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Biology

स्तनधारी कोशिकाओं में नवजात डीएनए के लिए बाध्य प्रोटीन की परीक्षा BrdU चिप-खांचा-पश्चिमी तकनीक का प्रयोग

Published: January 14, 2016 doi: 10.3791/53647
Automatic Translation
1
1Department of Radiation Oncology, Department of Oncological Sciences, Huntsman Cancer Institute, University of Utah School of Medicine

Abstract

हिस्टोन deacetylases 1 और 2 (HDAC1,2) डीएनए प्रतिकृति की साइटों के लिए स्थानीय बनाना। पिछले अध्ययन में, एक चयनात्मक अवरोध करनेवाला और एक आनुवंशिक पछाड़ना प्रणाली का उपयोग कर, हम प्रतिकृति कांटा प्रगति और स्तनधारी कोशिकाओं में नवजात क्रोमेटिन रखरखाव में HDAC1,2 के लिए उपन्यास कार्यों दिखाया। इसके अतिरिक्त, हम स्लॉट दाग के साथ ब्रोमो डिऑक्सीयूरिडीन (BrdU) -labeled डीएनए के क्रोमेटिन immunoprecipitation (चिप) को जोड़ती है और पश्चिमी मात्रात्मक नवजात डीएनए के साथ जुड़े प्रोटीन या हिस्टोन संशोधन को मापने के लिए विश्लेषण करती है कि एक BrdU चिप-खांचा-पश्चिमी तकनीक का इस्तेमाल किया।

सक्रिय रूप से विभाजित कोशिकाओं HDAC1,2 चयनात्मक अवरोध करनेवाला के साथ इलाज या Hdac1 और Hdac2 के खिलाफ siRNAs के साथ ट्रांसफ़ेक्ट और उसके बाद नए संश्लेषित डीएनए thymidine अनुरूप bromodeoxyuridine (BrdU) के साथ चिह्नित किया गया गया था। कोई महत्वपूर्ण सेल चक्र गिरफ्तारी या apoptosis था जब वहाँ BrdU लेबलिंग के कारण HDAC1,2 कार्यों की हानि करने के लिए एक समय बिंदु पर किया गया था। निम्नलिखित एलBrdU हिस्टोन एसिटिलीकरण के निशान से, chromatin immunoprecipitation (चिप) या क्रोमेटिन-remodeler के साथ कोशिकाओं के abeling विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ प्रदर्शन किया गया था। BrdU लेबल इनपुट डीएनए और immunoprecipitated (या ChIPed) डीएनए तो स्लॉट दाग तकनीक का उपयोग कर एक झिल्ली पर देखा और यूवी का उपयोग कर स्थिर हो गया था। प्रत्येक स्लॉट में नवजात डीएनए की मात्रा तो मात्रात्मक एक विरोधी BrdU एंटीबॉडी के साथ पश्चिमी विश्लेषण का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया था। नए संश्लेषित डीएनए जुड़े हिस्टोन एसिटिलीकरण के निशान और क्रोमेटिन remodeler के स्तर पर HDAC1,2 कार्यों के नुकसान का असर तो नियंत्रण के नमूने के लिए इलाज के नमूनों से प्राप्त BrdU चिप संकेत सामान्य से निर्धारित किया गया था।

Introduction

दोषपूर्ण डीएनए की मरम्मत और / या डीएनए प्रतिकृति कोशिका मृत्यु को गति प्रदान कर सकते हैं जो जीनोम अस्थिरता का एक प्रमुख कारण हैं। एक एकल बिना मरम्मत के डबल कतरा तोड़ कोशिका मृत्यु 1 पैदा करने के लिए पर्याप्त है। क्रोमेटिन संगठन क्षणिक दोनों प्रतिकृति के दौरान बदल दिया है और 2,3 की मरम्मत, और इन प्रक्रियाओं अखंडता जीनोम को एक खतरे के रूप में परिणाम देगा दौरान epigenetic जानकारी बनाए रखने के लिए विफलता है। HDAC3 या HDAC1,2 समारोह के नुकसान जेनोटोक्सिक तनाव (डीएनए की क्षति) और कोशिका मृत्यु 4-9 करने के लिए अग्रणी एस चरण प्रगति, डीएनए प्रतिकृति और मरम्मत में बाधा उत्पन्न करती। इसलिए यह कैंसर की कोशिकाओं में प्रतिकृति, मरम्मत और क्रोमेटिन को बाधित और बदले में वृद्धि को रोक सकते हैं और तेजी से बढ़ रही कैंसर की कोशिकाओं में चुनिंदा कोशिका मृत्यु को उत्पन्न जो डीएनए की क्षति, पैदा करने के लिए चयनात्मक HDAC अवरोधकों का उपयोग करने के लिए एक व्यावहारिक रणनीति है।

डीएनए प्रतिकृति के दौरान, क्रोमेटिन तेजी से disassembled जाता है और फिर डीएनए दोहराव निम्नलिखित reassembled। नवनियुक्त एसवाईnthesized हिस्टोन एच 4 क्रोमेटिन पर K5 और K12 अवशेष (H4K5K12ac) और निम्नलिखित बयान पर acetylated है, वे तेजी से हिस्टोन deacetylases (HDACs) 10,11 से deacetylated कर रहे हैं। हिस्टोन deacetylation द्वारा नवजात क्रोमेटिन अखंडता को बनाए रखने के लिए कोशिकाओं की विफलता बदले में डीएनए की क्षति और कोशिका मृत्यु में परिणाम कर सकते हैं जो कांटा पतन के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। हमने हाल ही में HDAC1,2 के चुनिंदा निषेध बढ़ जाती है हिस्टोन एसिटिलीकरण (H4K5ac, H4K12ac और H4K16ac) और कम प्रतिकृति कांटा प्रगति के साथ संबद्ध है, जो नवजात क्रोमेटिन, पर SMARCA5 क्रोमेटिन remodeler गतिविधि को रोकता है पता चला है कि कांटा पतन वृद्धि हुई है और प्रतिकृति तनाव प्रेरित डीएनए की क्षति 6 वृद्धि हुई । इस प्रकार, HDAC अवरोध करनेवाला उपचार तेजी से इन कोशिकाओं चक्र के रूप में, कैंसर की कोशिकाओं में बहुत जल्दी डीएनए की क्षति और मृत्यु को ट्रिगर और एस चरण के माध्यम से कई बार पारित करने के लिए नवजात क्रोमेटिन संरचना में परिवर्तन कर सकते हैं। यह HDACs हिस्टोन एसिटिलीकरण और प्रोटीन बिंदी को विनियमित करने के लिए कैसे कार्य को समझने के लिए इसलिए महत्वपूर्ण हैएनजी स्तनधारी कोशिकाओं में डीएनए प्रतिकृति बनाए रखने के लिए।

मात्रात्मक हिस्टोन एसिटिलीकरण और डीएनए प्रतिकृति के दौरान नवजात डीएनए के साथ जुड़े SMARCA5 क्रोमेटिन remodeler की मात्रा को मापने के लिए, हम एक संशोधित चिप परख BrdU चिप-खांचा-पश्चिमी तकनीक बुलाया तैयार की। एक स्लॉट का उपयोग कर एक झिल्ली पर एक वांछित प्रोटीन या हिस्टोन संशोधन के क्रोमेटिन immunoprecipitation (चिप) के बाद, नवजात डीएनए की मात्रा BrdU लेबल चिप डीएनए के पश्चिमी विश्लेषण का उपयोग कर पता लगाया जा सकता चिप नमूने में (thymidine अनुरूप, BrdU का उपयोग लेबल) का तबादला ब्लाट तंत्र। इस तकनीक का उपयोग करना, हम H4K16ac (क्रोमेटिन पैकेजिंग में शामिल एक निशान) और ISWI परिवार के सदस्य SMARCA5 (क्रोमेटिन का श्रृंगार / एसएनएफ संबंधी मैट्रिक्स जुड़े actin निर्भर नियामक) क्रोमेटिन remodeler एस चरण कोशिकाओं में नवजात डीएनए के साथ जुड़े रहे हैं कि पता चला 6। हम यह भी नवजात H4K16ac निशान डीएनए प्रतिकृति 6 दौरान HDAC1,2 द्वारा deacetylated है कि पाया। H4K16ac रोकताISWI परिवार के सदस्य SMARCA5 12 के क्रोमेटिन remodeler गतिविधि। इसलिए, BrdU चिप-खांचा-पश्चिमी तकनीक का उपयोग करते हुए, हम डीएनए प्रतिकृति के दौरान क्रोमेटिन remodeling के विनियमन में HDAC1,2 के लिए कार्य जुड़ सकता है। इसलिए, BrdU चिप-खांचा-वेस्टर्न ब्लाट तकनीक मात्रात्मक नवजात डीएनए के लिए बाध्य कर रहे हैं कि प्रोटीन या उनके बाद translational संशोधनों के सहयोग और हदबंदी गतिशीलता को मापने के लिए एक शक्तिशाली तरीका है।

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Protocol

BrdU लेबलिंग निम्नलिखित 1. chromatin immunoprecipitation (चिप)

  1. DMSO या HDAC1,2 चयनात्मक अवरोधकों या तो की उपस्थिति में संस्कृति NIH3T3 कोशिकाओं पहले 6 वर्णित है।
  2. DMSO या HDAC1,2 चयनात्मक inhibitors के साथ उपचार के बाद, एक बाँझ टिशू कल्चर हुड में कोशिकाओं को BrdU जोड़ें। एक बाँझ 37 डिग्री सेल्सियस टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में 60 मिनट के लिए bromodeoxyuridine की एक 20 माइक्रोन के अंतिम एकाग्रता (BrdU) के साथ 10 मिलीलीटर NIH3T3 मीडिया में चढ़ाया 2 एक्स 10 6 NIH3T3 कोशिकाओं को सेते हैं।
  3. 1% की एक अंतिम एकाग्रता में संस्कृति मीडिया के लिए सीधे formaldehyde जोड़कर डीएनए को Crosslink intracellular प्रोटीन। एक प्रकार के बरतन पर 10 मिनट के लिए आरटी पर formaldehyde के साथ 2 एक्स 10 6 NIH3T3 कोशिकाओं को सेते हैं।
  4. 125 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए ग्लाइसिन के अलावा द्वारा जोड़ने पार बुझाने। एक प्रकार के बरतन पर 5 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं।
  5. मीडिया निकालें और एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में पीबीएस में कोशिकाओं को इकट्ठा। स्पिन सेल4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 956 XG पर रास। ठंडा पीबीएस के साथ दो बार सेल गोली धो लें। ट्यूब से पीबीएस निकालें। उपयोग करें जब तक -80 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस (सतह पर तैरनेवाला) के बिना पार से जुड़े सेल गोली स्टोर।
  6. 500 μl FA140 बफर जोड़कर Crosslinked सेल गोली से lysate तैयार (50 HEPES KOH का मिमी पीएच 7.5, सोडियम क्लोराइड के 140 मिमी, 1 मिमी EDTA (8.0 पीएच), 1% ट्राइटन X-100 और 0.1% सोडियम deoxycholate) protease अवरोध कॉकटेल के साथ पूरक।
  7. नमूने 35% बिजली पर और एक 15 सेकंड पल्स के साथ पांच बार, पर 0.9 सेकंड और 0.1 सेकंड से दूर स्थापित करने sonicating द्वारा क्रोमेटिन कतरनी। नमूने के ताप से बचने के लिए sonication के हर दौर के बाद बर्फ पर ट्यूबों रखें।
    1. अलग sonicators के बीच अलग अलग होंगे बाल काटना दक्षता के रूप में एक डीएनए जेल पर बाल काटना की जाँच करें। Sonication जाँच करने के लिए, 0.16 एम की एकाग्रता के लिए सोडियम क्लोराइड जोड़कर Crosslink रिवर्स और कदम 1.17.1 प्रदर्शन करते हैं। - 1.22। भागो बाल काटना है या नहीं यह जांच करने के लिए एक 1.5% agarose जेल पर 10 μl डीएनए eluted500 बीपी पर एक औसत तीव्रता के साथ बीपी 300-700 के बीच।
  8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 17,949 XG पर 10 मिनट के लिए sonication, सेंट्रीफ्यूज नमूने निम्न और एक नया ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला।
    1. निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार वाणिज्यिक प्रोटीन परख किट का उपयोग प्रोटीन अनुमान को पूरा करें। नियंत्रण और प्रयोगात्मक नमूनों की चिप के लिए lysate के बराबर राशि का उपयोग करें। आम तौर पर, चिप प्रतिक्रिया प्रति कुल lysate के 1 मिलीग्राम का उपयोग करें।
  9. Protease अवरोध कॉकटेल युक्त FA140 बफर का उपयोग प्रोटीन ए-agarose की 50% घोल तैयार करें। Protease अवरोध कॉकटेल का 1/10 मात्रा में जोड़ें। कुल में नमूनों की संख्या के आधार पर की जरूरत मोतियों की मात्रा की गणना।
    1. FA140 बफर के साथ धो एक प्रोटीन-agarose मोती दो बार भंडारण बफर हटाने और 50% घोल बनाने के लिए मोती FA140 बफर करने के लिए एक समान मात्रा में जोड़ने के लिए।
    2. गैर-विशेष रूप से मोती के लिए बाध्य है कि प्रोटीन को हटाने के एक प्रोटीन-agarose की और में 50% घोल के 50 μl जोड़ने के लिए30 मिनट के लिए एक rotisserie मिक्सर में निरंतर अंत ओवर के अंत में रोटेशन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूने cubate।
  10. एक मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 956 XG पर नमूने स्पिन। सतह पर तैरनेवाला लीजिए और 8 μl H4K16ac एंटीबॉडी या सतह पर तैरनेवाला के लिए 1 मिलीग्राम / एमएल SMARCA5 एंटीबॉडी के 5 μl (5 ग्राम) या तो जोड़कर immunoprecipitation प्रदर्शन करते हैं। एक rotisserie मिक्सर में निरंतर अंत ओवर के अंत में रोटेशन के साथ 4 डिग्री सीओ / एन पर सेते हैं।
  11. 'इनपुट' नियंत्रण के लिए निकालने के 1 / 10th बचाने के लिए और एक तरफ -20 डिग्री सेल्सियस पर यह निर्धारित किया है। इनपुट आईपी नमूने के साथ पार से जुड़े रिवर्स होने की जरूरत है।
  12. नकारात्मक नियंत्रण immunoprecipitation के नमूने के रूप में खरगोश आईजीजी के बराबर राशि (1 मिलीग्राम / एमएल के 5 μl) का प्रयोग करें।
  13. अगले दिन, निकालने के लिए 50% प्रोटीन ए-agarose घोल के 50 μl जोड़ने और रोटेशन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए सेते हैं।
  14. 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 956 XG पर centrifugation द्वारा agarose मोती गोली, ध्यान से सतह पर तैरनेवाला और वा को दूरक्रमिक रूप से निम्नलिखित buffers के साथ मोती एसएच। बफर तैयारी में, सही उपयोग करने से पहले प्रोटीज अवरोधकों जोड़ें।
    1. कम नमक इम्यून परिसर धो बफर के साथ धो (FA140, पीएच 7.5 HEPES KOH के 50 मिमी के अंतिम एकाग्रता, सोडियम क्लोराइड के 140 मिमी, 1 मिमी EDTA (8.0 पीएच), 1% ट्राइटन X-100 और 0.1% सोडियम deoxycholate की) के लिए अंत ओवर के अंत में रोटेशन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट।
    2. उच्च नमक इम्यून परिसर धो बफर के साथ धो (FA500, पीएच 7.5 HEPES KOH के 50 मिमी के अंतिम एकाग्रता, सोडियम क्लोराइड की 500 मिमी, 1 मिमी EDTA (8.0 पीएच), 1% ट्राइटन X-100 और 0.1% सोडियम deoxycholate की) के लिए अंत ओवर के अंत में रोटेशन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट।
    3. LiCl इम्यून परिसर धो बफर अंत ओवर के अंत में रोटेशन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए (Tris सीएल 8.0 पीएच, LiCl को 250 मिमी, 0.5% NP40 और 0.5% सोडियम deoxycholate 10 मिमी के अंतिम एकाग्रता) के साथ धोएं।
  15. जैसा कि ऊपर वर्णित washes के बाद, 200 μl क्षालन समाधान और incubat (1% एसडीएस और 100 मिमी सोडियम बाइकार्बोनेट के अंतिम एकाग्रता) जोड़नेआरटी पर अंत ओवर के अंत में रोटेशन के साथ 15 मिनट के लिए आरटी पर ई।
  16. आरटी पर 956 XG पर नमूने स्पिन और एक नया 1.5 मिलीलीटर ट्यूब eluate हस्तांतरण। अतिरिक्त 200 μl क्षालन समाधान के साथ कदम दोहराएँ 1.15।
  17. Eluate के 400 μl करने के लिए, 0.16 एम की एकाग्रता के लिए सोडियम क्लोराइड जोड़ सकते हैं और अच्छी तरह मिला लें।
    1. इसके अलावा, एक तरफ स्थापित किया गया था कि 10 μl इनपुट (कदम 1.11) के लिए 400 μl क्षालन समाधान जोड़ सकते हैं और साथ ही साथ Crosslink इनपुट के नमूने रिवर्स करने के लिए 0.16 एम की एकाग्रता के लिए सोडियम क्लोराइड जोड़ें। 5 घंटे के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में incubating द्वारा नमूने crosslink उल्टा।
  18. रिवर्स-Crosslinked eluate के लिए 100% EtOH के 1 मिलीलीटर जोड़ें। अच्छी तरह मिक्स और 2 के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं - 3 घंटा या -20 डिग्री सीओ / एन। 15 मिनट के लिए 17,949 XG पर नमूने स्पिन और इथेनॉल त्यागें।
  19. गोली धोने के लिए 800 μl 70% इथेनॉल जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 17,949 XG पर स्पिन और इथेनॉल त्यागें। किसी भी अवशिष्ट इथेनॉल दूर करने के लिए संक्षेप में स्पिन। 1 के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर नमूने हवा शुष्क0 मिनट अवशिष्ट इथेनॉल हटाने के लिए।
  20. 90 μl RNase में डीएनए और DNase मुक्त पानी भंग और एक 0.2 मिलीग्राम / एमएल अंतिम एकाग्रता में 2 μl 10 मिलीग्राम / एमएल RNase जोड़ें। 30 मिनट के लिए पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  21. 10 μl 10x Proteinase कश्मीर बफर (100 मिमी Tris सीएल 8.0 पीएच, 50 मिमी EDTA पीएच 8.0, 5% एसडीएस) जोड़ें। अच्छी तरह मिक्स और 1 घंटे के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर 1 μl proteinase लालकृष्ण सेते जोड़ें।
  22. निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार वाणिज्यिक पीसीआर शुद्धि किट का उपयोग इनपुट और चिप डीएनए शुद्ध और 50 μl पानी में डीएनए elute। आगे उपयोग करें जब तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर डीएनए।

2. स्लॉट चिप डीएनए का धब्बा विश्लेषण

  1. 280 पर एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग एनएम निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार कदम 1.22 में वर्णित के रूप में 50 μl पानी में eluted इनपुट और चिप डीएनए की उपज उपाय।
  2. पता लगाने के रैखिक सीमा के भीतर हैं कि इनपुट के बराबर मात्रा (50 μl) या immunoprecipitated डीएनए ले लो।
    1. उदाहरण के लिए, यदि इनपुटडीएनए उपज 1.5 एनजी / μl, तो (कुल डीएनए एनजी या 45) 30 μl ले और पानी के साथ 50 μl करने के लिए खंड बनाने के लिए है। कारक चिप के लिए, 2.1 चरण से पूरे 50 μl eluate लेने के लिए और 2.3 कदम आगे बढ़ना।
  3. 0.4 एन NaOH, संक्षेप में भंवर और 10 सेकंड के लिए 956 XG के लिए सेंट्रीफ्यूज का 2.5 मात्रा जोड़कर 50 μl इनपुट या immunoprecipitated डीएनए denature, और 30 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं।
  4. 10 सेकंड के लिए 956 XG के लिए 1 एम Tris एचसीएल के 175 μl, पीएच 6.8, भंवर, सेंट्रीफ्यूज जोड़कर विकृत डीएनए को बेअसर और बर्फ पर नमूने रखें।
  5. नीचे वर्णित के रूप में स्लॉट दाग परख के लिए एक इनपुट के सीरियल कमजोर पड़ने और immunoprecipitated डीएनए तैयार करें।
    1. कदम 2.3 का पालन करें - 350 μl की कुल नमूना मात्रा पाने के लिए 2.4 (यानी, 50 μl इनपुट / चिप डीएनए, 125 μl 0.4 एन NaOH, 175 μl 1 एम Tris एचसीएल, पीएच 6.8)।
      नोट: उदाहरण के ऊपर कहा गया है के लिए, इनपुट डीएनए के 45 एनजी 0.129 एनजी / μl खत्म किया जा रहा होगा।
    2. इनपुट डीएनए के लिए, तीन ट्यूब लेबल100, 50 और 25 और 100 μl, 50 μl और विकृत और निष्प्रभावी डीएनए नमूने के 25 μl जोड़ने के रूप में। Nuclease मुक्त पानी के साथ 100 μl अंतिम मात्रा बनाओ। चिप डीएनए, लेबल के लिए 200, 100 और 50 और 200 μl जोड़ने के रूप में तीन ट्यूबों, 100 μl और विकृत और निष्प्रभावी डीएनए नमूने के 50 μl। Nuclease मुफ्त पानी के साथ 200 μl अंतिम मात्रा बनाओ।
  6. स्लॉट दाग तंत्र के आकार को झिल्ली कट। पहले 20x एसएससी में झिल्ली और सोख्ता कागजात पूर्व गीला और डीएनए को जोड़ने से पहले। निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार स्लॉट दाग तंत्र में उन्हें इकट्ठा।
  7. उचित स्लॉट में कदम 2.5.2 से pipet डीएनए। जीटा-जांच झिल्ली पर डीएनए खींचने के लिए धीरे-धीरे निर्वात लागू करें। सभी नमूनों तंत्र के माध्यम से पारित कर दिया है के बाद वैक्यूम बंद करो।
    1. तंत्र जुदा और तुरंत एक यूवी crosslinker का उपयोग कर झिल्ली पर डीएनए स्थिर करना। यूवी crosslinker में डीएनए की ओर किया है और Au का उपयोगcrosslinker में स्थापित करने tocrosslink। निर्माता प्रोटोकॉल का पालन करें।
  8. पश्चिमी सोख्ता प्रदर्शन से स्लॉट दाग पर BrdU पता लगाने।
    1. पीबीएस में गैर वसा शुष्क दूध 5% झिल्ली के लिए एंटीबॉडी की गैर विशिष्ट बंधन को रोकने के लिए आरटी पर 1 घंटे के लिए 0.1% बीच 20 (PBST) युक्त साथ झिल्ली ब्लॉक।
    2. प्राथमिक विरोधी BrdU एंटीबॉडी (1: 500 कमजोर पड़ने) जोड़ें PBST में 1% गैर वसा शुष्क दूध में पतला और एक प्रकार के बरतन पर आरटी पर 3 घंटे के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ दाग सेते हैं। प्राथमिक एंटीबॉडी ऊष्मायन के बाद PBST के साथ तीन बार झिल्ली धो लें।
    3. दाग एचआरपी संयुग्मित विरोधी माउस माध्यमिक एंटीबॉडी जोड़ें (1: 5,000 कमजोर पड़ने) और 1 घंटे के लिए आरटी पर सेते हैं। माध्यमिक एंटीबॉडी ऊष्मायन के बाद PBST के साथ तीन बार झिल्ली धो लें।
      नोट: पूरी तरह से प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी incubations के दौरान झिल्ली को कवर करने के लिए एंटीबॉडी की पर्याप्त मात्रा का प्रयोग करें।
  9. ईसीएल मिश्रण तैयार करें और धब्बा एसी के लिए इसे जोड़नेनिर्माता प्रोटोकॉल के मुताबिक। आरटी पर 5 मिनट के लिए ईसीएल मिश्रण के साथ झिल्ली सेते हैं।
    1. एक एक्स-रे कैसेट में झिल्ली की जगह एक्स-रे फिल्म के लिए झिल्ली को बेनकाब और निर्माता प्रोटोकॉल का उपयोग कर धब्बा का विकास।
    2. निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार छवि जम्मू सॉफ्टवेयर का उपयोग कर दाग स्कैनिंग के बाद इनपुट और ChIPed डीएनए के लिए प्राप्त संकेत यों। Quantitation के लिए, माप की सटीकता सुनिश्चित करने के क्रम में पता लगाने के रैखिक सीमा के भीतर है कि संकेत का उपयोग करें।

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Representative Results

HDAC1,2 चयनात्मक अवरोधकों की विशिष्टता का निर्धारण करने के लिए, Hdac1,2 फ्लोरिडा / FL और Hdac3 फ्लोरिडा / फ्लोरिडा fibrosarcoma कोशिकाओं का इस्तेमाल किया गया था। Adenovirus युक्त Cre Recombinase (विज्ञापन सीआरई) इन कोशिकाओं में Hdac1,2 और Hdac3 नष्ट करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। Hdac1,2 फ्लोरिडा / फ्लोरिडा के निम्न विज्ञापन-CRE संक्रमण कोशिकाओं, H4K5ac में एक मजबूत वृद्धि मनाया गया। 233 या 898 के साथ Hdac1,2 पीटकर कोशिकाओं के उपचार 233 और 898 इन कोशिकाओं में Hdac1,2 और नहीं Hdac3 बाधित पुष्टि है कि H4K5ac में किसी भी आगे की वृद्धि का परिणाम नहीं था। इसके विपरीत, Hdac3 पीटकर कोशिकाओं को 233 या 898 के अलावा, इसलिए कारण Hdac1,2 के निषेध और 3 का एक परिणाम के रूप में H4K5ac स्तरों पर एक additive प्रभाव को Hdac3 पीटकर कोशिकाओं में देखा वृद्धि की तुलना में H4K5ac में उल्लेखनीय वृद्धि के परिणामस्वरूप 233 और 898 Hdac1, 2-चयनात्मक inhibitors हैं। इन परिणामों में दिखाया जाता हैचित्रा 1।

हेला कोशिकाओं में नवजात डीएनए पर PCNA लोडिंग के कैनेटीक्स को देखने के लिए BrdU चिप-स्लॉट तकनीक, BrdU पल्स चेस विश्लेषण किया गया था मान्य करने के लिए। हमारे परिणाम नवजात डीएनए के साथ PCNA एसोसिएशन 15 मिनट के भीतर तेजी से होता है और पहले प्रकाशित परिणाम 13 के साथ समझौते में एक 30 मिनट का पीछा करने के बाद गायब हो जाता है कि पता चला है। इन परिणामों चित्रा 2 में दिखाया गया है।

BrdU-H4K16ac चिप खांचा-पश्चिमी तकनीक HDAC1,2 समारोह के अभाव में नवजात डीएनए के साथ जुड़े H4K16ac की राशि का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। खरगोश आईजीजी नियंत्रण (आंकड़े 3 ए और 3 बी) की तुलना में जब नवजात डीएनए के साथ जुड़े H4K16ac में एक मजबूत संवर्धन मनाया गया। HDAC1,2 गतिविधियों या Hdac1,2 की पछाड़ना के निषेध के बाद नवजात डीएनए जुड़े H4K16ac में वृद्धि चित्रा -3 सी में दिखाया गया है 3 डी, और 3E।

नवजात डीएनए पर SMARCA5 क्रोमेटिन remodeler के स्तर BrdU-SMARCA5 चिप खांचा-पश्चिमी तकनीक का उपयोग कर निर्धारित किया गया था। हमारे परिणाम स्तनधारी कोशिकाओं में नवजात डीएनए के साथ कि SMARCA5 सहयोगियों से पता चला है। चित्रा 4 में दिखाया गया है इसके अलावा, HDAC1,2 निषेध या Hdac1,2 की पछाड़ना नवजात डीएनए जुड़े SMARCA5 क्रोमेटिन remodeler की राशि में परिवर्तन नहीं किया।

आकृति 1
HDAC1,2 चयनात्मक अवरोधकों की विशिष्टता की चित्रा 1. पुष्टि। 898 या साथ विज्ञापन-CRE संक्रमण और इलाज के बाद Hdac1 फ्लोरिडा / फ्लोरिडा Hdac2 फ्लोरिडा / फ्लोरिडा या Hdac3 फ्लोरिडा / फ्लोरिडा fibrosarcoma कोशिकाओं से तैयार पूरे सेल lysates के पश्चिमी विश्लेषण233 3 कोशिकाओं माइक्रोन 898 या 48 घंटे के विज्ञापन-CRE संक्रमण के बाद 233 24 के लिए मानव संसाधन के साथ इलाज किया गया। यह आंकड़ा हमारे पिछले प्रकाशित काम 6 से ली गई है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा हेला कोशिकाओं में नवजात डीएनए के साथ PCNA एसोसिएशन के 2. डायनेमिक्स। हेला कोशिकाओं 30 मिनट के लिए bromodeoxyuridine (BrdU) के साथ लेबल रहे थे। कोशिकाओं तो समय का संकेत दिया अवधि (चेस) के लिए BrdU के बिना अनिगमित BrdU और मीडिया में सुसंस्कृत दूर करने के लिए धोया गया। Chromatin immunoprecipitation (चिप) विरोधी proliferating सेल परमाणु प्रतिजन (PCNA) एंटीबॉडी के साथ प्रदर्शन किया गया था। इनपुट डीएनए और PCNA से जुड़े लोगों में मौजूद BrdU लेबल डीएनए एक विरोधी बीआरडी का उपयोग कर स्लॉट दाग विश्लेषण में मूल्यांकन किया गयाचित्रा 2 में दिखाया गया है यू एंटीबॉडी। यह आंकड़ा हमारे पिछले प्रकाशित काम 6 से ली गई है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
Histone Deacetylase 1 और नवजात डीएनए। (एबी) bromodeoxyuridine (BrdU) पल्स पीछा करने पर 2 बढ़ जाती है H4K16ac की चित्रा 3. घटाने संकेत समय बिंदुओं पर नवजात डीएनए के साथ H4K16ac के सहयोग से निर्धारित करने के लिए हेला और NIH3T3 कोशिकाओं में प्रदर्शन किया गया था। (सीडी) NIH3T3 कोशिकाओं DMSO या 24 घंटे के लिए एक HDAC1,2 चयनात्मक अवरोध करनेवाला (898 या 233) के साथ या तो इलाज किया गया। (ई) NIH3T3 कोशिकाओं या तो गैर-लक्ष्य (एनटी) या Hdac1,2 (H12) siRNA साथ ट्रांसफ़ेक्ट थे। (सी - ई) से कोशिकाओं BrdU के साथ लेबल और इस्तेमाल किया गयाविरोधी H4K16ac साथ चिप के लिए स्लॉट सोख्ता द्वारा पीछा किया। झिल्ली विरोधी BrdU एंटीबॉडी के साथ जांच की गई थी। नंबर देखा चिप डीएनए के उच्च और मध्यम मात्रा की औसत BrdU के संकेत की छवि जम्मू quantitation के लिए संकेत मिलता है। यह आंकड़ा हमारे पिछले प्रकाशित काम 6 से ली गई है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4 नवजात डीएनए के साथ SMARCA5 एसोसिएट्स। HDAC1,2 समारोह के नुकसान के बाद नवजात क्रोमेटिन पर SMARCA5 की राशि दिखाया गया है। NIH3T3 कोशिकाओं या तो एक HDAC1,2 चयनात्मक अवरोध करनेवाला (898) के साथ इलाज या (एनटी) गैर-लक्ष्य या Hdac1,2 (H12) siRNA साथ ट्रांसफ़ेक्ट थे। कोशिकाओं विरोधी SMARCA5 या खरगोश आईजीजी साथ उपर्युक्त उपचार और चिप निम्नलिखित BrdU (नकारात्मक ग के साथ चिह्नित किया गयाontrol) का प्रदर्शन किया गया था। चिप डीएनए की बढ़ती मात्रा स्लॉट दाग पर देखा गया था और झिल्ली विरोधी BrdU एंटीबॉडी के साथ जांच की गई थी। यह आंकड़ा हमारे पिछले प्रकाशित काम 6 से ली गई है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस पांडुलिपि में वर्णित प्रोटोकॉल नव दोहराया या नवजात डीएनए पर प्रोटीन या उनके बाद translationally संशोधित रूपों की उपस्थिति को प्रदर्शित करने के लिए एक अपेक्षाकृत जल्दी विधि है। साथ ही, इस तकनीक को एक प्रोटीन या नवजात डीएनए के साथ अपने संशोधित रूप से संघ-हदबंदी कैनेटीक्स को मापने के लिए एक परमिट। इस तकनीक को सुरुचिपूर्ण iPOND प्रौद्योगिकी 13 के लिए पूरक है। IPOND प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में, नए संश्लेषित डीएनए एथिल डिऑक्सीयूरिडीन (edu) के साथ लेबल है। एक बायोटिन रूप साधना तो क्लिक करें रसायन विज्ञान का उपयोग edu पर जोड़ा जाता है। बायोटिन टैग नवजात डीएनए तो पश्चिमी सोख्ता से पता चला रहे streptavidin मोतियों और सह-सफ़ाई प्रोटीन का उपयोग immunoprecipitated है। दूसरी ओर, हमारे BrdU चिप-खांचा-पश्चिमी तकनीक में, नवजात डीएनए के साथ जुड़े एक प्रोटीन या अपने संशोधित रूप प्रोटीन-विशेष या संशोधित रूप विशिष्ट एंटीबॉडी और करने के लिए बाध्य BrdU लेबल नवजात डीएनए की राशि का उपयोग कर immunoprecipitated है प्रोटीन वें हैएन एक विरोधी BrdU एंटीबॉडी का उपयोग खांचा-पश्चिमी सोख्ता द्वारा मात्रात्मक निर्धारित की।

विशेष ध्यान देने की जरूरत है कि इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं। यह ब्याज की एंटीबॉडी एक उच्च दक्षता के साथ मानक चिप assays में अच्छी तरह से काम करता है कि यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है। यह BrdU चिप-खांचा-पश्चिमी परख प्रदर्शन से पहले मात्रात्मक पीसीआर द्वारा चिप assays में एक एंटीबॉडी की क्षमता का परीक्षण करने के लिए महत्वपूर्ण है। सटीक होना BrdU चिप-खांचा-पश्चिमी तकनीक के quantitation के लिए आदेश में, BrdU लेबल डीएनए के एक धारावाहिक कमजोर पड़ने शुरू में करने के लिए प्रदर्शन किया जाना चाहिए स्लॉट दाग और विरोधी BrdU एंटीबॉडी का उपयोग पश्चिमी विश्लेषण करने के लिए लागू किया जाना चाहिए पता लगाने के रैखिक सीमा निर्धारित करते हैं। चिप के डीएनए एकाग्रता का निर्धारण करने और इनपुट डीएनए BrdU लेबल डीएनए की राशि पश्चिमी सोख्ता में पता लगाने के रैखिक सीमा के भीतर है कि यह सुनिश्चित करने के लिए एक सक्षम बनाता है। उदाहरण के लिए, हम 50 में होना करने के लिए इनपुट डीएनए के 12.5 एनजी एनजी चुना गयाहमारे पायलट प्रयोग में रैखिक सीमा। चिप नमूनों की एकाग्रता बहुत अधिक है इसके अलावा, अगर यह स्लॉट के प्रदर्शन से पहले चिप डीएनए कमजोर करने के लिए आवश्यक है। इस तकनीक की सीमा क्रोमेटिन कर्तन की क्षमता पर निर्भर करता है, जो अपने संकल्प है। sonication द्वारा क्रोमेटिन के बाल काटना एक दिया प्रोटीन या नए संश्लेषित डीएनए के लिए अपने संशोधित रूप से निकटता को निर्धारित करता है।

अतीत में, स्तनधारी कोशिकाओं में डीएनए प्रतिकृति के दौरान क्रोमेटिन और क्रोमेटिन संशोधित एंजाइमों में परिवर्तन का अध्ययन उचित तकनीक की अनुपलब्धता के कारण पता करने के लिए एक मुश्किल सवाल बने रहे। इसके अलावा, G1 चरण में Hdac1,2 अशक्त कोशिकाओं गिरफ्तारी के बाद से, यह एस चरण के भीतर Hdac1,2 के लिए कार्यों की जांच करने के लिए मुश्किल था। हमारे अध्ययन में, हम एस चरण और उपन्यास BrdU चिप-एस के भीतर उनकी गतिविधियों को बाधित करने के लिए पहली बार में वर्ग चयनात्मक अवरोधकों का एक संयोजन का उपयोग डीएनए प्रतिकृति के दौरान इन दो Hdacs के लिए कार्यों को दिखायाबहुत-पश्चिमी तकनीक। भविष्य में, इस तकनीक को भी दोराहे पर हिस्टोन संशोधनों और क्रोमेटिन संशोधित एंजाइम अध्ययन करने के अलावा ठप दोराहे पर डीएनए की क्षति की प्रतिक्रिया और डीएनए की मरम्मत प्रोटीन की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अलावा, इस तकनीक माउस NIH3T3 कोशिकाओं तक सीमित नहीं है। इस तकनीक को सफलतापूर्वक एंजाइम या प्रोटीन के अन्य अवरोधकों प्रतिकृति दोराहे पर डीएनए प्रतिकृति और प्रतिकृति तनाव प्रेरित क्रोमेटिन परिवर्तन को प्रभावित कैसे जांच के क्रम में अन्य सेल लाइनों में इस्तेमाल किया जा सकता है।

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Acknowledgments

इस पांडुलिपि में काम विकिरण कैंसर विभाग और व्याध कैंसर संस्थान और एस.बी. स्वास्थ्य अनुदान के राष्ट्रीय संस्थान (R01-CA188520) से धन के द्वारा समर्थित किया गया था। मैं प्रोटोकॉल का प्रदर्शन और इसके लाभों को समझाने के लिए अपनी प्रयोगशाला में डेनिएल जॉनसन और स्टीवन बेनेट धन्यवाद। मैं पांडुलिपि पर आलोचनात्मक टिप्पणियों के लिए डॉ महेश चंद्रशेखरन (व्याध कैंसर संस्थान) का आभारी हूं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-BrdU (westerns) BD Biosciences B555627
Anti-SMARCA5 Abcam ab3749
Anti-H4K16ac Active Motif 39167
Zeta-Probe GT Membrane Bio-Rad 162-0197
Formaldehyde Fisher BP531-500
Protein A agarose Millipore 16-156
Rnase A Qiagen 19101
Proteinase K Sigma P4850
PCR Purification Kit Qiagen 28106
Glycine Sigma G7403
Protease inhibitor cocktail Roche 11836170001
BrdU Sigma B9285
Rabbit IgG  Millipore 12-370
HEPES Sigma H3375
NaCl Sigma S-3014
Triton-X-100 Sigma 93443
NP40 USB Corporation 19628
Sodium deoxycholate Sigma D6750
Sodium bicarbonate Sigma S-4019
Ethanol Decon Laboratories 04-355-222
DEPC-treated water Sigma 95284
Tris Fisher BP-152-5
EDTA Invitrogen 15575-020
SDS Ambion AM9820
Sodium hydroxide Mallinckrodt GenAR  MAL7772-06
20x SSC Life Technologies 15557-036
Non-fat dry milk Lab Scientific Inc M0841
ECL Thermo Fisher 80196
X-ray film Genesee Sci 30-101
Developer Konica Minolta SRX-101A
UV Crosslinker Stratagene XLE-1000
Sonicator Branson Sonifier  Digital Ultrasonic Cell Disruptor Model: 450
Centrifuge Eppendorf Model: 5810R
Water bath Fisher Scientific Isotemp Model: 2322
NanoDrop 1000 spectrophotometer ThermoScientific Model: 1000
Slot Blot apparatus  Schleicher and Schuell Minifold II 44-27570
Tissue Culture Incubator Thermo Scientific Series II 3110 Water-Jacketed CO2 Incubators

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References

  1. Podhorecka, M., Skladanowski, A., Bozko, P. H2AX Phosphorylation: Its Role in DNA Damage Response and Cancer Therapy. J nucleic acids. , (2010).
  2. Groth, A., Rocha, W., Verreault, A., Almouzni, G. Chromatin challenges during DNA replication and repair. 128, 721-733 (2007).
  3. Demeret, C., Vassetzky, Y., Mechali, M. Chromatin remodelling and DNA replication: from nucleosomes to loop domains. Oncogene. 20, 3086-3093 (2001).
  4. Bhaskara, S., et al. Deletion of histone deacetylase 3 reveals critical roles in S phase progression and DNA damage control. Mol Cell. 30, 61-72 (2008).
  5. Bhaskara, S., Hiebert, S. W. Role for histone deacetylase 3 in maintenance of genome stability. Cell Cycle. 10, 727-728 (2011).
  6. Bhaskara, S., et al. Histone deacetylases 1 and 2 maintain S-phase chromatin and DNA replication fork progression. Epigenetics Chromatin. 6, 27 (2013).
  7. Bhaskara, S., et al. Hdac3 is essential for the maintenance of chromatin structure and genome stability. Cancer Cell. 18, 436-447 (2010).
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  10. Taddei, A., Roche, D., Sibarita, J. B., Turner, B. M., Almouzni, G. Duplication and maintenance of heterochromatin domains. J Cell Biol. 147, 1153-1166 (1999).
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  12. Clapier, C. R., Cairns, B. R. Regulation of ISWI involves inhibitory modules antagonized by nucleosomal epitopes. Nature. 492, 280-284 (2012).
  13. Sirbu, B. M., et al. Analysis of protein dynamics at active, stalled, and collapsed replication forks. Genes Dev. 25, 1320-1327 (2011).

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आण्विक जीवविज्ञान अंक 107 HDAC1,2 नवजात डीएनए डीएनए प्रतिकृति जीनोम स्थिरता chromatin immunoprecipitation कर्क BrdU स्लॉट दाग histones क्रोमेटिन remodeler और HDAC अवरोधकों
स्तनधारी कोशिकाओं में नवजात डीएनए के लिए बाध्य प्रोटीन की परीक्षा BrdU चिप-खांचा-पश्चिमी तकनीक का प्रयोग
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Bhaskara, S. Examination of Proteins … More

Bhaskara, S. Examination of Proteins Bound to Nascent DNA in Mammalian Cells Using BrdU-ChIP-Slot-Western Technique. J. Vis. Exp. (107), e53647, doi:10.3791/53647 (2016).

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