
- Ding, S. T., Lilburn, M. S. The developmental expression of acyl-coenzyme A: cholesterol acyltransferase in the yolk sac membrane, liver, and intestine of developing embryos and posthatch turkeys. Poult Sci. 79 (10), 1460-1464 (2000).
- Ding, S. T., Lilburn, M. S. The ontogeny of fatty acid-binding protein in turkey (Meleagridis gallopavo) intestine and yolk sac membrane during embryonic and early posthatch development. Poult Sci. 81 (7), 1065-1070 (2002).
- Kanai, M., Soji, T., Sugawara, E., Watari, N., Oguchi, H., Matsubara, M., Herbert, D. C. Participation of endodermal epithelial cells on the synthesis of plasma LDL and HDL in the chick yolk sac. Microsc Res Tech. 35 (4), 340-348 (1996).
- Mobbs, I. G., McMillan, D. B. Structure of the endodermal epithelium of the chick yolk sac during early stages of development. Am J Anat. 155 (3), 287-309 (1979).
- Mobbs, I. G., McMillan, D. B. Transport across endodermal cells of the chick yolk sac during early stages of development. Am J Anat. 160 (3), 285-308 (1981).
- Nakazawa, F., Alev, C., Jakt, L. M., Sheng, G. Yolk sac endoderm is the major source of serum proteins and lipids and is involved in the regulation of vascular integrity in early chick development. Dev Dyn. 240 (8), 2002-2010 (2011).
- Noble, R. C., Cocchi, M. Lipid metabolism and the neonatal chicken. Prog Lipid Res. 29 (2), 107-140 (1990).
- Shand, J. H., West, D. W., McCartney, R. J., Noble, R. C., Speake, B. K. The esterification of cholesterol in the yolk sac membrane of the chick embryo. Lipids. 28 (7), 621-625 (1993).
- Speier, J. S., Yadgary, L., Uni, Z., Wong, E. A. Gene expression of nutrient transporters and digestive enzymes in the yolk sac membrane and small intestine of the developing embryonic chick. Poult Sci. 91 (8), 1941-1949 (2012).
- Walzem, R. L., Hansen, R. J., Williams, D. L., Hamilton, R. L. Estrogen Induction of VLDLy Assembly in Egg-Laying Hens. J Nutr. 129 (2), 467S-472S (1999).
- Yoshizaki, N., Soga, M., Ito, Y., Mao, K. M., Sultana, F., Yonezawa, S. Two-step consumption of yolk granules during the development of quail embryos. Dev Growth Differ. 46 (3), 229-238 (2004).
- alamarBlue Cell Viability Assay Protocol. , Source: https://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/cell-profilteration-assay-protocols/cell-viability-with-alamarblue.html#4 (2008).
- Lin, H. Y., Chen, C. C., Chen, Y. J., Lin, Y. Y., Mersmann, H. J., Ding, S. T. Enhanced Amelioration of High-Fat Diet-Induced Fatty Liver by Docosahexaenoic Acid and Lysine Supplementations. Biomed Res Int. 2014 (1), 310981 (2014).
- Lin, Y. Y., et al. Adiponectin receptor 1 regulates bone formation and osteoblast differentiation by GSK-3β/β-Catenin signaling in mice. Bone. 64, 147-154 (2014).
