Abstract
Histondeacetylase 1 en 2 (HDAC1,2) lokaliseren op de plaatsen van DNA-replicatie. In het vorige onderzoek met behulp van een selectieve remmer en een genetisch knockdown systeem, toonden wij nieuwe functies HDAC1,2 in replicatievork progressie en ontluikende chromatine onderhoud in zoogdiercellen. Daarnaast gebruikten we een BrdU-ChIP-Slot-westerse techniek die chromatine immunoprecipitatie (ChIP) van broom-deoxyuridine (BrdU) -gemerkte DNA combineert met slot blot en westerse analyses kwantitatief eiwitten of histonmodificatie geassocieerd met ontluikende DNA meten.
Actief delende cellen werden behandeld met HDAC1,2 selectieve remmer of getransfecteerd met siRNA tegen HDAC1 en HDAC2 en nieuw gesynthetiseerde DNA werd gemerkt met thymidine analoge broomdeoxyuridine (BrdU). De BrdU labeling werd uitgevoerd op een tijdstip waarop er geen significant celcyclus of apoptose door het verlies van HDAC1,2 functies. Volgende lAbeling van cellen met BrdU, chromatine immunoprecipitatie (ChIP) van histonacetylering merken of de chromatine-remodeler werd uitgevoerd met specifieke antilichamen. BrdU-gelabelde DNA ingang en immunogeprecipiteerd (of chiped) DNA werd vervolgens door aanstippen op een membraan met het slot blot-techniek en geïmmobiliseerd met UV. De hoeveelheid DNA in elke ontluikende slot werd vervolgens kwantitatief bepaald met behulp van Western-analyse met een anti-BrdU-antilichaam. Het effect van het verlies van HDAC1,2 functies op het niveau van nieuw gesynthetiseerde DNA-geassocieerde histonacetylering merken en chromatine remodeler werd vervolgens bepaald door het normaliseren van de BrdU-ChIP signaal afkomstig van behandelde monsters naar de controlemonsters.
Introduction
Defecte DNA herstel en / of DNA-replicatie zijn een belangrijke oorzaak van instabiliteit van het genoom, die celdood kunnen veroorzaken. Een enkele unrepaired double strand break voldoende is om celdood te 1 veroorzaken. Chromatine organisatie transient gewijzigd tijdens zowel de replicatie en reparatie 2,3 en niet epigenetische informatie behouden tijdens deze processen leidt tot een bedreiging voor de integriteit genoom. Verlies van HDAC3 of HDAC1,2 functie belemmert de S-fase progressie, DNA-replicatie en reparatie leidt tot genotoxische stress (DNA schade) en celdood 4-9. Daarom is een praktische strategie om selectieve HDAC inhibitoren replicatie, reparatie en chromatine verstoren kankercellen en DNA-schade veroorzaken, wat weer kan stoppen de groei en celdood selectief snel groeiende kankercellen.
Tijdens de DNA-replicatie, wordt chromatine snel gedemonteerd en daarna weer in elkaar gezet na DNA-duplicatie. Nieuw synthesized histon H4 wordt geacetyleerd op K5 en K12 residuen (H4K5K12ac) en na depositie op chromatine, zijn ze snel gedeacetyleerd door histondeacetylasen (HDAC) 10,11. Niet-cellen ontluikende chromatine integriteit van histondeacetylering handhaven kan leiden tot splitsing instorten, wat weer kan leiden tot DNA-schade en celdood. We hebben onlangs bleek dat de selectieve remming van HDAC1,2 verhoogt histonacetylering (H4K5ac, H4K12ac en H4K16ac) en remt SMARCA5 chromatine remodeler activiteit op ontluikende chromatine, die correleert met verminderde progressie replicatievork, verhoogde vork instorting en verhoogde replicatie stress-geïnduceerde DNA-schade 6 . Aldus kunnen HDAC remmer ontluikende chromatinestructuur te veranderen op DNA-schade en de dood veroorzaken zeer snel in kankercellen, omdat deze cellen snel cyclus en langs vele malen via de S-fase. Daarom is het belangrijk om te begrijpen hoe HDACs functie om histonacetylering en eiwitten bindi regulerenng DNA replicatie in zoogdiercellen te handhaven.
Om kwantitatief de hoeveelheid histonacetylering en SMARCA5 chromatine remodeler geassocieerd met ontluikende DNA tijdens de DNA-replicatie te meten, hebben we bedacht een aangepaste chip test genaamd de BrdU-ChIP-Slot-westerse techniek. Na chromatine immunoprecipitatie (ChIP) van een gewenst proteïne of histonmodificatie de hoeveelheid ontluikende DNA (geëtiketteerd met thymidine analoog BrdU) in het ChIP monster kan worden gedetecteerd met Western analyse van BrdU gelabelde ChIP DNA overgebracht op een membraan met behulp van een Groef Blot apparaat. Met deze techniek hebben we aangetoond dat H4K16ac (een markering die deze chromatine verpakking) en ISWI familielid SMARCA5 (SWI / SNF gerelateerde matrix geassocieerde actine afhankelijke regulator van chromatine) chromatine remodeler geassocieerd met ontluikende DNA in S-fasecellen 6. We vonden ook dat de ontluikende H4K16ac merk wordt gedeacetyleerd door HDAC1,2 tijdens de DNA-replicatie 6. H4K16ac remtchromatine remodeler activiteit van het ISWI familielid SMARCA5 12. Vandaar dat het gebruik van de BrdU-CHIP-Slot-Westerse techniek konden we de functies voor HDAC1,2 bij het reguleren van chromatine remodeling tijdens de DNA-replicatie te sluiten. Vandaar dat de BrdU-ChIP-Slot-Western Blot techniek is een krachtige aanpak van de associatie en dissociatie dynamiek van eiwitten of hun post-translationele modificaties die zijn gebonden aan ontluikende DNA kwantitatief te meten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Chromatine immunoprecipitatie (ChIP) na BrdU Labeling
- Kweek NIH3T3-cellen in de aanwezigheid van ofwel DMSO of HDAC1,2-selectieve inhibitors zoals eerder 6 beschreven.
- Na behandeling met DMSO of HDAC1,2 selectieve remmers, voeg BrdU aan de cellen in een steriele weefselkweek kap. Incubeer 2 x 10 6 NIH3T3-cellen uitgeplaat in 10 ml NIH3T3 media met een 20 pM eindconcentratie van broomdeoxyuridine (BrdU) gedurende 60 min in een steriele 37 ° C weefselkweek incubator.
- Crosslink intracellulaire eiwitten aan DNA door formaldehyde direct toevoegen aan het kweekmedium in een eindconcentratie van 1%. Incubeer 2 x 10 6 NIH3T3 cellen met formaldehyde bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten op een schudapparaat.
- Blus de verknoping door toevoeging van glycine tot een uiteindelijke concentratie van 125 mM. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten op een shaker.
- Verwijder het medium en cellen in PBS te verzamelen in een 15 ml centrifugebuis. Spin CELls bij 956 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Was de celpellet tweemaal met ijskoude PBS. Verwijder PBS uit de tube. Bewaar de verknoopte celpellet zonder PBS (het supernatans) bij -80 ° C tot gebruik.
- Bereid het lysaat van de verknoopte celpellet door toevoeging van 500 pi FA140 buffer (50 mM HEPES KOH pH 7,5, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA (pH 8,0), 1% Triton-X-100 en 0,1% natriumdeoxycholaat) aangevuld met protease inhibitor cocktail.
- Shear het chromatine door sonicating de monsters vijf keer bij 35% vermogen en met een 15 sec puls, 0,9 seconde aan en 0,1 seconde uit-instelling. Houd de buisjes op ijs na elke ronde van sonicatie verwarming van de monsters te voorkomen.
- Controleer de afschuiving op een DNA gel de afschuiving efficiëntie varieert tussen verschillende sonicators. Om sonicatie controleren, reverse verknoping door het toevoegen van NaCl tot een concentratie van 0,16 M en stappen 1.17.1 voeren. - 1.22. Run geëlueerde 10 pl DNA op een 1,5% agarose gel om te controleren of de afschuiving istussen 300 - 700 bp met een gemiddelde intensiteit van 500 bp.
- Na sonicatie, centrifuge monsters gedurende 10 min bij 17.949 xg bij 4 ° C en breng het supernatans naar een nieuwe buis.
- Voer eiwit schatting met de commerciële eiwit assay kit volgens protocol van de fabrikant. Gebruik gelijke hoeveelheid lysaat voor de chip van de controle en experimentele monsters. In het algemeen, gebruik 1 mg totaal lysaat per chip reactie.
- Bereid 50% suspensie van proteïne A-agarose gebruikt FA140 buffer bevattende proteaseremmer cocktail. Voeg 1/10 volume van de proteaseremmer cocktail. Bereken het volume kralen nodig op basis van het aantal monsters in totaal.
- Wash Proteïne A-agarose kralen met FA140 buffer tweemaal de opslagbuffer verwijderen en een gelijk volume aan FA140 buffer om de kralen tot 50% slurry te maken.
- Eiwitten die niet-specifiek binden aan de kralen te verwijderen, voeg 50 ul van 50% suspensie van proteïne A-agarose en incubate de monsters bij 4 ° C onder constant end-over-end rotatie in een rotisserie menger gedurende 30 min.
- Spin de monsters bij 956 xg bij 4 ° C gedurende een minuut. Verzamel de bovenstaande vloeistof en uitvoeren immunoprecipitatie door toevoeging ofwel 8 pl H4K16ac antilichaam of 5 ui (5 ug) van 1 mg / ml SMARCA5 antilichaam aan het supernatant. Incubeer bij 4 ° CO / N met een constante end-over-end rotatie in een rotisserie mixer.
- Opslaan 1 / 10e van het extract voor 'input' controle en instellen als terzijde bij -20 ° C. De ingang heeft reverse verknoopt met de IP samples worden.
- Met evenveel konijnen IgG (5 ui 1 mg / ml) als negatieve controle immunoprecipitatie monster.
- De volgende dag, toevoegen van 50 pl 50% proteïne A-agarose slurrie aan het extract en incubeer gedurende 1 uur bij 4 ° C met rotatie.
- Pellet agarose korrels door centrifugatie bij 956 xg gedurende 2 min bij 4 ° C, verwijder het supernatant en wash de kralen met de volgende buffers sequentieel. In buffer preparaten voeg proteaseremmers vlak voor gebruik.
- Wassen met laag zout immuuncomplex Wash Buffer (FA140; eindconcentratie van 50 mM HEPES KOH pH 7,5, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA (pH 8,0), 1% Triton-X-100 en 0,1% natrium deoxycholaat) voor 5 min bij 4 ° C met eind-over-eind rotatie.
- Wassen met High Salt immuuncomplex Wash Buffer (FA500; eindconcentratie van 50 mM HEPES KOH pH 7,5, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA (pH 8,0), 1% Triton-X-100 en 0,1% natrium deoxycholaat) voor 5 min bij 4 ° C met eind-over-eind rotatie.
- Wassen met LiCl immuuncomplex Wash Buffer (eindconcentratie van 10 mM Tris-Cl pH 8,0, 250 mM LiCl, 0,5% NP40 en 0,5% natrium deoxycholaat) gedurende 5 min bij 4 ° C met eind-over-eind rotatie.
- Na wassen zoals hierboven beschreven, voeg 200 ul elutieoplossing (eindconcentratie van 1% SDS en 100 mM natriumbicarbonaat) en incubate bij KT gedurende 15 min met end-over-end rotatie bij kamertemperatuur.
- Spin de monsters bij 956 xg bij kamertemperatuur en breng het eluaat om een nieuwe 1,5 ml buis. Herhaal stap 1,15 bijkomende 200 pl elutieoplossing.
- Aan 400 pl van het eluaat, voeg NaCl tot een concentratie van 0,16 M en meng.
- Bovendien, voeg 400 ul elutieoplossing tot 10 gl ingang die is vernietigd (stap 1,11) en voeg NaCl tot een concentratie van 0,16 M tot verknopen ingangsmonsters omgekeerde ook. Omgekeerde verknopen de monsters door incubatie bij 65 ° C waterbad gedurende 5 uur.
- Voeg 1 ml 100% EtOH omgekeerd-verknoopte eluaat. Goed mengen en incuberen bij -80 ° C gedurende 2 - 3 uur of bij -20 ° CO / N. Spin de monsters bij 17.949 g gedurende 15 min en gooi ethanol.
- Voeg 800 ui 70% ethanol om de pellet te wassen. Spin bij 17.949 xg gedurende 15 min bij 4 ° C en werp ethanol. Spin kort om alle resterende ethanol te verwijderen. Lucht-drogen van de monsters bij 37 ° C gedurende 10 min om achtergebleven ethanol te verwijderen.
- Los DNA in 90 pl RNase en DNase-vrij water en voeg 2 ul 10 mg / ml RNase in een 0,2 mg / ml eindconcentratie. Incubeer bij 37 ° C in een waterbad gedurende 30 min.
- Voeg 10 ul 10x Proteinase K Buffer (100 mM Tris-Cl pH 8,0, 50 mM EDTA pH 8,0, 5% SDS). Meng goed en voeg 1 pl proteïnase K. Incubeer bij 42 ° C gedurende 1 uur.
- Zuiver ingang en ChIP DNA met commerciële PCR zuivering kit volgens het protocol van de fabrikant en elueer DNA in 50 pl water. WINKEL DNA bij -20 ° C tot verder gebruik.
2. Slot Blot analyse van ChIP DNA
- Meet de opbrengst invoer- en ChIP DNA geëlueerd in 50 pi water zoals beschreven in stap 1,22 met behulp van een spectrofotometer bij 280 nm volgens het protocol van de fabrikant.
- Neem gelijke volumes (50 pl) van ingang of immunologisch neergeslagen DNA die binnen het lineaire traject van detectie.
- Bijvoorbeeld, als ingangDNA-opbrengst is 1,5 ng / ul, vervolgens 30 ul (of 45 ng totaal DNA) en maak het volume tot 50 pi met water. Voor factor ChIP, neem de volledige 50 ul eluaat van stap 2.1 en ga verder met stap 2.3.
- Denatureren 50 gl input of immunologisch neergeslagen DNA door het toevoegen van 2,5 volumina 0,4 N NaOH kort vortex en centrifugeer 956 xg gedurende 10 sec, en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 30 min.
- Neutraliseer het gedenatureerde DNA door het toevoegen van 175 ui 1 M Tris-HCl, pH 6,8, vortex, centrifugeer 956 xg gedurende 10 seconden en zet de monsters op ijs.
- Bereid een seriële verdunning van input en immunologisch neergeslagen DNA voor de Slot Blot analyse zoals hieronder beschreven.
- Volg stap 2,3 - 2,4 op een totaal monstervolume van 350 pi te krijgen (dat wil zeggen 50 ul Input / ChIP DNA, 125 ui 0,4 N NaOH, 175 ui 1 M Tris-HCl, pH 6,8).
Opmerking: Voor boven de instantie aangegeven, zal 45 ng ingang DNA uiteindelijk 0,129 ng / ul. - Voor input DNA, label drie buiss en 100, 50 en 25 en voeg 100 ul, 50 ul en 25 ul van het gedenatureerde en geneutraliseerde DNA monster. Maak de uiteindelijke volume tot 100 ul met nuclease-vrij water. Voor ChIP DNA, label drie buizen 200, 100 en 50 en voeg 200 ul, 100 pi en 50 pi van het gedenatureerde en geneutraliseerde DNA-monster. Maak uiteindelijke volume tot 200 ul met nuclease gratis water.
- Volg stap 2,3 - 2,4 op een totaal monstervolume van 350 pi te krijgen (dat wil zeggen 50 ul Input / ChIP DNA, 125 ui 0,4 N NaOH, 175 ui 1 M Tris-HCl, pH 6,8).
- Knip het membraan om de grootte van het Slot Blot inrichting. Pre-nat het membraan en blotting papers in 20x SSC vóór en voorafgaand aan het toevoegen DNA. Monteer ze in de sleuf Blot volgens protocol van de fabrikant.
- Pipet DNA uit stap 2.5.2 in de juiste sleuven. Breng vacuüm langzaam aan het DNA op de zeta-probe membraan trekken. Stop vacuüm nadat alle monsters door de apparatuur geleid.
- Demonteer de inrichting onmiddellijk immobiliseren van het DNA op het membraan met UV crosslinker. Hebben de DNA-kant naar boven in het UV crosslinker en het gebruik van de autocrosslink instelling in het verknopingsmiddel. Volg protocol van de fabrikant.
- Detecteren BrdU het slot blot door het uitvoeren van western blotting.
- Blokkeer het membraan met 5% vetvrije droge melk in PBS met 0,1% Tween-20 (PBST) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur werd het niet-specifieke binding van antilichamen aan het membraan voorkomen.
- Add primaire anti-BrdU-antilichaam (1: 500 verdunning) verdund in 1% niet-vette droge melk in PBST en incubeer de blot met het primaire antilichaam gedurende 3 uur bij kamertemperatuur op een shaker. Was het membraan met PBST driemaal na het primaire antilichaam incubatie.
- Add HRP-geconjugeerd anti-muis secundair antilichaam aan de blot (1: 5000 verdunning) en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Was het membraan met PBST driemaal na het secundaire antilichaam incubatie.
OPMERKING: Gebruik voldoende volume van de antilichamen volledig te bedekken het membraan tijdens de primaire en secundaire antilichaam incubaties.
- Bereid de ECL mix en voeg deze toe aan de vlek acgens het protocol van de fabrikant. Incubeer het membraan met ECL mengsel gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Plaats het membraan in een röntgencassette, het membraan naar de röntgenfilm bloot te stellen en te ontwikkelen met behulp blot protocol van de fabrikant.
- Kwantificeren van het verkregen signaal voor invoer en chiped DNA na het scannen van de blots met de Image J software volgens het protocol van de fabrikant. Voor kwantificering gebruikt het signaal dat binnen het lineaire traject van detectie teneinde de nauwkeurigheid van de meting te waarborgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om de specificiteit van HDAC1,2-selectieve remmers te bepalen, werden Hdac1,2 FL / FL en Hdac3 FL / FL fibrosarcoomcellen gebruikt. Adenovirus-bevattende Cre recombinase (Ad-Cre) werd gebruikt om Hdac1,2 en Hdac3 verwijderen in deze cellen. Volgende Ad-Cre infectie van Hdac1,2 FL / FL cellen, een robuuste toename H4K5ac waargenomen. Behandeling van Hdac1,2 knockout cellen met 233 of 898 leidde niet tot een verdere verhoging van H4K5ac bevestigd dat 233 en 898 remmen Hdac1,2 en niet Hdac3 in deze cellen. Daarentegen toevoeging van 233 of 898 tot Hdac3 knockout-cellen resulteerde in een significante toename H4K5ac vergelijking met de stijging waargenomen bij Hdac3 knockout cellen als gevolg van een additief effect op H4K5ac niveau als gevolg van remming van Hdac1,2 en 3. Vandaar 233 en 898 zijn HDAC1, 2-selectieve remmers. Deze resultaten worden getoond inFiguur 1.
Valideren de BrdU-ChIP-Slot techniek BrdU pulse-chase analyse werd uitgevoerd om te kijken naar de kinetiek van PCNA laden op de ontluikende DNA in HeLa-cellen. Onze resultaten toonden aan dat PCNA associatie met ontluikende DNA gebeurt snel binnen 15 min en verdwijnt na 30 min achtervolging in overeenstemming met eerder gepubliceerde resultaten 13. Deze resultaten worden getoond in Figuur 2.
BrdU-H4K16ac ChIP-Slot-Western techniek werd gebruikt om de hoeveelheid H4K16ac geassocieerd met ontluikende DNA in de afwezigheid van HDAC1,2 functioneren. Een robuuste verrijking H4K16ac geassocieerd met ontluikende DNA werd waargenomen in vergelijking met de konijnen-IgG controle (Figuren 3A en 3B). De toename van ontluikende DNA-geassocieerde H4K16ac na remming van HDAC1,2 activiteiten of knockdown van Hdac1,2 wordt getoond in figuur 3C 3D en 3E.
Het niveau van SMARCA5 chromatine remodeler op ontluikende DNA werd bepaald met behulp van BrdU-SMARCA5 ChIP-Slot-westerse techniek. Onze resultaten toonden dat SMARCA5 associeert met ontluikende DNA in zoogdiercellen. Bovendien HDAC1,2 remming of knockdown van Hdac1,2 niet de hoeveelheid ontluikende DNA-geassocieerde SMARCA5 chromatine remodeler veranderen zoals getoond in figuur 4.
Figuur 1. Bevestiging van de specificiteit van HDAC1,2-selectieve remmers. Western-analyse van hele cellysaten bereid uit HDAC1 FL / FL HDAC2 FL / FL of Hdac3 FL / FL fibrosarcoomcellen volgende Ad-Cre infectie en de behandeling met 898 of233. Cellen werden behandeld met 3 uM 898 of 233 voor 24 uur na een 48 hr Ad-Cre infectie. Dit cijfer is afkomstig van onze eerdere gepubliceerde werk 6. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Dynamica van PCNA associatie met de opkomende DNA in HeLa cellen. HeLa-cellen werden gemerkt met broomdeoxyuridine (BrdU) gedurende 30 min. Cellen werden vervolgens gewassen om zonder rechtspersoonlijkheid BrdU en gekweekt in de media te verwijderen zonder BrdU voor de aangegeven tijd (chase). Chromatine immunoprecipitatie (ChIP) werd uitgevoerd met anti-prolifererende cel nucleair antigen (PCNA) antilichamen. BrdU gemerkte DNA aanwezig in de ingezette DNA en die in verband met PCNA beoordeeld bij slot blot analyse met een anti-BrdU antilichaam zoals weergegeven in figuur 2. Dit cijfer is afgeleid van onze eerdere gepubliceerde werk 6. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Verlies van histondeacetylase 1 en 2 Verhoogt H4K16ac op ontluikende DNA. (AB) Bromodeoxyuridine (BrdU) pulse chase werd uitgevoerd in HeLa en NIH3T3 cellen associatie van H4K16ac bepalen met ontluikende DNA op de aangegeven tijdstippen. (CD) NIH3T3-cellen werden behandeld met DMSO of HDAC1,2-selectieve remmer (898 of 233) voor 24 uur. (E) NIH3T3-cellen werden getransfecteerd ofwel met niet-targeting (NT) of Hdac1,2 (H12) siRNA. Cellen van (C - E) werden gelabeld met BrdU en gebruiktevoor ChIP met anti-H4K16ac gevolgd door Slot blot. Het membraan werd gehybridiseerd met anti-BrdU-antilichaam. Getallen geven met Afbeelding J kwantificering van de gemiddelde BrdU signaal van hoge en middelgrote omvang van ChIP DNA gespot. Dit cijfer is afkomstig van onze eerdere gepubliceerde werk 6. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. SMARCA5 Associates met ontluikende DNA. De hoeveelheid SMARCA5 op ontluikende chromatine na verlies van HDAC1,2 functie wordt getoond. NIH3T3-cellen werden ofwel behandeld met een HDAC1,2-selectieve remmer (898) of getransfecteerd met niet-targeting (NT) of Hdac1,2 (H12) siRNA. Cellen werden gelabeld met BrdU na de bovengenoemde behandelingen en ChIP met anti-SMARCA5 of konijn IgG (negatieve control) werd uitgevoerd. Toenemende hoeveelheden ChIP DNA werd gespot op het slot blot en het membraan werd gehybridiseerd met anti-BrdU-antilichaam. Dit cijfer is afkomstig van onze eerdere gepubliceerde werk 6. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De in dit manuscript beschreven protocol is een relatief snelle methode om de aanwezigheid van eiwitten of hun post-translationeel gemodificeerde vormen van nieuw gerepliceerd of ontluikende DNA tonen. Bovendien, deze techniek maakt het mogelijk een aan de vereniging-dissociatie kinetiek van een eiwit of zijn gemodificeerde vorm met ontluikende DNA meten. Deze techniek is een aanvulling op de elegante iPOND technologie 13. In de iPOND technologie, is nieuw gesynthetiseerde DNA gelabeld met ethyl deoxyuridine (EDU). Een biotine conjugaat wordt daarna toegevoegd aan Edu met de klik chemie. Biotine gelabeld ontluikende DNA wordt vervolgens immunologisch neergeslagen met behulp streptavidineparels en medezuiverende eiwitten worden gedetecteerd door western blotting. Anderzijds, in onze BrdU-ChIP-Slot-Western techniek een eiwit of zijn gemodificeerde vorm geassocieerd met ontluikende DNA immuunprecipitatie gebruik van proteïne-specifieke of gemodificeerde vorm-specifiek antilichaam en de hoeveelheid BrdU gelabelde ontluikende DNA gebonden aan de eiwit then kwantitatief bepaald door Slot-Western blotting met behulp van een anti-BrdU-antilichaam.
Er zijn kritische stappen in dit protocol die speciale aandacht nodig heeft. Het is essentieel dat de interessante antilichaam werkt goed in standaardchip assays met een hoog rendement. Het is belangrijk om de efficiëntie van een antilichaam in ChIP assays met kwantitatieve PCR-testen alvorens de BrdU-CHIP-Slot-Western-bepaling. Om de kwantificering van de BrdU-CHIP-Slot-Western techniek nauwkeurig te zijn, moet een seriële verdunning van de BrdU gemerkte DNA worden toegepast op slot blot en western analyse met behulp van anti-BrdU-antilichaam dient aanvankelijk te worden uitgevoerd teneinde bepalen lineaire detectiegebied. Het bepalen van de DNA concentratie van ChIP en Input DNA maakt het mogelijk dat de hoeveelheid BrdU gelabelde DNA in het lineaire traject van detectie in Western blotting. Zo bepaalden we 50 ng tot 12,5 ng DNA ingevoerd worden inhet lineaire bereik in onze proefproject. Ook, als de concentratie van de ChIP monsters is zeer hoog, is het noodzakelijk om de ChIP DNA te verdunnen voordat slot. De beperking van deze techniek is de resolutie, die afhankelijk van de efficiëntie van chromatine afschuiving. Het afschuiven van chromatine door sonicatie bepaalt de nabijheid van een bepaald eiwit of een gemodificeerde vorm van de nieuw gesynthetiseerde DNA.
In het verleden, de studie van veranderingen in het chromatine en chromatine-modificerende enzymen tijdens DNA-replicatie in zoogdiercellen bleef een moeilijk probleem aan te pakken door de onbeschikbaarheid van geschikte technieken. Aangezien Hdac1,2 null-cellen arrestatie in G1 fase was het moeilijk om functies Hdac1,2 in S-fase te onderzoeken. In onze studie hebben we de functies voor deze twee HDAC toonde tijdens de DNA-replicatie met behulp van een combinatie van een first-in-class selectieve remmers om hun activiteiten binnen de S-fase en de roman BrdU-chip-S te remmenVeel westerse techniek. In de toekomst zou deze techniek ook gebruikt worden om de dynamica van DNA schade respons en DNA reparatie-eiwitten te bestuderen in de vastgelopen splitsing naast het bestuderen van de histon modificaties en chromatine-modificerende enzym bij de splitsing. Bovendien is deze techniek niet beperkt tot muizen NIH3T3 cellen. Deze techniek kan met succes worden gebruikt in andere cellijnen om te onderzoeken hoe andere remmers van enzymen of eiwitten beïnvloeden DNA replicatie en replicatie stress-geïnduceerde chromatine veranderingen op replicatievork.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Het werk in dit manuscript werd ondersteund door fondsen van Dept. of Radiation Oncology en Huntsman Cancer Institute en het National Institute of Health subsidie (R01-CA188520) naar SB. Ik dank Danielle Johnson en Steven Bennett in mijn lab voor het aantonen van het protocol en het uitleggen van de voordelen ervan. Ik ben dankbaar dat Dr. Mahesh Chandrasekharan (Huntsman Cancer Institute) voor kritische opmerkingen over het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-BrdU (westerns) | BD Biosciences | B555627 | |
| Anti-SMARCA5 | Abcam | ab3749 | |
| Anti-H4K16ac | Active Motif | 39167 | |
| Zeta-Probe GT Membrane | Bio-Rad | 162-0197 | |
| Formaldehyde | Fisher | BP531-500 | |
| Protein A agarose | Millipore | 16-156 | |
| Rnase A | Qiagen | 19101 | |
| Proteinase K | Sigma | P4850 | |
| PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| Glycine | Sigma | G7403 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
| BrdU | Sigma | B9285 | |
| Rabbit IgG | Millipore | 12-370 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| NaCl | Sigma | S-3014 | |
| Triton-X-100 | Sigma | 93443 | |
| NP40 | USB Corporation | 19628 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D6750 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S-4019 | |
| Ethanol | Decon Laboratories | 04-355-222 | |
| DEPC-treated water | Sigma | 95284 | |
| Tris | Fisher | BP-152-5 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
| SDS | Ambion | AM9820 | |
| Sodium hydroxide | Mallinckrodt GenAR | MAL7772-06 | |
| 20x SSC | Life Technologies | 15557-036 | |
| Non-fat dry milk | Lab Scientific Inc | M0841 | |
| ECL | Thermo Fisher | 80196 | |
| X-ray film | Genesee Sci | 30-101 | |
| Developer | Konica Minolta | SRX-101A | |
| UV Crosslinker | Stratagene | XLE-1000 | |
| Sonicator | Branson Sonifier Digital Ultrasonic Cell Disruptor | Model: 450 | |
| Centrifuge | Eppendorf | Model: 5810R | |
| Water bath | Fisher Scientific Isotemp | Model: 2322 | |
| NanoDrop 1000 spectrophotometer | ThermoScientific | Model: 1000 | |
| Slot Blot apparatus | Schleicher and Schuell Minifold II | 44-27570 | |
| Tissue Culture Incubator | Thermo Scientific | Series II 3110 Water-Jacketed CO2 Incubators |
References
- Podhorecka, M., Skladanowski, A., Bozko, P. H2AX Phosphorylation: Its Role in DNA Damage Response and Cancer Therapy. J nucleic acids. , (2010).
- Groth, A., Rocha, W., Verreault, A., Almouzni, G. Chromatin challenges during DNA replication and repair. 128, 721-733 (2007).
- Demeret, C., Vassetzky, Y., Mechali, M. Chromatin remodelling and DNA replication: from nucleosomes to loop domains. Oncogene. 20, 3086-3093 (2001).
- Bhaskara, S., et al. Deletion of histone deacetylase 3 reveals critical roles in S phase progression and DNA damage control. Mol Cell. 30, 61-72 (2008).
- Bhaskara, S., Hiebert, S. W. Role for histone deacetylase 3 in maintenance of genome stability. Cell Cycle. 10, 727-728 (2011).
- Bhaskara, S., et al. Histone deacetylases 1 and 2 maintain S-phase chromatin and DNA replication fork progression. Epigenetics Chromatin. 6, 27 (2013).
- Bhaskara, S., et al. Hdac3 is essential for the maintenance of chromatin structure and genome stability. Cancer Cell. 18, 436-447 (2010).
- Johnson, D. P., et al. HDAC1,2 inhibition impairs EZH2- and BBAP-mediated DNA repair to overcome chemoresistance in EZH2 gain-of-function mutant diffuse large B-cell lymphoma. Oncotarget. 6, 4863-4887 (2015).
- Bhaskara, S. Histone deacetylases 1 and 2 regulate DNA replication and DNA repair: potential targets for genome stability-mechanism-based therapeutics for a subset of cancers. Cell Cycle. 14, 1779-1785 (2015).
- Taddei, A., Roche, D., Sibarita, J. B., Turner, B. M., Almouzni, G.
- Alabert, C., Groth, A.
- Clapier, C. R., Cairns, B. R. Regulation of ISWI involves inhibitory modules antagonized by nucleosomal epitopes. Nature. 492, 280-284 (2012).
- Sirbu, B. M., et al. Analysis of protein dynamics at active, stalled, and collapsed replication forks. Genes Dev. 25, 1320-1327 (2011).
